CN102174025A - 一种同位素标记试剂及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种同位素标记试剂,是异硫氰酸基嘧啶类同位素标记试剂,其化学名为:[d0]/[d6]-4,6-二甲氧基嘧啶-2-异硫氰酸酯。该试剂的制备是首先将4,6-二氯-2-氨基嘧啶与甲醇钠/氘代甲醇钠反应,制得[d0]/[d6]-4,6-二甲氧基-2-氨基嘧啶粗产物;再将所得粗产物与硫光气和碳酸氢钠进行回流反应,得到最终粗产品;然后进行柱层析,即得本发明所述的同位素标记试剂。本发明的同位素标记试剂可应用在多肽N端残基的鉴定分析及蛋白质的定量分析中,可以加快标记反应速率、提高标记肽段的信号、有利于增强鉴定肽段的准确性和可信性;且标记部分的分子量较小,结构相对简单,性质稳定,具有操作简便等优点。
Description
技术领域
本发明涉及一种同位素标记试剂及其制备方法和应用,具体说,是涉及一种异硫氰酸基嘧啶类同位素标记试剂及其制备方法和该同位素标记试剂在多肽N端残基鉴定及蛋白质比较分析中的应用。
背景技术
转化医学(Translational Medicine)(参见Clin.Sci.,2007,112,217)是应对现在医学研究日趋复杂化和与基础临床严重脱离所提出的一种研究新策略。它是不断循环、不断上升、不断深入的一种新的医学研究模式,缩短了从实验室到病床的距离,是21世纪医学发展的一个新动力。转化医学研究中的重要课题之一就是发现及监测人类疾病的新参数——生物标志物(biomarker)(参见J.Clin.Pharmacol.2003,43,329)。对于疾病研究,生物标志物一般是指可供客观测定和评价的一个普通生理或病理或治疗过程中的某种特征性的生化指标,如蛋白质和多肽。通过对它的测定可以获知机体当前所处的生物学过程中的进程。检查一种疾病特异性的生物标志物,对于疾病的鉴定、早期诊断及预防、治疗过程中的监控可能起到帮助作用。寻找和发现有价值的生物标志物已经成为目前研究的一个重要热点。而蛋白质组学技术便是发现生物标志物的重要途径。蛋白质组研究具有在整体水平上发掘与寻求潜在疾病标志物的能力,蛋白质组技术完善了以基因组学为基础的方法,集中于动态描述基因调节,其主要研究目标在于对基因表达的蛋白质水平进行定量的测定,鉴定疾病、药物对生命过程的影响以及解释基因表达调控的机制。近年来,利用蛋白质组技术检测与疾病相关标志物的研究在国内外争相报道,为疾病的临床诊断开辟了新的途径。
20世纪80年代末,电喷雾电离(electrospray ionization,ESI)和基质辅助激光解吸电离(matrix assisted laser desorption/ionization,MALDI)两种软电离技术的出现,极大的推动了蛋白质组学的发展。应用串联质谱的技术,高效率的鉴定目标蛋白的酶解肽段,进而推测蛋白质种类的“bottom up”模式被广泛应用于蛋白质组学中生物标志物的定性研究中。但是一些情况,如:非正常的碎片离子、不准确的质量、不可靠地数据库搜索方式,往往会导致错误肽段序列的产生,通过鉴定多肽N端残基,可以很好的排除假阳性以及不确定的序列,进而提升测序准确性,进而提高所鉴定的靶蛋白(生物标志物biomarker)的可靠性。目前具体主要对肽段的N端α氨基进行化学标记,并结合多级质谱的碰撞诱导裂解(collision induced dissociation,CID)专一性的诱导产生N端标记产物离子,如a1或b1离子。
对于a1离子而言,Hsu等率先采用N端肽的双甲基化的标记方法,研究了衍生肽段在二级质谱中的a1离子信号(参见J.Proteome Res.,2005,4,101)。而另一种广泛应用的是异硫氰酸苯酯(PITC)的标记方法(参见J.Mass Spectrom.1997,32,225),该试剂通过在串联质谱中诱导肽段发生气相埃德曼(Edman)裂解,从而生成b1离子,在N端氨基酸测序和MRM定量中都有较好的应用。但是,以往的手段仍存在一些缺陷,如:标记后产物质谱信号下降,标记效率低下,某些肽段因为不能产生明确的N端离子,而得出错误的结果。此外,N端同分异构残基(亮氨酸、异亮氨酸)也不能够很方便的鉴定。
发明内容
针对上述现有技术的不足之处,本发明的目的之一是提供一种可以加快标记反应速率、提高标记肽段的信号、有利于增强鉴定肽段的准确性和可信性的同位素标记试剂;本发明的目的之二是提供所述同位素标记试剂的一种制备方法;本发明的目的之三是提供所述同位素标记试剂在多肽N端残基鉴定及蛋白质比较分析中的应用。
本发明提供的同位素标记试剂,为异硫氰酸基嘧啶类同位素标记试剂,其化学名为:[d0]/[d6]-4,6-二甲氧基嘧啶-2-异硫氰酸酯,简写为:[d0]/[d6]-DMPITC,
本发明所述的同位素标记试剂的制备方法,包括如下步骤:
a)将金属钠溶于无水甲醇/氘代甲醇中,配制成甲醇钠/氘代甲醇钠溶液;
b)将4,6-二氯-2-氨基嘧啶溶于无水甲醇/氘代甲醇中,再逐滴滴加到现配的甲醇钠/氘代甲醇钠溶液中,在15~35℃下搅拌过夜,制得[d0]/[d6]-4,6-二甲氧基-2-氨基嘧啶粗产物;
c)将[d0]/[d6]-4,6-二甲氧基-2-氨基嘧啶粗产物溶于无水二氯甲烷中,再加入硫光气和碳酸氢钠,进行回流反应7~9小时;使反应体系冷却到室温,倾入水中淬灭反应,得到[d0]/[d6]-4,6-二甲氧基嘧啶-2-异硫氰酸酯粗产品;
d)进行柱层析,得到纯化的[d0]/[d6]-4,6-二甲氧基嘧啶-2-异硫氰酸酯,即为本发明所述的同位素标记试剂。
甲醇钠/氘代甲醇钠溶液的浓度推荐为0.1~1.0mol/L。
甲醇钠/氘代甲醇钠与4,6-二氯-2-氨基嘧啶的摩尔比推荐为(2~4)∶1。
硫光气与4,6-二氯-2-氨基嘧啶的摩尔比推荐为(1.2~2.0)∶1。
碳酸氢钠与4,6-二氯-2-氨基嘧啶的摩尔比推荐为(3~5)∶1。
柱层析的洗脱液推荐体积比为1∶6的乙酸乙酯与正己烷的混合溶剂。
本发明还提供了所述的同位素标记试剂在多肽N端残基的鉴定分析及蛋白质的定量分析中的应用,其具体过程是:先将目标分析物分别与轻质的和重质的标记试剂反应,再进行除杂后处理,然后用氮气吹干纯化后的标记分析物,用体积比为1∶1的乙腈/水溶液溶解标记分析物,最后进行电喷雾-离子阱-飞行时间串联质谱(ESI-IT-TOF)分析。
所述的目标分析物为N端α氨基无修饰多肽或蛋白质经过变性、酶解而得到的混合肽段或不同生理状态下的生物体蛋白质提取物。
所述的蛋白质经过变性、酶解的操作过程如下:将蛋白质置于pH=8.0~8.5,含有40~50mmol/L碳酸氢铵的缓冲溶液中,在1mg/ml的浓度下进行变性操作:75℃热变性10分钟;冷却至室温后,按照重量比50∶1加入胰蛋白酶,在37℃酶解12~16小时。
所述的目标分析物与标记试剂的反应条件是:在体积比为2∶2∶1的吡啶/乙醇/水的混合溶剂中,于55~60℃反应90~120分钟。
所述的除杂后处理是指将目标分析物与标记试剂的反应后溶液用氮气吹干后,用二氯甲烷萃取除去多余的标记试剂。
所述的电喷雾-离子阱-飞行时间串联质谱(ESI-IT-TOF)分析条件是:在正离子的模式下进行数据采集,流动相是体积比为(1∶1)~(7∶3)的乙腈-水溶液,检测器电压为1.7kV,碰撞气为氩气,碰撞能量为10~50%。
本发明提供的同位素标记试剂结构中的异硫氰酸酯部分是同位素标记的活性部位,可以专一性的与多肽N端α氨基反应;结构中的嘧啶环部分可以提高被分析物在质谱中的离子化效率,在离子化过程中更容易加合质子,从而起到提高质谱信号强度的作用;结构中的两个甲氧基部分,作为同位素标签部分,可以在合成的过程中,方便的引入稳定同位素(6个氢/氘),用于基于质谱的蛋白质比较分析,标记后轻链与重链之间差6Da,非常有利于质谱图中一组峰的区分辨认。
与现有技术相比,本发明的同位素标记试剂在多肽N端残基鉴定和蛋白质的比较分析中的应用,具有如下优点:
首先,本发明用于特异性的标记多肽的N端α氨基,在质谱的分析过程中更有针对性,在一定程度上也降低了质谱分析的复杂性;串联质谱中所产生的报告离子(“轻”标记试剂m/z 198;“重”标记试剂m/z 204)也能够很好的用以指认标记肽段;相比传统标记试剂(PITC),本发明设计合成的DMPITC能够更好的诱导标记肽段产生b1离子,其信号强度和稳定性被DMPITC专一性的提高;结合同位素和三级质谱的双重验证,N端残基能够被准确的鉴定;在蛋白质的比较分析中,各个酶解肽段均能与轻质的和重质的标记试剂高效率的反应,产生一对质荷比相差6Da(单电荷)或3Da(双电荷)的质谱峰,且它们的相对强度反映了实际样品中蛋白质的浓度比。
其次,本发明的标记部分的分子量较小(轻质197Da;重质204Da),结构相对简单,性质比较稳定,在质谱分析过程中不会干扰图谱的解析,也不会使数据库的检索复杂化;相比较传统的标记试剂PITC中的苯基,DMPITC分子中的二甲氧基嘧啶环可以加快标记反应速率、提高标记肽段的信号,更有利于增强鉴定肽段的准确性和可信性。
最后,本发明采用直接ESI-IT-TOF MS分析方法,操作简便,样品不需要经过色谱分离纯化步骤,降低了由此带来的操作误差,而体系中所含的其他试剂,如:胰蛋白酶、碳酸氢铵等并不会影响标记反应的结果。
附图说明
图1是标准肽段分别在标准反应条件下与PITC和DMPITC的标记产物的对比质谱图。
图2是相同摩尔浓度下的未标记、PITC标记以及DMPITC标记的标准肽段混合物的质谱图。
图3是牛血清白蛋白BSA的质谱定量图(轻质和重质DMPITC以1∶1标记酶解肽段的混合物)。
图4是牛血清白蛋白BSA的质谱定量曲线。
图5是轻质和重质DMPITC标记肽段A(DRVYIHPFHL)的串联质谱图。
具体实施方法
下面结合实施例对本发明做进一步详细、完整地说明,但并不限制本发明的内容。
实施例1:本发明的同位素标记试剂([d0]/[d6]-DMPITC)的制备
将200mg金属钠溶于20mL无水甲醇/氘代甲醇中配置成20mL甲醇钠/氘代甲醇钠溶液;
将500mg 4,6-二氯-2-氨基嘧啶溶于10mL无水甲醇/氘代甲醇中,再逐滴滴加到现配的20mL甲醇钠/氘代甲醇钠溶液中,置于25℃下搅拌过夜;
过滤浓缩,再溶解于10mL去离子水中,用二氯甲烷萃取3次,每次5mL,合并有机相,用硫酸钠干燥后旋干,即得[d0]/[d6]-4,6-二甲氧基-2-氨基嘧啶的粗产物;
将745mg[d0]/[d6]-4,6-二甲氧基-2-氨基嘧啶的粗产物溶于20mL无水二氯甲烷中,加入硫光气(thiophosgene,0.36ml,4.8mmol)和碳酸氢钠(1g,12mmol),进行回流反应7~9小时,待反应体系冷却到室温后,将反应液倾入20ml水中淬灭反应;有机相用饱和碳酸氢钠水溶液洗涤3次,每次20mL,合并水层,再用二氯甲烷萃取3次,每次40mL;合并有机相,用无水硫酸镁干燥,再旋干,得到最终粗产品;
经过柱层析(乙酸乙酯∶正己烷=1∶6),得到轻、重同位素标记试剂——[d0]/[d6]-4,6-二甲氧基嘧啶-2-异硫氰酸酯(简写为[d0]/[d6]-DMPITC)426mg,收率为45%,淡黄色粉末。
反应式如下所示:
实施例2:本发明的同位素标记试剂([d0]/[d6]-DMPITC)的应用
应用原理如下所示:
一、标准肽段(DRVYIHPF)的对比标记反应
1.配置体积比为2∶2∶1的乙醇/吡啶/水的混合溶液,并以此溶剂为反应溶剂;
2.向100~200μL乙醇溶解的轻标记试剂DMPITC和PITC(均为50nmol/μL)的两份溶液中,各加入400~600μL上述反应溶剂,并按标记试剂与肽段摩尔比500∶1的比例加入肽段溶液,混和后于55~60℃下进行反应90~120min;
3.待反应液冷却后,先用氮气吹干,再用二氯甲烷萃取除去多余的标记试剂,然后用氮气吹干,并用50~100μL体积比为1∶1的乙腈-水溶液溶解标记肽段;
4.进行ESI-IT-TOF MS分析,分析条件是:在正离子的模式下进行数据采集,流动相是体积比为(1∶1)~(7∶3)的乙腈-水溶液。
ESI-IT-TOF MS的分析结果如下:
1.DMPITC标记结果如图1中的b所示,由该图可见:未标记肽段峰消失,多肽的N端α氨基与标记试剂发生了反应,且产生了质量增加197Da的质谱峰;PITC标记结果如图1中的a所示,由该图可见:PITC标记速度较慢,体系中仍存在未标记的肽段;由此说明了DMPITC良好的标记特异性和更强的反应活性。
2.如图2所示,在相同的摩尔浓度下,DMPITC标记的肽段信号得到大幅度的增强,而PITC标记肽段的强度却出现了下降,这说明了标记试剂显著的信号增强能力,非常有利于低峰度肽段的分析检测。
二、蛋白质的比较分析
1.将牛血清白蛋白置于含有0.04~0.05M的碳酸氢铵,pH=8.0~8.5的水溶液中于75℃进行热变性10min;
2.冷却至室温后,按重量比50∶1向此溶液中加入胰蛋白酶,在37℃酶解12~16小时;
3.将酶解产物分别配成浓度比从0.02∶1至5∶1的溶液,两部分混合酶解肽段分别与轻质、重质标记试剂反应,与实例1相同,执行相同的后处理步骤;
4.合并两份混合肽段的标记产物,并进行ESI-IT-TOF MS分析,分析条件是:在正离子的模式下进行数据采集,流动相是体积比为(1∶1)~(7∶3)的乙腈-水溶液。
ESI-IT-TOF MS的分析结果如下:
1.如图3所示:在DMPITC所标记的BSA酶解产物的质谱图中检测到了成对的质谱峰,其峰度比值与理论差异较小,且线性关系良好(R2=0.9988)(见图4所示)。
2.采用质谱直接分析的策略,节省了分析时间,提高了效率,此外选用丰度最高的三条肽段进行定量,最大限度的降低了分析误差和其他离子的干扰。
三、多肽N端残基的准确鉴定
1.与实例1相同,肽段分别与轻质和重质标记试剂反应,并执行相同的后处理步骤;
2.N端标记上轻质和重质DMPITC的肽段分别在相同的参数下,进行ESI-IT-TOF MS分析,分析条件是:在正离子的模式下进行数据采集,流动相是体积比为(1∶1)~(7∶3)的乙腈-水溶液,碰撞气为氩气,碰撞能量视实际情况而定,这里为40%,三级质谱碰撞能量为20%,检测器电压1.7kV。
ESI-IT-TOF MS的分析结果如下:
1.如图5所示,通过对质谱图低分子量区域的分析,DMPITC诱导产生高强度的b1离子m/z 313.1,且根据其质量上增加6Da的同位素标记离子m/z319.1,可以准确的鉴定出b1离子。
2.根据b1离子和报告离子的质量差异可以快速推测出其N端残基为天冬氨酸(115Da)。
3.对于N端为同分异构体的残基(亮氨酸和异亮氨酸),可以根据DMPITC诱导产生的b1离子在三级质谱中的两个产物离子([DMPITC+H]+和[b1-CO]+)的相对丰度比(73.3±4.5%和15.8±1.4%)而分别区分。
4.此外其余的序列信息,如:y4,y9,b5,b6等离子,同样可以作为数据库的搜索条件,用以提高测序准确度。
Claims (14)
2.一种权利要求1所述的同位素标记试剂的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:
a)将金属钠溶于无水甲醇/氘代甲醇中,配制成甲醇钠/氘代甲醇钠溶液;
b)将4,6-二氯-2-氨基嘧啶溶于无水甲醇/氘代甲醇中,再逐滴滴加到现配的甲醇钠/氘代甲醇钠溶液中,在15~35℃下搅拌过夜,制得[d0]/[d6]-4,6-二甲氧基-2-氨基嘧啶粗产物;
c)将[d0]/[d6]-4,6-二甲氧基-2-氨基嘧啶粗产物溶于无水二氯甲烷中,再加入硫光气和碳酸氢钠,进行回流反应7~9小时;使反应体系冷却到室温,倾入水中淬灭反应,得到[d0]/[d6]-4,6-二甲氧基嘧啶-2-异硫氰酸酯粗产品;
d)进行柱层析,得到纯化的[d0]/[d6]-4,6-二甲氧基嘧啶-2-异硫氰酸酯,即为本发明所述的同位素标记试剂。
3.根据权利要求2所述的同位素标记试剂的制备方法,其特征在于:甲醇钠/氘代甲醇钠溶液的浓度为0.1~1.0mol/L。
4.根据权利要求2所述的同位素标记试剂的制备方法,其特征在于:甲醇钠/氘代甲醇钠与4,6-二氯-2-氨基嘧啶的摩尔比为(2~4)∶1。
5.根据权利要求2所述的同位素标记试剂的制备方法,其特征在于:硫光气与4,6-二氯-2-氨基嘧啶的摩尔比为(1.2~2.0)∶1。
6.根据权利要求2所述的同位素标记试剂的制备方法,其特征在于:碳酸氢钠与4,6-二氯-2-氨基嘧啶的摩尔比为(3~5)∶1。
7.根据权利要求2所述的同位素标记试剂的制备方法,其特征在于:柱层析的洗脱液是体积比为1∶6的乙酸乙酯与正己烷的混合溶剂。
8.一种权利要求1所述的同位素标记试剂在多肽N端残基的鉴定分析及蛋白质的定量分析中的应用。
9.根据权利要求8所述的同位素标记试剂的应用,其特征在于:是先将目标分析物分别与轻质的和重质的标记试剂反应,再进行除杂后处理,然后用氮气吹干纯化后的标记分析物,用体积比为1∶1的乙腈/水溶液溶解标记分析物,最后进行电喷雾-离子阱-飞行时间串联质谱(ESI-IT-TOF)分析。
10.根据权利要求9所述的同位素标记试剂的应用,其特征在于:所述的目标分析物为N端α氨基无修饰多肽或蛋白质经过变性、酶解而得到的混合肽段或不同生理状态下的生物体蛋白质提取物。
11.根据权利要求10所述的同位素标记试剂的应用,其特征在于,蛋白质经过变性、酶解的操作过程如下:将蛋白质置于pH=8.0~8.5,含有40~50mmol/L碳酸氢铵的缓冲溶液中,在1mg/ml的浓度下进行变性操作:75℃热变性10分钟;冷却至室温后,按照重量比50∶1加入胰蛋白酶,在37℃酶解12~16小时。
12.根据权利要求9所述的同位素标记试剂的应用,其特征在于,所述的目标分析物与标记试剂的反应条件是:在体积比为2∶2∶1的吡啶/乙醇/水的混合溶剂中,于55~60℃反应90~120分钟。
13.根据权利要求9所述的同位素标记试剂的应用,其特征在于,所述的除杂后处理是指将目标分析物与标记试剂的反应后溶液用氮气吹干后,用二氯甲烷萃取除去多余的标记试剂。
14.根据权利要求9所述的同位素标记试剂的应用,其特征在于,所述的电喷雾-离子阱-飞行时间串联质谱(ESI-IT-TOF)分析条件是:在正离子的模式下进行数据采集,流动相是体积比为(1∶1)~(7∶3)的乙腈-水溶液,检测器电压为1.7kV,碰撞气为氩气,碰撞能量为10~50%。
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