CN102816832A - 桑叶中具α-葡萄糖苷酶抑制活性的化合物及用途 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种桑叶中具α-葡萄糖苷酶抑制活性的化合物,通过磁珠分离和液相色谱-质谱联用及核磁共振分析方法从桑叶中初步筛选,再制备分离或购置目标化合物,进行α-葡萄糖苷酶抑制活性验证,从而获取具α-葡萄糖苷酶抑制活性的化合物。与传统方法相比,本发明方法初筛无须制备分离化合物,显著提高了筛选效率、缩短了筛选时间,减少了标的化合物制备分离步骤。此外,本发明筛选方法具有快速、准确、重现性好等特点。可推广用于天然药物或中药混合物中具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的化合物的快速筛选。本发明方法获得的具α-葡萄糖苷酶抑制活性的化合物可在制备抗糖尿病药物中应用。
Description
技术领域
本发明属于药物筛选方法领域,涉及桑叶中具α-葡萄糖苷酶抑制活性的化合物,尤其涉及应用磁珠分离和液相色谱-质谱联用及核磁共振分析技术从桑叶中获得具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的化合物,并在制备治疗糖尿病药物中的应用。
背景技术
糖尿病是一种慢性代谢紊乱性疾病,其主要的干预方法是控制饮食、减少摄入性碳水化合物的含量、药物治疗等。人体摄入的碳水化合物经过小肠上皮细胞的酶(如淀粉酶和α-葡萄糖苷酶)的水解作用生成葡萄糖之后,才被吸收进入血液循环。阿卡波糖等α-葡萄糖苷酶抑制剂可以抑制α-葡萄糖苷酶,减少碳水化合物转化成葡萄糖,是一类临床常用的糖尿病治疗药物。现有的α-葡萄糖苷酶抑制剂筛选方法主要采用体外酶活性抑制实验,仅能对纯化合物的活性进行评价,难以用于中药等复杂混合物中α-葡萄糖苷酶抑制剂的筛选。
亲和选择技术联用质谱分析方法可以快速分析与鉴定与特定蛋白或酶结合的配体化合物,如将特定蛋白或酶加入待筛选的样品中使用超滤膜把蛋白结合物与未结合的化合物分离开,再进行质谱检测;或是把特定蛋白或酶固定在色谱固定相中,使用洗脱溶剂把化合物按照与蛋白的结合强弱依次洗脱下来,进行质谱检测;还可将特定蛋白或酶固定在某种合适的载体上,与配体化合物作用后,把不结合的部分洗脱掉,然后把结合配体洗脱出来,进行质谱检测。
发明内容
本发明的目的是提供一种桑叶中具α-葡萄糖苷酶抑制活性的化合物,该化合物通过以下步骤实现:
(1)制备键合α-葡萄糖苷酶的磁珠
(a)磁珠活化:取磁珠使用2-(N-吗啡啉)乙磺酸溶液清洗后加入1-乙基-3-(3-二甲氨丙基)碳二亚胺盐酸盐溶液和N-羟基琥珀酰亚胺溶液混合均匀,孵育活化30 min后移去上清液,并用2-(N-吗啡啉)乙磺酸溶液清洗;
(b)磁珠键合:在活化的磁珠上,加入含α-葡萄糖苷酶的2-(N-吗啡啉)乙磺酸溶液,震荡混合均匀,在室温孵育30 min进行包被,移去上清液,再用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗包被的磁珠4次,弃去清洗液,待用。
(2)键合磁珠质量考察:将制备的键合磁珠分散在PBS溶液中,使用扫描式电子显微镜对α-葡萄糖苷酶键合磁珠的表面分别进行扫描成像,检查磁珠键合情况,磁珠表面不粗糙、较光滑的表明键合情况良好。
(3)筛选具α-葡萄糖苷酶抑制活性的化合物
(a)具潜在α-葡萄糖苷酶抑制活性的化合物初筛:取30μl桑叶提取物水溶液2份,分别加到1ml 分散于醋酸铵溶液的键合α-葡萄糖苷酶的磁珠和空白磁珠,放在振荡器上混匀,孵育1 h。弃去上清液,再加入1ml醋酸铵溶液清洗2次,弃去清洗液,最后使用含10%乙腈的醋酸铵溶液洗脱,吸取洗脱液备用,平行操作三份,取空白磁珠和酶键合磁珠的洗脱液进行液相分析及液质鉴定,洗脱液浓缩后,用氘代二甲基亚砜(DMSO)溶解,做核磁共振氢谱分析;
(b)目标化合物获取及活性验证
采用常规柱色谱分离技术分离获取目标化合物群,再采用制备液相色谱分离、纯化目标化合物或购置相对应的目标化合物;
采用酶抑制活性实验验证纯化的目标化合物是否具有α-葡萄糖苷酶抑制活性,计算其半数抑制浓度。
所述化合物为异槲皮素和紫云英苷。
本发明的另一个目的是提供从桑叶中筛选获得的具α-葡萄糖苷酶抑制活性的化合物在制备抗糖尿病药物中的应用。
本发明通过一种快速筛选桑叶中具α-葡萄糖苷酶抑制活性的化合物的方法,提供一种具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的化合物。与传统方法相比,初筛无须制备分离化合物,显著提高了筛选效率、缩短了筛选时间,减少了标的化合物制备分离步骤。此外,本筛选方法具有快速、准确、重现性好等特点。可推广用于天然药物或中药混合物中具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的化合物的快速筛选。本发明方法获得的具α-葡萄糖苷酶抑制活性的化合物可在制备抗糖尿病药物中应用。
附图说明
图 1 磁珠电镜图,A:空白磁珠,B:α-葡萄糖苷酶键合磁珠。
图 2桑叶磁珠结合洗脱液液相色谱图。
图 3桑叶磁珠结合洗脱液液相色谱-质谱图,其中图3-1和图3-2分别为峰8的光谱图与质谱图,图3-3和图3-4分别为峰10的光谱图与质谱图。
图4 桑叶磁珠结合洗脱液核磁共振氢谱图。
具体实施方式
下面将结合附图和实施例进一步说明本发明的实质内容及有益效果,该实施例仅用于说明本发明而非对本发明的限制。
实施例所用仪器: Finnigan LCQ Deca XPplus液质联用仪器(Finnigan公司);Bruker Avance III 500MHz核磁共振仪(Bruker公司);F200酶标仪(Tecan公司)
实施例1 键合α-葡萄糖苷酶的磁珠制备
1. 试剂及溶液配制:
α-葡萄糖苷酶 (Saccharomyces cerevisiae,simga公司);羧基磁珠Dynabeads® MyOne Carboxylic Acid,规格:10 mg/ml(invitrogen公司);1-乙基-3-(3-二甲氨丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC,sigma公司);2-(N-吗啡啉)乙磺酸(MES,sigma公司);N-羟基琥珀酰亚胺(NHS, sigma公司)。
25 mmol/L的MES溶液配制 称取MES适量,加水溶解,加1mol/L氢氧化钠溶液调pH至6,制成浓度为25mmol/L的MES溶液。
50 mg/ml EDC溶液配制 称取EDC适量,快速溶解在冷的25mmol/L的MES溶液中,制成浓度为50mg/ml的EDC溶液。临用时新鲜配制。
50 mg/ml NHS溶液配制 称取NHS适量,快速溶解在冷的25mmol/L的MES溶液中,制成浓度为50mg/ml的NHS溶液。临用时新鲜配制。
1mg/ml α-葡萄糖苷酶溶液配制 称取α-葡萄糖苷酶1mg,快速溶解在冷的25mmol/L的MES溶液中,制成浓度为1 mg/ml的α-葡萄糖苷酶溶液。临用时新鲜配制。
2. 键合α-葡萄糖苷酶的磁珠的制备
磁珠活化 取300 μl磁珠,加入等体积25mmol/L的 2-(N-吗啡啉)乙磺酸(pH 6)溶液清洗两次,每次10 min,弃去清洗液,加入50 μl新鲜配置50 mg/ml EDC溶液和50 μl的50 mg/ml NHS溶液,混合均匀,在室温下缓慢倾斜旋转孵育30 min。孵育后,把管子放于磁铁上4 min,移除上清液,使用300 μl 25 mmol/L MES溶液清洗两次。
磁珠键合 在活化磁珠中,加入1 mg/ml α-葡萄糖苷酶溶液60μl,再加入25 mmol/L MES溶液40 μl,震荡混合均匀,在室温孵育30 min,或4℃缓慢倾斜旋转孵育2 h,孵育后,把管子放于磁铁上4 min,移除上清液。加10 mmol/L PBS溶液300μl冲洗包被的磁珠4次,加质量分数为0.1-0.5 %的牛血清白蛋白PBS溶液300 μl,震荡混合均匀,弃去上清液。
3. 键合磁珠质量考察 将制备的键合磁珠分散在10 mmol/L PBS溶液中,使用扫描式电子显微镜对空白磁珠、α-葡萄糖苷酶键合磁珠的表面分别进行扫描成像,检查磁珠键合情况。见图1, 从图1可以看出,空白磁珠(A)表面非常粗糙,α-葡萄糖苷酶键合磁珠(B)表面比较光滑,表明α-葡萄糖苷酶已键合于磁珠表面。
实施例2 桑叶水溶性提取物中具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的化合物筛选
1. 药品、试剂及溶液配制;
紫云英苷和异槲皮素标准品(上海融禾医药科技发展有限公司)。
桑叶水溶性提取物:将桑叶500g用8倍量50%乙醇回流提取2次,每次1 h。将提取液浓缩后用石油醚脱脂,将水层用盐酸调节pH值至2,用乙酸乙酯萃取,回收溶剂至干,得桑叶水溶性提取物。
10 mmol/L的醋酸铵溶液配制:称取醋酸铵适量,加水溶解,制成浓度为10 mmol/L的醋酸铵溶液。
α-葡萄糖苷酶键合磁珠溶液配制:取上述用0.5 mg空白磁珠制备的键合α-葡萄糖苷酶的磁珠,加入10 mmol/L的醋酸铵溶液1 ml,震荡混合均匀。
空白磁珠溶液配制:取50 μl空白磁珠(含空白磁珠0.5 mg),活化后加入10 mmol/L的醋酸铵溶液1 ml,震荡混合均匀。
2. α-葡萄糖苷酶抑制活性筛选系统:由环形磁铁、键合α-葡萄糖苷酶的磁珠、液相色谱-质谱联用仪与核磁共振仪组成。
3. 桑叶水溶性提取物中具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的化合物筛选:
称取10 mg桑叶水溶性提取物于1 ml 离心管中,加入1ml纯水,超声15 min,10000 rpm离心5 min,吸取上清液备用。取30 μl上清液,分别加到1 ml 的α-葡萄糖苷酶键合磁珠和空白磁珠溶液中,放在振荡器上混匀,孵育1 h。然后放于磁铁上,使磁珠与溶液分开,弃去溶液,在磁珠上再加入10 mmol/L醋酸铵溶液1ml,重复上述操作,洗脱2次,弃去洗脱液。最后一次清洗使用含10%乙腈的醋酸铵溶液,吸取洗脱液备用,平行操作三份。洗脱液进行液质分析。液质分析条件:色谱柱:Agilent Zorbax SB-C18柱 250×4.6 mm, 5 μm,流动相为0.05%甲酸-水A和乙腈B;梯度洗脱程序如下:0 min,10%B;25 min, 45%B;35 min, 100%B;流速:0.5 ml/min,进样量:60μl,柱温:30℃,检测器:二极管阵列检测器,波长扫描范围:190~400 nm;检测波长:254 nm。质谱参数:离子源:电喷雾(ESI)源,正负离子扫描模式,质量扫描范围:m/z 100–2000,碰撞气:高纯氦,雾化气:高纯氮,电喷雾电压:4.5 kV,鞘气流速:30 arb,辅助气流速:10 arb,毛细管温度:350℃;毛细管电压:15 V。α-葡萄糖苷酶键合磁珠洗脱液的液相色谱图参见图2,其中A图为桑叶水提物色谱图,B图为α-葡萄糖苷酶键合磁珠的洗脱液色谱图,酶键合磁珠的洗脱液有两个明显的色谱峰。经紫外光谱和质谱鉴定推测色谱峰8(M8)为异槲皮素,色谱峰10(M10)为紫云英苷。(参见图3,其中图3-1和图3-2分别为峰8的光谱图与质谱图,图3-3和图3-4分别为峰10的光谱图与质谱图)。将α-葡萄糖苷酶键合磁珠的洗脱液及空白磁珠的洗脱液浓缩至干,用氘代DMSO溶解,另取异槲皮素和紫云英苷标准品用氘代DMSO溶解,测键合磁珠的洗脱液、空白磁珠的洗脱液及标准品核磁共振氢谱。核磁共振氢谱参数:脉冲序列:zg30,谱宽:10330.57Hz,扫描次数:32(参见图4,图中可以看出桑叶磁珠洗脱液及两个标准品的核磁共振图谱(1H谱)。α-葡萄糖苷酶键合磁珠洗脱液的氢谱中有异槲皮素和紫云英苷两个化合物的氢信号。进一步验证桑叶酶键合磁珠洗脱液中含有异槲皮素和紫云英苷,空白磁珠洗脱液中无异槲皮素、紫云英苷。再通过与购置的异槲皮素和紫云英苷标准品比较,最终鉴定为: M8为异槲皮素, M10为紫云英苷。说明桑叶水提物中异槲皮素和紫云英苷对α-葡萄糖苷酶有潜在抑制活性。
4. 异槲皮素、紫云英苷α-葡萄糖苷酶抑制活性验证
取异槲皮素、紫云英苷标准品配制成浓度为0.05、0.1、0.5、1、5、10、20 mmol/L的待测品溶液,各取20 μl加入20 μl浓度为0.1 U/ml的α-葡萄糖苷酶溶液,置于在96孔板中,在37℃震荡混匀孵育10 min后,加5 mmol/L对硝基苯基-α-D-吡喃半乳糖苷溶液20 μl,在37℃震荡混匀孵育30 min后,再加入0.2 mol/L碳酸氢钠溶液80 μl停止反应,在37℃震荡10 min,于405 nm波长处测定吸收值,计算α-葡萄糖苷酶抑制抑制活性。
测试结果表明,异槲皮素、紫云英苷均具有较好的α-葡萄糖苷酶抑制活性,其中异槲皮素的半数抑制浓度(IC50)为462.1 μmol/L,紫云英苷的半数抑制浓度(IC50)为662.9 μmol/L。
Claims (3)
1.一种桑叶中具α-葡萄糖苷酶抑制活性的化合物,其特征在于,通过以下步骤实现:
(1)制备键合α-葡萄糖苷酶的磁珠:
(a)磁珠活化:取磁珠使用2-(N-吗啡啉)乙磺酸溶液清洗后加入1-乙基-3-(3-二甲氨丙基)碳二亚胺盐酸盐溶液和N-羟基琥珀酰亚胺溶液混合均匀,孵育活化30 min后移去上清液,并用2-(N-吗啡啉)乙磺酸溶液清洗;
(b)磁珠键合:在活化的磁珠上,加入含α-葡萄糖苷酶的2-(N-吗啡啉)乙磺酸溶液,震荡混合均匀在室温孵育30 min进行包被,移去上清液,再用磷酸盐缓冲液清洗包被的磁珠,弃去清洗液,待用;
(2)键合磁珠质量考察:将制备的键合磁珠分散在磷酸盐缓冲液中,使用扫描式电子显微镜对α-葡萄糖苷酶键合磁珠的表面分别进行扫描成像,检查磁珠键合情况,磁珠表面不粗糙、较光滑的表明键合情况良好;
(3)筛选具α-葡萄糖苷酶抑制活性的化合物:
(a)具α-葡萄糖苷酶抑制活性的化合物初筛:取30μl桑叶提取物水溶液2份,分别加到已分散在醋酸胺溶液的键合α-葡萄糖苷酶的磁珠和空白磁珠中,放在振荡器上混匀,孵育1 h,弃去上清液,再加入醋酸胺溶液清洗,弃去清洗液,最后使用含10%乙腈的醋酸胺溶液洗脱,取空白磁珠和酶键合磁珠的洗脱液进行液相分析及液质鉴定,洗脱液浓缩后,用氘代二甲基亚砜溶解,做核磁共振氢谱分析;
(b)目标化合物获取及活性验证:采用常规柱色谱分离技术分离获取目标化合物群,再采用制备液相色谱分离、纯化目标化合物或购置相对应的目标化合物;采用酶抑制活性实验验证纯化的目标化合物是否具有α-葡萄糖苷酶抑制活性,计算其半数抑制浓度。
2.根据权利要求1所述的一种桑叶中具α-葡萄糖苷酶抑制活性的化合物,其特征在于,所述具α-葡萄糖苷酶抑制活性的化合物为异槲皮素和紫云英苷。
3.根据权利要求1或2所述的一种桑叶中具α-葡萄糖苷酶抑制活性的化合物在制备抗糖尿病药物中的应用。
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20121212 |