CN102426210A - 一种血浆中多胺类物质的测定方法 - Google Patents

一种血浆中多胺类物质的测定方法 Download PDF

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李清
毕开顺
刘然
贾英
尹然
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Abstract

本发明涉及对生物血浆样本中多胺类物质的检测方法，多胺是一类具有重要生理作用的内源性物质，在细胞增殖、蛋白质与核酸合成等方面起着重要作用。因此多胺的产生与癌症的发生密切相关，多胺可以作为癌症标记物应用于癌症的诊断与治疗。由于多胺本身性质很难被常规方法检测出来，本发明提供一种灵敏稳定的方法用于人体内血浆中多胺的检测，为癌症的临床诊断提供了依据，为抗癌药物研究开发提供了依据。

Description

一种血浆中多胺类物质的测定方法
技术领域
本发明属于医药技术领域，具体涉及一种血浆中多胺类物质的测定方法，更确切地说是一种对血浆中多胺类物质进行高效灵敏定量测定的方法。 
背景技术
多胺是一类小分子脂肪胺类化合物，带有两个或两个以上伯胺基与仲胺基，通常指1,3-丙二胺、腐胺、尸胺、精脒、精胺等。多胺在生物体内广泛存在，参与基因表达和翻译的调节、细胞增殖等生命活动过程，与癌症的发生发展密切相关。 
目前对体内内源性物质多胺的定量测定主要有液相色谱-荧光衍生化法、液相色谱-紫外衍生化法、免疫法和液相色谱-质谱检测法几种。液相色谱-荧光衍生化法具有灵敏的特点，但其它内源性物质易干扰其测定，专一性较差难以满足高水平临床研究的需要；液相色谱-紫外衍生化法具有专一的特点，但灵敏度又很难适合体内低浓度的多胺测定；免疫法虽操作相对简便，但对各多胺分离能力差，测定交叉干扰严重，且实施价格较高，对临床后续研究性价值不高。液相色谱-质谱联用技术具有专一性强、灵敏度高的优点，在体内药物分析、内源性物质测定分析和代谢组学相关领域方面已有成熟的应用，是近年来应用迅速发展的分析测试技术。 
由于多胺是小分子化合物，具有结构简单、在体内含量低的特点，而临床检测需建立快速、灵敏、准确、经济的测定方法，因此实际能够应用在临床上的多胺检测方法目前尚未完全建立。 
发明内容
本文目的是采用简便的预处理方法、灵敏的检测手段，建立血浆中多胺的分析方法，实现血浆中痕量多胺的检测，使多胺在癌症的预诊、治疗评价以及在抗癌药物的开发研究中发挥重要作用。 
本发明所述多胺类物质优选腐胺、1,3-丙二胺、尸胺、精胺、精脒。 
本发明是这样实现的： 
（1）血样本预处理：
a．取一定量采集的血浆，加入一定量内标溶液及一定量高氯酸、酸性甲醇或三氯醋酸溶液，涡旋混匀后，高速离心取上清液；
b．取经a步骤处理后的上清液，加入衍生化试剂、碱化试剂，涡旋混匀，在超声条件下反应后加入中止反应试剂、萃取溶剂后震荡，上层有机溶液转移吹干，加入甲醇超声离心后取上清液，进行LC -MS分析。
（2） 液相分离： 
a．采用C18作固定相，
b．流动相A：甲醇，流动相B：水。
    梯度洗脱并控制流速 
（3）  MS 测定：
电喷雾离子源，正离子扫描。
步骤（1）a操作中，内标溶液优选物质量浓度为500ng/ml的1,6-已二胺，高氯酸的质量浓度优选5%-9%，酸性甲醇的质量浓度优选1%-5%，三氯醋酸质量浓度优选5%-9%。 
步骤（1）b操作中，衍生化试剂、碱化试剂的加入顺序优选先加入碱化试剂，后加入衍生化试剂。 
步骤（1）b操作中，碱化试剂优选0.5 mol/L至2 mol/L氢氧化钠溶液， 
步骤（1）b操作中，衍生化试剂为苯甲酰氯溶液和乙腈的混合溶液，苯甲酰氯质量浓度优选1%-5%。
步骤（1）b操作中，超声反应时的温度优选30oC。 
步骤（1）b操作中，中止反应试剂优选饱和氯化钠溶液。 
步骤（1）b操作中，萃取溶剂优选乙醚。 
步骤（2）中梯度洗脱优选14分钟内甲醇体积浓度由55 %上升到74 %，控制流速优选在0.8 ml/min-1.2 ml/min，柱温优选20 oC-40 oC，进样体积优选5 μL-15 μL。 
步骤（3）中，质谱条件优选毛细管电压：4200-4500 V，雾化气流速: 1.1-1.3 Bar，干燥气流速: 5.0-7.0 L ? min-1，干燥气温度: 210-230 oC，扫描范围: 50-900 m/z，定量离子: 1,3-丙二胺 m/z: 303.1，腐胺 m/z: 319.1，尸胺 m/z: 333.2，1,6-已二胺(内标)m/z: 347.2，精脒 m/z: 480.2，精胺 m/z: 641.3。 
本发明预处理方法操作简便，血浆杂质特别是其它内源性物质对多胺类物质定量检测无干扰；定量限不超过0.5 ng · mL-1。血浆中1,3-丙二胺、腐胺、尸胺、精脒、精胺在0.4 ~ 200.0 ngmL-1浓度范围内线性关系良好，相关系数在0.9937~0.9972之间。低、中、高三个浓度的质控样品日内、日间精密度(RSD)分别小于14 %和13 %，平均提取回收率在77.87~84.0 %之间，基质效应在87.0~103.2 %之间，该方法灵敏、准确、重复性好。 
本发明方法所采用的衍生化试剂灵敏、活泼、可与各多胺发生定量完全反应，经与中止反应试剂反应后即可减少副反应发生，有利于多胺的体内定量分析。此衍生化试剂优于其它方法采用的苯磺酰氯、荧光胺类荧光衍生化试剂以及柱后衍生化试剂等。 
附图说明：
图1为采用实施例1方法测定血浆中腐胺、1,3-丙二胺、尸胺、1,6-己二胺、精脒、精胺的质谱总离子流色谱图，图中1为腐胺，2为1,3-丙二胺，3为尸胺，4为1,6-己二胺(内标)，5为精脒，6为精胺。
图2为采用实施例2方法测定血浆中腐胺、1,3-丙二胺、尸胺、1,6-己二胺、精脒、精胺的质谱总离子流色谱图，图中1为腐胺，2为1,3-丙二胺，3为尸胺，4为1,6-己二胺(内标)，5为精脒，6为精胺。 
图3为采用实施例3方法测定血浆中腐胺、1,3-丙二胺、尸胺、1,6-己二胺、精脒、精胺的质谱总离子流色谱图，图中1为腐胺，2为1,3-丙二胺，3为尸胺，4为1,6-己二胺(内标)，5为精脒，6为精胺。 
图4为采用实施例4方法测定血浆中腐胺、1,3-丙二胺、尸胺、1,6-己二胺、精脒、精胺的质谱总离子流色谱图，图中1为腐胺，2为1,3-丙二胺，3为尸胺，4为1,6-己二胺(内标)，5为精脒，6为精胺。 
图5：采用实施例5方法测定血浆中腐胺、1,3-丙二胺、尸胺、1,6-己二胺、精脒、精胺的质谱总离子流色谱图，图中1为腐胺，2为1,3-丙二胺，3为尸胺，4为1,6-己二胺(内标)，5为精脒，6为精胺。 
图6：采用实施例6方法测定血浆中腐胺、1,3-丙二胺、尸胺、1,6-己二胺、精脒、精胺的质谱总离子流色谱图，图中1为腐胺，2为1,3-丙二胺，3为尸胺，4为1,6-己二胺(内标)，5为精脒，6为精胺。 
具体实施方式：
实施例1
（1）血样预处理
a．取血浆样品250 μL，加入质量浓度为5% HClO4 125 μL，涡旋混匀，高速离心。
b．取经a步骤处理后的上清液，加入2 mol  mL-1 NaOH 400 μL，125 μL苯甲酰氯质量浓度为4%的苯甲酰氯、乙腈的混合溶液，涡旋溶解混匀，30oC超声反应30 min，加入1 mL饱和氯化钠溶液终止反应，以2 mL乙醚萃取衍生后多胺，空气流下吹干，以50 μL甲醇超声复溶，15000 r.m.p离心3 min，取10 μL上清液进行LC -MS分析。 
（2）液相分离：色谱柱为Kromasil C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相A：甲醇，B：水；梯度洗脱：0- 14 min：55 % A→74 % A。流速为1.0 mL ? min-1，柱温为35oC，进样10 μL。 
（3）MS 测定 
质谱条件：电喷雾离子源，正离子检测方式；毛细管电压：4500 V，雾化气流速: 1.3 Bar，干燥气流速: 7.0 L ? min-1，干燥气温度: 230oC，扫描范围: 50-900 m/z，定量离子: 1,3-丙二胺 m/z: 303.1，腐胺 m/z: 319.1，尸胺 m/z: 333.2，1,6-已二胺(内标)m/z: 347.2，精脒 m/z: 480.2，精胺 m/z: 641.3。
在此条件下，血浆中腐胺、1,3-丙二胺、尸胺、精脒、精胺分别在10.1,11.1,11.9, 13.5,14.5分钟出峰，LC-MS总离子流色谱图如图一所示。 
按内标法以峰面积或峰高法计算出样品中各多胺的浓度。 
采用实施例1的方法，血浆仅经5 % HClO4沉淀蛋白后，采用苯甲酰氯柱前衍生LC-MS测定血浆中5种多胺。此方法样品前处理过程简单，各多胺分离良好且不受其它内源性物质干扰，各多胺定量限为0.5 ng  mL-1。血浆中1,3-丙二胺、腐胺、尸胺、精脒、精胺在0.4 ~ 200.0 ngmL-1浓度范围内线性关系良好，相关系数腐胺为0.9941，1,3-丙二胺为0.9937，尸胺为0.9967，精脒为0.9972，精胺为0.9954。血浆中1,3-丙二胺、腐胺、尸胺、精脒、精胺在分别均为2ngmL-1、40 ngmL-1、160 ngmL-1这低、中、高三个浓度的质控样品日内、日间精密度(RSD)分别为13.7 %和12.1 %；平均提取回收率腐胺为84.0 %，1,3-丙二胺为81.4 %，尸胺为80.6 %，精脒为83.2 %，精胺为77.87%；基质效应腐胺为87.0 %，1,3-丙二胺为79.4 %，尸胺为103.2 %，精脒为93.2 %，精胺为87.6 %。 
实施例2 
（1）血样预处理
a．取血浆样品250 μL，加入质量浓度为9 % HClO4 125 μL，涡旋混匀，高速离心。
b．取经a步骤处理后的上清液，加入0.5 mol  mL-1 NaOH 400 μL，125 μL苯甲酰氯质量浓度为4%的苯甲酰氯、乙腈的混合溶液，涡旋溶解混匀，30 oC超声反应30 min，加入1 mL饱和氯化钠溶液终止反应，以2 mL乙醚萃取衍生后多胺，空气流下吹干，以50 μL甲醇超声复溶，15000 r.m.p离心3 min，取10 μL上清液进行LC -MS分析。 
（2）液相分离：色谱柱为Kromasil C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相A：甲醇，B：水；梯度洗脱：0- 14 min：55 % A→74 % A。流速为1.0 mL ? min-1，柱温为35oC，进样10 μL。 
（3）MS 测定 
质谱条件：电喷雾离子源，正离子检测方式；毛细管电压：4500 V，雾化气流速: 1.3 Bar，干燥气流速: 7.0 L ? min-1，干燥气温度: 230 ℃，扫描范围: 50-900 m/z，定量离子: 1,3-丙二胺 m/z: 303.1，腐胺 m/z: 319.1，尸胺 m/z: 333.2，1,6-已二胺(内标)m/z: 347.2，精脒 m/z: 480.2，精胺 m/z: 641.3。
在此条件下，血浆中腐胺、1,3-丙二胺、尸胺、精脒、精胺分别在10.3,11.3,11.6, 13.2,13.6分钟出峰，LC-MS总离子流色谱图如图二所示。 
按内标法以峰面积或峰高法计算出样品中各多胺的浓度。 
采用实施例2的方法，血浆经9 % HClO4沉淀蛋白后，多胺有所损失，采用本实例方法测得5种多胺，腐胺定量限为1 ng · mL-1，1,3-丙二胺为2 ng · mL-1，尸胺为2 ng · mL-1，精脒为2 ng · mL-1，精胺为2 ng · mL-1。血浆中1,3-丙二胺、腐胺、尸胺、精脒、精胺在2 ~ 200.0 ngmL-1浓度范围内线性关系较差，相关系数腐胺为0.9921，1,3-丙二胺为0.9877，尸胺为0.9897，精脒为0.9891，精胺为0.9798。血浆中1,3-丙二胺、腐胺、尸胺、精脒、精胺在分别均为2ngmL-1、40 ngmL-1、160 ngmL-1这低、中、高三个浓度的质控样品日内、日间精密度(RSD)分别为12.6 %和11.7 %；平均提取回收率腐胺为76.8 %，1,3-丙二胺为71.2 %，尸胺为77.1 %，精脒为63.2 %，精胺为67.87%；基质效应腐胺为72.4 %，1,3-丙二胺为79.4 %，尸胺为103.2 %，精脒为93.2 %，精胺为87.6 %。 
实施例3 
（1）血样预处理
a．取血浆样品250 μL，加入质量浓度为1 % 酸性甲醇150 μL，涡旋混匀，高速离心。
b．取经a步骤处理后的上清液，加入2 mol  mL-1 NaOH 400 μL，125 μL苯甲酰氯质量浓度为1%的苯甲酰氯、乙腈的混合溶液，涡旋溶解混匀，30oC超声反应30 min，加入1 mL饱和氯化钠溶液终止反应，以2 mL乙醚萃取衍生后多胺，空气流下吹干，以50 μL甲醇超声复溶，15000 r.m.p离心3 min，取10 μL上清液进行LC -MS分析。 
（2）液相分离：色谱柱为Kromasil C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相A：甲醇，B：水；梯度洗脱：0- 14 min：55 % A→74 % A。流速为1.0 mL ? min-1，柱温为35oC，进样10 μL。 
（3）MS 测定 
质谱条件：电喷雾离子源，正离子检测方式；毛细管电压：4500 V，雾化气流速: 1.3 Bar，干燥气流速: 7.0 L ? min-1，干燥气温度: 230oC，扫描范围: 50-900 m/z，定量离子: 1,3-丙二胺 m/z: 303.1，腐胺 m/z: 319.1，尸胺 m/z: 333.2，1,6-已二胺(内标)m/z: 347.2，精脒 m/z: 480.2，精胺 m/z: 641.3。
在此条件下，血浆中腐胺、1,3-丙二胺、尸胺、精脒、精胺分别在10.0, 10.5,11.2, 12.6,13.1分钟出峰，LC-MS总离子流色谱图如图三所示。 
按内标法以峰面积或峰高法计算出样品中各多胺的浓度。 
采用实施例3方法，血浆经1 % 酸性甲醇沉淀蛋白后，采用苯甲酰氯柱前衍生HPLC-MS测定血浆中5种多胺。本实例方法测得腐胺定量限为0.8 ng  mL-1，其余各多胺定量限为1 ng  mL-1。血浆中1,3-丙二胺、腐胺、尸胺、精脒、精胺在1 ~ 200.0 ngmL-1浓度范围内线性关系较差，相关系数腐胺为0.9864，1,3-丙二胺为0.9781，尸胺为0.9712，精脒为0.9781，精胺为0.9899。血浆中1,3-丙二胺、腐胺、尸胺、精脒、精胺在分别均为2ngmL-1、40 ngmL-1、160 ngmL-1这低、中、高三个浓度的质控样品日内、日间精密度(RSD)分别为15 %和14.7 %，平均提取回收率腐胺为84.2 %，1,3-丙二胺为83.8 %，尸胺为72.5 %，精脒为73.2 %，精胺为81.3%；基质效应腐胺为77.3 %，1,3-丙二胺为76.1 %，尸胺为113.2 %，精脒为103.2 %，精胺为57.6 %。 
实施例4 
（1）血样预处理
a．取血浆样品250 μL，加入质量浓度为5 % 酸性甲醇150 μL，涡旋混匀，高速离心。
b．取经a步骤处理后的上清液，加入2 mol  mL-1 NaOH 400 μL，125 μL苯甲酰氯质量浓度为1%的苯甲酰氯、乙腈的混合溶液，涡旋溶解混匀，30oC超声反应30 min，以2 mL乙醚萃取衍生后多胺，空气流下吹干，以50 μL甲醇超声复溶，15000 r.m.p离心3 min，取10 μL上清液进行LC -MS分析。 
（2）液相分离：色谱柱为Kromasil C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相A：甲醇，B：水；梯度洗脱：0- 14 min：55 % A→74 % A。流速为1.0 mL ? min-1，柱温为35oC，进样10 μL。 
（3）MS 测定 
质谱条件：电喷雾离子源，正离子检测方式；毛细管电压：4500 V，雾化气流速: 1.3 Bar，干燥气流速: 7.0 L ? min-1，干燥气温度: 230oC，扫描范围: 50-900 m/z，定量离子: 1,3-丙二胺 m/z: 303.1，腐胺 m/z: 319.1，尸胺 m/z: 333.2，1,6-已二胺(内标)m/z: 347.2，精脒 m/z: 480.2，精胺 m/z: 641.3。
在此条件下，血浆中腐胺、1,3-丙二胺、尸胺、精胺分别在10.0, 10.4,11.1,13.0分钟出峰，LC-MS总离子流色谱图如图四所示。 
按内标法以峰面积或峰高法计算出样品中各多胺的浓度。 
采用实例4的方法，血浆经5 % 酸性甲醇沉淀蛋白后，由于苯甲酰氯副反应物质干扰精脒测定，且对色谱柱损害较大，采用该法仅测得血浆中4种多胺。本实例方法测得腐胺定量限为0.8 ng  mL-1，其余各多胺定量限均为 1 ng  mL-1。血浆中1,3-丙二胺、腐胺、尸胺、精胺在1 ~ 200.0 ngmL-1浓度范围内线性关系较差，相关系数腐胺为0.9889，1,3-丙二胺为0.9961，尸胺为0.9734，精胺为0.9879；血浆中1,3-丙二胺、腐胺、尸胺、精脒、精胺在分别均为2ngmL-1、40 ngmL-1、160 ngmL-1这低、中、高三个浓度的质控样品日内、日间精密度(RSD)分别为13.4 % 与14.2 %；平均提取回收率腐胺为89.7 %，1,3-丙二胺为67.7%，尸胺为79.3 %，精胺为81.3%；基质效应腐胺为79.1 %，1,3-丙二胺为79.4 %，尸胺为93.2 %，精胺为57.6 %。 
实施例5 
（1）血样预处理
a．取血浆样品250 μL，加入质量浓度为5 % 三氯醋酸150 μL，涡旋混匀，高速离心。
b．取经a步骤处理后的上清液，加入2 mol  mL-1 NaOH 400 μL，125 μL苯甲酰氯质量浓度为1%的苯甲酰氯、乙腈的混合溶液，涡旋溶解混匀，超声反应30 min，加入1 mL饱和氯化钠溶液终止反应，以2 mL乙酸乙酯萃取衍生后多胺，空气流下吹干，以50 μL甲醇超声复溶，15000 r.m.p离心3 min，取10 μL上清液进行LC -MS分析。 
（2）液相分离：色谱柱为Kromasil C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相A：甲醇，B：水；梯度洗脱：0- 14 min：55 % A→74 % A。流速为1.0 mL ? min-1，柱温为35oC，进样10 μL。 
（3）MS 测定 
质谱条件：电喷雾离子源，正离子检测方式；毛细管电压：4500 V，雾化气流速: 1.3 Bar，干燥气流速: 7.0 L ? min-1，干燥气温度: 230 oC，扫描范围: 50-900 m/z，定量离子: 1,3-丙二胺 m/z: 303.1，腐胺 m/z: 319.1，尸胺 m/z: 333.2，1,6-已二胺(内标)m/z: 347.2，精脒 m/z: 480.2，精胺 m/z: 641.3。
在此条件下，血浆中腐胺、1,3-丙二胺、尸胺、精脒、精胺分别在9.9, 10.4,11.1, 12.4,12.9分钟出峰，LC-MS总离子流色谱图如图五所示。 
按内标法以峰面积或峰高法计算出样品中各多胺的浓度。 
采用本实例方法，血浆经5 % 三氯醋酸沉淀蛋白后，由乙酸乙酯萃取衍生后多胺，各多胺萃取不完全，测得各多胺定量限均为2 ng  mL-1。血浆中1,3-丙二胺、腐胺、尸胺、精脒、精胺在2 ~ 200.0 ngmL-1浓度范围内线性关系差，相关系数腐胺为0.9877，1,3-丙二胺为0.9932，尸胺为0.9874，精脒为0.9799，精胺为0.9773；血浆中1,3-丙二胺、腐胺、尸胺、精脒、精胺在分别均为2ngmL-1、40 ngmL-1、160 ngmL-1这低、中、高三个浓度的质控样品日内、日间精密度(RSD)分别为14.9 %与17.4%；平均提取回收率腐胺为61.9 %，1,3-丙二胺为59.7 %，尸胺为68.9 %，精脒为69.5%，精胺为69.7%；基质效应腐胺为76.3 %，1,3-丙二胺为58.9%，尸胺为76.7 %，精脒为54.9 %，精胺为67.4 %。 
实施例6 
（1）血样预处理
a．取血浆样品250 μL，加入质量浓度为9 % 三氯醋酸150 μL，涡旋混匀，高速离心。
b．取经a步骤处理后的上清液，加入2 mol  mL-1 NaOH 400 μL，125 μL苯甲酰氯质量浓度为1%的苯甲酰氯、乙腈的混合溶液，涡旋溶解混匀，30oC超声反应30 min，加入1 mL饱和氯化钠溶液终止反应，以2 mL乙醚萃取衍生后多胺，空气流下吹干，以50 μL甲醇超声复溶，15000 r.m.p离心3 min，取10 μL上清液进行LC -MS分析。 
（2）液相分离：色谱柱为Kromasil C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相A：甲醇，B：水；梯度洗脱：0- 14 min：55 % A→74 % A。流速为1.0 mL ? min-1，柱温为35oC，进样10 μL。 
（3）MS 测定 
质谱条件：电喷雾离子源，正离子检测方式；毛细管电压：4500 V，雾化气流速: 1.3 Bar，干燥气流速: 7.0 L ? min-1，干燥气温度: 230oC，扫描范围: 50-900 m/z，定量离子: 1,3-丙二胺 m/z: 303.1，腐胺 m/z: 319.1，尸胺 m/z: 333.2，1,6-已二胺(内标)m/z: 347.2，精脒 m/z: 480.2，精胺 m/z: 641.3。
在此条件下，血浆中腐胺、1,3-丙二胺、尸胺、精脒、精胺分别在9.9, 10.4,11.1, 12.4,12.9分钟出峰，LC-MS总离子流色谱图如图六所示。 
按内标法以峰面积或峰高法计算出样品中各多胺的浓度。 
采用本实例方法，血浆经9 % 三氯醋酸沉淀蛋白后，内源性物质干扰较弱，但样品损失较多，测得各多胺定量限均为2 ng  mL-1。血浆中1,3-丙二胺、腐胺、尸胺、精脒、精胺在2 ~ 200.0 ngmL-1浓度范围内线性关系差，相关系数腐胺为0.9889，1,3-丙二胺为0.9914，尸胺为0.9734，精脒为0.9700，精胺为0.9632；血浆中1,3-丙二胺、腐胺、尸胺、精脒、精胺在分别均为2ngmL-1、40 ngmL-1、160 ngmL-1这低、中、高三个浓度的质控样品日内、日间精密度(RSD)分别为17.3 %与16.9 %；平均提取回收率腐胺为71.3 %，1,3-丙二胺为67.4 %，尸胺为58.1 %，精脒为54.5%，精胺为65.3%；基质效应腐胺为56.3 %，1,3-丙二胺为65.8 %，尸胺为66.3 %，精脒为44.7 %，精胺为62.1 %。 

Claims (10)

1.一种血浆中多胺类物质的测定方法，包括：
（1）血样本预处理：
 a．取一定量的血浆，加入一定量内标溶液及一定量高氯酸、酸性甲醇或三氯醋酸溶液，涡旋混匀后，高速离心取上清液；
b．取血浆经a处理后的上清液，加入衍生化试剂，加入碱化试剂、溶剂等涡旋，超声反应后加入中止反应试剂、萃取溶剂后震荡，上层有机溶液转移吹干，加入甲醇超声离心后取上清液；
（2） 液相分离：
a． 采用C18作固定相；
b． 流动相A：水，流动相B：甲醇
   （3）梯度洗脱并控制流速
 MS 测定：
电喷雾离子源，正离子扫描。
2.根据权利要求1所述的血浆多胺类物质的测定方法，其特征在于多胺类物质包括腐胺、1,3-丙二胺、尸胺、精胺、精脒等。
3.根据权利要求1所述的血浆多胺类物质的测定方法，其特征在于步骤（1）a操作中，内标溶液为物质量浓度为500ng/ml的1,6-已二胺，高氯酸的质量浓度为5%-9%，酸性甲醇的质量浓度为1%-5%，三氯醋酸质量浓度为5%-9%。
4.根据权利要求1所述的血浆多胺类物质的测定方法，其特征在于步骤（1）b操作中，衍生化试剂、碱化试剂的加入顺序为先加入碱化试剂，后加入衍生化试剂。
5.根据权利要求1所述的血浆多胺类物质的测定方法，其特征在于步骤（1）b操作中，碱化试剂为物质量浓度0.5 mol/L至2 mol/L的氢氧化钠溶液。
6.根据权利要求1所述的血浆多胺类物质的测定方法，其特征在于步骤（1）b操作中，衍生化试剂为苯甲酰氯溶液和乙腈的混合溶液，苯甲酰氯质量浓度为1%-5%。
7.根据权利要求1所述的血浆多胺类物质的测定方法，其特征在于步骤（1）b操作中，超声反应时的温度为30oC。
8.根据权利要求1所述的血浆多胺类物质的测定方法，其特征在于步骤（1）b操作中，中止反应试剂为饱和氯化钠溶液，萃取溶剂为乙醚。
9.根据权利要求1所述的血浆多胺类物质的测定方法，其特征在于步骤（2）中梯度洗脱为14分钟内甲醇体积浓度由55 %上升到74 %，控制流速优选在0.8 ml/min-1.2 ml/min，设定柱温为20 oC-40 oC，进样体积为5 μL-15 μL。
10.根据权利要求1所述的血浆多胺类物质的测定方法，其特征在于步骤（3）中，质谱条件为毛细管电压：4200-4500 V，雾化气流速: 1.1-1.3 Bar，干燥气流速: 5.0-7.0 L ? min-1，干燥气温度: 210-230 oC，扫描范围: 50-900 m/z，定量离子: 1,3-丙二胺 m/z: 303.1，腐胺 m/z: 319.1，尸胺 m/z: 333.2，1,6-已二胺(内标)m/z: 347.2，精脒 m/z: 480.2，精胺 m/z: 641.3。
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