CN104678028A - 生物原胺类神经递质的前处理和检测方法、及检测试剂盒 - Google Patents

生物原胺类神经递质的前处理和检测方法、及检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明属于检测技术领域,涉及一种生物原胺类神经递质和/或其代谢产物的前处理方法,包括将含有生物原胺类神经递质和/或其代谢产物的样品衍生化,对衍生化产物在线固相萃取。在此基础上,还涉及生物原胺类神经递质和/或其代谢产物的检测方法、检测试剂盒及用途。本发明的前处理方法能够去除衍生化产物中的杂质,将衍生化产物富集后以适宜浓度转移入后续检测步骤。本发明的检测方法能快速、准确地测定出生物样品中生物原胺类神经递质及其代谢产物含量,检测灵敏度高。

Description

生物原胺类神经递质的前处理和检测方法、及检测试剂盒
技术领域
本发明属于检测技术领域,涉及一种生物原胺类神经递质及代谢产物的前处理方法、检测方法、检测试剂盒及用途。
背景技术
生物原胺类神经递质主要包括多巴胺(DA)、去甲肾上腺素(NE)、肾上腺素(E)、5-羟色胺(5-HT)等,是人脑内神经元普遍存在的、十分重要的物质,在人体神经、心血管、内分泌等组织系统起着广泛的调节作用,对情绪、情感、应激行为、睡眠觉醒等生理活动有重要影响。
生物原胺类神经递质及代谢产物的含量变化与多种疾病密切相关,是诊断嗜铬细胞瘤、阿尔茨海默氏症、唐氏综合征、抑郁症和帕金森等疾病的重要依据。同时,生物原胺类神经递质还可用作诊疗性药物,如去甲肾上腺素和肾上腺素是心肺复苏的主要药物、多巴胺是重要的抗休克和治疗急慢性肾功能衰竭的药物。因此,生物样品中生物原胺类神经递质及其代谢产物含量的准确测定对于疾病诊断和控制、药物开发与治疗及基础医学研究具有重要意义。尤其在神经精神药物研究领域,生物原胺类神经递质含量测定的疾病诊断及药物疗效评价作用更加突出。
生物样品中生物原胺类神经递质及其代谢产物的含量很低,特别是代谢产物,其含量通常仅达到pg/mL至ng/mL数量级,再加上生物原胺类神经递质及其代谢产物的稳定性差,在光照和碱性条件下容易发生氧化分解,这就进一步降低了生物样品中生物原胺类神经递质 及其代谢产物的含量;而且,生物原胺类神经递质及其代谢产物的荧光响应和质谱响应信号较弱;这就导致难以对生物样品中生物原胺类神经递质及其代谢产物的含量进行准确检测。
早期采用电化学方法测定样品中生物原胺类神经递质的含量,但生物样品基质复杂,内源性物质和生物原胺类神经递质之间、不同种生物原胺类神经递质之间的干扰较多,导致采用电化学方法测定含量存在极大困难。尤其对于大鼠微渗析样品,由于其生物原胺类神经递质及代谢产物含量的很低,因此一直难以准确检测。
近来,生物原胺类神经递质及其代谢产物的含量检测取得了一些进展,包括采用质谱进行检测,质谱相比其他检测仪器,灵敏度更高,并且能够将内源性物质和生物原胺类神经递质之间、不同种生物原胺类神经递质之间的干扰大幅降低。但生物原胺类神经递质及其代谢产物在质谱的反相色谱柱上保留极弱,且普遍含有的酚羟基使得离子化效率降低,使得质谱响应信号减弱,制约了质谱检测灵敏度的发挥。对于这一问题,目前的做法是将生物原胺类神经递质及其代谢产物中导致质谱信号减弱或稳定性降低的基团进行衍生化处理,以提高检测灵敏度。但衍生化处理的缺点是引入了高浓度的强酸或强碱盐,这些盐类物质不仅会干扰质谱信号,而且对色谱柱乃至液质体系的寿命都会造成影响,因此必须尽可能在检测前去除这些盐类物质。
已有的液液萃取和离线固相萃取除盐前处理技术,都需要在萃取后进行再浓缩,这使得前处理变得步骤繁杂;而且,生物原胺类神经递质及其代谢产物的稳定性差,浓缩等方法会造成生物原胺类神经递质的降解,回收率降低。
目前尚须新的生物原胺类神经递质及其代谢产物的前处理方法及检测方法。
发明内容
本发明给出一种生物原胺类神经递质和/或其代谢产物的前处理方法,该前处理方法能去除衍生化产生的盐类、未反应的生物原胺类 神经递质原形杂质,减少杂质对检测造成的影响;同时能够将衍生化产物快速洗脱并以适宜浓度转移至后续检测步骤。在此基础上,本发明还给出了生物原胺类神经递质和/或其代谢产物的检测方法,该方法能够准确、快速测定生物样品中生物原胺类神经递质和/或其代谢产物的含量、灵敏度高。并且,避免了生物原胺类神经递质及其代谢产物在测定处理过程中不稳定的问题。在此基础上,进而给出一种生物原胺类神经递质和/或其代谢产物的检测试剂盒。
本发明一方面提供了一种生物原胺类神经递质和/或其代谢产物的前处理方法,包括将含有生物原胺类神经递质和/或其代谢产物的样品衍生化,以及将衍生化产物进行在线固相萃取的步骤。
本发明任一项实施方式中,所述前处理方法包含如下(1)-(9)的任意一项或者多项:
(1)在线固相萃取的流动相为水和乙腈;
(2)在线固相萃取的富集阶段,乙腈和水的体积比为(5-15):(85-95)或(5-20):(80-95);具体为5:95、10:90、15:85或20:80;
(3)在线固相萃取的转移阶段,乙腈和水的体积比为(85-100):(0-15);具体为85:15、90:10、95:5或100:0;
(4)在线固相萃取的转移阶段,流动相的流速为0.2-1.0mL/min;
(5)在线固相萃取的柱活化阶段,乙腈和水的体积比为(5-15):(85-95)或(5-20):(80-95);具体为5:95、10:90、15:85或20:80;
(6)在线固相萃取流动相的洗脱程序为:乙腈5-15v/v%(0min,0.2-1mL/min)→乙腈5-15v/v%(2-5min,0.2-1.0mL/min)→乙腈85-100v/v%(5-8min,0.2-1.0mL/min)→乙腈85-100v/v%(8-12min,0.2-1.0mL/min)→乙腈85-100v/v%(8.5-12.5min,0.2-1.0mL/min)→乙腈85-100v/v%(9-13min,0.2-1.0mL/min)→乙腈5-15v/v%(9.5-13.5min,0.2-1.0mL/min)→乙腈5-15v/v%(10.5-14.5min,0.2-1.0mL/min)→乙腈5-15v/v%(12.5-16.5min,0.2-1.0mL/min);
(7)在线固相萃取柱为SPE柱、预柱或色谱柱;
(8)在线固相萃取柱的填料为以硅胶和/或其修饰物为基质的封端或未封端的反相碳十八、以硅胶和/或其修饰物为基质的封端或未封端的反相碳八、弱阳离子交换萃取柱、强阳离子交换萃取柱、官能化聚苯乙烯/二乙烯苯萃取柱、氧化铝萃取柱和HILIC萃取柱中的一种或多种;
(9)在线固相萃取柱为美国Thermo公司的Retain PEP Javelin,10mm×2.1mm,或者HYPERSIL ODS预柱,20×4mm,5μm。
本发明任一项实施方式中,所述前处理方法包含如下(1)-(13)的任意一项或者多项:
(1)衍生化是样品与衍生化试剂反应;
(2)衍生化试剂的结构含有与芳环连接的磺酰氯基或酰氯基;具体地,还含与芳环连接的胺基;更具体地,含对位或间位胺基;进一步具体地,胺基为伯胺、仲胺或者叔胺;
(3)衍生化试剂为2-氯苯磺酰氯、3-氯苯磺酰氯、4-(氯磺酰)异氰酸苯酯、4-氯苯磺酰氯、苯磺酰氯、2,3,4-三氟苯磺酰氯、2,3-二氯苯磺酰氯、2,4,5-三氯苯磺酰氯、2,4,6-三氯苯磺酰氯、2,4-二氟苯磺酰氯、2,4-二溴苯磺酰氯、2,4-二硝基苯磺酰氯、2,5-二氟苯磺酰氯、2,5-二氯苯磺酰氯、2,5-二溴苯磺酰氯、2,6-二氟苯磺酰氯、2-(三氟甲基)苯磺酰氯、2-氟苯磺酰氯、2-氯-4-(三氟甲基)苯磺酰氯、2-氯-4-氟苯磺酰氯、2-氯-4-氰基苯磺酰氯、2-氰基苯磺酰氯、2-溴-4,6-二氟苯磺酰氯、2-溴苯磺酰氯、2-溴-4-氟苯磺酰氯、2-甲基-5-硝基苯磺酰氯、2-硝基苯磺酰氯、3,4,5-三氟苯磺酰氯、3,4-二氟苯磺酰氯、3,4-二氯苯磺酰氯、3,5-二氟苯磺酰氯、3,5-二氯-2-羟基苯磺酰氯、3,5-二氯苯磺酰氯、3,5-二甲基苯磺酰氯、3-(三氟甲基)苯磺酰氯、3-氟-4-甲基苯磺酰氯、3-氟苯磺酰氯、3-氯-2-氟苯磺酰氯、3-氯-4-甲基苯磺酰氯、3-氰基-4-氟苯磺酰氯、3-氰基苯磺酰氯、3-溴苯磺酰氯、3-甲氧基苯磺酰氯、3-硝基苯磺酰氯、4,4'-亚甲基双(苯磺酰氯)、4-(三氟甲基)苯磺酰氯、4-(溴甲基)苯磺酰氯、4-(甲磺酰)苯磺酰氯、4-乙酰基苯磺酰氯、4-叔丁基苯磺酰氯、4-异丙基苯磺酰氯、4-氟-2-甲基苯磺酰氯、4-氟苯磺酰氯、4-氯-2-硝基苯磺酰氯、4- 氯-3-硝基苯磺酰氯、4-氰基苯磺酰氯、4-溴-2,5-二氟苯磺酰氯、4-溴-2,6-二氯苯磺酰氯、4-溴-2-氟苯磺酰氯、4-溴-2-氯苯磺酰氯、4-溴-3-氟苯磺酰氯、4-溴-3-甲基苯磺酰氯、4-溴苯磺酰氯、4-甲基-3-硝基苯磺酰氯、4-甲氧基苯磺酰氯、4-甲氧基苯磺酰氯、4-硝基苯磺酰氯、4-碘苯磺酰氯、4-苯氧基苯磺酰氯、5-氟-2-甲基苯磺酰氯、5-氯-2-氟苯磺酰氯、五氟苯磺酰氯、五甲基苯磺酰氯、2,4,6-三异丙基苯磺酰氯、2,4-二甲氧基苯磺酰氯、2,5-二甲氧基苯磺酰氯、2,5-双(三氟甲基)苯磺酰氯、2-(三氟甲氧基)苯磺酰氯、2-溴-4-(三氟甲基)苯磺酰氯、2-溴-5-(三氟甲基)苯磺酰氯、2-甲氧基-4-硝基苯磺酰氯、2-硝基-4-(三氟甲基)苯磺酰氯、3,4-二甲氧基苯磺酰氯、3,5-双(三氟甲基)苯磺酰氯、3-(三氟甲氧基)苯磺酰氯、3-(二氟甲氧基)苯磺酰氯、3-氟-4-甲氧基苯磺酰氯、3-溴-5-(三氟甲基)苯磺酰氯、4,4′-亚甲基双(苯磺酰氯)、4-(三氟甲氧基)苯磺酰氯、4-(二氟甲氧基)苯磺酰氯、4-(二甲氨基)偶氮苯-4′-磺酰氯、4-二甲胺基苯基偶氮苯磺酰氯、4-氟-2-三氟甲基苯磺酰氯、4-溴-2-(三氟甲基)苯磺酰氯、4-溴-2-(三氟甲氧基)苯磺酰氯、4-溴-3-(三氟甲基)苯磺酰氯、4-甲氧基-2,3,6-三甲基苯磺酰氯、4-硝基-3-(三氟甲基)苯磺酰氯、5-溴-2-甲氧基苯磺酰氯、(2-氯苯基)甲基磺酰氯、4-(氟磺酰)苯酰氯、对氨基苯磺酰氯、对氨基苯酰氯、对甲胺基苯磺酰氯、对甲胺基苯酰氯、对二甲胺基苯磺酰氯、对二甲胺基苯酰氯、间氨基苯磺酰氯、间氨基苯酰氯、间甲胺基苯磺酰氯、间甲胺基苯酰氯、间二甲胺基苯磺酰氯、间二甲胺基苯酰氯、4-二甲胺基苯基偶氮苯磺酰氯、1-二甲氨基萘-5-磺酰氯、对氨基萘磺酰氯、对氨基萘酰氯、对甲胺基萘磺酰氯、对甲胺基萘酰氯、对二甲胺基萘磺酰氯和对二甲胺基萘酰氯中的一种或多种;优选为对二甲胺基苯磺酰氯;
(4)对二甲胺基苯磺酰氯的合成路线为:
具体地,对二甲胺基苯磺酸溶液中通入氯气,以氢氧化钠为催化剂 在-20~0℃冰水浴中搅拌反应2-4小时,浓缩至干,固体以无水乙醇冲洗后,浓缩滤液,得对二甲氨基苯磺酰氯;
(5)衍生化试剂以甲醇或乙腈为溶剂配置成溶液使用;具体地,溶液浓度为1ng/mL~10mg/mL;
(6)衍生化在碱性环境下进行;具体地,碱性环境由乙酸铵、硼酸-碳酸氢钠缓冲盐、磷酸-磷酸钠缓冲盐、碳酸钠-碳酸氢钠缓冲盐、碳酸氢钠-氢氧化钠缓冲盐、硼酸-氢氧化钠缓冲盐和硼酸-四硼酸钠缓冲盐中一种或多种形成;
(7)衍生化温度为20-80℃;
(8)衍生化时间1-60min;
(9)衍生化为取代反应;
(10)样品为在体内或体外含细胞、组织、器官和维持体内正常功能的环境介质中至少一种的生物基质;具体地,所述样品为脑微渗析液、脑脊液、人工脑脊液、血浆、全血、血清、尿液和唾液中的一种或多种;
(11)生物原胺类神经递质和/或其代谢产物的结构含酚羟基和/或胺基;
(12)生物原胺类神经递质或其代谢产物为如下任意一种或多种:多巴胺(DA)、5-羟色胺(5-HT)、犬尿喹啉酸(KA)、4-二羟基苯乙酸(DOPAC)、5-羟吲哚乙酸(5-HIAA)、5-羟基吲哚-2-羧酸(5-Hydroxyindole-2-carboxylic acid)、高香草酸(HVA)、3,4-二羟基苄胺(DHBA)、3-羟基邻氨基苯甲酸(3-HAA)、去甲肾上腺素(NE)、肾上腺素(E)、犬尿氨酸(KYN)、3-甲氧基-4-羟基苯乙二醇(MHPG)、色氨酸(TRP)、3-羟基犬尿氨酸(3-HK)、香草基扁桃酸(VMA)、褪黑素(Melatonin)和喹啉酸(Quinolinic Acid),结构式如下所示:
具体地,生物原胺类神经递质或其代谢产物为多巴胺(DA)、去甲肾上腺素(NE)、肾上腺素(E)、5-羟色胺(5-HT)、犬尿氨酸(KYN)及其代谢产物中一种或多种;
(13)还包括样品衍生化前进行蛋白沉淀;具体地,蛋白沉淀是样品和有机溶剂混合、离心取上清液;更具体地,有机溶剂为甲醇-乙腈溶剂或者三氯乙酸-高氯酸溶剂;进一步具体地,样品和有机溶剂体积比为(1:1)-(1:5)。
本发明再一方面提供了一种生物原胺类神经递质和/或其代谢产物的检测方法,包含前述的前处理方法,以及对前处理产物进行测定的步骤。
本发明任一项实施方式中,所述检测方法包含如下(1)-(8)任意一项或者多项:
(1)所述测定为定性或者定量测定;
(2)采用液质联用进行测定;
(3)液相色谱色谱柱的填料为以硅胶和/或其修饰物为基质的封端或未封端的反相碳十八、以硅胶和/或其修饰物为基质的封端或未封端的反相碳八、弱阳离子交换萃取柱、强阳离子交换萃取柱、官能化聚苯乙烯/二乙烯苯萃取柱、氧化铝萃取柱和HILIC萃取柱中一种或多种;
(4)液相色谱的柱温为30-35℃;
(5)液相色谱的样品池保持4℃;
(6)液相色谱的流动相为水和乙腈;具体地,流动相的洗脱程序为:乙腈20-30v/v%(0min,0.2-1.0mL/min)→乙腈20-30v/v%(2-5min,0.2-1.0mL/min)→乙腈70-90v/v%(5-8min,0.2-1.0mL/min)→乙腈70-90v/v%(8.0-12.0min,0.2-1.0mL/min)→乙腈20-30v/v%(8.5-16.5min,0.2-1.0mL/min);
(7)质谱的离子源为电喷雾离子源;具体地,离子喷射电压为4000-4500V;更具体地,雾化气压力为35-45psi;进一步具体地,干燥器温度为300-350℃,流速为9-10L/min;更进一步具体地,检测方式为正离子多反应监测模式;
(8)所述前处理产物为在线固相萃取的转移阶段转移至液相色谱
的物质。
本发明另一方面提供了一种生物原胺类神经递质和/或其代谢产物的检测试剂盒,包括衍生化试剂和在线固相萃取柱;具体地,还包括与萃取柱配合使用的流动相试剂;更具体地,还包括碱性调节剂。
本发明任一项实施方式中,所述检测试剂盒包含如下(1)-(6)中任意一项或者多项,
(1)流动相试剂为水和乙腈的混合液;
(2)流动相试剂包括第一流动相试剂、第二流动相试剂和第三流动相试剂,分别用于在线固相萃取的富集、转移和柱活化阶段;
(3)第一流动相试剂中,乙腈和水的体积比为(5-15):(85-95)或(5-20):(80-95);
(4)第二流动相试剂中,乙腈和水的体积比为(85-100):(0-15);
(5)第三流动相试剂中,乙腈和水的体积比为(5-15):(85-95)或(5-20):(80-95);
(6)衍生化试剂的结构含有与芳环连接的磺酰氯基或酰氯基;具体地,还含有与芳环连接的胺基;更具体地,胺基为对位或间位胺基;进一步具体地,衍生化试剂为2-氯苯磺酰氯、3-氯苯磺酰氯、4-(氯磺酰)异氰酸苯酯、4-氯苯磺酰氯、苯磺酰氯、2,3,4-三氟苯磺酰氯、2,3-二氯苯磺酰氯、2,4,5-三氯苯磺酰氯、2,4,6-三氯苯磺酰氯、2,4-二氟苯磺酰氯、2,4-二溴苯磺酰氯、2,4-二硝基苯磺酰氯、2,5-二氟苯磺酰氯、2,5-二氯苯磺酰氯、2,5-二溴苯磺酰氯、2,6-二氟苯磺酰氯、2-(三氟甲基)苯磺酰氯、2-氟苯磺酰氯、2-氯-4-(三氟甲基)苯磺酰氯、2-氯-4-氟苯磺酰氯、2-氯-4-氰基苯磺酰氯、2-氰基苯磺酰氯、2-溴-4,6-二氟苯磺酰氯、2-溴苯磺酰氯、2-溴-4-氟苯磺酰氯、2-甲基-5-硝基苯磺酰氯、2-硝基苯磺酰氯、3,4,5-三氟苯磺酰氯、3,4-二氟苯磺酰氯、3,4-二氯苯磺酰氯、3,5-二氟苯磺酰氯、3,5-二氯-2-羟基苯磺酰氯、3,5-二氯苯磺酰氯、3,5-二甲基苯磺酰氯、3-(三氟甲基)苯磺酰氯、3-氟-4-甲基苯磺酰氯、3-氟苯磺酰氯、3-氯-2-氟苯磺酰氯、3-氯-4-甲基苯磺酰氯、3-氰基-4-氟苯磺酰氯、3-氰基苯磺酰氯、3-溴苯磺酰氯、3-甲氧基苯磺酰氯、3-硝基苯磺酰氯、4,4'-亚甲基双(苯磺酰氯)、4-(三氟甲基)苯磺酰氯、4-(溴甲基)苯磺酰氯、4-(甲磺酰)苯磺酰氯、4-乙酰基苯磺酰氯、4-叔丁基苯磺酰氯、4-异丙基苯磺酰氯、4-氟-2-甲基苯磺酰氯、4-氟苯磺酰氯、4-氯-2-硝基苯磺酰氯、4-氯-3-硝基苯磺酰氯、4-氰基苯磺酰氯、4-溴-2,5-二氟苯磺酰氯、4-溴-2,6- 二氯苯磺酰氯、4-溴-2-氟苯磺酰氯、4-溴-2-氯苯磺酰氯、4-溴-3-氟苯磺酰氯、4-溴-3-甲基苯磺酰氯、4-溴苯磺酰氯、4-甲基-3-硝基苯磺酰氯、4-甲氧基苯磺酰氯、4-甲氧基苯磺酰氯、4-硝基苯磺酰氯、4-碘苯磺酰氯、4-苯氧基苯磺酰氯、5-氟-2-甲基苯磺酰氯、5-氯-2-氟苯磺酰氯、五氟苯磺酰氯、五甲基苯磺酰氯、2,4,6-三异丙基苯磺酰氯、2,4-二甲氧基苯磺酰氯、2,5-二甲氧基苯磺酰氯、2,5-双(三氟甲基)苯磺酰氯、2-(三氟甲氧基)苯磺酰氯、2-溴-4-(三氟甲基)苯磺酰氯、2-溴-5-(三氟甲基)苯磺酰氯、2-甲氧基-4-硝基苯磺酰氯、2-硝基-4-(三氟甲基)苯磺酰氯、3,4-二甲氧基苯磺酰氯、3,5-双(三氟甲基)苯磺酰氯、3-(三氟甲氧基)苯磺酰氯、3-(二氟甲氧基)苯磺酰氯、3-氟-4-甲氧基苯磺酰氯、3-溴-5-(三氟甲基)苯磺酰氯、4,4′-亚甲基双(苯磺酰氯)、4-(三氟甲氧基)苯磺酰氯、4-(二氟甲氧基)苯磺酰氯、4-(二甲氨基)偶氮苯-4′-磺酰氯、4-二甲胺基苯基偶氮苯磺酰氯、4-氟-2-三氟甲基苯磺酰氯、4-溴-2-(三氟甲基)苯磺酰氯、4-溴-2-(三氟甲氧基)苯磺酰氯、4-溴-3-(三氟甲基)苯磺酰氯、4-甲氧基-2,3,6-三甲基苯磺酰氯、4-硝基-3-(三氟甲基)苯磺酰氯、5-溴-2-甲氧基苯磺酰氯、(2-氯苯基)甲基磺酰氯、4-(氟磺酰)苯酰氯、对氨基苯磺酰氯、对氨基苯酰氯、对甲胺基苯磺酰氯、对甲胺基苯酰氯、对二甲胺基苯磺酰氯、对二甲胺基苯酰氯、间氨基苯磺酰氯、间氨基苯酰氯、间甲胺基苯磺酰氯、间甲胺基苯酰氯、间二甲胺基苯磺酰氯、间二甲胺基苯酰氯、4-二甲胺基苯基偶氮苯磺酰氯、1-二甲氨基萘-5-磺酰氯、对氨基萘磺酰氯、对氨基萘酰氯、对甲胺基萘磺酰氯、对甲胺基萘酰氯、对二甲胺基萘磺酰氯和对二甲胺基萘酰氯中的一种或多种,优选为对二甲胺基苯磺酰氯;更进一步具体地,衍生化试剂以乙腈为溶剂配置成溶液使用;更加具体地,溶液的浓度为1ng/mL~10mg/mL。
本发明任一项实施方式中,所述检测试剂盒包含如下(1)-(5)任意一项或者多项:
(1)在线固相萃取柱为SPE柱、预柱或色谱柱;
(2)在线固相萃取柱的填料为以硅胶和/或其修饰物为基质的封端或未封端的反相碳十八、以硅胶和/或其修饰物为基质的封端或未封端的 反相碳八、弱阳离子交换萃取柱、强阳离子交换萃取柱、官能化聚苯乙烯/二乙烯苯萃取柱、氧化铝萃取柱和HILIC萃取柱中一种或多种;
(3)在线固相萃取柱为美国Thermo公司的Retain PEP Javelin,10mm×2.1mm,或者HYPERSIL ODS预柱,20×4mm,5μm;
(4)碱性调节剂为乙酸铵、硼酸-碳酸氢钠缓冲盐、磷酸-磷酸钠缓冲盐、碳酸钠-碳酸氢钠缓冲盐、碳酸氢钠-氢氧化钠缓冲盐、硼酸-氢氧化钠缓冲盐和硼酸-四硼酸钠缓冲盐中的一种或多种;
(5)还包括蛋白沉淀剂;具体地,所述蛋白沉淀剂为甲醇-乙腈溶剂或者三氯乙酸-高氯酸溶剂。
本发明又一方面提供了前述检测试剂盒在生物原胺类神经递质和/或其代谢产物检测中的用途;具体地,所述检测为定性或定量检测;更具体地,生物原胺类神经递质和/或其代谢产物的结构含酚羟基和/或胺基;进一步具体地,生物原胺类神经递质或其代谢产物为如下任意一种或多种:多巴胺(DA)、5-羟色胺(5-HT)、犬尿喹啉酸(KA)、4-二羟基苯乙酸(DOPAC)、5-羟吲哚乙酸(5-HIAA)、5-羟基吲哚-2-羧酸(5-Hydroxyindole-2-carboxylic acid)、高香草酸(HVA)、3,4-二羟基苄胺(DHBA)、3-羟基邻氨基苯甲酸(3-HAA)、去甲肾上腺素(NE)、肾上腺素(E)、犬尿氨酸(KYN)、3-甲氧基-4-羟基苯乙二醇(MHPG)、色氨酸(TRP)、3-羟基犬尿氨酸(3-HK)、香草基扁桃酸(VMA)、褪黑素(Melatonin)和喹啉酸(Quinolinic Acid);更为具体地,生物原胺类神经递质或其代谢产物为多巴胺、去甲肾上腺素、肾上腺素、5-羟色胺、犬尿氨酸及其代谢产物中一种或多种。
本发明还提供了一种在体内或体外检测生物原胺类神经递质和/或其代谢产物的方法,包括使用有效量前述的检测试剂盒的步骤。
本发明又一方面提供了式Ⅰ所示的对二甲胺基苯磺酰氯化合物,
本发明还提供了对二甲胺基苯磺酰氯的合成路线如下,
具体地,对二甲胺基苯磺酰氯的制备方法包括向对二甲胺基苯磺酸溶液通入氯气,以氢氧化钠为催化剂在-20~0℃条件下反应2-4小时的步骤;更具体地,还包括将反应产物浓缩至干,固体以无水乙醇冲洗,浓缩滤液。
本发明进一步还提供了对二甲胺基苯磺酰氯在生物原胺类神经递质和/或其代谢产物的衍生化、前处理或检测中的用途。
本发明中术语“生物原胺类神经递质”是一类脑内具有神经调节活性的含氮的低分子量有机化合物的总称。主要包括多巴胺(DA)、5-羟色胺(5-HT)、去甲肾上腺素(NE)、肾上腺素(E)等。
本发明中术语“生物原胺类神经递质代谢产物”是指生物原胺类神经递质在生物体内代谢转化成的代谢产物。例如5-羟色胺代谢转化成的5-羟吲哚乙酸,多巴胺按以下路径代谢转化成的4-二羟基苯乙酸、高香草酸等。
发明的有益效果
1.本发明采用衍生化处理与在线固相萃取结合的前处理方法,能够去除衍生化产物中的盐类杂质,以及未反应的生物原胺类神经递质和/或其代谢产物原形,减少了这些物质对后续检测的影响。
2.本发明在线固相萃取步骤采用水和乙腈为流动相,并于富集阶段,在保证衍生化产物不被洗脱前提下尽可能提高乙腈的比例,有助于将衍生化产物中的盐类杂质和未反应的生物原胺类神经递质和/或其代谢产物原形洗脱掉,减少杂质对后续检测的干扰。
3.本发明在线固相萃取的转移阶段,采用含高比例乙腈的流动相,有利于衍生化产物的快速洗脱。同时,流动相结合本发明的萃取柱,无需浓缩可使衍生化产物以适宜的浓度转移至后续检测步骤,既保证了后续检测的灵敏度,又能够减少后续检测的峰展宽。
4.本发明在线固相萃取的柱活化阶段,采用含低比例乙腈的流动相长时间活化萃取柱,可以大大降低萃取柱的杂质残留量,从而保证后续使用的效果。
5.申请人设计合成了对二甲氨基苯磺酰氯,并在本发明中作为衍生化试剂使用,其衍生化反应的条件温和、易于控制,更易与生物原胺类神经递质和/或其代谢产物发生反应,效率更高。
6.本发明生物原胺类神经递质和/或其代谢产物的检测方法,能够快速、准确地检测出样品中的生物原胺类神经递质和/或其代谢产物的含量,灵敏度高、检测准确。
7.本发明检测方法中,液相色谱样品池保持低温,有助于衍生化产物的稳定,有利于准确检测。
8.本发明检测方法,在线固相萃取能够同步实现生物原胺类神经递质和/或其代谢产物的除盐和富集,避免了现有技术中生物原胺类神经递质和/或其代谢产物不稳定,前处理时降解、回收率低和前处理步骤复杂的问题。
9.本发明检测方法中,在线固相萃取富集、转移步骤的流动相组成及洗脱程序设计、阀切换程序设计,能够实现待测物在除杂阶段的强保留和检测阶段快洗脱,并且柱活化能够提高在线固相萃取柱的寿命。
附图说明
图1:本发明实施例1产物的质谱图;
图2:对二甲胺基苯磺酰氯和生物原胺类神经递质的衍生化反应通式。
图3(a):在线固相萃取中富集步骤的示意图。
图3(b):在线固相萃取中转移步骤的示意图。
图3(c):在线固相萃取中柱活化步骤的示意图。
图4(a):实施例1大鼠空白脑组织匀浆中5-HT的色谱图。
图4(b):实施例1大鼠空白脑组织匀浆中5-HIAA的色谱图。
图4(c):实施例1大鼠空白脑组织匀浆中DA的色谱图。
图4(d):实施例1大鼠空白脑组织匀浆中DOPAC的色谱图。
图4(e):实施例1大鼠空白脑组织匀浆中NE的色谱图。
图4(f):实施例1大鼠空白脑组织匀浆中IS的色谱图。
图4(g):实施例1大鼠空白脑组织匀浆中HVA的色谱图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述,但是本领域技术人员将会理解,下列实施例仅用于说明本发明,而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者,按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1:生物原胺类神经递质及其代谢产物的测定(1)
1.所用试剂与材料:
大鼠空白脑组织匀浆液:将大鼠断头处死,小心剪开头骨并取出脑组织。精密称取大鼠空白脑组织,加入9倍体积的10mM的抗坏血酸水溶液,应用高速匀浆器匀浆成为10%的大鼠空白脑组织匀浆液。
内标溶液:乙腈溶解稀释的对乙酰氨基酚溶液。
神经递质标准品溶液:向生物原胺类神经递质标准品加入10mM的抗坏血酸水溶液配制。其中,生物原胺类神经递质标准品自Sigma公司购买。
碳酸钠-氢氧化钠缓冲盐,以及含1mg/mL对二甲胺基苯磺酰氯的乙腈溶液。
其中,对二甲胺基苯磺酰氯可采用现有的任何方法合成,也可按照申请人提出的如下路线合成。
将对二甲氨基苯磺酸溶解于二氯甲烷中,加入适量氢氧化钠催化,通入干燥氯气,在-20~0℃的冰水浴下搅拌反应2-4小时。后处理:浓缩反应液至干。固体用绝对无水乙醇洗三次后,浓缩滤液,得产物对二甲氨基苯磺酰氯,质谱如图1所示。其中氯气的生成方法为常规方法,即由次氯酸钙和浓盐酸反应生成,并用干燥剂干燥。
2.测定方法: 
向大鼠空白脑组织匀浆中加入一定量的内标溶液和系列浓度的神经递质标准品溶液,加入碳酸钠-氢氧化钠缓冲盐和1mg/mL的对二甲胺基苯磺酰氯的乙腈溶液,涡旋混合30s后,置于37℃反应40min,对二甲胺基苯磺酰氯与生物原胺类神经递质的衍生化反应如图2所示。进样前,在14000r/min下离心5min,进样50μL,进行在线固相萃取-液质联用(On-line-HPLC-MS/MS)分析。
在线固相萃取的条件:SPE柱为Retain PEP Javelin,10mm×2.1mm,美国Thermo公司。在线固相萃取过程的富集、转移和柱活化步骤是通过阀的切换实现的,如图3(a)-图3(c)所示。富集时,六通阀1-6相连,进样后,样品过SPE柱进行除杂和吸附富集;之后,六通阀1-2相连,洗脱剂由SPE泵(图3(b)的液相泵)进入以洗脱SPE柱,将SPE柱上的待测物转移至分析柱(液相色谱)进行分析;然后,六通阀1-6再次相连,SPE柱进行柱活化,分析柱平衡。其中,SPE泵的梯度洗脱程序及阀的切换程序见表1。
液相色谱的检测条件:U3000液相色谱仪(美国Thermo公司),配有双三元梯度泵、在线真空脱气机、自动进样器、VWD检测器和变色龙7.1软件;分析柱:色谱柱ZORBAX SB-C18,50×2.1mm×3.5μm,美国Agilent公司;柱温35℃,样品池4℃。其中,控制流动相的洗脱泵的洗脱程序见表1。
质谱的检测条件:Agilent6410三级四级杆质谱仪,配有电喷雾(ESI)接口、MSD检测器、Agilent化学工作站。离子源为电喷雾离子源(ESI);离子喷射电压:4500V;雾化气压力45Psi;干燥器温度350℃,流速10L/min;检测方式为正离子多反应监测模式(MRM)。
表1
生物原胺类神经递质及其代谢产物定量分析所对应的离子对及质谱条件如表2所示。
表2
3.测定及计算结果:
3.1上述实验方法得到的典型色谱图见图4(a)-图4(g)。
3.2绘制标准曲线:
将系列浓度的生物原胺类神经递质标准溶液分别加入大鼠空白脑组织匀浆中,再加入一定量的内标溶液(乙腈溶解稀释的对乙酰氨基酚溶液),并按照1的方法对样品进行测定,并采用内标法计算浓度。同时,按照1的方法测定大鼠空白脑组织匀浆,并用内标法计算本底值,每个样品的测定值减去大鼠空白脑组织匀浆的本底值为校正峰面积,以浓度为横坐标,校正峰面积为纵坐标绘制各种生物原胺类神经递质的标准曲线,见表3。
表3
3.3精密度和准确度:
取多份50μL的大鼠空白脑组织匀浆,从各神经递质标准曲线范围内选择高、中、低三个标准浓度各50μL分别加入到多份大鼠空白脑组织匀浆液中,再加入内标物混匀,形成多个试样,按照本实施例1的方法对试样进行前处理、检测,并除去本底值,计算精密度和准确度,结果见表4。
表4
由上表可知,本发明检测方法的精密度为3.8-11.3%,准确度达到95%以上。
3.4回收率和基质抑制
(1)向各种生物原胺类神经递质中分别加入50μL大鼠空白脑组织匀浆,将每种生物原胺类神经递质分别制成低、中、高三种浓度(浓度与表4相同)的匀浆样品,同时制备相同浓度不含大鼠空白脑组织匀浆的标准样品。除不加内标外,分别按1方法测定峰面积,按照下式计算回收率,结果见表5。其中,每种生物原胺类神经递质的回收率为低、中、
高浓度测定的平均值。
回收率=匀浆样品峰面积/标准样品峰面积×100%
(2)取大鼠空白脑组织匀浆,14000r/min下离心5min后,取上清 液。向各种生物原胺类神经递质中分别加入50μL上清液基质,将每种生物原胺类神经递质分别制成低、中、高三种浓度(浓度与表4相同)的基质样品,同时制备相同浓度不含上清液基质的标准样品。除不加内标外,分别按1方法测定峰面积,按照下式计算基质抑制,结果见表5。其中,每种生物原胺类神经递质的基质抑制为低、中、高浓度测定的平均值。测定基质抑制率是为了考察内源性和引入杂质对测定结果的影响,以总体说明基质的影响。若基质抑制率不能达到85-115%,则说明存在基质抑制或基质诱导现象。
基质抑制率=基质样品峰面积/标准样品峰面积×100%
表5
名称 基质抑制(%) 回收率(%)
NE 110.5±4.2 104.2±5.3
DA 98.8±5.3 104.3±3.4
5-HT 113.3±2.3 91.3±8.4
DOPAC 95.3±6.4 99.4±8.8
HVA 109.8±5.8 104.2±7.2
5-HIAA 94.5±8.4 89.7±10.3
实施例2:生物原胺类神经递质及其衍生化产物的稳定性研究
1.实验方法: 
考察各种生物原胺类神经递质及其代谢产物在不同pH介质等条件中的稳定性,及生物原胺类神经递质衍生化产物的稳定性。
将生物原胺类神经递质或其代谢产物精密称定,用10mM的抗坏血酸水溶液配制成1mg/mL溶液。分别用1%甲酸(pH=1)、10mM乙酸铵(pH=5)和人工脑脊液(pH=7.4)稀释,使其浓度分别为10ng/mL、100ng/mL和1000ng/mL或40ng/mL、400ng/mL和4000ng/mL。样品置于37℃、50rpm,分别加热0、2、4、8、16和24小时终止加热。取各样品 按照实施例1的方法对生物原胺类神经递质或其代谢产物进行衍生化处理,将衍生化产物在一定温度下放置一定时间后按照实施例1的方法进行检测,考察衍生化产物在不同温度下的稳定性。
稳定性回收率=各点测定值/0小时测定值×100%
稳定性回收率在85-115%范围内即认为稳定性良好。
2.实验结果: 
所有生物原胺类神经递质及其代谢产物原形在pH=1的溶液中37℃加热24小时稳定性良好。
在pH=5的溶液内以37℃加热,5-HIAA、5-HT、DOPAC、HVA在24小时内稳定性良好,DA和NE在4小时内稳定良好,但24小时后分别下降至0小时的41%和42.9%。
在pH=7.4的溶液37℃加热,5-HIAA和HVA在8小时内稳定性良好,DOPAC和5-HT在4小时内稳定性良好,NE和DA在2小时内稳定性良好。
所有生物原胺类神经递质的衍生化产物-20℃放置3天以及4℃放置1天均稳定性良好,各样品线性良好。
实施例3:生物原胺类神经递质及其代谢产物的测定(2)
1.测定方法:
参照实施例1的测定方法。 
不同的是,衍生化试剂溶液使用苯磺酰氯的乙腈溶液,浓度为1mg/mL。生物原胺类神经递质及其代谢产物定量分析所对应的离子对及质谱条件如表6所示。
表6
2.测定结果: 
2.1绘制标准曲线:
精密称量氯化钠、氯化钾、氯化钙、氯化镁、磷酸氢二钠和4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPEs)固体粉末加入1L双蒸水中,振荡溶解,使其分别含147mmol/L氯化钠、3mmol/L氯化钾、1.2mmol/L氯化钙、1.2mmol/L氯化镁、2.0mmol/L磷酸氢二钠和10mmol/L 4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPEs),再用0.1mol/L氢氧化钠调至pH=7.4,得到空白人工脑脊液。
取多份空白人工脑脊液,将系列浓度的生物原胺类神经递质分别加入不同份的空白人工脑脊液中,加入内标物,采用本实施例1中的方法测定,并用内标法计算浓度。以浓度为横坐标,色谱峰面积为纵坐标绘制各种生物原胺类神经递质的标准曲线,见表7。
表7
名称 LOD(ng/mL) LOQ(ng/mL) R2 线性范围ng/mL
NE 0.05 0.20 0.9912 1-1000
DA 0.05 0.20 0.9854 1-1000
5HT 0.05 0.10 0.9911 1-1000
[0161] 
DOPAC 0.10 0.20 0.9904 4-4000
HVA 0.05 0.10 0.9898 1-1000
5-HIAA 0.05 0.10 0.9879 4-4000
KA 0.20 0.50 0.9915 4-4000
KYN 0.05 0.20 0.9924 1-1000
3-HK 0.5 1.00 0.9956 1-1000
3-HAA 1.00 2.00 0.9899 10-10000
ME 0.05 0.20 0.9869 1-1000
TRP 0.05 0.10 0.9917 1-1000
2.2精密度和准确度
取多份50μL的空白人工脑脊液,从各神经递质标准曲线范围内选择高、中、低三个标准浓度各50μL分别加入到多份空白人工脑脊液中,再加入内标物混匀,形成多个试样,按照本实施例1的测定方法前处理、检测,并计算精密度和准确度,结果见表8。
表8
由上表可知,本发明检测方法的精密度为2.1-11.2%,准确度达到93% 以上。
2.3回收率和基质抑制
对于各种生物原胺类神经递质,在其标准曲线范围内选择高、中、低三个浓度(与表8相同),参照实施例1方法(不同的是,以空白人工脑脊液代替大鼠空白脑组织匀浆使用)进行回收率和基质抑制效应考察(n=3),结果见表9。
表9
名称 基质抑制(%) 回收率(%)
NE 90.4±3.7 93.9±6.2
DA 95.5±6.5 100.1±3.2
5-HT 94.7±9.9 97.5±14.7
DOPAC 97.1±5.4 101.7±7.7
HVA 94.1±5.5 100.1±11.9
5-HIAA 96.5±4.1 98.0±5.1
KA 92.6±4.3 98.0±6.3
KYN 91.3±4.4 96.4±10.0
3-HK 94.8±9.3 102.4±12.8
3-HAA 97.6±12.0 103.9±7.7
ME 95.4±5.8 98.8±3.0
TRP 93.7±4.6 96.1±5.4
实施例4:生物原胺类神经递质及其代谢产物的测定(3)
1.测定方法:
参照实施例1的测定方法。 
不同的是,衍生化试剂溶液使用2-萘磺酰氯的乙腈溶液,浓度为1mg/mL。生物原胺类神经递质及其代谢产物定量分析所对应的离子对及质谱条件如表10所示。
表10
名称 衍生化基团数 离子对 裂解电压(V) 碰撞能量(eV)
NE 3 740>128.1 148 40
DA 3 724>127.1 145 40
5HT 2 557>127.1 134 40
DOPAC 2 547>127.1 133 40
HVA 1 373>128.1 123 28
5-HIAA 1 382>128.1 133 28
KA 1 380>127.1 108 28
KYN 2 589>128.1 138 40
3-HK 2 605>128.1 171 40
3-HAA 1 342>128.1 152 25
ME 1 423>128.1 143 25
TRP 1 395>128.1 138 25
2.测定结果: 
2.1绘制标准曲线:
取多份空白人工脑脊液,将系列浓度的生物原胺类神经递质分别加入不同份的空白人工脑脊液中,加入内标物,采用本实施例1中的方法测定,并用内标法计算浓度。以浓度为横坐标,色谱峰面积为纵坐标绘制各种生物原胺类神经递质的标准曲线,见表11。
表11
名称 LOD(ng/mL) LOQ(ng/mL) R2 线性范围ng/mL
NE 0.05 0.2 0.9956 1-1000
DA 0.05 0.2 0.9896 1-1000
5HT 0.05 0.1 0.9913 1-1000
DOPAC 0.1 0.2 0.9954 4-4000
HVA 0.02 0.1 0.9968 1-1000
[0183] 
5-HIAA 0.05 0.1 0.9887 4-4000
KA 0.2 0.5 0.9896 4-4000
KYN 0.05 0.2 0.9945 1-1000
3-HK 0.5 1.0 0.9958 1-1000
3-HAA 1.0 2.0 0.9981 10-10000
ME 0.05 0.2 0.9967 1-1000
TRP 0.05 0.1 0.9938 1-1000
2.2精密度和准确度
取多份50μL的空白人工脑脊液,从各神经递质标准曲线范围内选择高、中、低三个标准浓度各50μL分别加入到多份空白人工脑脊液中,再加入内标物混匀,形成多个试样,按照本实施例1的测定方法前处理、检测,并计算精密度和准确度,结果见表12。
表12
由上表可知,本发明检测方法的精密度为2.4-12.9%,准确度达到92%以上。
2.3回收率和基质抑制
对于各种生物原胺类神经递质,在其标准曲线范围内选择高、中、低三个浓度(与表12相同),参照实施例1方法(不同的是,以空白人工脑脊液代替大鼠空白脑组织匀浆使用)进行回收率和基质抑制效应考察(n=3),结果见表13。
表13
名称 基质抑制(%) 回收率(%)
NE 96.4±14.0 101.0±7.2
DA 99.6±10.3 103.8±8.0
5-HT 103.4±11.1 100.9±13.7
DOPAC 101.8±9.9 103.6±6.8
HVA 98.1±11.9 106.2±6.4
5-HIAA 99.6±9.0 104.6±6.5
KA 97.4±9.0 102.0±8.8
KYN 95.6±11.5 104.9±6.5
3-HK 97.4±13.8 109.9±4.1
3-HAA 98.2±13.1 109.2±3.1
ME 99.5±12.5 103.7±5.6
TRP 96.9±10.0 102.9±6.5
实施例5:生物原胺类神经递质及其代谢产物的测定(4)
1.测定方法:
参照实施例1的测定方法。 
不同的是,在线固相萃取条件:SPE柱为HYPERSIL ODS预柱,20×4mm,5μm,美国Thermo公司。
其中,SPE泵和洗脱泵的梯度洗脱程序见表14。
表14
2.测定及计算结果:
2.1绘制标准曲线:
取多份空白人工脑脊液,将系列浓度的生物原胺类神经递质分别加入不同份的空白人工脑脊液中,加入内标物,采用本实施例1中的方法测定,并用内标法计算浓度。以浓度为横坐标,色谱峰面积为纵坐标绘制各种生物原胺类神经递质的标准曲线,见表15。
表15
名称 LOD(ng/mL) LOQ(ng/mL) R2 线性范围ng/mL
NE 0.05 0.20 0.9997 1-1000
DA 0.05 0.20 0.9954 1-1000
5HT 0.05 0.10 0.9901 1-1000
DOPAC 0.10 0.20 0.9924 4-4000
HVA 0.05 0.10 0.9918 1-1000
5-HIAA 0.10 0.20 0.9989 4-4000
2.2精密度和准确度
取多份50μL的空白人工脑脊液,从各神经递质标准曲线范围内选 择高、中、低三个标准浓度各50μL分别加入到多份空白人工脑脊液中,再加入内标物混匀,形成多个试样,按照本实施例1的测定方法检测,并计算精密度和准确度,结果见表16。
表16
由上表可知,本发明检测方法的精密度为0.4-14.5,准确度为92%以上。
2.3回收率和基质抑制
对于各种生物原胺类神经递质,在其标准曲线范围内选择高、中、低三个浓度(与表16相同),参照实施例1方法(不同的是,以空白人工脑脊液代替大鼠空白脑组织匀浆使用)进行回收率和基质抑制效应考察(n=3),结果见表17。
表17
名称 基质抑制(%) 回收率(%)
NE 102.5±11.9 95.2±4.3
DA 103.2±12.8 99.5±3.0
5-HT 106.8±5.9 96.5±15.3
DOPAC 106.7±4.5 101.6±7.8
HVA 101.9±8.8 100.4±11.4
5-HIAA 103.6±6.3 99.3±2.9
实施例6:生物原胺类神经递质及其代谢产物的测定(5)
1.测定方法:
参照实施例1的测定方法。 
不同的是,在线固相萃取条件:SPE柱为ZORBAX SB-C18分析柱,30×2.1mm,3.5μm,美国Agilent公司。
其中,SPE泵和洗脱泵的梯度洗脱程序见表18。
表18
2.测定结果: 
2.1绘制标准曲线:
取多份空白人工脑脊液,将系列浓度的生物原胺类神经递质分别加入不同份的空白人工脑脊液中,加入内标物,采用本实施例1中的方法测定,并用内标法计算浓度。以浓度为横坐标,色谱峰面积为纵坐标绘制各种生物原胺类神经递质的标准曲线,见表19。
表19
名称 LOD(ng/mL) LOQ(ng/mL) R2 线性范围ng/mL
NE 0.05 0.20 0.9897 1-1000
DA 0.05 0.20 0.9994 1-1000
5HT 0.05 0.10 0.9968 1-1000
DOPAC 0.10 0.20 0.9984 4-4000
HVA 0.05 0.10 0.9904 1-1000
5-HIAA 0.10 0.20 0.9876 4-4000
2.2精密度和准确度
取多份50μL的空白人工脑脊液,从各神经递质标准曲线范围内选择高、中、低三个标准浓度各50μL分别加入到多份空白人工脑脊液中,再加入内标物混匀,形成多个试样,按照本实施例1的测定方法前处理、检测,并计算精密度和准确度,结果见表20。
表20
由上表可知,本发明检测方法的精密度为4.4-12.4,%,准确度为92%以上。
2.3回收率和基质抑制
对于各种生物原胺类神经递质,在其标准曲线范围内选择高、中、低三个浓度(与表20相同),参照实施例1方法(不同的是,以空白人工脑脊液代替大鼠空白脑组织匀浆使用)进行回收率和基质抑制效应考察 (n=3),结果见表21。
表21
名称 基质抑制(%) 回收率(%)
NE 96.4±14.0 101.0±7.2
DA 99.6±10.3 103.8±8.0
5-HT 103.4±11.1 100.9±13.7
DOPAC 101.8±9.9 103.6±6.8
HVA 98.1±11.9 106.2±6.4
5-HIAA 99.6±9.0 104.6±6.5
实施例7:不同生物样品中生物原胺类神经递质及其代谢产物的含量测定
1.测定方法: 
取大鼠空白纹状体和皮层组织20-100mg,加入含有10mM抗坏血酸和内标物的溶液,加入比例为(1:1)-(1:5),冰浴条件下制备脑组织匀浆液。取组织匀浆液,加入适量的硼酸-碳酸钠缓冲液,再加入100μL的丹磺酰氯溶液,涡旋混合30秒后,置于37℃反应40分钟。进样前14000r/min离心5min,按照实施例1参数进样50μL,进行测定分析。
2.测定结果: 
大鼠空白纹状体和皮层组织中各生物原胺类神经递质及其代谢产物的含量结果见表22。
表22
实施例8:不同衍生化试剂的衍生化效果对比
1.测定方法
精密称量氯化钠、氯化钾、氯化钙、氯化镁、磷酸氢二钠和4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPEs)固体粉末加入1L双蒸水中,振荡溶解,使其分别含147mmol/L氯化钠、3mmol/L氯化钾、1.2mmol/L氯化钙、1.2mmol/L氯化镁、2.0mmol/L磷酸氢二钠和10mmol/L 4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPEs),再用0.1mol/L氢氧化钠调至pH=7.4,得到空白人工脑脊液。将一定浓度的神经递质标准溶液加入至空白人工脑脊液中配置样品,使神经递质的浓度为1μg/mL。再向样品中加入一定量的内标溶液(乙腈溶解稀释的对乙酰氨基酚溶液),并加入碳酸钠-氢氧化钠缓冲盐,分别使用下表衍生化试剂的乙腈溶液(浓度1mg/mL)进行衍生化反应,即涡旋混合30s后,置于37℃反应10min。参照实施例1的测定方法测定得峰面积,结果见表23。
2.测定结果
表23
结果显示,相同衍生化条件下,对于不含胺基的DOPAC和HVA,对二甲胺基苯磺酰氯和丹磺酰氯分子衍生化产物灵敏度高于苯磺酰氯。对于含胺基的NE,三者的差异不大。另外,对二甲胺基苯磺酰氯相比丹磺酰氯分子,在相同的衍生化条件下峰面积更大,灵敏度更高。
尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述,本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导,可以对那些细节进行各种修改和替换,这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。

Claims (11)

1.生物原胺类神经递质和/或其代谢产物的前处理方法,包括将含有生物原胺类神经递质和/或其代谢产物的样品衍生化,以及将衍生化产物进行在线固相萃取的步骤。
2.根据权利要求1所述的前处理方法,其特征在于如下(1)-(12)的任意一项或者多项:
(1)所述衍生化是样品与衍生化试剂反应;
(2)衍生化试剂的结构含有与芳环连接的磺酰氯基或酰氯基;具体地,还含与芳环连接的胺基;更具体地,含对位或间位胺基;进一步具体地,胺基为伯胺、仲胺或者叔胺;
(3)衍生化试剂为2-氯苯磺酰氯、3-氯苯磺酰氯、4-(氯磺酰)异氰酸苯酯、4-氯苯磺酰氯、苯磺酰氯、2,3,4-三氟苯磺酰氯、2,3-二氯苯磺酰氯、2,4,5-三氯苯磺酰氯、2,4,6-三氯苯磺酰氯、2,4-二氟苯磺酰氯、2,4-二溴苯磺酰氯、2,4-二硝基苯磺酰氯、2,5-二氟苯磺酰氯、2,5-二氯苯磺酰氯、2,5-二溴苯磺酰氯、2,6-二氟苯磺酰氯、2-(三氟甲基)苯磺酰氯、2-氟苯磺酰氯、2-氯-4-(三氟甲基)苯磺酰氯、2-氯-4-氟苯磺酰氯、2-氯-4-氰基苯磺酰氯、2-氰基苯磺酰氯、2-溴-4,6-二氟苯磺酰氯、2-溴苯磺酰氯、2-溴-4-氟苯磺酰氯、2-甲基-5-硝基苯磺酰氯、2-硝基苯磺酰氯、3,4,5-三氟苯磺酰氯、3,4-二氟苯磺酰氯、3,4-二氯苯磺酰氯、3,5-二氟苯磺酰氯、3,5-二氯-2-羟基苯磺酰氯、3,5-二氯苯磺酰氯、3,5-二甲基苯磺酰氯、3-(三氟甲基)苯磺酰氯、3-氟-4-甲基苯磺酰氯、3-氟苯磺酰氯、3-氯-2-氟苯磺酰氯、3-氯-4-甲基苯磺酰氯、3-氰基-4-氟苯磺酰氯、3-氰基苯磺酰氯、3-溴苯磺酰氯、3-甲氧基苯磺酰氯、3-硝基苯磺酰氯、4,4'-亚甲基双(苯磺酰氯)、4-(三氟甲基)苯磺酰氯、4-(溴甲基)苯磺酰氯、4-(甲磺酰)苯磺酰氯、4-乙酰基苯磺酰氯、4-叔丁基苯磺酰氯、4-异丙基苯磺酰氯、4-氟-2-甲基苯磺酰氯、4-氟苯磺酰氯、4-氯-2-硝基苯磺酰氯、4-氯-3-硝基苯磺酰氯、4-氰基苯磺酰氯、4-溴-2,5-二氟苯磺酰氯、4-溴-2,6-二氯苯磺酰氯、4-溴-2-氟苯磺酰氯、4-溴-2-氯苯磺酰氯、4-溴-3-氟苯磺酰氯、4-溴-3-甲基苯磺酰氯、4-溴苯磺酰氯、4-甲基-3-硝基苯磺酰氯、4-甲氧基苯磺酰氯、4-甲氧基苯磺酰氯、4-硝基苯磺酰氯、4-碘苯磺酰氯、4-苯氧基苯磺酰氯、5-氟-2-甲基苯磺酰氯、5-氯-2-氟苯磺酰氯、五氟苯磺酰氯、五甲基苯磺酰氯、2,4,6-三异丙基苯磺酰氯、2,4-二甲氧基苯磺酰氯、2,5-二甲氧基苯磺酰氯、2,5-双(三氟甲基)苯磺酰氯、2-(三氟甲氧基)苯磺酰氯、2-溴-4-(三氟甲基)苯磺酰氯、2-溴-5-(三氟甲基)苯磺酰氯、2-甲氧基-4-硝基苯磺酰氯、2-硝基-4-(三氟甲基)苯磺酰氯、3,4-二甲氧基苯磺酰氯、3,5-双(三氟甲基)苯磺酰氯、3-(三氟甲氧基)苯磺酰氯、3-(二氟甲氧基)苯磺酰氯、3-氟-4-甲氧基苯磺酰氯、3-溴-5-(三氟甲基)苯磺酰氯、4,4′-亚甲基双(苯磺酰氯)、4-(三氟甲氧基)苯磺酰氯、4-(二氟甲氧基)苯磺酰氯、4-(二甲氨基)偶氮苯-4′-磺酰氯、4-二甲胺基苯基偶氮苯磺酰氯、4-氟-2-三氟甲基苯磺酰氯、4-溴-2-(三氟甲基)苯磺酰氯、4-溴-2-(三氟甲氧基)苯磺酰氯、4-溴-3-(三氟甲基)苯磺酰氯、4-甲氧基-2,3,6-三甲基苯磺酰氯、4-硝基-3-(三氟甲基)苯磺酰氯、5-溴-2-甲氧基苯磺酰氯、(2-氯苯基)甲基磺酰氯、4-(氟磺酰)苯酰氯、对氨基苯磺酰氯、对氨基苯酰氯、对甲胺基苯磺酰氯、对甲胺基苯酰氯、对二甲胺基苯磺酰氯、对二甲胺基苯酰氯、间氨基苯磺酰氯、间氨基苯酰氯、间甲胺基苯磺酰氯、间甲胺基苯酰氯、间二甲胺基苯磺酰氯、间二甲胺基苯酰氯、4-二甲胺基苯基偶氮苯磺酰氯、1-二甲氨基萘-5-磺酰氯、对氨基萘磺酰氯、对氨基萘酰氯、对甲胺基萘磺酰氯、对甲胺基萘酰氯、对二甲胺基萘磺酰氯和对二甲胺基萘酰氯中的一种或多种;优选为对二甲胺基苯磺酰氯;
(4)衍生化试剂以甲醇或乙腈为溶剂配置成溶液使用;具体地,溶液浓度为1ng/mL-10mg/mL;
(5)衍生化在碱性环境下进行;具体地,碱性环境由乙酸铵、硼酸-碳酸氢钠缓冲盐、磷酸-磷酸钠缓冲盐、碳酸钠-碳酸氢钠缓冲盐、碳酸氢钠-氢氧化钠缓冲盐、硼酸-氢氧化钠缓冲盐和硼酸-四硼酸钠缓冲盐中一种或多种形成;
(6)衍生化温度为20-80℃;
(7)衍生化时间1-60min;
(8)衍生化为取代反应;
(9)样品为在体内或体外含细胞、组织、器官和维持体内正常功能的环境介质中至少一种的生物基质;具体地,所述样品为脑微渗析液、脑脊液、人工脑脊液、血浆、全血、血清、尿液和唾液中的一种或多种;
(10)生物原胺类神经递质和/或其代谢产物的结构含酚羟基和/或胺基;
(11)生物原胺类神经递质或其代谢产物为如下任意一种或多种:多巴胺、5-羟色胺、犬尿喹啉酸、4-二羟基苯乙酸、5-羟吲哚乙酸、5-羟基吲哚-2-羧酸、高香草酸、3,4-二羟基苄胺、3-羟基邻氨基苯甲酸、去甲肾上腺素、肾上腺素、犬尿氨酸、3-甲氧基-4-羟基苯乙二醇、色氨酸、3-羟基犬尿氨酸、香草基扁桃酸、褪黑素和喹啉酸;具体地,为多巴胺、去甲肾上腺素、肾上腺素、5-羟色胺和犬尿氨酸中的一种或多种;
(12)还包括样品衍生化前进行蛋白沉淀;具体地,蛋白沉淀是样品和有机溶剂混合、离心取上清液;更具体地,有机溶剂为甲醇-乙腈溶剂或者三氯乙酸-高氯酸溶剂;进一步具体地,样品和有机溶剂体积比为(1:1)-(1:5)。
3.根据权利要求1所述的前处理方法,其中,特征在于如下(1)-(9)的任意一项或者多项:
(1)在线固相萃取的流动相为水和乙腈;
(2)在线固相萃取的富集阶段,乙腈和水的体积比为(5-15):(85-95)或(5-20):(80-95);
(3)在线固相萃取的转移阶段,乙腈和水的体积比为(85-100):(0-15);
(4)在线固相萃取的转移阶段,流动相的流速为0.2-1.0mL/min;
(5)在线固相萃取的柱活化阶段,乙腈和水的体积比为(5-15):(85-95)或(5-20):(80-95);
(6)在线固相萃取的流动相为水和乙腈;流动相的洗脱程序为:乙腈5-15v/v%(0min,0.2-1mL/min)→乙腈5-15v/v%(2-5min,0.2-1.0mL/min)→乙腈85-100v/v%(5-8min,0.2-1.0mL/min)→乙腈85-100v/v%(8-12min,0.2-1.0mL/min)→乙腈85-100v/v%(8.5-12.5min,0.2-1.0mL/min)→乙腈85-100v/v%(9-13min,0.2-1.0mL/min)→乙腈5-15v/v%(9.5-13.5min,0.2-1.0mL/min)→乙腈5-15v/v%(10.5-14.5min,0.2-1.0mL/min)→乙腈5-15v/v%(12.5-16.5min,0.2-1.0mL/min);
(7)在线固相萃取柱为SPE柱、预柱或色谱柱;
(8)在线固相萃取柱的填料为以硅胶和/或其修饰物为基质的封端或未封端的反相碳十八、以硅胶和/或其修饰物为基质的封端或未封端的反相碳八、弱阳离子交换萃取柱、强阳离子交换萃取柱、官能化聚苯乙烯/二乙烯苯萃取柱、氧化铝萃取柱和HILIC萃取柱中的一种或多种;
(9)在线固相萃取柱为美国Thermo公司的Retain PEP Javelin,10mm×2.1mm,或者HYPERSIL ODS预柱,20×4mm,5μm。
4.生物原胺类神经递质和/或其代谢产物的检测方法,包含权利要求1-3任一所述的前处理方法,以及对前处理产物进行测定的步骤。
5.根据权利要求4所述的检测方法,其特征在于如下(1)-(8)任意一项或者多项:
(1)所述测定为定性或者定量测定;
(2)采用液质联用进行测定;
(3)液相色谱色谱柱的填料为以硅胶和/或其修饰物为基质的封端或未封端的反相碳十八、以硅胶和/或其修饰物为基质的封端或未封端的反相碳八、弱阳离子交换萃取柱、强阳离子交换萃取柱、官能化聚苯乙烯/二乙烯苯萃取柱、氧化铝萃取柱和HILIC萃取柱中一种或多种;
(4)液相色谱的柱温为30-35℃;
(5)液相色谱的样品池保持4℃;
(6)液相色谱的流动相为水和乙腈;具体地,流动相的洗脱程序为:乙腈20-30v/v%(0min,0.2-1.0mL/min)→乙腈20-30v/v%(2-5min,0.2-1.0mL/min)→乙腈70-90v/v%(5-8min,0.2-1.0mL/min)→乙腈70-90v/v%(8.0-12.0min,0.2-1.0mL/min)→乙腈20-30v/v%(8.5-16.5min,0.2-1.0mL/min);
(7)质谱的离子源为电喷雾离子源;具体地,离子喷射电压为4000-4500V;更具体地,雾化气压力为35-45psi;进一步具体地,干燥器温度为300-350℃,流速为9-10L/min;更进一步具体地,检测方式为正离子多反应监测模式;
(8)所述前处理产物为在线固相萃取的转移阶段转移至液相色谱的物质。
6.生物原胺类神经递质和/或其代谢产物的检测试剂盒,包括衍生化试剂和在线固相萃取柱;具体地,还包括与萃取柱配合使用的流动相试剂;更具体地,还包括碱性调节剂。
7.根据权利要求6所述的检测试剂盒,其特征在于如下(1)-(6)中任意一项或者多项,
(1)流动相试剂为水和乙腈的混合液;
(2)流动相试剂包括第一流动相试剂、第二流动相试剂和第三流动相试剂,分别用于在线固相萃取的富集、转移和柱活化阶段;
(3)第一流动相试剂中,乙腈和水的体积比为(5-15):(85-95)或(5-20):(80-95);
(4)第二流动相试剂中,乙腈和水的体积比为(85-100):(0-15);
(5)第三流动相试剂中,乙腈和水的体积比为(5-15):(85-95)或(5-20):(80-95);
(6)衍生化试剂的结构含有与芳环连接的磺酰氯基或酰氯基;具体地,还含有与芳环连接的胺基;更具体地,胺基为对位或间位胺基;进一步具体地,衍生化试剂为2-氯苯磺酰氯、3-氯苯磺酰氯、4-(氯磺酰)异氰酸苯酯、4-氯苯磺酰氯、苯磺酰氯、2,3,4-三氟苯磺酰氯、2,3-二氯苯磺酰氯、2,4,5-三氯苯磺酰氯、2,4,6-三氯苯磺酰氯、2,4-二氟苯磺酰氯、2,4-二溴苯磺酰氯、2,4-二硝基苯磺酰氯、2,5-二氟苯磺酰氯、2,5-二氯苯磺酰氯、2,5-二溴苯磺酰氯、2,6-二氟苯磺酰氯、2-(三氟甲基)苯磺酰氯、2-氟苯磺酰氯、2-氯-4-(三氟甲基)苯磺酰氯、2-氯-4-氟苯磺酰氯、2-氯-4-氰基苯磺酰氯、2-氰基苯磺酰氯、2-溴-4,6-二氟苯磺酰氯、2-溴苯磺酰氯、2-溴-4-氟苯磺酰氯、2-甲基-5-硝基苯磺酰氯、2-硝基苯磺酰氯、3,4,5-三氟苯磺酰氯、3,4-二氟苯磺酰氯、3,4-二氯苯磺酰氯、3,5-二氟苯磺酰氯、3,5-二氯-2-羟基苯磺酰氯、3,5-二氯苯磺酰氯、3,5-二甲基苯磺酰氯、3-(三氟甲基)苯磺酰氯、3-氟-4-甲基苯磺酰氯、3-氟苯磺酰氯、3-氯-2-氟苯磺酰氯、3-氯-4-甲基苯磺酰氯、3-氰基-4-氟苯磺酰氯、3-氰基苯磺酰氯、3-溴苯磺酰氯、3-甲氧基苯磺酰氯、3-硝基苯磺酰氯、4,4'-亚甲基双(苯磺酰氯)、4-(三氟甲基)苯磺酰氯、4-(溴甲基)苯磺酰氯、4-(甲磺酰)苯磺酰氯、4-乙酰基苯磺酰氯、4-叔丁基苯磺酰氯、4-异丙基苯磺酰氯、4-氟-2-甲基苯磺酰氯、4-氟苯磺酰氯、4-氯-2-硝基苯磺酰氯、4-氯-3-硝基苯磺酰氯、4-氰基苯磺酰氯、4-溴-2,5-二氟苯磺酰氯、4-溴-2,6-二氯苯磺酰氯、4-溴-2-氟苯磺酰氯、4-溴-2-氯苯磺酰氯、4-溴-3-氟苯磺酰氯、4-溴-3-甲基苯磺酰氯、4-溴苯磺酰氯、4-甲基-3-硝基苯磺酰氯、4-甲氧基苯磺酰氯、4-甲氧基苯磺酰氯、4-硝基苯磺酰氯、4-碘苯磺酰氯、4-苯氧基苯磺酰氯、5-氟-2-甲基苯磺酰氯、5-氯-2-氟苯磺酰氯、五氟苯磺酰氯、五甲基苯磺酰氯、2,4,6-三异丙基苯磺酰氯、2,4-二甲氧基苯磺酰氯、2,5-二甲氧基苯磺酰氯、2,5-双(三氟甲基)苯磺酰氯、2-(三氟甲氧基)苯磺酰氯、2-溴-4-(三氟甲基)苯磺酰氯、2-溴-5-(三氟甲基)苯磺酰氯、2-甲氧基-4-硝基苯磺酰氯、2-硝基-4-(三氟甲基)苯磺酰氯、3,4-二甲氧基苯磺酰氯、3,5-双(三氟甲基)苯磺酰氯、3-(三氟甲氧基)苯磺酰氯、3-(二氟甲氧基)苯磺酰氯、3-氟-4-甲氧基苯磺酰氯、3-溴-5-(三氟甲基)苯磺酰氯、4,4′-亚甲基双(苯磺酰氯)、4-(三氟甲氧基)苯磺酰氯、4-(二氟甲氧基)苯磺酰氯、4-(二甲氨基)偶氮苯-4′-磺酰氯、4-二甲胺基苯基偶氮苯磺酰氯、4-氟-2-三氟甲基苯磺酰氯、4-溴-2-(三氟甲基)苯磺酰氯、4-溴-2-(三氟甲氧基)苯磺酰氯、4-溴-3-(三氟甲基)苯磺酰氯、4-甲氧基-2,3,6-三甲基苯磺酰氯、4-硝基-3-(三氟甲基)苯磺酰氯、5-溴-2-甲氧基苯磺酰氯、(2-氯苯基)甲基磺酰氯、4-(氟磺酰)苯酰氯、对氨基苯磺酰氯、对氨基苯酰氯、对甲胺基苯磺酰氯、对甲胺基苯酰氯、对二甲胺基苯磺酰氯、对二甲胺基苯酰氯、间氨基苯磺酰氯、间氨基苯酰氯、间甲胺基苯磺酰氯、间甲胺基苯酰氯、间二甲胺基苯磺酰氯、间二甲胺基苯酰氯、4-二甲胺基苯基偶氮苯磺酰氯、1-二甲氨基萘-5-磺酰氯、对氨基萘磺酰氯、对氨基萘酰氯、对甲胺基萘磺酰氯、对甲胺基萘酰氯、对二甲胺基萘磺酰氯和对二甲胺基萘酰氯中的一种或多种,优选为对二甲胺基苯磺酰氯;更进一步具体地,衍生化试剂以乙腈为溶剂配置成溶液使用;更加具体地,溶液的浓度为1ng/mL~10mg/mL。
8.根据权利要求6所述的检测试剂盒,其特征在于如下(1)-(5)任意一项或者多项:
(1)在线固相萃取柱为SPE柱、预柱或色谱柱;
(2)在线固相萃取柱的填料为以硅胶和/或其修饰物为基质的封端或未封端的反相碳十八、以硅胶和/或其修饰物为基质的封端或未封端的反相碳八、弱阳离子交换萃取柱、强阳离子交换萃取柱、官能化聚苯乙烯/二乙烯苯萃取柱、氧化铝萃取柱和HILIC萃取柱中一种或多种;
(3)在线固相萃取柱为美国Thermo公司的Retain PEP Javelin,10mm×2.1mm,或者HYPERSIL ODS预柱,20×4mm,5μm;
(4)碱性调节剂为乙酸铵、硼酸-碳酸氢钠缓冲盐、磷酸-磷酸钠缓冲盐、碳酸钠-碳酸氢钠缓冲盐、碳酸氢钠-氢氧化钠缓冲盐、硼酸-氢氧化钠缓冲盐和硼酸-四硼酸钠缓冲盐中的一种或多种;
(5)还包括蛋白沉淀剂;具体地,所述蛋白沉淀剂为甲醇-乙腈溶剂或者三氯乙酸-高氯酸溶剂。
9.权利要求6-8任一所述检测试剂盒在生物原胺类神经递质和/或其代谢产物检测中的用途;具体地,所述检测为定性或定量检测;更具体地,生物原胺类神经递质和/或其代谢产物的结构含酚羟基和/或胺基;进一步具体地,生物原胺类神经递质或其代谢产物为如下任意一种或多种:多巴胺、5-羟色胺、犬尿喹啉酸、4-二羟基苯乙酸、5-羟吲哚乙酸、5-羟基吲哚-2-羧酸、高香草酸、3,4-二羟基苄胺、3-羟基邻氨基苯甲酸、去甲肾上腺素、肾上腺素、犬尿氨酸、3-甲氧基-4-羟基苯乙二醇、色氨酸、3-羟基犬尿氨酸、香草基扁桃酸、褪黑素和喹啉酸;更为具体地,生物原胺类神经递质或其代谢产物为多巴胺、去甲肾上腺素、肾上腺素、5-羟色胺、犬尿氨酸及其代谢产物中一种或多种。
10.一种在体内或体外检测生物原胺类神经递质和/或其代谢产物的方法,包括使用有效量权利要求6-8任一所述的检测试剂盒的步骤。
11.其包含如下(1)-(3)中任意一项或多项:
(1)式Ⅰ所示的对二甲胺基苯磺酰氯化合物,
(2)对二甲胺基苯磺酰氯的合成路线如下,
具体地,对二甲胺基苯磺酰氯的制备方法包括向对二甲胺基苯磺酸溶液通入氯气,以氢氧化钠为催化剂在-20~0℃条件下反应2-4小时的步骤;更具体地,还包括将反应产物浓缩至干,固体以无水乙醇冲洗,浓缩滤液;
(3)对二甲胺基苯磺酰氯在生物原胺类神经递质和/或其代谢产物的衍生化、前处理或检测中的用途。
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