CN112526049A - 基于超高效液相色谱串联静电场轨道阱质谱同时检测白酒中10种甜味剂的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了基于超高效液相色谱串联静电场轨道阱质谱同时检测白酒中10种甜味剂的方法。样品用纯水稀释后直接进样，经ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱分离，甲醇和0.01mol/L乙酸铵水溶液为流动相进行梯度洗脱，采用负离子模式，通过全扫描与二级碎片离子对白酒中10种目标化合物进行定性定量检测。结果表明，10种甜味剂的线性相关系数均大于0.99，基质加标回收率范围为％‑％，相对标准偏差RSD值在％‑％，检测限为ng/ml。该方法简便、快速，定性定量准确可靠，可作为白酒中10种甜味剂的快速筛查方法。
Description
技术领域
本发明涉及白酒甜味剂检测领域，特别涉及一种基于超高效液相色谱串联静电场轨道阱质谱同时检测白酒中10种甜味剂的方法。
背景技术
随着中国白酒越来越受世界人民的青睐，国际市场更加广泛，因此，要求我国白酒企业的酿造工艺更加规范，卫生质量安全标准向国际化标准靠近。白酒生产企业有大型企业，也有众多小作坊，大多数小作坊厂房简陋，设备陈旧，技术落后。随着白酒行业不断的发展，国内白酒行业各类安全隐患和事件凸显，甜味剂问题等多种白酒事件频发，这些问题在一定程度上制约了白酒行业的发展。据贵州省市场监管局食品不合格情况的通告，2019年-2020年贵州省食品安全监督抽检结果涉及甜味剂的超范围使用问题，其中白酒中不合格项目包括甜蜜素、糖精钠、三氯蔗糖等甜味剂。
甜味剂是赋予食品甜味的物质，是一类重要的食品添加剂，已在美国、欧盟及中国等100多个国家和地区广泛使用，有的品种使用历史已超过100年。甜味剂有人工和天然之分，在食品中适量添加可改善食品风味，但长期大量摄入人工甜味剂可能会导致高血糖、葡萄糖耐受不良、肥胖等代谢系统性疾病。随着食品工业的发展，复合甜味剂的使用和新型甜味剂的开发成为发展的潮流和趋势，但这也对监管提出了新的挑战。我国GB 2760-2014《食品安全国家标准食品添加剂使用标准》规范管理使用的甜味剂有甜菊糖苷、糖精钠、甜蜜素、阿斯巴甜、安赛蜜、甘草、木糖醇、麦芽糖醇等十余种，可以用于面包、糕点、饼干、饮料、调味品等食品中。根据食品安全国家标准规定，白酒中不允许添加天然或人工合成甜味剂。因此白酒中检出甜味剂属于超范围使用，原因可能是生产企业为增加产品的某方面口感，在产品中添加甜味剂来调节，也可能是原辅料带入的因素。
现有食品中甜味剂的分析方法有液相色谱法、气相色谱法、拉曼光谱法、离子色谱法]、液相色谱串联质谱法，液相色谱检测时由于甜蜜素与三氯蔗糖的紫外吸收较弱，不适宜使用紫外检测器，使得多种甜味剂同时检测受到限制，气相色谱检测甜蜜素需要衍生化且会产生假阳性情况。上述几种检测方法抗干扰能力弱、灵敏度低及特异性不强。
目前检测机构多采用液相色谱串联四极杆质谱法检测白酒中甜味剂，但低分辨率质谱的缺点是必须采用标准参考物质做定性的依据。鉴于此，本研究针对白酒样品的特性，建立了一种基于超高效液相色谱串联静电场轨道阱质谱同时检测白酒中10种甜味剂的快速检测方法，该方法前处理简单、快速，不仅可以实现甜味剂的精准定性，同时可完成准确定量，为白酒中甜味剂检测提供参考。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的是提供一种基于超高效液相色谱串联静电场轨道阱质谱同时检测白酒中10种甜味剂的方法，该方法前处理简单、快速，不仅可以实现甜味剂的精准定性，同时可完成准确定量，可以克服现有技术的不足。
本发明的技术方案是，基于超高效液相色谱串联静电场轨道阱质谱同时检测白酒中10种甜味剂的方法包括以下步骤
(1)试剂与仪器的准备，试剂为甜味剂标准物质；乙酸铵；甲醇；纯水；所述甜味剂标准物质为：安赛蜜；甜蜜素；D(+)-甘露糖；D-山梨糖醇；糖精钠；阿斯巴甜；阿力甜；麦芽糖醇；纽甜；三氯蔗糖；仪器为超高效液相色谱；静电场轨道阱质谱仪；
(2)样品前处理：准确称取被测样品1.00g，用纯水定容至10.0ml，混匀，0.22μm有机滤膜过滤后测定；
(3)标准溶液的配制：准确称取适量甜味剂标准物质，分别用纯水溶解后配制成1000mg/L的标准储备液，于4℃冷藏保存；准确吸取各标准储备液.0ng/mL-100ng/mL工作曲线；
(4)色谱条件：色谱柱采用ACQUITY UPLC HSS T3，规格100mm×2.1mm，1.8μm；柱温35℃；流动相为0.01mol/L乙酸铵溶液和甲醇；流速0.3mL/min；采用梯度洗脱；进样量10μL；
(5)质谱条件：可加热点喷雾离子源HESI，负离子检测模式；鞘气流速:12L/min；辅助气流速:3.6L/min；吹扫气流速：0L/min；喷雾电压:3000V；毛细管温度:325℃；辅助气加热温度：350℃；扫描模式：一级全扫描+数据依赖的二级扫描Full scan+ddms2，母粒子扫描分辨率：70000，最大注入时间：200ms，扫描范围100m/z～500m/z，子粒子扫描分辨率：17500，触发阈值：1×105，最大注入时间：50ms；
(6)用于超高效液相色谱串联静电场轨道阱质谱及相关软件得到甜味剂标准物质的色谱质谱信息；
(7)用于超高效液相色谱串联静电场轨道阱质谱及相关软件得到处理后样品甜味剂色谱质谱信息；
(8)将甜味剂标准物质的色谱质谱信息与处理后样品的甜味剂色谱质谱信息进行比对，通过分析色谱质谱信息进行最终判定。
前述的基于超高效液相色谱串联静电场轨道阱质谱同时检测白酒中10种甜味剂的方法是，所述梯度洗脱，初始至6分钟，甲醇体积为5％，乙酸铵水溶液为95％；6至8分钟，甲醇体积为95％，乙酸铵水溶液为95％；8至10分钟，甲醇体积为5％，乙酸铵水溶液为95％。
本发明的有益效果是：
(1)在现有的一个检测过程中，样品前处理通常会占用全程时间的50％以上，本发明在不影响检测结果的前提下采用简单、无损、低成本、环境友好的前处理方法是最优选择。针对白酒样品，本方法采用样品用水稀释10倍后直接上机检测，结合色谱柱分离和精确质量数定性定量，经检测，具有法简便、快速，定性定量准确可靠的优点。
(2)本发明建立了超高效液相色谱串联静电场轨道阱质谱快速检测白酒中10种甜味剂的方法，白酒样品用水稀释后即可直接进样分析，采用ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱同时对安赛蜜、糖精钠、甜蜜素、阿斯巴甜、纽甜、麦芽糖醇、阿力甜、D-山梨糖醇、D-甘露糖及三氯蔗糖进行色谱分离检测，并采用高分辨质谱与二级离子碎片进行准确的定性定量分析实际样品检测结果表明，该方法能够满足白酒中10种甜味剂的精准定性和准确定量的快速检测，极大地提高了分析效率和准确性。
附图说明
图1安赛蜜提取离子色谱图；
图2安赛蜜二级质谱图；
图3甜蜜素提取离子色谱图；
图4甜蜜素二级质谱图；
图5甘露糖提取离子色谱图；
图6甘露糖二级质谱图；
图7山梨糖醇提取离子色谱图；
图8山梨糖醇二级质谱图；
图9糖精钠提取离子色谱图；
图10糖精钠二级质谱图；
图11阿斯巴甜提取离子色谱图
图12阿斯巴甜二级质谱图；
图13阿力甜提取离子色谱图
图14阿力甜二级质谱图；
图15麦芽糖醇提取离子色谱图
图16麦芽糖醇二级质谱图；
图17纽甜提取离子色谱图
图18纽甜二级质谱图；
图19三氯蔗糖提取离子色谱图
图20三氯蔗糖二级质谱图。
具体实施方式
以下将对本发明的优选实施例进行详细的描述。应当理解，优选实施例仅为了说明本发明，而不是为了限制本发明的保护范围。
基于超高效液相色谱串联静电场轨道阱质谱同时检测白酒中10种甜味剂的方法包括以下步骤
(1)试剂与仪器的准备，试剂为甜味剂标准物质；乙酸铵；甲醇；纯水；所述甜味剂标准物质为：安赛蜜；甜蜜素；D(+)-甘露糖；D-山梨糖醇；糖精钠；阿斯巴甜；阿力甜；麦芽糖醇；纽甜；三氯蔗糖；仪器为超高效液相色谱；静电场轨道阱质谱仪；
(2)样品前处理：准确称取被测样品1.00g，用纯水定容至10.0ml，混匀，0.22μm有机滤膜过滤后测定；
(3)标准溶液的配制：准确称取适量甜味剂标准物质，分别用纯水溶解后配制成1000mg/L的标准储备液，于4℃冷藏保存；准确吸取各标准储备液.0ng/mL-100ng/mL工作曲线；
(4)色谱条件：色谱柱采用ACQUITY UPLC HSS T3，规格100mm×2.1mm，1.8μm；柱温35℃；流动相为0.01mol/L乙酸铵溶液和甲醇；流速0.3mL/min；采用梯度洗脱；进样量10μL；
(5)质谱条件：可加热点喷雾离子源HESI，负离子检测模式；鞘气流速:12L/min；辅助气流速:3.6L/min；吹扫气流速：0L/min；喷雾电压:3000V；毛细管温度:325℃；辅助气加热温度：350℃；扫描模式：一级全扫描+数据依赖的二级扫描Full scan+ddms2，母粒子扫描分辨率：70000，最大注入时间：200ms，扫描范围100m/z～500m/z，子粒子扫描分辨率：17500，触发阈值：1×105，最大注入时间：50ms；
(6)用于超高效液相色谱串联静电场轨道阱质谱及相关软件得到甜味剂标准物质的色谱质谱信息；
(7)用于超高效液相色谱串联静电场轨道阱质谱及相关软件得到处理后样品甜味剂色谱质谱信息；
(8)将甜味剂标准物质的色谱质谱信息与处理后样品的甜味剂色谱质谱信息进行比对，通过分析色谱质谱信息进行最终判定。
为证明上述方法，通过下述试验进行验证
1材料与方法
1.1试剂与仪器
1.1.1试剂
甜味剂标准物质：安赛蜜(德国Dr公司，批号：G137930)；甜蜜素(北京坛墨公司，批号：A1910277)；D(+)-甘露糖(德国Dr公司，批号：G832837)；D-山梨糖醇(德国Dr公司，批号：G145145)；糖精钠(德国Dr公司，批号：G154497)；阿斯巴甜(德国Dr公司，批号：G132138)；阿力甜(加拿大Toronto Research Chemicals公司，批号：A536500)；麦芽糖醇(美国TMstandard公司，批号2221805)；纽甜(上海安谱公司，批号：44760100)；三氯蔗糖(德国Dr公司，批号：G125127)；乙酸铵(色谱纯，天津科密欧公司)；甲醇(色谱纯，美国默克公司)；纯水(18.2Ω，美国密理博公司)。
1.1.2仪器
超高效液相色谱(美国赛默飞世尔公司，Ultimate-3000)和静电场轨道阱质谱仪(美国赛默飞世尔公司，Q-Exactive)。
1.2实验方法
1.2.1样品前处理：准确称取样品1.00g，用纯水定容至10.0ml，混匀，0.22μm有机滤膜过滤后测定。
1.2.2标准溶液的配制：准确称取适量标准物质，分别用纯水溶解后配制成1000mg/L的标准储备液，于4℃冷藏保存。准确吸取各标准储备液1.0ng/mL-100ng/mL工作曲线
1.2.3色谱条件：ACQUITY UPLC HSS T3(100mm×2.1mm，1.8μm)；柱温35℃。流动相为0.01mol/L乙酸铵溶液和甲醇；流速0.3mL/min；采用梯度洗脱(见表1)；进样量10μL。
表1梯度洗脱条件
| 时间/min | 甲醇/％ | 乙酸铵水溶液/％ |
| 0 | 5 | 95 |
| 1 | 5 | 95 |
| 6 | 95 | 5 |
| 6.5 | 95 | 5 |
| 8 | 5 | 95 |
| 10 | 5 | 95 |
1.2.4质谱条件：可加热点喷雾离子源(HESI)，负离子检测模式；鞘气流速:12L/min(即40arb)；辅助气流速:3.6L/min(即12arb)；吹扫气流速：0L/min；喷雾电压:3 000V；毛细管温度:325℃；辅助气加热温度：350℃；扫描模式：一级全扫描+数据依赖的二级扫描(Full scan+ddms2)，母粒子扫描分辨率：70 000，最大注入时间：200ms，扫描范围100m/z～500m/z，子粒子扫描分辨率：17 500，触发阈值：1×105，最大注入时间：50ms。
2.1样品前处理的选择
在一个检测过程中，样品前处理通常会占用全程时间的50％以上，因此在不影响检测结果的前提下采用简单、无损、低成本、环境友好的前处理方法是最优选择。针对白酒样品，本方法采用样品用水稀释10倍后直接上机检测，结合色谱柱分离和精确质量数定性定量，未见有基质干扰和基质效应。
2.2流动相的选择
对常用的流动相甲醇-水和乙腈-水进行对比，结果表明使用甲醇效果略好于乙腈。同时，将0.1％甲酸水溶液和0.01mol/L乙酸铵溶液分别与甲醇作流动相进行比较，发现流动相中含有0.1％甲酸时，部分甜味剂峰型拖尾，而使用0.01mol/L乙酸铵时，响应较高，同时峰形较好。因此，本文采用0.01mol/L乙酸铵水溶液-甲醇作流动相。
2.3质谱参数的选择
采用Xcalibur 2.1软件计算的化合物加合离子的理论单一同位素的精确质量数作为提取色谱图的依据，表2列出了10种甜味剂的分析参数。理论精确质量数与实测精确质量数的相对偏差越小，则筛查结果的可信程度越高。10种甜味剂相关色谱和质谱信息见表2和图1-图20。
表2 10种甜味剂的分子式、保留时间、理论精确质量数和实测精确质量数
从表2可以看出，10甜味剂的质量数相对偏差全部<3μg/kg，按照欧盟2002/657/EC增加的LC/MS目标准则，筛查要求质量精度在±50mDa之间，分辨率>10000，因此可根据保留时间、精确质量数对白酒中非法添加甜味剂进行快速筛查与确证。
2.4线性范围和最低检出限
关于高分辨质谱的最低检出限，有报道以10倍信噪比所对应的浓度值作为最低检出限[53-54]，但由于高分辨质谱提取目标离子的精确质量数，基线噪音极低，以此方法计算出的最低检出限与方法的真实性存在差距。本实验采用基质空白提取液逐级稀释标准溶液至仪器所能检出的最低浓度，该浓度应满足在较长一段时间内连续多次平行测定的相对标准偏差较低，然后将该浓度做为方法的最低检出限。
表3 10种甜味剂的线性范围、相关系数、检测限和回归方程
2.6方法的回收率和精密度
以1、5、10μg/kg三个水平添加到空白样品中，测定回收率和精密度，结果见表4。
表4 10种甜味剂加标回收率与相对标准偏差(n＝6)
通过上述试验检测结果表明，该方法能够满足白酒中10种甜味剂的精准定性和准确定量的快速检测，极大地提高了分析效率和准确性。
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
Claims (2)
1.基于超高效液相色谱串联静电场轨道阱质谱同时检测白酒中10种甜味剂的方法，其特征在于：该方法包括以下步骤
(1)试剂与仪器的准备，试剂为甜味剂标准物质；乙酸铵；甲醇；纯水；所述甜味剂标准物质为：安赛蜜；甜蜜素；D(+)-甘露糖；D-山梨糖醇；糖精钠；阿斯巴甜；阿力甜；麦芽糖醇；纽甜；三氯蔗糖；仪器为超高效液相色谱；静电场轨道阱质谱仪；
(2)样品前处理：准确称取被测样品1.00g，用纯水定容至10.0ml，混匀，0.22μm有机滤膜过滤后测定；
(3)标准溶液的配制：准确称取适量甜味剂标准物质，分别用纯水溶解后配制成1000mg/L的标准储备液，于4℃冷藏保存；准确吸取各标准储备液1.0ng/mL-100ng/mL工作曲线；
(4)色谱条件：色谱柱采用ACQUITY UPLC HSS T3，规格100mm×2.1mm，1.8μm；柱温35℃；流动相为0.01mol/L乙酸铵溶液和甲醇；流速0.3mL/min；采用梯度洗脱；进样量10μL；
(5)质谱条件：可加热点喷雾离子源HESI，负离子检测模式；鞘气流速:12L/min；辅助气流速:3.6L/min；吹扫气流速：0L/min；喷雾电压:3000V；毛细管温度:325℃；辅助气加热温度：350℃；扫描模式：一级全扫描+数据依赖的二级扫描Full scan+ddms2，母粒子扫描分辨率：70000，最大注入时间：200ms，扫描范围100m/z～500m/z，子粒子扫描分辨率：17 500，触发阈值：1×105，最大注入时间：50ms；
(6)用于超高效液相色谱串联静电场轨道阱质谱及相关软件得到甜味剂标准物质的色谱质谱信息；
(7)用于超高效液相色谱串联静电场轨道阱质谱及相关软件得到处理后样品甜味剂色谱质谱信息；
(8)将甜味剂标准物质的色谱质谱信息与处理后样品的甜味剂色谱质谱信息进行比对，通过分析色谱质谱信息进行最终判定。
2.根据权利要求1所述的基于超高效液相色谱串联静电场轨道阱质谱同时检测白酒中10种甜味剂的方法，其特征在于：所述梯度洗脱，初始至6分钟，甲醇体积为5％，乙酸铵水溶液为95％；6至8分钟，甲醇体积为95％，乙酸铵水溶液为95％；8至10分钟，甲醇体积为5％，乙酸铵水溶液为95％。
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