CN105628845A - 一种丙二酰基人参皂苷的含量测定方法 - Google Patents
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Abstract
一种无对照品而准确测定丙二酰基人参皂苷的含量测定方法，通过阀切换从高效液相色谱流出组分中收集待测样品中含丙二酰基人参皂苷的组分，将该组分水解获得其水解产物，测定上述水解产物中相应的中性人参皂苷含量，其与待测样品中丙二酰基人参皂苷的物质的量相等，进而换算出样品中丙二酰基人参皂苷的含量。该方法简单、快速，测定结果精密度、准确度高，可用于样品中丙二酰基人参皂苷的定性定量分析及质量控制。
Description
技术领域
本发明属于药物分析方法领域，涉及丙二酰基人参皂苷的含量测定方法，特别的，涉及一种柱切换高效液相色谱法测定丙二酰基人参皂苷的含量测定方法。
背景技术
对照品是化学定量分析中测量化学成分量值的基本参照，在药物分析中具有重要意义。然而，很多化学成分难以获得足够的对照品，或者其对照品因为理化性质不稳定难以保存，这种情况下很难测量该化学成分的准确量值。
丙二酰基人参皂苷(malonyl-ginsenoside)称为丙二酸单酰基人参皂苷，在鲜人参及其药材中含量很高，其中，鲜参中丙二酰基人参皂苷含量比中性人参皂苷高很多，生晒参中丙二酰基人参皂苷含量略高于中性人参皂苷。是一类极性大，亲水性强，极易溶于水的酸性皂苷，该类化合物分子中酰基键极不稳定，很容易水解，遇酸、碱或在热水、热甲醇条件下都会发生水解反应脱去丙二酸，成为相应的人参皂苷。研究发现人参中，以丙二酰基人参皂苷M-Rb1、M-Rb2、M-Rc为主，具有降糖活性，能降低糖尿病模型小鼠血糖，促进肝糖元合成。丙二酰基人参皂苷Rb1具有促进小鼠齿状突长时呈增效作用，对神经生长因子诱导外培养鸡胚的背根神经突的外生长有增强作用。由此可见，准确测定人参及其制品中各类丙二酰基人参皂苷的含量对于评价人参产品的品质，指导临床用途有重要的意义。
现有技术中一般采用差值法估算人参中的丙二酰基人参皂苷的含量，即先测定人参中中性人参皂苷的含量，然后将人参提取物用碱水解，测定水解后样品中中性人参皂苷的含量，减除水解前样品中相应的中性人参皂苷的含量，差值为相应的丙二酰基人参皂苷的含量。
这一方法的缺点在于，第一，水解产生相同中性人参皂苷的丙二酰基人参皂苷类物质至少两种，可能很多种，因此无法测定每一种丙二酰基人参皂苷的含量；第二，由于丙二酰基人参皂苷化学性质不稳定，因此其对照品无法长时间保存和运输；第三，常温下这一类化合物在溶液中稳定时间不足6小时，用其本身作为对照品难以完成常规测试过程中的方法学考察，无法确定数据的可靠性。而现有技术中的检测方法均不能解决上述技术缺陷。因此，开发一种行之有效的检测方法测定丙二酰基人参皂苷的含量极为重要。
发明内容
为填补现有技术的空白，本发明旨在提供一种能够准确测定人参及其制品中不同丙二酰基人参皂苷含量的方法。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的,具体为：
1)取含丙二酰基人参皂苷的组分B，将其水解获得水解产物C，包括由丙二酰基人参皂苷水解产生的中性人参皂苷；
2)测定步骤1)中所得中性人参皂苷的含量D；
3)根据D计算组分B中丙二酰基人参皂苷的含量。
优选的，步骤1)中，所述水解方法为碱溶液水解法。
进一步优选的，碱溶液选自氢氧化钠或氢氧化钾水溶液，浓度为0.1～0.5M，水解液温度为60～90℃，水解时间4～10min。
进一步优选的，水解的具体步骤为，先在线将组分B其富集于固相萃取小柱，然后向固相萃取小柱中通入碱溶液而进行水解。
更优选的，所述的富集方法为，采用阀切换法在线将丙二酰基人参皂苷吸附于固相萃取小柱上；优选的，阀切换法的具体操作为，使丙二酰基人参皂苷组分B的洗脱组分通过固相萃取富集柱，同时通过泵添加调节剂改变流出组分的溶剂组成，使含丙二酰基人参皂苷组分B和其它成分完全吸附于富集柱上，再次通过阀切换，将碱溶液泵入富集柱中，使丙二酰基人参皂苷的丙二酰基水解,获得水解产物C。
更优选的，采用阀切换法富集皂苷的富集条件为，富集柱填料为聚乙烯苯树脂，具体规格：粒径30～50um、填料用量10～30mg、内径1/8～1/16英寸，修饰剂为纯水，流速0.1～0.5mL/min。
优选的，步骤2)中的具体测定方法为，将步骤1)中所述的固相萃取小柱直接连接于色谱柱的前端进行色谱分析，测定水解产物C中相应的中性人参皂苷含量D；优选的，所述链接方式为串联法。
进一步优选的，所述步骤2)中，具体的测定方法为，①水解结束后，通过阀切换，清洗管路和富集柱中的碱溶液，②再次通过阀切换，记录丙二酰基人参皂苷水解产生的相应中性人参皂苷D的仪器型号响应值A1，③再将对照品中性人参皂苷进样，记录其响应值A2，④将响应值A1与A2进行比较，计算水解产生的中性人参皂苷D的含量。
优选的，所述待测样品B的制备方法为，取鲜人参匀浆0.1～5g，精密称定，加入甲醇10～50mL，超声处理10～30min后置于0-4℃冰箱中放置过夜。使用前充分混合，取1～10mL悬浮液，离心10-30min，取上清液，经色谱法分离即得。
另外，本发明还提供上述含量测定方法在丙二酰基人参皂苷定性分析中的应用。
具体的，本发明还利用上述含量测定方法，鉴定了未知结构的丙二酰基人参皂苷。具体鉴定方法如下：
参见图2可知，图2为8年生鲜人参中丙二酰基人参皂苷Rf(以下简称为mRf)的定量分析色谱图，图2A表示人参总提取物的色谱图；图2B表示从总提物中在线富集的含有丙二酰基人参皂苷1的组分的总离子流色谱图，其中化合物1结构未知；图2C表示将化合物1水解后，所得产物的总离子流色谱图，2、3均为单一的化合物。
另外，参见图4可知，化合物1为丙二酰基人参皂苷，但是由于E06和E05质谱规律相同，因此，无法确定其母核为人参皂苷Rg1或人参皂苷Rf，而用对照品比较可知，图2中化合物2、3分别为人参皂苷Rg1和人参皂苷Rf，因此就间接推知化合物1为丙二酰基人参皂苷Rf，即确定了其结构。
因此，本发明的有益效果是显而易见的。本发明先将不同丙二酰基人参皂苷类物质分离，直接在线富集于固相萃取小柱上，采用温和的碱水解条件在柱上进行水解，然后将萃取小柱直接串联到色谱柱上进行分析，整个过程无样品损失(富集过程回收率为99.48±1.25％(mRe)，水解过程回收率为99.67±0.66％)，分析结果精密度高(RSD＝0.92％)。不仅可以分别对不同的丙二酰基人参皂苷进行定量，而且可用于鉴定未知结构的丙二酰基人参皂苷。
附图说明
图1为人参总提物经分离、水解、定量分析色谱图；其中，标记1为共流出的中性人参皂苷；A为待测组分；B为分离组分；C为水解产物；M－D为丙二酰基人参皂苷；D丙二酰基人参皂苷水解产生的中性人参皂苷；R为中性人参皂苷D的对照品。
图2为丙二酰基人参皂苷Rf分离鉴定色谱图，图2A表示人参总提取物的色谱图(检测波长：210nm)；图2B表示从总提物中在线富集的含有丙二酰基人参皂苷Rf的组分总离子流色谱图；图2C表示将化合物1水解后，所得产物的总离子流色谱图，1、2、3分别为丙二酰基人参皂苷Rf、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rf。
图3为丙二酰基人参皂苷Rf的质谱图(缩写为MS)，分别是：ESI-MS(上)，CIDMS/MS(中)以及脱羧基子离子的CIDMS/MS图(下)。
图4为实施例一记载的8年生人参中丙二酰基人参皂苷Rf的含量测定步骤示意图，其中I为待测样品色谱图(检测波长：210nm)、II为富集在固相萃取小柱上的样品在与I相同分离条件下获得的总离子流色谱图、III为柱上水解后的总离子流色谱图(色谱条件不同)；图中标记(1)为丙二酰基人参皂苷Rf，标记(2)为人参皂苷Rg1，标记(3)为人参皂苷Rf；C为色谱柱，E为富集柱，MS为质谱，P为高压输液泵，S为样品，UV为紫外检测器，V为切换阀。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明了，下面结合具体实施方式并参照附图，对本发明进一步详细说明。应该理解，这些描述只是示例性的，而并非要限制本发明的范围。
实施例一：采用人参皂苷Rf为对照品测定8年生人参中丙二酰基人参皂苷Rf的含量，具体操作为：
①通过色谱柱C-1分离待测样品A中的人参皂苷，获得含丙二酰基人参皂苷的组分B；
②通过阀切换，联通UV、P-2和E-1，使丙二酰基人参皂苷组分B的洗脱组分通过富集柱E-1，同时通过泵P-2添加调节剂改变流出组分的溶剂组成，使丙二酰基人参皂苷组分B和其它成分完全吸附于富集柱E-1上；
③完成后通过阀切换，联通泵P-3和富集柱E-1，此时富集柱E-2与UV检测器、P-2联通；泵P-3与富集柱E-1联通；P-3将碱溶液泵入富集柱E-1中使丙二酰基人参皂苷的丙二酰基水解,获得水解产物C；
④水解结束后，通过阀切换联通P-4、E-1，清洗管路和富集柱中的碱溶液，然后联通P-4、E-1和MS，记录丙二酰基人参皂苷水解产生的相应中性人参皂苷D的仪器型号响应值A1；将对照品中性人参皂苷进样，获得响应值A2；将响应值A1与A2进行比较，计算水解产生的中性人参皂苷D的含量；
⑤中性人参皂苷D与样品A中相应的丙二酰基人参皂苷物质的量相等，经计算即得丙二酰基人参皂苷的量。
其中，
步骤①中样品A的制备方法为：取鲜人参1支，切成约0.5cm见方小块，然后用匀浆器匀浆。取匀浆约1g，置于20mL同位素瓶中，精密称定，加入甲醇10mL，超声处理10min后置于0-4℃冰箱中放置过夜。使用前采用涡旋混合仪充分混合，取1mL悬浮液，10000rpm离心10min，取上清液进样分析。
步骤①的高效液相色谱条件：色谱柱为C18柱，流动相A为10％乙腈溶液含有5mM甲酸铵、B相为纯乙腈，采用梯度洗脱，洗脱时间为40min，B相的变化范围为5％～100％，流速为0.2mL/min，进样体积5uL，检测波长210nm,流动相梯度时间表如表1所示。
表1
步骤②的富集条件：富集柱填料聚乙烯苯树脂(UniPS30-1000polystyrene，40um，苏州纳微)，填料用量10mg，富集柱内径1/16英寸。修饰剂为纯水，流速0.2mL/min。
步骤③的水解条件：水解液0.2M氢氧化钠水溶液，流速5uL/min,水解液温度为90℃，水解时间4min。
步骤④的液相色谱条件：色谱柱ChromleathC18整体柱(25×2mmid，Merck，German)，流速0.5mL/min，流动相同步骤①的高效液相色谱条件，梯度时间表如表2所示。
表2
步骤⑤的测定结果：所测定的8年生人参中丙二酰基人参皂苷Rf的含量为26.7ug/g鲜重。
实施例二：采用人参皂苷Rf为对照品测定8年生人参中丙二酰基人参皂苷Rf的含量，具体操作为：
①通过色谱柱C-1分离待测样品A中的人参皂苷，获得含丙二酰基人参皂苷的组分B；
②通过阀切换，联通UV、P-2和E-1，使丙二酰基人参皂苷组分B的洗脱组分通过富集柱E-1，同时通过泵P-2添加调节剂改变流出组分的溶剂组成，使丙二酰基人参皂苷组分B和其它成分完全吸附于富集柱E-1上；
③完成后通过阀切换，联通泵P-3和富集柱E-1，此时富集柱E-2与UV检测器、P-2联通；泵P-3与富集柱E-1联通；P-3将碱溶液泵入富集柱E-1中使丙二酰基人参皂苷的丙二酰基水解,获得水解产物C；
④水解结束后，通过阀切换联通P-4、E-1，清洗管路和富集柱中的碱溶液，然后联通P-4、E-1和MS，记录丙二酰基人参皂苷水解产生的相应中性人参皂苷D的仪器型号响应值A1；将对照品中性人参皂苷进样，获得响应值A2；将响应值A1与A2进行比较，计算水解产生的中性人参皂苷D的含量；
⑤中性人参皂苷D与样品A中相应的丙二酰基人参皂苷物质的量相等，经计算即得丙二酰基人参皂苷的量。
其中，
步骤①中样品A的制备方法为：取鲜人参1支，切成月0.5cm见方小块，然后用匀浆器匀浆。取匀浆约0.1g，置于20mL同位素瓶中，精密称定，加入甲醇1mL，超声处理10min后置于0-4℃冰箱中放置过夜。使用前采用涡旋混合仪充分混合，取0.5mL悬浮液，10000rpm离心5min，取上清液进样分析。
步骤①的高效液相色谱条件：色谱柱为C18柱，流动相A为10％乙腈溶液含有5mM甲酸铵、B相为纯乙腈，采用梯度洗脱，洗脱时间为40min，B相的变化范围为5％～100％，流速为0.1mL/min，进样体积5uL，检测波长210nm,流动相梯度时间表如表3所示。
表3
步骤②的富集条件：富集柱填料聚乙烯苯树脂(UniPS30-1000polystyrene，40um，苏州纳微)，填料用量10mg，富集柱内径1/16英寸。修饰剂为纯水，流速0.2mL/min。
步骤③的水解条件：水解液0.2M氢氧化钠水溶液，流速5uL/min,水解液温度为60℃，水解时间4min。
步骤④的液相色谱条件：色谱柱ChromleathC18整体柱(25×2mmid，Merck，German)，流速0.5mL/min，流动相同步骤①的高效液相色谱条件，梯度时间表如表4所示。
表4
步骤⑤的测定结果：所测定的8年生人参中丙二酰基人参皂苷Rf的含量为26.2ug/g鲜重。
实施例三：采用人参皂苷Rf为对照品测定8年生人参中丙二酰基人参皂苷Rf的含量，具体操作为：
①通过色谱柱C-1分离待测样品A中的人参皂苷，获得含丙二酰基人参皂苷的组分B；
②通过阀切换，联通UV、P-2和E-1，使丙二酰基人参皂苷组分B的洗脱组分通过富集柱E-1，同时通过泵P-2添加调节剂改变流出组分的溶剂组成，使丙二酰基人参皂苷组分B和其它成分完全吸附于富集柱E-1上；
③完成后通过阀切换，联通泵P-3和富集柱E-1，此时富集柱E-2与UV检测器、P-2联通；泵P-3与富集柱E-1联通；P-3将碱溶液泵入富集柱E-1中使丙二酰基人参皂苷的丙二酰基水解,获得水解产物C；
④水解结束后，通过阀切换联通P-4、E-1，清洗管路和富集柱中的碱溶液，然后联通P-4、E-1和MS，记录丙二酰基人参皂苷水解产生的相应中性人参皂苷D的仪器型号响应值A1；将对照品中性人参皂苷进样，获得响应值A2；将响应值A1与A2进行比较，计算水解产生的中性人参皂苷D的含量；
⑤中性人参皂苷D与样品A中相应的丙二酰基人参皂苷物质的量相等，经计算即得丙二酰基人参皂苷的量。
其中，
步骤①中样品A的制备方法为：取鲜人参1支，切成月0.5cm见方小块，然后用匀浆器匀浆。取匀浆约5g，置于20mL同位素瓶中，精密称定，加入甲醇10mL，超声处理10min后置于0-4℃冰箱中放置过夜。使用前采用涡旋混合仪充分混合，取5mL悬浮液，10000rpm离心10min，取上清液进样分析。
步骤①的高效液相色谱条件：色谱柱为C18柱，流动相A为10％乙腈溶液含有5mM甲酸铵、B相为纯乙腈，采用梯度洗脱，洗脱时间为40min，B相的变化范围为5％～100％，流速为0.1mL/min，进样体积5uL，检测波长210nm,流动相梯度时间表如表5所示。
表5
步骤②的富集条件：富集柱填料聚乙烯苯树脂(UniPS30-1000polystyrene，40um，苏州纳微)，填料用量10mg，富集柱内径1/16英寸。修饰剂为纯水，流速0.2mL/min。
步骤③的水解条件：水解液0.2M氢氧化钠水溶液，流速5uL/min,水解液温度为90℃，水解时间10min。
步骤④的液相色谱条件：色谱柱ChromleathC18整体柱(25×2mmid，Merck，German)，流速0.5mL/min，流动相同步骤①的高效液相色谱条件，梯度时间表如表6所示。
表6
步骤⑤的测定结果：所测定的8年生人参中丙二酰基人参皂苷Rf的含量为26.0ug/g鲜重。
实施例四：采用人参皂苷Rf为对照品测定8年生人参中丙二酰基人参皂苷Rf的含量，具体操作为：
①通过色谱柱C-1分离待测样品A中的人参皂苷，获得含丙二酰基人参皂苷的组分B；
②通过阀切换，联通UV、P-2和E-1，使丙二酰基人参皂苷组分B的洗脱组分通过富集柱E-1，同时通过泵P-2添加调节剂改变流出组分的溶剂组成，使丙二酰基人参皂苷组分B和其它成分完全吸附于富集柱E-1上；
③完成后通过阀切换，联通泵P-3和富集柱E-1，此时富集柱E-2与UV检测器、P-2联通；泵P-3与富集柱E-1联通；P-3将碱溶液泵入富集柱E-1中使丙二酰基人参皂苷的丙二酰基水解,获得水解产物C；
④水解结束后，通过阀切换联通P-4、E-1，清洗管路和富集柱中的碱溶液，然后联通P-4、E-1和MS，记录丙二酰基人参皂苷水解产生的相应中性人参皂苷D的仪器型号响应值A1；将对照品中性人参皂苷进样，获得响应值A2；将响应值A1与A2进行比较，计算水解产生的中性人参皂苷D的含量；
⑤中性人参皂苷D与样品A中相应的丙二酰基人参皂苷物质的量相等，经计算即得丙二酰基人参皂苷的量。
其中，
步骤①中样品A的制备方法为：取鲜人参1支，切成月0.5cm见方小块，然后用匀浆器匀浆。取匀浆约2g，置于20mL同位素瓶中，精密称定，加入甲醇1mL，超声处理15min后置于0-4℃冰箱中放置过夜。使用前采用涡旋混合仪充分混合，取10mL悬浮液，10000rpm离心25min，取上清液进样分析。
步骤①的高效液相色谱条件：色谱柱为C18柱，流动相A为10％乙腈溶液含有5mM甲酸铵、B相为纯乙腈，采用梯度洗脱，洗脱时间为40min，B相的变化范围为5％～100％，流速为0.3mL/min，进样体积16uL，检测波长210nm,流动相梯度时间表如表7所示；
表7
。步骤②的富集条件：富集柱填料聚乙烯苯树脂(UniPS30-1000polystyrene，40um，苏州纳微)，填料用量10mg，富集柱内径1/16英寸。修饰剂为纯水，流速0.2mL/min。
步骤③的水解条件：水解液0.2M氢氧化钠水溶液，流速5uL/min,水解液温度为80℃水解时间14min。
步骤④的液相色谱条件：色谱柱ChromleathC18整体柱(25×2mmid，Merck，German)，流速0.5mL/min，流动相同步骤①的高效液相色谱条件，梯度时间表如表8所示。
表8
步骤⑤的测定结果：所测定的8年生人参中丙二酰基人参皂苷Rf的含量为26.3ug/g鲜重。
Claims (7)
1.一种丙二酰基人参皂苷的含量测定方法，其特征在于，
1)取含丙二酰基人参皂苷的组分B，将其水解获得水解产物C，包括由丙二酰基人参皂苷水解产生的中性人参皂苷；
2)测定步骤1)中所得中性人参皂苷的含量D；
3)根据D计算组分B中丙二酰基人参皂苷的含量。
2.根据权利要求1所述的含量测定方法，其特征在于，步骤1)中，所述水解方法为碱溶液水解法。
3.根据权利要求2所述的含量测定方法，其特征在于，步骤1)中，水解的具体步骤为，先在线将组分B其富集于固相萃取小柱，然后向固相萃取小柱中通入碱溶液而进行水解。
4.根据权利要求3所述的含量测定方法，其特征在于，步骤1)中，所述的富集方法为，采用阀切换法在线将丙二酰基人参皂苷吸附于固相萃取小柱上；优选的，阀切换法的具体操作为，使丙二酰基人参皂苷组分B的洗脱组分通过固相萃取富集柱，同时通过泵添加调节剂改变流出组分的溶剂组成，使含丙二酰基人参皂苷组分B和其它成分完全吸附于富集柱上，再次通过阀切换，将碱溶液泵入富集柱中，使丙二酰基人参皂苷的丙二酰基水解,获得水解产物C。
5.根据权利要求3-4任意一项所述的含量测定方法，其特征在于，步骤2)中具体的测定方法为，将步骤1)中所述的固相萃取小柱直接连接于色谱柱的前端进行色谱分析，测定水解产物C中相应的中性人参皂苷含量D。
6.根据权利要求5所述的含量测定方法，其特征在于，所述步骤2)中，具体的测定方法为，①水解结束后，通过阀切换，清洗管路和富集柱中的碱溶液，②再次通过阀切换，记录丙二酰基人参皂苷水解产生的相应中性人参皂苷D的仪器型号响应值A1，③再将对照品中性人参皂苷进样，记录其响应值A2，④将响应值A1与A2进行比较，计算水解产生的中性人参皂苷D的含量。
7.权利要求1-6任意一项所述的含量测定方法的用途，其特征在于，所述含量测定方法在鉴定丙二酰基人参皂苷结构中的应用。
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