CN109613144A

CN109613144A - 一种儿茶酚胺类激素的检测方法

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Publication number: CN109613144A
Application number: CN201910113608.8A
Authority: CN
Inventors: 陆优丽; 姜凤丽; 张美微; 李水军; 刘罡; 刘罡一; 贾晶莹; 忻亮; 张梦琪; 余成寅
Original assignee: Shanghai Keling Biomedical Technology Co Ltd
Current assignee: Shanghai Keling Biomedical Technology Co Ltd
Priority date: 2019-02-14
Filing date: 2019-02-14
Publication date: 2019-04-12
Anticipated expiration: 2039-02-14
Also published as: CN109613144B

Abstract

本发明提供一种儿茶酚胺类激素的检测方法，所述方法包括步骤：(1)对样品进行蛋白沉淀，取上清液；(2)对上清液进行丹磺酰氯衍生化；(3)衍生化后的液体进行固相萃取；(4)萃取获得的样品进行液相色谱串联质谱分析，计算获得儿茶酚胺及其氧甲基化代谢物的含量。本发明方法操作简单方便，便于大规模操作，具有高通量、高灵敏度、高特异性。

Description

一种儿茶酚胺类激素的检测方法

技术领域

本发明涉及一种医药检测领域，具体的涉及一种人体内源性激素的检测方法。

背景技术

儿茶酚胺是一类结构中含有儿茶酚和胺基的神经递质，也是人体内的一类重要激素。儿茶酚胺激素通常是指肾上腺素、去甲肾上腺素、多巴胺这三种激素，它们的生理作用广泛，对心血管和内脏的功能都有调节作用，并可促进人体的新陈代谢，还可引起体内电解质和多种激素水平的变化；同时，该三种激素也是儿茶酚胺分泌型肿瘤的重要诊断标志物(如嗜铬细胞瘤，交感副神经节瘤，简称PPGLs)，在区分PPGLs和儿童最常见的颅外实体瘤神经母细胞瘤方面也很重要。不同的儿茶酚胺激素由氧甲基转移酶在不同部位转变成各自的氧甲基化代谢物，它们虽然无生物活性，但可以持续产生和分泌。人体内若长期存在高水平的儿茶酚胺激素，则这类代谢物会持续升高。因此，比起间断分泌的儿茶酚胺，氧甲基化代谢物更能代表一段时期内人体儿茶酚胺激素的真实水平，这个特征使其成为判断体内儿茶酚胺水平较特异的标志物，更是成为诊断PPGLs的金标准。

杭州佰辰医学检验所有限公司于2016年10月18日申请的中国专利201610907368.5，发明名称“一种利用液相色谱串联质谱检测血浆中儿茶酚胺的方法”。该发明公开了一种利用液相色谱串联质谱检测血浆中儿茶酚胺的方法。本发明的方法创新性地应用高通量液相色谱串联三重四级杆质谱仪进行儿茶酚胺的检测，具有以下有益效果：采用乙腈进行蛋白沉淀，丹磺酰氯进行衍生化反应，提取后使用液相色谱串联三重四级杆质谱仪检测，前处理步骤简单，可以有效去除血浆基质干扰，特异性好；通过丹磺酰氯衍生化后，能有效提高检测灵敏度；高通量液相色谱串联质谱仪进行检测，同时定性并精准定量血浆中包括多巴胺，肾上腺素，去甲肾上腺素的3种儿茶酚胺，检测时间短，通量高，检测灵敏度高，特异性好，成本低廉。但是仅能检测3种代谢产物，且预处理样品中需冻干步骤。

杭州佰辰医学检验所有限公司于2016年12月21日申请的中国专利201610935910.8号，发明名称“高通量液相色谱串联质谱的检测方法以及检测4种儿茶酚胺代谢物的方法”公开了一种高通量液相色谱串联质谱的检测方法。可以同时检测4种儿茶酚胺代谢物，但是也需要冻干。

广东中科康仪生物技术有限公司于2017年11月7日申请的中国专利“一种用液相色谱串联质谱技术检测儿茶酚胺及代谢产物的方法”，专利号CN201711081600.5，该发明公开一种用液相色谱串联质谱技术检测儿茶酚胺及代谢产物的方法，该方法可以高灵敏度地、特异性地一次性检测出儿茶酚胺及其代谢产物，包括MN和NMN(协会指南中首推的指标)、E和NE(起辅助诊断作用)以及DA和3-MT，可以用于各种类型的PPGL进行诊断，但是有3个指标的最低定量限高于正常参考阈值，如有患者浓度高于正常参考阈值而低于最低定量限，则被误判为正常。

尽管LC-MS/MS技术的多级反应监测模式(MRM)有强大的定量检测功能，但却鲜有同时检测血浆中儿茶酚胺及其O-甲基化代谢物的报道。有两个主要的检测难点，一是无论是儿茶酚胺还是氧甲基化代谢物在血浆中的水平都极低，二是已有不少报道指出目前存在的检测血浆中氧甲基化代谢物的方法干扰多而复杂。

因此临床迫切需要一种具备高灵敏度且能高效地检测血样中儿茶酚胺类激素的方法。

发明内容

为了解决现有技术的欠缺，本发明提供了一种用液相色谱串联质谱技术检测儿茶酚胺类激素的方法，该方法可检测生物样本中的肾上腺素(E)、去甲肾上腺素(NE)、变肾上腺素(MN)、变去甲肾上腺素(NMN)、3-甲氧酪胺(3-MT)和多巴胺(DA)，方法特异性强，灵敏度高，检测通量大。

本发明提供一种儿茶酚胺类激素的检测方法，所述方法包括步骤：

(1)对样品进行蛋白沉淀，取上清液；

(2)对上清液进行丹磺酰氯衍生化；

(3)衍生化后的液体进行固相萃取；

(4)萃取获得的样品进行液相色谱串联质谱分析，计算获得儿茶酚胺类激素的含量。

上述儿茶酚胺类激素包括肾上腺素、去甲肾上腺素、多巴胺、变肾上腺素、变去甲肾上腺素和3-甲氧酪胺中的三种以上。

上述步骤(4)中质谱通道还针对分析物选择了定量和定性离子对，并通过计算二者比值与标准样品的偏差来判断临床样本是否存在干扰。

上述定量和定性离子对为：

上述步骤(1)中样品包括不同浓度的标准曲线样品和血浆样品。

上述步骤(1)中在待测样品中加入已知浓度的稳定同位素标记的E、NE、DA、MN、NMN和3-MT作为内标。

上述步骤(1)中沉淀剂为甲醇、乙醇、丙酮、乙腈或其混合物。优选乙醇。混合物可以是甲醇、乙醇、丙酮、乙腈中的二种或三种物质混合而成。

上述步骤(2)中衍生化反应条件为pH9.5，60℃避光孵育15分钟；之后用甲酸水溶液将溶液pH调节至6～8。

上述步骤(3)中采用MCX或SCX浓缩型阳离子交换SPE小柱。

上述步骤(4)中使用ExionLC串联Qtrap6500或性能相等同的其它品牌仪器进行检测，色谱柱为Luna Omega C18 100A,1.6μm,2.1×50mm或性能相等同的其它品牌色谱柱，流动相的水相和有机相分别为5mmol/L甲酸铵-水和5mmol/L甲酸铵-95％乙腈-水。

上述步骤(4)中质谱条件为雾化气：60psi；加热气：70psi；气帘气：30psi；碰撞气：10psi；电压：5500V；温度：600℃。

本发明和传统方法比较，存在显著的优势，主要表现在3个方面，即高通量、高灵敏度、高特异性。

A.传统方法基本为手动方法，为了最大程度的浓缩样本，检测儿茶酚胺氧甲基化代谢物时通常使用500μL血浆，进行SPE萃取(固相萃取)后洗脱液一般经吹干重组后进样分析。如果运用衍生化技术，则通常在样本净化吹干后再使用过量的衍生化试剂进行反应，最终衍生化完全的样本再次净化去除过量的衍生化试剂或直接进样分析。整个过程使用的样本体积大，处理流程复杂且耗时，对操作人员的熟练和专业程度要求高，无法实现高通量检测。而本方法使用200μL血浆，全程96孔板处理样本，无需吹干和重组，手动操作也可大大提高检测通量。如能配合自动化样本前处理仪，方法可进行直接转移，样本通量将会进一步提高。

B.传统的LC-MS/MS方法通常只检测儿茶酚胺的3个氧甲基化代谢物，因为儿茶酚胺的极性更大，且浓度也较低，所以无论是前处理还是色谱条件的优化都有巨大的挑战，临床上通常检测四个指标，本方法通过衍生化技术减小了6个分析物的极性，又显著的提高了分析物的灵敏度，获得了很高的SPE回收率，也使检测方法变得更加灵敏，可在一个方法中实现所有6个分析物的同时检测。

C.儿茶酚胺及其氧甲基化代谢物的检测难点还在于它们特别容易受到血浆内源性干扰物的干扰，因为极性大，导致分析物在反相色谱柱上无法很好的保留，而色谱保留是基于色谱的干扰分离的基础。如果运用亲水色谱柱(HILIC)，分析物能得到较好的保留，然而亲水柱的分离度有限，对于及其相似的干扰物仍无法很好的分离，无限延长色谱分析时间或更换柱效更好的分析柱或许可以增加干扰的分离，但灵敏度也会降低。因此丹磺酰氯衍生化后因为极性和离子化效率的改善，分析物在反相色谱柱上能与干扰实现很好的分离，且检测灵敏度能很好的满足要求。

儿茶酚胺及其氧甲基化代谢物的同时检测在临床上判断儿茶酚胺分泌异常的疾病以及治疗监测中具有重要意义。检测的灵敏度和抗干扰的特异性是方法的主要指标，而实现高通量检测则是方法能在临床广泛应用的基础。。

附图说明

图1为儿茶酚胺类激素的色谱图。

具体实施方式

以下，参照实施例对本发明进行更详细和具体地描述，但下述实施例并不意在限制本发明。

实施例儿茶酚胺类激素的检测方法

(1)血浆样本前处理

1)衍生化步骤：标准曲线用水作为替代基质，取标准曲线样本和待测血浆样本各200μL置于96孔收集板中，加入10μL混合同位素内标工作液，再加入0.56mL乙醇溶液，1800转/分钟涡旋1分钟后全部转移至96孔沉淀板(2mL/well)，正压并收集滤液，在滤液中加入60μL丹磺酰氯溶液(1～30mg/mL)和80μL pH调节剂(硼酸缓冲液，将溶液调至pH＝9.5)，1800转/分钟涡旋10秒后封板，60℃孵育15分钟，打开封膜，在其中加入0.8mL 0.2％甲酸-水溶液调节pH至7后待上样。(实践中，pH6-8都可以)

2)固相萃取流程：分别用300μL甲醇和2％甲酸-水活化和平衡MCX小柱，将衍生化并稀释后的样品分两次进行上样，上样结束后用700μL 2％甲酸水清洗2次，再用200μL70％乙腈清洗2次，最后用40μL 10％氨水乙腈进行洗脱至96孔收集板中，并用80μL 2.5％氨水-4％甲酸-20％乙腈-水稀释洗脱液后封板并供LC-MS/MS进样分析。

(2)液相色谱质谱条件

使用ExionLC串联Qtrap6500(SCIEX，加拿大)仪器进行分析和检测。

1)以Luna Omega C18 100A,1.6μm,2.1×50mm(Phenomenex公司，美国)作为分离柱，并将5mmol/L甲酸铵-水和5mmol/L甲酸铵-95％乙腈-水分别作为流动相的水相和有机相进行梯度洗脱，分析时间为11.5分钟。

2)质谱检测采用电喷雾电离(ESI)模式，正离子扫描，雾化气：60psi；加热气：70psi；气帘气：30psi；碰撞气：10psi；电压：5500V；温度：600℃。质谱通道根据分析物选择定量和定性离子对，并通过计算二者比值与标准样品的偏差来判断临床样本是否存在干扰。定量和定性离子对见下表：

分析物	定量通道	定性通道
			MN	664.2→646.3amu	664.2→412.1amu
NMN	650.2→553.2amu	650.2→261.1amu
			3-MT	634.2→400.2amu	634.2→263.2amu
E	883.2→631.2amu	883.2→397.2amu
			NE	869.2→617.2amu	869.2→235.0amu
DA	853.2→619.2amu	853.2→263.2amu

(3)该实施例结果

儿茶酚胺类激素的定量下限在2.5-10pg/mL之间，线性范围则达到了1000倍，无论是正常水平还是异常升高的样本均可在线性范围内被定量检出(见表1)。该方法的灵敏度较高，部分分析物的检测限(LoD)可达到1pg/mL。从图1的真实样本色谱图也能看出，衍生化后的分析物在C18分析柱上与干扰峰可实现较好的分离；该样本的检测结果为3-MT,2.51pg/mL；NMN,84.3pg/mL；MN,316pg/mL；DA,11.3pg/mL；NE,423pg/mL；E,64.1pg/mL。

表1.儿茶酚胺及其氧甲基代谢物的线性回归方程

分析物	线性回归方程	相关系数(r)
			3-MT	y＝0.00166x+0.000271	0.9965
NMN	y＝0.000291x+0.0000948	0.9978
			MN	y＝0.00311x+0.000103	0.9990
DA	y＝0.00143x+0.000129	0.9986
			NE	y＝0.000119x+0.0000786	0.9989
E	y＝0.018x+0.00314	0.9977

通过外添加回收试验考察方法的准确度，并进行了连续三个批次的准确度和精密度验证。结果表明(见表2)，儿茶酚胺及其氧甲基代谢物的批内和批间准确度在89.78-108.5％之间，精密度均<9％。所有分析物的回收率均在85％以上，内标校正后的基质效应接近1.00。

表2.儿茶酚胺及其氧甲基代谢物的验证指标性能

本检测方法所需样品含量少，检测整个过程在96孔板中操作，便于自动化大规模操作。与佰辰生物的专利相比，具有更大的优势：检测分析物全面，可以一次检测，提供更多信息，避免嗜铬细胞瘤的漏检。采用同位素内标与分析物一一对应，定量更精准；而且处理样品和标准品可以同时操作，且样品预处理中无需冻干步骤，衍生化时间更短，效率更高。

广东中科康仪生物技术有限公司申请的专利方法，能同时检测六种物质，本发明采用丹磺酰氯衍生化技术，使得目标分析物的极性和离子化效率大大增加，从而大大有利于儿茶酚胺类分析物在反向色谱的保留和质谱灵敏度的提升，使得血浆中痕量水平的激素可被定量检出。在于灵敏度要远高于中科康仪的方法，且更具临床意义，具体参见表3：

表3定量下限与参考值的比较

MNs	正常参考值(pg/mL)	中科康仪定量下限(pg/mL)	本专利定量下限(pg/mL)
				MN	<98.5	20	10
NMN	<165	20	10
				3-MT	<18.4	20	2.5
E	<112	156	10
				NE	<750	156	10
DA	<30.6	156	5

由于中科康仪有3个指标的最低定量限高于正常参考阈值，如有患者浓度高于正常参考阈值而低于最低定量限，则被误判为正常，从而造成漏诊、误诊。

此外，应理解，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细地说明，本领域的普通技术人员应当理解，在不脱离本发明的范围和实质的情况下，可以对本发明的技术方案进行各种修改或者等同替换。

Claims

1.一种儿茶酚胺类激素的检测方法，其特征在于，所述方法包括步骤：

(1)对样品进行蛋白沉淀，取上清液；

(2)对上清液进行丹磺酰氯衍生化；

(3)衍生化后的液体进行固相萃取；

2.如权利要求1所述儿茶酚胺类激素的检测方法，其特征在于，所述儿茶酚胺类激素包括肾上腺素、去甲肾上腺素、多巴胺、变肾上腺素、变去甲肾上腺素和3-甲氧酪胺中的三种以上。

3.如权利要求1所述儿茶酚胺类激素的检测方法，其特征在于，所述步骤(4)中质谱通道还针对分析物选择了定量和定性离子对，并通过计算二者比值与标准样品的偏差来判断临床样本是否存在干扰。

4.如权利要求2所述儿茶酚胺类激素的检测方法，其特征在于，所述步骤(4)中质谱通道还针对分析物选择了定量和定性离子对，并通过计算二者比值与标准样品的偏差来判断临床样本是否存在干扰。

5.如权利要求3或4所述儿茶酚胺类激素的检测方法，其特征在于，所述定量和定性离子对为：

分析物定量通道定性通道 MN 664.2→646.3amu 664.2→412.1amu NMN 650.2→553.2amu 650.2→261.1amu 3-MT 634.2→400.2amu 634.2→263.2amu E 883.2→631.2amu 883.2→397.2amu NE 869.2→617.2amu 869.2→235.0amu DA 853.2→619.2amu 853.2→263.2amu

6.如权利要求1-4任一权利要求所述儿茶酚胺类激素的检测方法，其特征在于，所述步骤(1)中样品包括不同浓度的标准曲线样品和血浆样品。

7.如权利要求1-4任一权利要求所述儿茶酚胺类激素的检测方法，其特征在于，所述步骤(1)中在待测样品中加入已知浓度的稳定同位素标记的E、NE、DA、MN、NMN和3-MT作为内标。

8.如权利要求6所述儿茶酚胺类激素的检测方法，其特征在于，所述步骤(1)中沉淀剂为甲醇、乙醇、丙酮、乙腈或其混合物。

9.如权利要求6所述儿茶酚胺类激素的检测方法，其特征在于，所述步骤(2)中衍生化反应条件为pH9.5，60℃避光孵育15分钟；之后用甲酸水溶液将溶液pH调节至6～8。

10.如权利要求7所述儿茶酚胺类激素的检测方法，其特征在于，所述步骤(3)中采用MCX或SCX浓缩型阳离子交换SPE小柱。

11.如权利要求10所述儿茶酚胺类激素的检测方法，其特征在于，所述步骤(4)中使用ExionLC串联Qtrap6500或性能相等同的其它品牌仪器进行检测，色谱柱为LunaOmegaC18100A,1.6μm,2.1×50mm或性能相等同的其它品牌色谱柱，流动相的水相和有机相分别为5mmol/L甲酸铵-水和5mmol/L甲酸铵-95％乙腈-水。

12.如权利要求8-11任一权利要求所述儿茶酚胺类激素的检测方法，其特征在于，所述步骤(4)中质谱条件为雾化气：60psi；加热气：70psi；气帘气：30psi；碰撞气：10psi；电压：5500V；温度：600℃。