CN102944604B - 哌嗪基嘧啶类同位素标记试剂的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种哌嗪基嘧啶类同位素标记试剂的应用。所述的同位素标记试剂为轻质和重质的同位素标记试剂[d0]-/[d6]-2，4-二甲氧基-6-哌嗪基嘧啶。该试剂应用于脂肪酸、多肽或蛋白质等的含羧基化合物的比较分析中。1.脂肪酸的分析，包括下列步骤：a)脂肪酸分别与轻重标记试剂反应，后处理后进行LC-MS/MS分析，选取产物离子m/z 225和m/z 231作为定量离子。b)通过观察标记的脂肪酸的成对质谱峰即可对多种含羧基脂肪酸进行识别，根据其相对峰面积即可定量。2.多肽蛋白质比较分析，包括下列步骤：a)目标分析蛋白质等经过热变性、酶解后与前述的轻质或重质同位素标记试剂反应。b)将反应后的溶液进行后处理，进行MALDI-TOF MS比较分析。
Description
技术领域
本发明涉及一种哌嗪基嘧啶类同位素标记试剂的设计、合成方法，及其在含羧基化合物的质谱分析的应用。特别是结合液相色谱质谱和基质辅助激光解析质谱的方法，实现快速、高效、准确的质谱分析，为高通量的研究羧基化合物提供了良好的手段，更为诊断医学中生物标志物的质谱分析提供了一种策略。
技术背景
诊断医学研究中的重要课题之一就是发现及监测人类疾病的新参数——生物标志物（biomarker）（参见J.Clin.Pharmacol.2003,43,329.）。对于疾病研究，生物标志物一般是指可供客观测定和评价的一个普通生理或病理或治疗过程中的某种特征性的生化指标，通过对它的测定可以获知机体当前所处的生物学过程中的进程。检查一种疾病特异性的生物标志物，对于疾病的鉴定、早期诊断及预防、治疗过程中的监控可能起到帮助作用。寻找和发现有价值的生物标志物已经成为目前研究的一个重要热点。含羧基化合物在制药工业，生物医学领域，包括体内代谢通路上都扮演了非常重要的角色（参见Anal.Chem.1977,49,442.），对于这些物质在生物标志物领域的研究正越来越多的被关注，且成为热点。脂肪酸类化合物如亚油酸、亚麻酸、EPA、DHA、花生四烯酸等作为一大类含羧基化合物是人体内和自然界中重要的代谢物，与多种代谢酶的功能相关。这些化合物的含量变化与人体内代谢紊乱有很大的关联，例如，肥胖，糖尿病、代谢紊乱综合症等多种疾病相关（参见Biochem.J.2011,435,723.Nature 2006,444(7121),840.Diabetes 2002,51(1),7.LipidsHealth Dis.2011,10,82.Diabetes 2010,1(3),68.）。因此，对生物样本（如血浆，尿液）中脂肪酸类化合物进行定性和定量分析对研究许多生理变化和疾病诊断有非常重要的作用。
以往多是采用先衍生化后气相色谱分析的方法，并按照峰面积归一化的方法进行定量分析该类物质。在商品化的试剂当中多是采用甲酯化和硅烷化等试剂，不仅标记试剂的反应活性较低而且准确性欠佳。此外，随着待测物分子量的增加，挥发性也逐渐下降，检测的灵敏度也不同程度的下降。所以，近年来逐渐有一些基于液相色谱质谱标记后分析该类化合物的报道（参见Anal.Chem.2007,79,5150.Anal.Chem.2010,82,6790.Anal.Chem.2011,83,3192.），但这些试剂均有着其固有的缺点，例如标记时间较长，背景残留严重，标记选择性差（与羟基也反应），灵敏度低，从而影响目标化合物的检测。而且这些试剂只能修饰一种类型的基团，能够适用的待测物有限，从而使其应用领域非常狭窄。这些局限性都促使了新的标记方法的发展和应用。
此外，肽类和蛋白质类物质是人体内非常重要的含羧基的内源性生物活性物质，也是重要的生物标志物。它涉及激素、神经、细胞生长和生殖各领域，其重要性在于调节体内各个系统器官和细胞。其代谢水平与人体众多生理活动相关，检测这一类物质对于心脑血管等疾病的临床诊断具有重要意义，发展高灵敏度、高准确性的分析方法来检测肽类物质一直是科研工作者研究的热点和难点。在诊断医学研究中，许多肽类物质由于其微弱的含量以及较弱的质谱响应使得他们很难被定性定量检测到。如果能够将多肽和蛋白质中影响质谱正离子检测模式的羧基封闭，再标记上能够显著提高质谱信号的物质，则能够很好的提高该类大分子化合物的质谱响应，在未来的诊断医学研究中将发挥其巨大的潜力。
发明内容
本发明要解决的问题是提供一种哌嗪基嘧啶类同位素标记试剂的用途,用于上述试剂的脂肪酸等化合物和多肽蛋白质分析方法，尤其是用于质谱分析。
本发明涉及到的这种同位素标记试剂化学名为[d0]-或[d6]-2，4-二甲氧基-6-哌嗪基嘧啶，（简写为[d0]-/[d6]-DMPP），其结构如下：
A是氨基部分，它是同位素标记的活性部位，可以在缩合剂EDCI的催化下专一性的与脂肪酸和多肽等分子的羧基反应，此外该基团也是提高羧基质谱响应的重要基团。
B是嘧啶环部分，将此芳香含氮杂环结构引入含羧基化合物的分子中，可以提高被分析物在质谱中的离子化效率，在离子化过程中更容易加合质子，从而起到提高质谱信号强度的作用。
C是两个甲氧基部分，作为同位素标签部分，可以在合成的过程中，方便的引入稳定同位素（6个氢/氘），用于基于质谱的同位素比较分析。标记后轻链与重链之间差6Da，非常有利于质谱图中一组峰的区分辨认。
本发明所涉及的同位素标记试剂DMPP，其合成方法如下式所示：
将Boc保护的哌嗪(373mg,2mmol)和碳酸钾(304mg,2.2mmol)溶于适量的20ml无水DMF中，并向该溶液中逐滴加入2，4，6-三氯嘧啶(0.23ml,2mmol)，并温和的搅拌。室温反应10小时后，倾入水中淬灭反应，并用二氯甲烷提取得到粗产品2，4-二氯-6-Boc哌嗪基嘧啶(466mg,1.4mmol)。150mg金属钠溶于15mL无水甲醇中配置成甲醇钠溶液。将2，4-二氯-6-Boc哌嗪基嘧啶溶于10mL无水甲醇中，再逐步滴加到已配好的甲醇钠溶液中，搅拌过夜，反应液置于25℃下搅拌过夜，然后过滤浓缩，再溶解于10mL去离子水中，用二氯甲烷萃取3次，每次15mL。合并有机相，用硫酸钠干燥后旋干，可得[d0]-2，4-二甲氧基-6-Boc哌嗪基嘧啶的粗产物。以氘代甲醇（methanol-d4）代替上述步骤中的无水甲醇合成[d6]-产物。可得[d6]-的粗产物。将[d0]-或[d6]-粗产物经柱层析分离的粗产品，并加入80%三氟乙酸的二氯甲烷溶液，搅拌5小时，减压蒸干反应溶剂，用2M碳酸氢铵水溶液调节pH至中性，析出的固体用异丙醚进行洗涤，得到轻、重同位素标记试剂-[d0]-或[d6]-2，4-二甲氧基-6-哌嗪基嘧啶的白色固体(183mg,41%)。
本发明提供了一种将上述试剂应用于含羧基化合物特别是脂肪酸和多肽蛋白质的快速、高灵敏度、低残留的分析，此方法包括下述步骤：
1.对于脂肪酸的分析方法如下：
a)目标脂肪酸分别与轻质的和重质的标记试剂反应，后处理，进行LC/MS/MS串联质谱分析。
b)以被标记脂肪酸产物离子m/z 225，及其同位素产物离子m/z 231作为定量离子进行MRM定量分析。
上述鉴定方法优选的反应条件如下：
所述的a)步骤是将目标分析物与轻重标记试剂室温下标记反应20秒。选用能够很好溶解标记试剂的甲醇作为反应溶剂，氮气吹干后，再用适量的含0.1%三氟乙酸的50%乙腈水溶解，经过强酸性阳离子树脂除杂后进行液相色谱质谱分析。所述的b)步骤是将轻重标记的脂肪酸在碰撞池中进行一定能量的碎裂，并采用MRM的模式分别选取m/z 225，及其同位素产物离子m/z 231作为定量离子。
2.对于酶解多肽的比较分析方法如下：
a)目标分析蛋白质经过热变性、酶解后与前述的轻质或重质同位素标记试剂反应。
b)将反应后的溶液氮气吹干，复溶后进行MALDI-TOF MS分析。
所述的a)步骤是将目标分析物（一对）置于缓冲溶液中进行热变性，蛋白酶解后的肽段可以直接进行标记反应，且溶剂需为乙腈。所述的b)步骤是用含0.1%三氟乙酸的50%乙腈水溶解后再进行点样分析。
上述的目标分析物可以是合成多肽、以及蛋白质的酶解产物、或者是不同生理状态下的生物体蛋白质提取物。
所述的缓冲溶液中优选含有40-50mM的碳酸氢铵，pH 8.0-8.5，优选将目标分析物（蛋白质）溶于此溶液中进行变性酶解。
所述的蛋白质酶解是在1mg/mL的浓度下，按重量比50：1加入胰蛋白酶，在37℃酶解12-16小时。
所述的LC-MS/MS质谱分析和基质辅助激光解析-飞行时间质谱MALDI-TOF MS分析所用的采集条件均是在正离子的模式下进行，其中液相色谱流动相：水和乙腈；流动相中无需添加任何缓冲盐。对于DMPP标记的脂肪酸，采用MRM的方式进行定量，碰撞气为氮气。采取适合的串联质谱碰撞电压进行。一般选取20%-40%的碰撞能量。
本发明在脂肪酸和多肽蛋白质的比较分析方面有以下几个优点：
首先，本发明用于特异性的标记待测物的羧基，在质谱的分析过程中更有针对性，在一定程度上也降低了质谱分析的复杂性。结合6Da的差异能够更好的用于识别标记产物。相比传统标记试剂（PP），我们设计合成的DMPP能够更显著地提高待测物的信号。在蛋白质的标记分析中，各个酶解肽段均能与轻质的和重质的标记试剂高效率的反应，产生一对质荷比相差6Da（单羧基）,或12Da(双羧基)等的质谱峰。
其次，该同位素标记试剂合成路线简单，使标记产物分子量有较大的提高，很好的避免了质谱检测低分子量区域的信号干扰，标记产物很稳定，在质谱分析时不会产生干扰图谱解析的碎片离子。同时，采用同位素试剂标记的内标，避免购买昂贵的且不易得到的内标，减少了实验成本。而该标记反应更是有着标记速度快，显著提高产物质谱响应强度，产物本底噪音低，无质谱残留，等诸多优点，而体系中所含的其他试剂，如胰蛋白酶、碳酸氢铵等也并不会影响标记反应的结果。。
最后，DMPP标记产物既可以采用质谱直接分析，也可以结合液相色谱质谱联用的技术，使更多低峰度的待测物被有效的检测出来，大大的提高了分析的选择性和实用性。
附图说明
图1是DMPP的标记过程示意图。
图2a是18种脂肪酸分别在标准反应条件下与轻重DMPP的混合标记产物质谱图，b是相同摩尔浓度下的商品化标记试剂PP标记的以及DMPP标记的脂肪酸混合物的质谱图。
图3a、b分别是轻重DMPP标记的硬脂酸的串联质谱图。
图4DMPP标记脂肪酸产物的稳定性（a-d分别为一至四周的质谱分析结果）。
图5a、b分别是轻质DMPP标记多肽n和a与其未标记多肽的混合物质谱图。
图6a、b分别是是轻质与重质DMPP标记多肽n和a等摩尔混合物质谱图。
图7是牛血清白蛋白BSA的酶解肽段的质谱图（a为轻质DMPP标记酶解肽段，b重质DMPP标记酶解肽段）。
图8是多肽n的MALDI-TOF-TOF MS串联质谱图（a为轻质DMPP标记肽段，b重质DMPP标记肽段）。
图9a、b分别是未标记的溶菌酶lysozyme和牛血清白蛋白BSA与其轻质DMPP标记产物的混合物的质谱图。
具体实施方法
以下具体实施方法将有助于理解本发明，但并不限制本发明的内容。
1.试剂合成部分
实施例1：[d0]-或[d6]-2，4-二甲氧基-6-哌嗪基嘧啶，（简写为[d0]-/[d6]-DMPP）的合成。
操作步骤如下：
将Boc保护的哌嗪(373mg,2mmol)和碳酸钾(304mg,2.2mmol)溶于适量的20ml无水DMF中，并向该溶液中逐滴加入2，4，6-三氯嘧啶(0.23ml,2mmol)，并温和的搅拌。室温反应10小时后，倾入水中淬灭反应，并用二氯甲烷提取得到粗产品2，4-二氯-6-Boc哌嗪基嘧啶(466mg,1.4mmol)。150mg金属钠溶于15mL无水甲醇中配置成甲醇钠溶液。将2，4-二氯-6-Boc哌嗪基嘧啶溶于10mL无水甲醇中，再逐步滴加到已配好的甲醇钠溶液中，搅拌过夜，反应液置于25℃下搅拌过夜，然后过滤浓缩，再溶解于20mL去离子水中，用二氯甲烷萃取3次，每次20mL。合并有机相，用硫酸钠干燥后旋干，可得[d0]-2，4-二甲氧基-6-Boc哌嗪基嘧啶的粗产物。以氘代甲醇（methanol-d4）代替上述步骤中的无水甲醇合成[d6]-产物。可得[d6]-的粗产物。将[d0]-或[d6]-粗产物经柱层析分离的粗产品，并加入80%三氟乙酸的二氯甲烷溶液，搅拌5小时，减压蒸干反应溶剂，用碳酸氢铵水溶液调节pH至中性，析出的固体用异丙醚进行洗涤，得到轻、重同位素标记试剂-[d0]-或[d6]-2，4-二甲氧基-6-哌嗪基嘧啶的白色固体(183mg,40%)。
2.试剂应用部分
应用原理如附图1所示：
实施例1：含羧基小分子的标记效果
操作步骤如下：
1.配置一系列18种脂肪酸和其他六种酸（胆酸、石胆酸、脱落酸、维生素A酸，唾液酸（N-乙酰神经氨酸），以及绿原酸）的乙醇溶液250pmol/μL，并以此为反应底物。
2.向4μL的上述溶液中加入8μL甲醇溶解的标记试剂DMPP(30nmol/μL)，以及3μL的HOAt(15nmol/μL),并以70μL甲醇作为反应溶剂，最后加入7μL甲醇溶解的新鲜EDC(15nmol/μL),在室温下涡旋20秒。
3.之后需将反应体系快速氮气吹干，并用含0.1%三氟乙酸的50%乙腈水25μL溶解标记底物。
4.制备新鲜的氨转型的强酸性阳离子交换树脂，首先，将732树脂（凝胶型）去离子水浸泡洗涤多次之后，至洗脱液呈中性，之后浸泡于去离子水中溶胀12小时，然后将树脂浸于4%的盐酸溶液中酸化4小时，而后去离子水洗至中性，反复三次，最后将树脂浸于10%的氨水中氨化转型4小时，而后去离子水洗至中性，之后将树脂浸于5%的氨水中浸泡待用，使用前取适量去离子水洗至中性。
5.向上述溶液中加入等体积的新鲜制备的氨转型的强酸性阳离子交换树脂，静置片刻，用乙醇对树脂进行超声洗涤5分钟，分三次，每次加入量为800μL，合并洗脱液。适当浓缩后，加入等量的重质DMPP的标记产物，合并上述溶液即可进行LC-MS/MS分析，采用Agilent Zorbax SB-C8,2.1×100mm,1.8μm,USA，质谱仪为6410A,和6538Q-TOF MS。喷雾气压30psi,雾化气温度350℃，电压4000V。流动相A相：水；B相：乙腈，洗脱梯度：0-10min，B相75-83%，10-11min，B相83-95%，11-25min，B相95-95%，流速：0.3mL/min，进样量10μL。其余六种酸采用，Agilent poreshell,SB-C18,2.1×100mm,2.7μm,USA，质谱仪为6410A,喷雾气压30psi,雾化气温度350℃，电压4000V。流动相A相：水；B相：乙腈，洗脱梯度：0-4min，B相30-90%，4-20min，B相90-90%流速：0.3mL/min。
LC-MS/MS的分析结果如下：
1.DMPP标记结果如图2所示，18种脂肪酸呈现等比例的质谱峰，脂肪酸的羧基均与轻质、重质标记试剂发生了反应，且分别产生了质量增加206Da和212Da的质谱峰。且低分子量区域背景噪音较低，不会对高分子量区域造成干扰。与传统的标记试剂PP相比，DMPP标记产物产生4-5倍更强的信号峰。由此说明了DMPP能够更好的提高底物的质谱响应并将非常有利于低峰度脂肪酸的分析检测。而强酸性阳离子交换树脂能够显著的吸附过量的衍生化试剂，显著降低背景噪音，和离子抑制效应，提高产物质谱响应。
2.如图3所示，轻重DMPP标记的脂肪酸和其他六种酸（胆酸、石胆酸、脱落酸、维生素A酸，唾液酸（N-乙酰神经氨酸），以及绿原酸）在串联质谱中产生高丰度的产物离子m/z 225和m/z 231，采用MRM的模式分别选取合适的碰撞能量，将他们作为定量离子，能够大幅度提高其质谱响应，具体结果如表1和表2所示，其中绿原酸需采用丰度更强的产物离子m/z 163.3作为定量离子。
3.连续四周考察衍生化产物的稳定性（保存在4℃冰箱中），如图4所示，可见棕榈酸C16:0的稳定性很高，其质谱信号没有明显的下降，这将非常有利于样品的保存和长期分析。
表1.18种脂肪酸的LC-MS/MS分析结果
表2.胆酸、石胆酸、脱落酸、维生素A酸，唾液酸，以及绿原酸的分析结果
实施例2：多肽的比较分析
操作步骤如下：
1.将牛血清白蛋白置于含有0.04-0.05M的碳酸氢铵，pH 8.0-8.5的水溶液中进行热变性10min.
2.冷却至室温后，按重量比50：1向此溶液中加入胰蛋白酶，在37℃酶解12-16小时。
3.将酶解产物以及标准多肽a和n分成两份，两部分别与轻质、重质标记试剂DMPP反应,溶剂为乙腈，与实例1执行相同的后处理步骤，但无进行树脂吸附等后续步骤，之后直接进行质谱分析。
4.MALDI-TOF MS的分析条件是：所有采集条件均是在正离子的模式下进行，点样基质CHCA溶剂为0.1%三氟乙酸的50%乙腈水。
MALDI-TOF MS的分析结果如下：
1.如图5所示，通过对比等浓度DMPP标记的多肽a和n的标记产物和未标记底物，标记多肽显著提高多肽的质子化效率，而过量的衍生化试剂本身被基质所抑制，不会对高分子量区域的多肽造成明显的影响。
2.将轻重DMPP标记的多肽等比例混合，进行MALDI质谱分析，如图6所示，轻重多肽呈现等比例丰度的质谱峰，证明了该方法在多肽相对定量上的潜力，此外，因为羧基对于多肽的普遍性，采用这种同位素比对的方法，也为微量多肽的识别提供了良好的方案。
3.如图7所示，在DMPITC所标记的BSA酶解产物的质谱图中检测到了多对（6Da的倍数）的质谱峰,通过比较可以看到所有多肽均被标记，且根据轻重标记肽的质量差异便可以知道多肽羧基数量。
4.采用质谱直接分析的策略，节省了分析时间，提高了效率，此外，通过轻重质量差异的（方框中所示）对比检测方法，可以很好的避免其他杂质的干扰。
5.通过对比轻重DMPP标记多肽的碎片如b,y离子，如图8所示，能够很好的验证多肽序列，以及确定多肽中酸性残基的位点，这为多肽的高准确度测序提供了一个良好的手段。
实施例3：蛋白的标记
操作步骤如下：
1.与实例1相同，未变性的蛋白质(溶菌酶lysozyme、牛血清白蛋白BSA)与轻质标记试剂反应，并执行相同的后处理步骤。
2.将相同浓度的未标记蛋白质与已标记的蛋白相混合。
3.MALDI-TOF MS的分析条件是：所有采集条件均是在正离子的模式下进行，激光能量适当增加20%，检测模式为线性，点样基质SA溶剂为0.1%三氟乙酸的50%乙腈水。
MALDI-TOF MS的分析结果如下：
1.如图9所示，牛血清白蛋白和溶菌酶均完全被标记，且与未标记的原始蛋白相比较，峰面积均提高五倍以上，对于低峰度蛋白检测十分有利。
2.被标记上的DMPP数量与蛋白的原始羧基数量十分接近，据此也可以用来研究蛋白质的羧基数量，为蛋白质的结构分析提供一种研究手段。
Claims (9)
1.一种哌嗪基嘧啶类同位素标记试剂的用途，哌嗪基嘧啶类同位素标记试剂具有如下结构式：
[d0]-DMPP,X＝H
[d6]-DMPP,X＝D
，其中，X＝H或D，其特征是用于含羧基有机化合物的快速标记及质谱分析。
2.如权利要求1所述的用途，其特征是采用下述步骤：
a)在乙醇或水溶液中，含羧基的有机化合物的目标分析物，无需任何分子转化直接与轻质的同位素标记试剂[d0]-2，4-二甲氧基-6-哌嗪基嘧啶或重质的同位素标记试剂[d6]-2，4-二甲氧基-6-哌嗪基嘧啶反应进行标记；
b)对于小分子脂肪酸化合物，将标记后的样品经过或不经过强酸性阳离子树脂除杂，进行液相色谱质谱分析。
3.如权利要求2所述的用途，其特征是所述的含羧基的有机化合物是脂肪酸、多肽或蛋白质。
4.如权利要求2所述的用途，其特征是所述的步骤是在一对目标分析物乙醇、乙腈或水溶液中分别加入一对同位素标记试剂，即轻质的和重质的同位素标记试剂于室温下反应20秒，氮气吹干后，再用适量的含0.1％三氟乙酸的50％乙腈水溶解，将标记后的样品经过或不经过强酸性阳离子树脂除杂进行液相色谱质谱分析或基质辅助激光解析MALDI质谱分析。
5.如权利要求4所述的用途，其特征是所述的反应需加入30nmol/μL的标记试剂8μL进行标记反应，且需要加入3μL的1-羟基-7-偶氮苯并三氮唑15nmol/μL催化剂和7μL的1-乙基-3-(3-二甲胺丙基)碳二亚胺盐酸盐15nmol/μL缩合剂，氮气吹干溶剂的方式结束标记反应。
6.如权利要求5所述的用途，其特征是所述的目标分析物为脂肪酸化合物时，在70μL甲醇中分别与轻重标记试剂进行标记反应，标记后的样品经过强酸性阳离子树脂除杂，然后进行液相色谱质谱分析；目标分析物为多肽或蛋白质时，经过热变性、酶解后在70μL乙腈溶液中分别与轻重标记试剂进行标记反应，标记后的样品不经过强酸性阳离子树脂除杂直接进行基质辅助激光解析MALDI质谱分析。
7.如权利要求6所述的用途，其特征是所述的液相色谱质谱所用的条件是：所有图谱的采集均是在正离子的模式下进行，流动相：水和乙腈；碰撞气为氮气，碰撞能量为25-40eV。
8.如权利要求6所述的用途，其特征是所述的液相色谱质谱分析，选取产物离子m/z 225.1和m/z 231.1作为定量离子；通过观察标记的脂肪酸的成对质谱峰进行识别，并根据其相对峰面积即可定量分析。
9.如权利要求6所述的用途，其特征是所述的液相色谱质谱分析包括下列步骤：a)脂肪酸分别与轻重标记试剂反应，后处理后进行LC-MS/MS分析，并选取产物离子m/z 225.1和m/z 231.1作为定量离子。
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