CN112697912B - 一种检测枸橼酸托法替布中间体及其相关杂质的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于分析化学领域，具体涉及一种HPLC法分离测定枸橼酸托法替布中间体及其相关杂质的方法，所述方法采用的色谱柱是以十八烷基硅烷键合硅胶为填料，采用流动相A和流动相B进行梯度洗脱，进入检测器进行检测；所述流动相A为磷酸盐缓冲液‑乙腈，所述流动相B为乙腈和甲醇混合液。本发明可以有效的将枸橼酸托法替布中间体及其相关杂质分开，且该方法具有很高的灵敏度及分离度，重复性及耐用性好，操作简单，结果稳定可靠，对于实现枸橼酸托法替布中间体及枸橼酸托法替布质量控制具有极其重要的意义。

Description

一种检测枸橼酸托法替布中间体及其相关杂质的方法

技术领域

本发明属于分析化学领域，具体时间涉及一种检测枸橼酸托法替布中间体及其相关杂质的方法。

背景技术

托法替布(Tofacitinib)，化学名为N-甲基-N-[(3R，4R)-1-氰乙酰基-4-甲基哌啶-3-基]-7-H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-胺，是由辉瑞公司(Pfrizer)开发的一种抗类风湿性关节炎口服抑制剂，其枸橼酸盐(枸橼酸托法替布，Tofacitinib Citrate)已经通过Ⅲ期临床试验，于2012年11月6日获美国食品药品管理局(FDA)批准上市，于2013年3月25日获得日本医药品医疗器械综合机构(PMDA)批准上市，于2017年3月22日获得欧洲药品质量管理局(EDQM)批准上市。

目前已报道的托法替布制备方法较多，其中使用4-氯-7-对甲苯磺酰基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶(起始物料1)和(3R,4R)-1-苄基-N,4-二甲基哌啶-3-胺盐酸盐(起始物料2)为起始物料，经缩合、脱保护、氢化、氰基乙酰化得到托法替布是一种相对比较成熟的制备方法，为大多数申报厂家的首选路线。其合成路线如下：

通常来说，一种药物杂质总含量应小于1.0％，单个杂质含量应小于0.1％，对于制备枸橼酸托法替布过程中产生的杂质或引入的有关物质，不论是在原料药还是制剂中均需要进行严格控制。

N-((3R,4R)-1-苄基-4-甲基哌啶-3-基)-N-甲基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-胺，是合成枸橼酸托法替布的关键中间体，结构如式Ⅰ所示：

我们研究发现，枸橼酸托法替布的关键中间体Ⅰ的质量直接影响枸橼酸托法替布成品的质量，对枸橼酸托法替布的关键中间体的分析研究对反应过程的控制以及杂质控制对枸橼酸托法替布成品质量的提高起着至关重要的作用。

申请号为201510124650.1的中国专利公开了托法替布中间体杂质、托法替布杂质及其合成方法，以及托法替布的质量监控方法,但是其主要是对含氯中间体化合物进行控制，由于合成路线不同，所涉及的杂质也不一样。另有文献《沈阳药科大学学报》2018年第35卷第2期131页，报道了RP-HPLC法测定枸橼酸托法替尼含量以及有关物质。但是，目前为止，尚未有文献单独的报导枸橼酸托法替布的关键中间体Ⅰ的检测方法，更没有公开的方法报道可以同时分离测定枸橼酸托法替布中间体Ⅰ及其相关杂质的方法，因此，有必要建立一种简单有效的方法对该关键中间体进行质量控制。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种HPLC法分离测定枸橼酸托法替布中间体及其相关杂质的方法；本发明的方法可以有效的将枸橼酸托法替布中间体及其相关杂质分开，且该方法具有很高的灵敏度及分离度，重复性及耐用性好，操作简单，结果稳定可靠。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

HPLC法分离测定枸橼酸托法替布中间体及其相关杂质的方法，所述方法采用的色谱柱是以十八烷基硅烷键合硅胶为填料，采用流动相A和流动相B进行梯度洗脱，进入检测器进行检测；所述相关杂质包括杂质a、杂质b、杂质c、杂质d、杂质e、杂质f和杂质g的一种或多种，具体结构式如下所示：

所述流动相A为磷酸盐缓冲液，所述流动相B为乙腈和甲醇的混合液。

所述枸橼酸托法替布中间体为N-((3R,4R)-1-苄基-4-甲基哌啶-3-基)-N-甲基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-胺，是合成枸橼酸托法替布的关键中间体，本发明中，也称为式Ⅰ中间体或者枸橼酸托法替布中间体Ⅰ或者枸橼酸托法替布中间体，其化学式为C₂₀H₂₅N₅，结构如式Ⅰ所示：

该中间体的分析研究对反应过程的控制以及质量的提高起着至关重要的作用，也直接影响枸橼酸托法替布成品的质量。本发明的检测分析方法可以有效的将枸橼酸托法替布中间体及其相关杂质分开，且该方法具有很高的灵敏度及分离度，重复性及耐用性好，操作简单，结果稳定可靠。

所述流动相A为磷酸盐缓冲液与乙腈的体积比为95:5；

作为一种优选，所述流动相A磷酸盐缓冲液为pH 3.0-4.5的10mmol/L磷酸二氢钾水溶液，即所述流动相A为用磷酸调节10mmol/L磷酸二氢钾pH值至3.0-4.5形成的磷酸盐缓冲液；

作为一种优选，所述流动相A磷酸盐缓冲液为pH 3.5的10mmol/L磷酸二氢钾水溶液，即所述流动相A为用磷酸调节10mmol/L磷酸二氢钾pH值至3.5形成的磷酸盐缓冲液；

进一步，所述流动相B为乙腈和甲醇的混合液，其体积比为93:7；

进一步，所述梯度洗脱设置如下：

所述流动相进行洗脱的流速为0.7～1.3ml/min。

作为一种优选，所述洗脱设置如下：

所述流动相进行洗脱的流速为1.0ml/min；

进一步，所述十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱填料的颗粒粒径为3-6μm；所述色谱柱的柱温为20-35℃；

作为一种优选，所述十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱填料的颗粒粒径为5μm；所述色谱柱的柱温为25℃；

作为一种优选，所述十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱为YMC-pack ODS-AQ；

进一步，所述检测器的检测波长为220nm±2nm；

作为一种优选，所述检测器的检测波长为220nm；

进一步，HPLC法分离测定枸橼酸托法替布中间体及其相关杂质的方法，所述相关杂质为杂质a、杂质b、杂质c、杂质d、杂质e、杂质f和杂质g，具体包括以下步骤：

1)配制系统适用性溶液：取枸橼酸托法替布中间体和杂质a、杂质b、杂质c、杂质d、杂质e、杂质f和杂质g溶于稀释剂中，得系统适用性溶液；

2)配制供试品溶液：取供试样品溶于稀释剂中，得供试品溶液；

3)配制对照溶液：取枸橼酸托法替布中间体，用稀释剂溶解稀释制成对照溶液；

4)分别取步骤1)所述系统适用性溶液步骤2)所述供试品溶液和步骤3)所述对照溶液进样，进行高效液相色谱分析，记录色谱图，确定枸橼酸托法替布中间体及其相关杂质的保留时间，按主成分自身对照法计算供试品溶液中相关杂质的含量。

枸橼酸托法替布中间体及各杂质a、杂质b、杂质c、杂质d、杂质e、杂质f和杂质g的线性关系如下表所示：

进一步，所述稀释剂为甲醇-乙腈体积比为70:30。

本发明的目的之二在于提供一种于固液分离测定枸橼酸托法替布中间体及其相关杂质的试剂组合物，由以下试剂组成：

试剂A：磷酸盐缓冲液。

试剂B：有机溶剂。

所述相关杂质包括杂质a、杂质b、杂质c、杂质d、杂质e、杂质f和杂质g的一种或多种。

所述流动相A为磷酸盐缓冲液，所述流动相B为乙腈和甲醇混合物。

作为一种优选，所述磷酸盐缓冲液中磷酸盐缓冲液为10mmol/L磷酸二氢钾(磷酸调pH3.5)；所述有机溶剂为乙腈-甲醇(体积比93:7)。

本发明提供的用于测定枸橼酸托法替布中间体及其相关杂质的试剂组合物能有效分离枸橼酸托法替布中间体及其相关杂质，对于实现枸橼酸托法替布中间体及枸橼酸托法替布质量控制具有极其重要的意义。

本发明的有益效果在于：

1)本发明提供了一种HPLC法分离测定枸橼酸托法替布中间体及其相关杂质的方法，本发明的方法可以有效的将枸橼酸托法替布中间体及其相关杂质分开，且该方法具有很高的灵敏度及分离度，重复性及耐用性好，操作简单，结果稳定可靠。

2)本发明中枸橼酸托法替布中间体的分析研究对反应过程的控制以及质量的提高起着至关重要的作用，也直接影响枸橼酸托法替布成品的质量，所以该方法对于实现枸橼酸托法替布中间体及枸橼酸托法替布质量控制具有极其重要的意义。

附图说明

图1为混合溶液系统适应性色谱图；注：从左到右依次为杂质a，杂质b，杂质c，式Ⅰ中间体，杂质d，杂质e，杂质f，杂质g。

具体实施方式

以下将参照附图，对本发明的优选实施例进行详细描述。优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，所举实施例是为了更好地对本发明的内容进行说明，但并不是本发明的内容仅限于所举实施例。所以熟悉本领域的技术人员根据上述发明内容对实施方案进行非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。

本发明所涉及的杂质除了杂质e外，都可以从市面购买获得。杂质e合成方法见实施例1。

实施例1：N-((3R,4R)-1-苄基-4-甲基哌啶-3-基)-7-异丙基-N-甲基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-胺(杂质e)的合成。

在100mL三口烧瓶中，加入10g N-((3R,4R)-1-苄基-4-甲基哌啶-3-基)-N-甲基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-胺、50mL DMF、搅拌升温至40～50℃，固体完全溶解，加入11.7g碳酸铯，5.5g2-溴丙烷，TLC(PE:EA＝1:1)跟踪反应直至反应结束，降温至室温，过滤，滤饼用少量乙酸乙酯淋洗，滤液中加入125mL乙酸乙酯和125mL水，搅拌，静置分层，有机相依次用纯化水洗涤两次(125mL×2)，合并有机相，加入无水硫酸钠干燥，过滤，滤液45℃减压浓缩至干，得到N-((3R,4R)-1-苄基-4-甲基哌啶-3-基)-7-异丙基-N-甲基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-胺(杂质e)5.3g。

LC-MS(m/z):378[M+H]⁺；

1HNMR(500MHz,DMSO-d6):

δ8.41(s,1H),7.77(m,1H),7.70-7.72(m,2H),7.41-7.44(m,3H),7.00-7.01(m,1H),5.34(m,1H),5.05-5.08(m,1H),4.42-4.48(m,2H),4.04-4.06(m,1H),3.45(m,1H),3.35-3.37(m,3H),3.20(s,2H),2.46-2.49(m,2H),1.68-1.71(m,1H),1.44-1.45(m,6H)；1.16-1.17(m,3H)；

13CNMR(125MHz,DMSO-d6):δ143.18、131.55、129.68、129.39、129.68、124.14、104.21、101.17、67.28、61.98、59.32、53.91、47.11、46.90、46.19、34.85、29.25、27.31、25.46、22.79、22.21、22.15、12.04。

实施例2

1色谱条件：

色谱柱：YMC-pack ODS-AQ，4.6×250mm，5μm，流动相A：10mmol/L磷酸二氢钾水溶液(磷酸调pH值3.5)，流动相B：乙腈-甲醇(体积比为93:7)，进行梯度洗脱，梯度洗脱设置如下：

流速：每分钟1ml；

柱温：25℃；

检测波长：220nm；

进样量：10μl；

稀释剂：甲醇:乙腈(体积比为70:30)

2方法与结果

2.1溶液配制

供试品溶液配制：取枸橼酸托法替布中间体约10mg，精密称定，置20ml量瓶中，加稀释剂超声溶解并稀释至刻度，摇匀，即得供试品溶液。

对照溶液配制：精密取供试品溶液1ml置100ml量瓶中，加稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得对照溶液。

2.2系统适用性

取枸橼酸托法替布中间体及杂质a、杂质b、杂质c、杂质d、杂质e、杂质f和杂质g共计7个杂质对照品。加稀释剂稀释制成杂质定位溶液和混合溶液，精密量取10μl，分别注入液相色谱仪中，记录色谱图，混合溶液结果见图1。混合溶液中，枸橼酸托法替布中间体峰与各杂质峰完全分离，其最小分离度为3.8，主峰保留时间为16.305分钟(图1)。

2.3精密度

取枸橼酸托法替布中间体约10mg，精密称定，共6份。分别置20ml量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，作为供试品溶液；分别精密取供试品溶液1ml置100ml量瓶中，加稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得对照溶液。精密量取上述溶液各10μl，分别注入液相色谱仪中，记录色谱图。按主成分自身对照法计算6份供试品溶液中总杂质含量及RSD。6份供试品的总杂分别1.33％、1.34％、1.34％、1.34％、1.34％和1.33％，RSD为0.47％，小于2％，符合高效液相色谱法对有关物质检查的要求。

2.4线性和范围

取枸橼酸托法替布式Ⅰ中间体及各杂质对照品适量，加稀释剂溶解并稀释成1ml中含杂质b、杂质c、杂质d、杂质f、杂质g均约5μg、杂质a约7.5μg、杂质e和枸橼酸托法替布中间体约75μg的溶液作为线性贮备液，分别移取1ml置50ml、1ml置25ml、1ml置10ml、2ml置10ml、4ml置10ml量瓶中，加稀释剂稀释至刻度，作为线性供试液。另取定量限溶液作为线性最低点。记录峰面积A，以浓度C为横坐标，A为纵坐标，建立标准曲线。得线性方程(表1)，枸橼酸托法替布中间体及各杂质在线性范围内具有良好的线性关系。

表1线性测定结果

名称	浓度范围(μg/ml)	线性方程	相关系数
				式Ⅰ中间体	0.0591μg/ml～29.5730μg/ml	y＝34.5824x+1.9686	1.0000
杂质a	0.0322μg/ml～3.2226μg/ml	y＝53.5067x+0.8934	0.9997
				杂质b	0.0578μg/ml～1.9274μg/ml	y＝35.3125x+0.3068	0.9998
杂质c	0.0562μg/ml～1.8724μg/ml	y＝35.8417x+0.0798	1.0000
				杂质d	0.0318μg/ml～2.1219μg/ml	y＝87.9911x+0.1580	0.9999
杂质e	0.0753μg/ml～28.2225μg/ml	y＝27.5665x+1.3227	1.0000
				杂质f	0.0701μg/ml～2.0042μg/ml	y＝25.6008x-0.0137	1.0000
杂质g	0.0515μg/ml～2.0587μg/ml	y＝40.0807x-0.0073	0.9999

2.5定量限和检测限

取枸橼酸托法替布中间体及各杂质对照品适量，用稀释剂溶解并稀释制成一系列的溶液，S/N≈10时，作为定量限溶液。S/N≈3时，作为检测限溶液。进行测定。枸橼酸托法替布中间体和各杂质的定量限和检测限结果见表2。

表2定量限和检测限结果

2.6结论：

在该色谱条件下，枸橼酸托法替布中间体及其杂质可以完全分离，该方法专属性强、准确度好、精密度高、重复性好、系统适用性好，符合药物质量研究标准的技术要求。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (7)

1.HPLC法分离测定枸橼酸托法替布中间体及其相关杂质的方法，其特征在于，所述方法采用的色谱柱是以十八烷基硅烷键合硅胶为填料，采用流动相A和流动相B进行梯度洗脱，进入检测器进行检测；所述相关杂质包括杂质d、杂质f、杂质g和杂质a、杂质b、杂质c或杂质e中的一种或者多种，具体结构式如下所示：

所述枸橼酸托法替布中间体，化学名为：N-((3R,4R)-1-苄基-4-甲基哌啶-3-基)-N-甲基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-胺，结构式如式Ⅰ所示：

所述流动相A为磷酸盐缓冲液-乙腈体积比95:5，所述流动相B为体积比93:7的乙腈和甲醇混合溶液，所述梯度洗脱设置如下：

所述流动相进行洗脱的流速为0.7～1.3ml/min。

2.根据权利要求1所述的方法，所述洗脱设置如下：

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述磷酸盐缓冲液为用磷酸调节到pH 3.0～4.5的10mmol/L磷酸二氢钾水溶液。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述磷酸盐缓冲液为用磷酸调节pH 3.5的10mmol/L磷酸二氢钾水溶液。

5.根据权利要求1-4任一项所述的方法，其特征在于，所述十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱填料的颗粒粒径为3～6μm；所述色谱柱的柱温为20～35℃。

6.根据权利要求1-4任一项所述的方法，其特征在于，所述检测器的检测波长为220nm±2nm。

7.根据权利要求1-4任一项所述的方法，其特征在于，所述十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱为YMC-packODS-AQ柱。

Images