CN109180591A - 一种稳定同位素标记试剂及其制备方法 - Google Patents

一种稳定同位素标记试剂及其制备方法 Download PDF

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CN109180591A CN201810994177.6A CN201810994177A CN109180591A CN 109180591 A CN109180591 A CN 109180591A CN 201810994177 A CN201810994177 A CN 201810994177A CN 109180591 A CN109180591 A CN 109180591A
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王伟
雷雯
杜晓宁
徐建飞
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Abstract

本发明涉及一种稳定同位素标记试剂及其制备方法，该试剂包括[d3]‑6‑(1‑哌嗪基)‑4‑甲氧基嘧啶和[d0]‑6‑(1‑哌嗪基)‑4‑甲氧基嘧啶，制备时，首先将1‑Boc‑哌嗪与4，6‑二氯嘧啶反应生成4‑氯‑6‑Boc哌嗪基嘧啶；将其与新鲜配制的甲醇钠/氘代甲醇钠反应生成[d0]/[d3]‑4‑甲氧基‑6‑Boc哌嗪基嘧啶粗产物；将所得粗产物经柱色谱分离纯化后，在三氟乙酸的二氯甲烷溶液中脱去Boc保护基团，即得本发明所述的同位素标记试剂。本发明制备的稳定同位素标记试剂[d0]/[d3]‑6‑(1‑哌嗪基)‑4‑甲氧基嘧啶经分离纯化后化学纯度达98％以上，同位素丰度达99atom％D以上。

Description

一种稳定同位素标记试剂及其制备方法
技术领域
本发明涉及稳定同位素标记化合物领域，具体涉及一种稳定同位素标记试剂及其制备方法。
背景技术
代谢组学(metabonomics)在20世纪90年代中期提出并迅速地发展起来，是继基因组学、转录组学和蛋白质组学之后，系统生物学的重要组成领域。基因组学、转录组学、蛋白质组学和代谢组学等各种“组学”在生命科学领域中发挥了重要的作用，它们分别从调控生命过程的不同层面进行研究，使人们能够从分子水平研究生命现象，探讨生命的本质，逐步系统地认识生命发展的规律。近年来，代谢组学得到迅速发展并渗透到多项领域，比如疾病诊断、医药研制开发、营养食品科学、毒理学、环境学、植物学、精准医疗等与人类生命安全、健康护理密切相关的研究领域。代谢组学是一门“在新陈代谢的动态进程中，系统研究代谢产物的变化规律，揭示机体生命活动代谢本质”的科学，其主要研究对象是各种代谢路径的底物和产物的小分子代谢物，而这些小分子物质在生物体内的代谢通路如TCA(三羧酸) 循环中起着至关重要的作用，是正常生理过程、病理过程以及对治疗干预的药理学反应的重要指标。随着代谢组学在疾病诊断、精准医疗、致病机理研究等方面研究的深入，对小分子物质含量的准确定量日益重要。
通常，代谢组学研究的生物样本主要是血样、尿液、组织、植物提取物以及一些微生物样本，质谱(MS)以其广泛的适用面和极高的灵敏度和特异性为复杂基质中的小分子化合物的检测提供了一个强大的分析工具。但是这些小分子物质种类多且复杂，并且含量较低，基质对分析和测定的干扰较大，在质谱中直接进样检测分析往往难以达到理想的检测要求。
在基于质谱的同位素稀释质谱法中，利用稳定同位素标记试剂对样品进行衍生化处理解决了多种化合物的定性和定量问题。通过化学反应将被测组分转化为衍生物，改变目标化合物的结构和性质，可以使待测组分在色谱分析中增强其在色谱柱上的保留能力，从而拥有更好的色谱峰形和分离效果，并在质谱检测中得到更好的响应值，进而在进样检测中为小分子代谢物的准确定量提供了有力支持。
基于以上对于小分子代谢物的定量检测技术要求，需要对该稳定同位素标记衍生化试剂进行合成生产以致力于实际应用。
发明内容
本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种稳定同位素标记试剂[d0]/[d3]-6-(1-哌嗪基)-4-甲氧基嘧啶及其制备方法。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：一种稳定同位素标记试剂，该试剂为包括[d3]-6-(1-哌嗪基)-4-甲氧基嘧啶和[d0]-6-(1-哌嗪基)-4-甲氧基嘧啶，其中，所述[d3]-6-(1-哌嗪基)-4-甲氧基嘧啶为[d0]-6-(1-哌嗪基)-4-甲氧基嘧啶特定位点用氘取代氢的同位素标记试剂，所述试剂的化学结构式如下：
当X为H时，所述试剂为[d0]-6-(1-哌嗪基)-4-甲氧基嘧啶，当X为D时，所述试剂为[d3]-6-(1-哌嗪基)-4-甲氧基嘧啶。
本发明的试剂包括[d0]/[d3]-6-(1-哌嗪基)-4-甲氧基嘧啶，可应用在含羧基小分子代谢物的定性及准确定量分析中。在使用时，将衍生化试剂[d0]-6-(1-哌嗪基)-4- 甲氧基嘧啶与富集净化后的样品反应，[d3]-6-(1-哌嗪基)-4-甲氧基嘧啶与相对应的标准品反应，分别标记衍生后混合均匀后进入LC-MS分析。
该衍生化试剂可以用于多种含羧基基团化合物的同位素标记，利用胺基与羧基易发生缩合反应的特性，该衍生化试剂对于含羧基基团的化合物具有高度专一的标记特点；氘标记试剂与天然丰度试剂相比相差3Da的分子量，能够有效避免色谱中的同位素效应(5Da以上二者色谱峰容易分离)，同时作为同位素标签的内标试剂与天然丰度的试剂具有互相不干扰的质谱峰群，使得数据处理更为简便。
一种如上所述稳定同位素标记试剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将1-Boc-哌嗪与4，6-二氯嘧啶混合，反应生成4-氯-6-Boc哌嗪基嘧啶；
(2)将4-氯-6-Boc哌嗪基嘧啶溶于甲醇中，滴加甲醇钠反应生成[d0]-4-甲氧基-6-Boc哌嗪基嘧啶粗产物；将4-氯-6-Boc哌嗪基嘧啶溶于氘代甲醇中，滴加氘代甲醇钠反应生成[d3]-4-甲氧基-6-Boc哌嗪基嘧啶粗产物；
(3)将步骤(2)得到的[d0]-4-甲氧基-6-Boc哌嗪基嘧啶粗产物及[d3]-4-甲氧基-6-Boc哌嗪基嘧啶粗产物经柱色谱纯化，脱去Boc保护基团，即得所述试剂。其中，Boc为叔丁氧羰基。
本发明的工艺路线如下所示：
优选的，所述的1-Boc-哌嗪和4，6-二氯嘧啶在混合前均溶解于DMF溶剂中。
优选的，所述的1-Boc-哌嗪和4，6-二氯嘧啶的摩尔比为1：(1～6)。
优选的，所述的1-Boc-哌嗪和4，6-二氯嘧啶的反应温度为室温，反应时间为 6～16h。在该反应条件下，反应过程温和，且收率高。
优选的，所述的甲醇钠及氘代甲醇钠为新鲜配置的溶液，由金属钠溶于无水甲醇或无水氘代甲醇中配置得到，甲醇钠或氘代甲醇钠的溶液浓度为0.1～3mol/L。采用新鲜配置的甲醇钠溶液活性更高，可以使反应以较快速率进行。甲醇/氘代甲醇为反应溶剂，反应是将甲氧基取代氯基团，所以将Na与甲醇反应生成甲醇钠，利用醇钠与卤代烃的亲核取代反应，将-OCH3取代-Cl；在反应中，本着不引入多余物质的原则，故将反应溶剂定为甲醇。
优选的，所述的4-氯-6-Boc哌嗪基嘧啶与甲醇钠或氘代甲醇钠的摩尔比为1： (1～20)。
优选的，所述的4-氯-6-Boc哌嗪基嘧啶与甲醇钠或氘代甲醇钠的反应温度为 20～60℃，反应时间为6～16h。在该条件下反应温和，产率高。
与现有技术相比，本发明的有益效果体现在以下几方面：
(1)本发明操作过程简单，反应条件温和，合成过程不会造成同位素丰度的稀释，适用于稳定同位素标记试剂的合成；
(2)本发明所得的稳定同位素产品化学纯度98％以上，同位素丰度99atom％D 以上，且质量数差异在3个Da，能够有效避免色谱中的同位素效应，同时作为同位素标签的内标试剂与天然丰度的试剂具有互相不干扰的质谱峰群，满足同位素稀释质谱法定量检测含羧基小分子代谢物对内标试剂的要求；
(3)本发明具有良好的经济性和实际应用价值。
具体实施方式
下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1
稳定同位素标记试剂[d0]/[d3]-6-(1-哌嗪基)-4-甲氧基嘧啶的合成方法，该方法具体合成过程包括以下步骤：
在圆底烧瓶将1.49g(0.010mol)4，6-二氯嘧啶和1.51g(0.011mol)碳酸钾溶于50mL无水DMF中，在烧杯中将1.86g(0.010mol)1-Boc-哌嗪溶于50mL无水 DMF中，在缓慢搅拌下将1-Boc-哌嗪溶液滴加到烧瓶中，在25℃下回流反应6h，将反应液倾入水中猝灭反应，用二氯甲烷萃取3次，每次40mL，合并有机相，用无水硫酸镁干燥后旋干，即得到粗产物4-氯-6-Boc哌嗪基嘧啶；
将78.2mg(0.0034mol)金属钠溶于25mL无水甲醇/氘代甲醇中，配制成25mL 浓度为0.136mol/L的甲醇钠/氘代甲醇钠溶液；将1.0g(0.0034mol)4-氯-6-Boc哌嗪基嘧啶溶于50mL无水甲醇/氘代甲醇中，再逐步滴加到新鲜配制的25mL (0.136mol/L)甲醇钠/氘代甲醇钠溶液中，在20℃下搅拌回流16h，制得[d0]/[d3]-4- 甲氧基-6-Boc哌嗪基嘧啶的粗产物；
将[d0]/[d3]-4-甲氧基-6-Boc哌嗪基嘧啶粗产物经柱色谱分离纯化后，溶于50mL80％三氟乙酸的二氯甲烷中，室温下进行回流反应10小时；使反应体系冷却到室温，倾入水中猝灭反应，析出的固体即为轻、重同位素标记试剂——[d0]/[d3]-6-(1-哌嗪基)-4-甲氧基嘧啶(简写为[d0]/[d3]-MPP)36.9mg，收率为 5.6％，白色固体粉末，化学纯度98.18％，同位素丰度99.32atom％D。
实施例2
稳定同位素标记试剂[d0]/[d3]-6-(1-哌嗪基)-4-甲氧基嘧啶的合成方法，该方法具体合成过程包括以下步骤：
在圆底烧瓶将8.94g(0.060mol)4，6-二氯嘧啶和1.51g(0.011mol)碳酸钾溶于50mL无水DMF中，在烧杯中将1.86g(0.010mol)1-Boc-哌嗪溶于50mL无水 DMF中，在缓慢搅拌下将1-Boc-哌嗪溶液滴加到烧瓶中，在25℃下回流反应16h，将反应液倾入水中猝灭反应，用二氯甲烷萃取3次，每次40mL，合并有机相，用无水硫酸镁干燥后旋干，即得到粗产物4-氯-6-Boc哌嗪基嘧啶；
将1.56g(0.068mol)金属钠溶于25mL无水甲醇/氘代甲醇中，配制成25mL 浓度为2.72mol/L的甲醇钠/氘代甲醇钠溶液；将1.0g(0.0034mol)4-氯-6-Boc哌嗪基嘧啶溶于50mL无水甲醇/氘代甲醇中，再逐步滴加到新鲜配制的25mL (2.72mol/L)甲醇钠/氘代甲醇钠溶液中，在60℃下搅拌回流6h，制得[d0]/[d3]-4- 甲氧基-6-Boc哌嗪基嘧啶的粗产物；
将[d0]/[d3]-4-甲氧基-6-Boc哌嗪基嘧啶粗产物经柱色谱分离纯化后，溶于50mL80％三氟乙酸的二氯甲烷中，室温下进行回流反应1小时；使反应体系冷却到室温，倾入水中猝灭反应，析出的固体即为轻、重同位素标记试剂——[d0]/[d3]-6-(1-哌嗪基)-4-甲氧基嘧啶(简写为[d0]/[d3]-MPP)100.3mg，收率为 15.2％，白色固体粉末，化学纯度98.03％，同位素丰度99.52atom％D。
实施例3
稳定同位素标记试剂[d0]/[d3]-6-(1-哌嗪基)-4-甲氧基嘧啶的合成方法，该方法具体合成过程包括以下步骤：
在圆底烧瓶将2.98g(0.020mol)4，6-二氯嘧啶和1.51g(0.011mol)碳酸钾溶于50mL无水DMF中，在烧杯中将1.86g(0.010mol)1-Boc-哌嗪溶于50mL无水 DMF中，在缓慢搅拌下将1-Boc-哌嗪溶液滴加到烧瓶中，在25℃下回流反应8h，将反应液倾入水中猝灭反应，用二氯甲烷萃取3次，每次40mL，合并有机相，用无水硫酸镁干燥后旋干，即得到粗产物4-氯-6-Boc哌嗪基嘧啶；
将313mg(0.0136mol)金属钠溶于25mL无水甲醇/氘代甲醇中，配制成25mL 浓度为0.544mol/L的甲醇钠/氘代甲醇钠溶液；将1.0g(0.0034mol)4-氯-6-Boc哌嗪基嘧啶溶于50mL无水甲醇/氘代甲醇中，再逐步滴加到新鲜配制的25mL (0.544mol/L)甲醇钠/氘代甲醇钠溶液中，在30℃下搅拌回流14h，制得[d0]/[d3]-4- 甲氧基-6-Boc哌嗪基嘧啶的粗产物；
将[d0]/[d3]-4-甲氧基-6-Boc哌嗪基嘧啶粗产物经柱色谱分离纯化后，溶于50mL80％三氟乙酸的二氯甲烷中，室温下进行回流反应2小时；使反应体系冷却到室温，倾入水中猝灭反应，析出的固体即为轻、重同位素标记试剂——[d0]/[d3]-6-(1-哌嗪基)-4-甲氧基嘧啶(简写为[d0]/[d3]-MPP)176.9mg，收率为 26.8％，白色固体粉末，化学纯度99.13％，同位素丰度99.61atom％D。
实施例4
稳定同位素标记试剂[d0]/[d3]-6-(1-哌嗪基)-4-甲氧基嘧啶的合成方法，该方法具体合成过程包括以下步骤：
在圆底烧瓶将4.47g(0.030mol)4，6-二氯嘧啶和1.51g(0.011mol)碳酸钾溶于50mL无水DMF中，在烧杯中将1.86g(0.010mol)1-Boc-哌嗪溶于50mL无水 DMF中，在缓慢搅拌下将1-Boc-哌嗪溶液滴加到烧瓶中，在25℃下回流反应12h，将反应液倾入水中猝灭反应，用二氯甲烷萃取3次，每次40mL，合并有机相，用无水硫酸镁干燥后旋干，即得到粗产物4-氯-6-Boc哌嗪基嘧啶；
将626mg(0.0272mol)金属钠溶于25mL无水甲醇/氘代甲醇中，配制成25mL 浓度为1.088mol/L的甲醇钠/氘代甲醇钠溶液；将1.0g(0.0034mol)4-氯-6-Boc哌嗪基嘧啶溶于50mL无水甲醇/氘代甲醇中，再逐步滴加到新鲜配制的25mL (1.088mol/L)甲醇钠/氘代甲醇钠溶液中，在35℃下搅拌回流8h，制得[d0]/[d3]-4- 甲氧基-6-Boc哌嗪基嘧啶的粗产物；
将[d0]/[d3]-4-甲氧基-6-Boc哌嗪基嘧啶粗产物经柱色谱分离纯化后，溶于50mL80％三氟乙酸的二氯甲烷中，室温下进行回流反应4小时；使反应体系冷却到室温，倾入水中猝灭反应，析出的固体即为轻、重同位素标记试剂——[d0]/[d3]-6-(1-哌嗪基)-4-甲氧基嘧啶(简写为[d0]/[d3]-MPP)324.7mg，收率为 49.2％，白色固体粉末，化学纯度98.70％，同位素丰度99.48atom％D。
实施例5
稳定同位素标记试剂[d0]/[d3]-6-(1-哌嗪基)-4-甲氧基嘧啶的合成方法，该方法具体合成过程包括以下步骤：
在圆底烧瓶将1.49g(0.010mol)4，6-二氯嘧啶和1.51g(0.011mol)碳酸钾溶于50mL无水DMF中，在烧杯中将1.86g(0.010mol)1-Boc-哌嗪溶于50mL无水 DMF中，在缓慢搅拌下将1-Boc-哌嗪溶液滴加到烧瓶中，在25℃下回流反应10h，将反应液倾入水中猝灭反应，用二氯甲烷萃取3次，每次40mL，合并有机相，用无水硫酸镁干燥后旋干，即得到粗产物4-氯-6-Boc哌嗪基嘧啶；
将938mg(0.0408mol)金属钠溶于25mL无水甲醇/氘代甲醇中，配制成25mL 浓度为1.632mol/L的甲醇钠/氘代甲醇钠溶液；将1.0g(0.0034mol)4-氯-6-Boc哌嗪基嘧啶溶于50mL无水甲醇/氘代甲醇中，再逐步滴加到新鲜配制的25mL (1.632mol/L)甲醇钠/氘代甲醇钠溶液中，在50℃下搅拌回流10h，制得[d0]/[d3]-4- 甲氧基-6-Boc哌嗪基嘧啶的粗产物；
将[d0]/[d3]-4-甲氧基-6-Boc哌嗪基嘧啶粗产物经柱色谱分离纯化后，溶于50mL80％三氟乙酸的二氯甲烷中，室温下进行回流反应5小时；使反应体系冷却到室温，倾入水中猝灭反应，析出的固体即为轻、重同位素标记试剂——[d0]/[d3]-6-(1-哌嗪基)-4-甲氧基嘧啶(简写为[d0]/[d3]-MPP)527.3mg，收率为 79.9％，白色固体粉末，化学纯度99.22％，同位素丰度99.36atom％D。
实施例6
稳定同位素标记试剂[d0]/[d3]-6-(1-哌嗪基)-4-甲氧基嘧啶的合成方法，该方法具体合成过程包括以下步骤：
在圆底烧瓶将7.45g(0.050mol)4，6-二氯嘧啶和1.51g(0.011mol)碳酸钾溶于50mL无水DMF中，在烧杯中将1.86g(0.010mol)1-Boc-哌嗪溶于50mL无水 DMF中，在缓慢搅拌下将1-Boc-哌嗪溶液滴加到烧瓶中，在25℃下回流反应14h，将反应液倾入水中猝灭反应，用二氯甲烷萃取3次，每次40mL，合并有机相，用无水硫酸镁干燥后旋干，即得到粗产物4-氯-6-Boc哌嗪基嘧啶；
将782mg(0.0340mol)金属钠溶于25mL无水甲醇/氘代甲醇中，配制成25mL 浓度为1.360mol/L的甲醇钠/氘代甲醇钠溶液；将1.0g(0.0034mol)4-氯-6-Boc哌嗪基嘧啶溶于50mL无水甲醇/氘代甲醇中，再逐步滴加到新鲜配制的25mL (1.360mol/L)甲醇钠/氘代甲醇钠溶液中，在40℃下搅拌回流12h，制得[d0]/[d3]-4- 甲氧基-6-Boc哌嗪基嘧啶的粗产物；
将[d0]/[d3]-4-甲氧基-6-Boc哌嗪基嘧啶粗产物经柱色谱分离纯化后，溶于50mL80％三氟乙酸的二氯甲烷中，室温下进行回流反应8小时；使反应体系冷却到室温，倾入水中猝灭反应，析出的固体即为轻、重同位素标记试剂——[d0]/[d3]-6-(1-哌嗪基)-4-甲氧基嘧啶(简写为[d0]/[d3]-MPP)416.5mg，收率为 63.1％，白色固体粉末，化学纯度98.31％，同位素丰度99.13atom％D。

Claims (8)

1.一种稳定同位素标记试剂，其特征在于，该试剂为包括[d3]-6-(1-哌嗪基)-4-甲氧基嘧啶和[d0]-6-(1-哌嗪基)-4-甲氧基嘧啶，其中，所述[d3]-6-(1-哌嗪基)-4-甲氧基嘧啶为[d0]-6-(1-哌嗪基)-4-甲氧基嘧啶特定位点用氘取代氢的同位素标记试剂，所述试剂的化学结构式如下：
当X为H时，所述试剂为[d0]-6-(1-哌嗪基)-4-甲氧基嘧啶，当X为D时，所述试剂为[d3]-6-(1-哌嗪基)-4-甲氧基嘧啶。
2.一种如权利要求1所述稳定同位素标记试剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将1-Boc-哌嗪与4，6-二氯嘧啶混合，反应生成4-氯-6-Boc哌嗪基嘧啶；
(2)将4-氯-6-Boc哌嗪基嘧啶溶于甲醇中，滴加甲醇钠反应生成[d0]-4-甲氧基-6-Boc哌嗪基嘧啶粗产物；将4-氯-6-Boc哌嗪基嘧啶溶于氘代甲醇中，滴加氘代甲醇钠反应生成[d3]-4-甲氧基-6-Boc哌嗪基嘧啶粗产物；
(3)将步骤(2)得到的[d0]-4-甲氧基-6-Boc哌嗪基嘧啶粗产物及[d3]-4-甲氧基-6-Boc哌嗪基嘧啶粗产物经柱色谱纯化，脱去Boc保护基团，即得所述试剂。
3.根据权利要求2所述的一种稳定同位素标记试剂的制备方法，其特征在于，所述的1-Boc-哌嗪和4，6-二氯嘧啶在混合前均溶解于DMF溶剂中。
4.根据权利要求2所述的一种稳定同位素标记试剂的制备方法，其特征在于，所述的1-Boc-哌嗪和4，6-二氯嘧啶的摩尔比为1：(1～6)。
5.根据权利要求2所述的一种稳定同位素标记试剂的制备方法，其特征在于，所述的1-Boc-哌嗪和4，6-二氯嘧啶的反应温度为室温，反应时间为6～16h。
6.根据权利要求2所述的一种稳定同位素标记试剂的制备方法，其特征在于，所述的甲醇钠及氘代甲醇钠为新鲜配置的溶液，由金属钠溶于无水甲醇或无水氘代甲醇中配置得到，甲醇钠或氘代甲醇钠的溶液浓度为0.1～3mol/L。
7.根据权利要求2所述的一种稳定同位素标记试剂的制备方法，其特征在于，所述的4-氯-6-Boc哌嗪基嘧啶与甲醇钠或氘代甲醇钠的摩尔比为1：(1～20)。
8.根据权利要求2所述的一种稳定同位素标记试剂的制备方法，其特征在于，所述的4-氯-6-Boc哌嗪基嘧啶与甲醇钠或氘代甲醇钠的反应温度为20～60℃，反应时间为6～16h。
CN201810994177.6A 2018-08-29 2018-08-29 一种稳定同位素标记试剂及其制备方法 Pending CN109180591A (zh)

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