CN101339187A - 甲砜基嘧啶类同位素标记试剂、合成方法及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种甲砜基嘧啶类稳定同位素标记试剂的设计、合成方法及其在蛋白质比较分析中的应用。本发明所述的同位素标记试剂化学名为[d6]-4,6-二甲氧基-2-甲砜基嘧啶。该试剂应用于半胱氨酸、含半胱氨酸的多肽以及蛋白质的定性和相对定量分析,此方法包括下列步骤:a)目标分析物经变性、还原、酶解;b)目标分析物与前述轻质或重质的同位素标记试剂反应;c)将标记后的样品溶液直接进行MALDI-TOF MS分析。
Description
技术领域
本发明涉及一种甲砜基嘧啶类稳定同位素标记试剂的设计、合成方法及其在蛋白质比较分析中的应用,特别是结合基质辅助激光解吸离子化-飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)方法,实现快速、高效、灵敏的差异蛋白质组学分析。
技术背景
蛋白质组学是继基因组学后生命科学领域最具前景的新兴学科之一,其研究最初的目标是找到方法以大规模分离并鉴定蛋白质,摆脱以往只能研究单个或少数蛋白质状态,目前已形成相对成熟的技术和有效的研究手段。随着工作的不断深入,人们已不再满足于对一个混合体系中的蛋白质进行定性分析,要求更加准确的定量分析,其中一项关键内容,就是通过比较正常与异常细胞或组织中蛋白质表达水平的差异,进而找到此环境下密切相关的差异蛋白所引发的疾病,从而为临床诊断、病理研究、新药开发等提供理论依据(参见Biotechnol.Genet.Eng.Rev.1996,13,19-50;Trends Biochem.Sci.2006,31,473-484)。
过去,主要采用二维差异凝胶电泳(DIGE)技术,来实现蛋白质差异表达研究(参见Proteomics 2001,1,377-396)。但是作为分离手段的二维凝胶电泳,有着其固有的缺点,如对于分离强酸性及强碱性蛋白,含量低的蛋白,及某些膜蛋白,结果都不能令人满意,同时这种方法的自动化程度难以提高,再加上其在进行蛋白比较分析方面的局限性(参见Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.2000,17,9390-9395;Trends Anal.Chem.2003,22,273-281),都促使了新方法的发展和应用。
近年来,随着质谱技术的发展,特别是软电离技术-电喷雾电离(ESI)和基质辅助激光解吸电离(MALDI)的出现和发展,使得质谱成为蛋白组学研究中日益重要的分析手段。其中,适合于质谱检测的同位素标记方法很令人关注。这种同位素标记方法包括体内和体外标记两种。体内标记是在培养液中引入同位素标记部分(参见Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.1999,96,6591-6596;Mol.Cell.Proteomics 2002,1,376-386),其应用范围有限,不能直接对从组织中提取的细胞进行分析;而体外标记中,同位素标记部分是在分析过程中引入,因其应用所受到的限制较少,所以近年来受到重视。其中,最早出现的稳定同位素亲和标记(ICAT)试剂是目前应用最广泛的同位素标记试剂(参见Nat.Biotechnol.1999,10,994-999),并且已经商品化,蛋白的标记、分离都可以依赖ICAT试剂来实现。然而在实际应用过程中也出现了许多问题,如标签部分质量过大,影响多肽的检测以及增加数据库搜索的复杂性;非特异性吸附、不可逆吸附和容量低等缺陷。此后一系列改良的ICAT试剂和其它类型的标记试剂不断的涌现(参见Nat.Biotechnol.2002,20,512-515;Anal.Chem.2002,74,4969-4979;Mol.Cell.Proteomics 2004,3,1154-1169),使质谱技术在蛋白质定量研究方面的能力大大提高。然而这些技术依然存在许多不完善之处,比如:同位素标记试剂高昂的成本,标记效率的有限性及后续的分离检测过程引入的定量误差等。
发明内容
本发明要解决的问题是:1)提供一种甲砜基嘧啶类同位素标记试剂;2)提供上述同位素标记试剂中重质试剂的合成方法;3)提供上述同位素标记试剂在蛋白质比较分析中的应用方法。
本发明方法涉及到的这种同位素标记试剂,化学名为[d0]-/[d6]-4,6-二甲氧基-2-甲砜基嘧啶(简写为[d0]-/[d6]-DMMSP),其结构如下:
A为甲砜基部分,作为同位素标记的活性部位,用来特异性标记蛋白质或者多肽片段结构中的半胱氨酸残基;
B为嘧啶环部分,作为提高质谱信号的功能部位,用来提高目标多肽或蛋白质的离子化效率,进一步增强质谱响应值;
C为两个甲氧基部分,作为同位素质量标签部位,含有6个氢/氘,用于基于质谱的蛋白质比较分析。
本发明所涉及的重质同位素标记试剂-[d6]-DMMSP,其合成方法如下式所示:
4,6-二氯-2-甲硫基嘧啶溶于无水氘代甲醇(methanol-d4)中,逐步滴加到氘代甲醇钠溶液中。其中氘代甲醇钠溶液是通过金属钠溶于无水氘代甲醇中制备而成的。反应液在室温下搅拌过夜,温度优选为25℃,时间优选为8小时,过滤浓缩,然后溶解在去离子水中,用二氯甲烷萃取。合并有机相,干燥,优选无水硫酸钠,旋干,可得到中间体-[d6]-4,6-二甲氧基-2-甲硫基嘧啶的粗产物。
将上一步骤中的粗产物溶于无水二氯甲烷,加入3-氯过氧苯甲酸(mCPBA),两种底物的摩尔比优选为1∶4。混合物在室温下搅拌,温度优选为30℃,时间优选为5小时,之后用饱和硫代硫酸钠水溶液淬灭反应。有机相用饱和碳酸氢钠水溶液洗涤,合并水层,用二氯甲烷萃取。然后合并有机相,干燥,优选无水硫酸镁,旋干,得到最终的粗产品。经过柱层析,得到重质同位素标记试剂一[d6]-4,6-二甲氧基-2-甲砜基嘧啶([d6]-DMMSP)。
本发明提供了一种将上述试剂应用于半胱氨酸、含半胱氨酸的多肽以及蛋白质的定性和相对定量分析中的方法,此方法包括下列步骤:
a)目标分析物经变性、还原、酶解;
b)目标分析物与前述轻质或重质的同位素标记试剂反应;
c)将标记后的样品溶液直接进行MALDI-TOF MS分析。
上述测定方法优选的反应条件如下:
所述的a)步骤是将目标分析物(一对)置于缓冲溶液中,加入变性剂和还原剂,进行蛋白质的变性和还原后,将溶液稀释之后加入胰蛋白酶酶解;所述的b)步骤是在目标分析物溶液中分别加入一对同位素标记试剂,反应两小时,所述的c)步骤是将反应后的样品溶液等量混合,进行MALDI-TOF MS分析。
上述的目标分析物可以是半胱氨酸、含半胱氨酸的肽、标准蛋白质、蛋白质混合物或不同生理状态下的生物体蛋白提取物。
所述的缓冲溶液中优选含有0.03M的碳酸氢铵,pH 8.2,优选将目标分析物置于此溶液中进行变性和还原。
所述的变性剂优选是尿素,加入量为浓度8M。所述的还原剂优选是二硫苏糖醇(DTT),加入比例优选是二十倍的蛋白摩尔数。变性还原条件优选是37℃,6小时。
所述的样品溶液优选在1mg/mL的浓度下完成变性和还原操作,然后在稀释至0.5mg/mL的浓度下,按重量比50∶1加入胰蛋白酶,在37℃酶解8小时。
所述的标记反应优选在pH 6.5条件下进行,酶解过程完成后,用乙酸进行pH值的调整。
所述的还原、变性、酶解过程及标记反应优选在恒温恒湿箱内完成。
MALDI-TOF MS分析所用的优选条件是:基质为α-氰基-4-羟基肉桂酸(α-CHCA),溶于含0.1%三氟乙酸的1∶1乙腈/水溶液中,浓度为6mg/mL;数据采集均在正离子、反射模式下进行。
之后图谱解析,进行定性及相对定量分析。
本发明在半胱氨酸、含半胱氨酸的肽、蛋白质定性与相对定量研究中有以下几个优点:首先,本发明用于特异性标记半胱氨酸的巯基侧链,在质谱分析的过程中更有针对性,在一定程度上降低了图谱解析的复杂程度。在蛋白质鉴定时,只有含有半胱氨酸的多肽片断在标记反应完成后,能够产生138Da的质量位移(“轻”同位素标记),通过标记前后图谱的比较,很容易确认哪些多肽片断是含有半胱氨酸的,以及含有几个半胱氨酸。而在蛋白质相对定量时,分析的目标主要是寻找质荷比相差6Da的成对出现的多肽信号,它们的相对强度比反映了实际样品中蛋白质的浓度比。
其次,此发明的标记部分相对较小(138Da),结构相对简单,性质比较稳定,在质谱分析时不会产生干扰图谱解析的碎片离子,也不会使数据库的检索复杂化。同时,由于标记试剂分子中含有嘧啶环,标记后可以增加半胱氨酸残基的碱性,提高目标肽段的质谱信号,有利于提高蛋白质鉴定或比较分析结果的可信性和准确性。
最后,本发明中采用直接MALDI-TOF MS分析方法,操作简便,样品不经任何分离纯化步骤,降低了由此带来的影响相对定量结果的误差。体系中含有胰蛋白酶、过量的变性剂(尿素)、还原剂(DTT)以及标记试剂,这些物质的存在不会影响蛋白质的鉴定以及相对定量结果的准确性。
附图说明
图1是应用时的步骤示意图。
具体实施方法
以下具体实施方法将有助于理解本发明,但并不限制本发明的内容。
1.试剂合成部分
实施例1:[d6]-4,6-二甲氧基-2-甲砜基嘧啶([d6]-DMMSP)的合成
操作步骤如下:
4,6-二氯-2-甲硫基嘧啶(500mg,2.5mmol)溶于10mL无水氘代甲醇中,逐步滴加到20mL氘代甲醇钠溶液中(200mg金属钠溶于20mL无水氘代甲醇)。反应液在25℃下搅拌过夜后,过滤浓缩,然后溶解在10mL去离子水中,用二氯甲烷萃取(3×5mL)。合并有机相,硫酸钠干燥,旋干,可得到[d6]-4,6-二甲氧基-2-甲硫基嘧啶的粗产物。
将[d6]-粗产物(400mg,2.1mmol)溶于40mL无水二氯甲烷,加入3-氯过氧苯甲酸(mCPBA,1.4g,8mmol)。混合物在30℃下搅拌5小时后,用饱和硫代硫酸钠水溶液淬灭反应。有机相用饱和碳酸氢钠水溶液洗涤(3×20mL),合并水层,用二氯甲烷萃取(3×40mL)。然后合并有机相,用无水硫酸镁干燥,旋干,得到最终的粗产品。经过柱层析(乙酸乙酯∶正己烷=1∶3),得到重质同位素标记试剂——[d6]-4,6-二甲氧基-2-甲砜基嘧啶([d6]-DMMSP,400mg,67%,白色固体)。
2.试剂应用部分
应用原理如下式:
实施例2:混合多肽的标记反应
操作步骤如下:
1.多肽混合物:His-Cys-Lys-Phe-Trp-Trp(HW-6),angiotensin I human acetate hydrate(DL-10),[Glu1]-fibrinopeptide B human(ER-14)和neurotensin(EL-13)各1μmol,溶于500μL的0.03M的碳酸氢铵缓冲溶液中(pH 8.0-8.2),加入二硫苏糖醇(DTT)2μmol,用醋酸溶液调节pH至6.5。
2.向配好的多肽溶液中加入[d0]-DMMSP(5μmol),修饰反应在37℃恒温恒湿箱中进行2小时。
3.MALDI-TOF MS分析条件为:基质α-氰基-4-羟基肉桂酸(α-CHCA),溶于含0.1%三氟乙酸的1∶1乙腈/水溶液中,浓度为6mg/mL;数据采集在正离子、反射模式下进行。
MALDI-TOF MS分析结果如下:
1.只有含半胱氨酸残基的多肽(HW-6)的[M+H]+峰消失,发生了标记反应,质量增加了138Da;而其余不含半胱氨酸残基的多肽(DL-10、ER-14和EL-13)的[M+H]+峰都可以检测到,没有被标记。这说明标记试剂对于多肽片段中半胱氨酸残基的巯基侧链具有很高的特异性,且反应完全、活性高。
2.进行标记反应以后,含半胱氨酸残基的多肽(HW-6)信号大幅增强,而其余不含半胱氨酸残基的多肽信号受到明显抑制,峰强度很低。说明标记试剂的巯基特异性反应可以提高目标肽段的质谱响应能力,有利于低丰度蛋白质的检测和分析。
实施例3:蛋白质的比较分析
实验步骤如附图1所示。
操作步骤如下:
1.两份溶菌酶标准品0.9mg和1mg分别溶于500μL 30mmol/L碳酸氢铵缓冲溶液中(pH 8.0-8.2,内含8M尿素),再分别加入DTT 2μmol,置于37℃恒温恒湿箱中保温6小时。
2.冷却后,两份溶菌酶溶液分别用30mmol/L碳酸氢铵缓冲溶液(pH 8.0-8.2)稀释至1mL,按胰蛋白酶/溶菌酶为1∶50(w/w)的比例加入胰蛋白酶溶液,置于37℃恒温恒湿箱中酶解过夜。
3.两份溶菌酶酶解产物分别用30mmol/L碳酸氢铵缓冲溶液(pH 8.0-8.2)稀释至2mL,用醋酸溶液调节pH至6.5后,向第一份酶解产物溶液中加入[d0]-DMMSP(5μmol),第二份酶解产物溶液中加入[d6]-DMMSP(5μmol),共同放置于37℃恒温恒湿箱中,2小时后进行等体积混合,稀释后进行质谱分析。
4.MALDI-TOF MS分析条件为:基质α-氰基-4-羟基肉桂酸(α-CHCA),溶于含0.1%三氟乙酸的1∶1乙腈/水溶液中,浓度为6mg/mL;数据采集在正离子、反射模式下进行。
MALDI-TOF MS分析结果如下:
1.通过对酶解产物的MALDI-TOF MS分析,获得了溶菌酶的典型酶解片段的信号,共有16条肽段被检测出,其中9条为含有半胱氨酸的多肽。肽段的归属是应用ExPASyMolecular Biology Server上的PeptideMass工具进行检索得到的(http://cn.expasy.org/tools/)。
2.进行同位素标记以后,上述9条含有半胱氨酸的多肽质荷比(m/z)都增加了138Da([d0]-DMMSP标记)或144Da([d6]-DMMSP标记);而其它不含半胱氨酸的多肽质荷比(m/z)不变。
3.在MALDI-TOF MS图谱中,检测到一系列相邻并成对出现的信号,质量数相差6Da,每一对峰即对应着一个被标记的半胱氨酸肽段(m/z为肽段分子量+标记部分分子量138/144Da)。每一对多肽信号的强度比值与样品溶液中溶菌酶的含量比值一致,定量的误差小于4%。
Claims (12)
1.一种甲砜基嘧啶类同位素标记试剂,化学名为[d6]-4,6-二甲氧基-2-甲砜基嘧啶,其结构式如下:
2.如权利要求1所述的甲砜基嘧啶类同位素标记试剂的合成方法,其特征是通过下述步骤合成:
4,6-二氯-2-甲硫基嘧啶溶于无水氘代甲醇中,逐步滴加到氘代甲醇钠溶液中,其中氘代甲醇钠溶液是通过金属钠溶于无水氘代甲醇中制备而成的,反应液在室温下搅拌8小时;过滤浓缩,然后溶解在去离子水中,用二氯甲烷萃取;合并有机相,干燥,旋干,得到中间体-[d6]-4,6-二甲氧基-2-甲硫基嘧啶的粗产物;将上述的粗产物溶于无水二氯甲烷,加入3-氯过氧苯甲酸,混合物在室温下搅拌2小时,之后用饱和硫代硫酸钠水溶液淬灭反应;有机相用饱和碳酸氢钠水溶液洗涤,合并水层,用二氯甲烷萃取;然后合并有机相,干燥,旋干,得到最终的粗产品;再经过柱层析,得到重质同位素标记试剂-[d6]-4,6-二甲氧基-2-甲砜基嘧啶。
3.一种如权利要求1所述的甲砜基嘧啶类同位素标记试剂的用途,其特征是用于半胱氨酸、含半胱氨酸的多肽或蛋白质的定性和相对定量分析。
4.如权利要求3所述的用途,其特征是采用下述步骤:
a)目标分析物半胱氨酸、含半胱氨酸的多肽或蛋白质经变性、还原、酶解;
b)目标分析物与轻质的同位素标记试剂[d0]-4,6-二甲氧基-2-甲砜基嘧啶或重质的同位素标记试剂[d6]-4,6-二甲氧基-2-甲砜基嘧啶反应;
c)将标记后的样品溶液直接进行基质辅助激光解吸离子化-飞行时间质谱分析。
5.如权利要求4所述的用途,其特征是所述的a)步骤是将目标分析物(一对)置于缓冲溶液中,加入变性剂和还原剂,进行蛋白质的变性和还原后,将溶液稀释之后加入胰蛋白酶酶解;所述的b)步骤是在目标分析物溶液中分别加入一对同位素标记试剂即轻质的同位素标记试剂[d0]-4,6-二甲氧基-2-甲砜基嘧啶和重质的同位素标记试剂[d6]-4,6-二甲氧基-2-甲砜基嘧啶反应两小时,所述的c)步骤是将b)步骤反应后的二种样品溶液等量混合,进行基质辅助激光解吸离子化-飞行时间质谱分析。
6.如权利要求5所述的用途,其特征是所述的目标分析物是半胱氨酸、含半胱氨酸的多肽、标准蛋白质、蛋白质混合物或不同生理状态下生物组织的蛋白提取物。
7.如权利要求5所述的用途,其特征是所述的缓冲溶液中含有0.03M的碳酸氢铵,pH 8.2,将目标分析物置于此溶液中进行变性和还原。
8.如权利要求5所述的用途,其特征是所述的变性剂是尿素,加入量为浓度8M;所述的还原剂是二硫苏糖醇,加入比例是二十倍的蛋白摩尔数;变性还原条件是37℃,6小时。
9.如权利要求5所述的用途,其特征是所述的样品溶液在1mg/mL的浓度下完成变性和还原操作,然后在稀释至0.5mg/mL的浓度下,按重量比50∶1加入胰蛋白酶,在37℃酶解8小时。
10.如权利要求5所述的用途,其特征是所述的标记反应在pH 6.5条件下进行,酶解过程完成后,用乙酸进行pH值的调整。
11.如权利要求5的用途,其特征是所述的还原、变性、酶解过程及标记反应均在恒温恒湿箱内完成。
12.如权利要求5所述的用途,其特征是基质辅助激光解吸离子化-飞行时间质谱分析所用的条件是:基质为α-氰基-4-羟基肉桂酸,溶于含0.1%三氟乙酸的1∶1乙腈/水溶液中,浓度为6mg/mL;数据采集均在正离子、反射模式下进行。
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Open date: 20090107 |