CN109444293B - 一种新鲜烟叶中内源水溶性b族维生素的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本申请属于烟草代谢组学中的烟草内容物检测技术领域，具体涉及一种新鲜烟叶中内源水溶性B族维生素的检测方法。该检测方法针对新鲜烟叶中内源水溶性B族维生素进行检测，具体用于分别或者同时对9种B族维生素中一种或任意几种进行定性或者定量检测。本申请采用液质联用分析新鲜烟叶样品中相关维生素B族成分含量时，具有：前样品处理简单，定量定性时分辨率高、灵敏度高、快速简便、干扰小、适用于复杂基质样品等优点，尤其是可对较宽浓度范围全九种植物内源性B族维生素同时测定，而且测定时间较短，一个样本检测仅需18min，并且该检测方法灵敏度高、精密度好、加标回收率高，因此具有较好的实用价值和推广应用意义。
Description
技术领域
本申请属于烟草代谢组学中的烟草内容物检测技术领域，具体涉及一种新鲜烟叶中内源水溶性B族维生素的检测方法。
背景技术
植物是自然界中维生素B族的主要制造者，但是植物体内维生素B族的研究开展较晚。烟草作为一种模式植物，其体内的维生素B族可以作为生长调节剂来刺激烟草的生长发育，其中维生素B族的含量、代谢特征都对烟草的生长有较大的影响；因此准确检测植物维生素B族在植物体内的含量变化，是了解其生理机制、代谢途径的重要前提。
现有技术中，测定植物维生素B族的方法主要有差分脉冲伏安法（DPV）、高效液相色谱法（HPLC）、薄层色谱分析法（TLC）以及液相色谱‒串联质谱法（LC‒MS/MS）等，但针对不同类型植物应用时，各种检测方法的适用性存在一定局限性。而就烟草而言，建立一种烟叶中高通量、高灵敏度和较为标准化的维生素B族检测方法，对研究植物维生素B族的代谢和烟叶培育具有重要意义。
发明内容
本申请目的在于提供一种可以检测新鲜烟叶中多种内源水溶性B族维生素（维生素B1、维生素B2、维生素B3、维生素B5、维生素B6、维生素B7和维生素B9、维生素B12和维生素B16）的检测方法，从而为烟草代谢组学的深入发展奠定一定技术基础。
本申请所采取的技术方案详述如下。
一种新鲜烟叶中内源水溶性B族维生素的检测方法，该检测方法针对新鲜烟叶中内源水溶性B族维生素进行检测，可以分别或者同时对维生素B1、维生素B2、维生素B3、维生素B5、维生素B6、维生素B7和维生素B9、维生素B12和维生素B16中一种或任意几种进行定性或者定量检测，该方法具体包括如下步骤：
（一）对新鲜烟叶进行预处理
（1）首先，将新鲜烟叶利用液氮速冻，冷冻干燥后粉碎机打碎（粉碎100~300目），备用；
（2）其次，以0.5 mmol/L盐酸溶液作为提取液，每20mg粉碎烟叶样品中，加入提取液0.5~1.5mL（优选1mL），35~42℃进行萃取30~60min，需要注意的是，萃取操作时应当避光，优选操作为：40℃避光萃取40min（进一步优选操作为利用超声辅助萃取，具体例如采用美国sonics公司的超声波细胞破碎仪超声功率为60%条件下进行辅助超声萃取操作）；
（3）最后，将上述混合体系15000~20000转离心10~20min，（优选4℃、20000转离心10 min），取上清液，利用0.45μm滤膜过滤，取滤液进行测定；
（二）利用HPLC-MS/MS（液相色谱-串联质谱联用）绘制标准曲线
（1）首先，利用超纯水配制维生素B1、维生素B2、维生素B3、维生素B5、维生素B6、维生素B7和维生素B9、维生素B12和维生素B16母液以及其混合标准工作溶液；
（2）其次，进行液相色谱、质谱检测；
液相色谱检测分析时，具体操作参数参考如下：
色谱柱：Waters公司ACOUTITY UPLC HSS T3柱，规格2.1×100mm，1.8μm；
色谱分析时：柱温40℃；进样量：1μL；
以流动相A/B相进行梯度洗脱：
流动相A，10mmol/L的甲酸铵水溶液（pH=5），
流动相B，0. 1%甲酸-甲醇溶液；
流速：0.3 mL min-1；
梯度洗脱程序：
0~2.5 min内B相由0%升至10.00%，
2.5~5.0 min内B相升至10.50%，
5.0~7.0 min内B相升至10.90%，
7.0~7.1 min时B相升至30.33%，
7.1~10.1 min时B相升至30.50%，
10.1~15.0 min时B相升至45.00%，
15.0~15.1 min时B相升至100.00%，
15.1~18.0 min时B相保持在100.00%；
质谱分析时，质谱条件参考设置为：
离子源：电喷雾离子源；正离子扫描；多反应监测；
干燥气温度：290℃，干燥气流量：12 L min-1；
雾化器压力：40 psi；鞘气温度：200℃，鞘气流量：11L min-1；
正离子电离模式下毛细管电压：4 kV，负离子电离模式下喷雾电压：3.5 kV；
各B族维生素样品MRM模式（multi reaction monitoring，多反应检测扫描）下特征碎片离子参考如下：
（3）最后，分别配制用于正离子扫描模式的系列浓度的混合标准溶液，并进行测定，每个浓度平行测定3 次，以目标组分定量离子的峰面积平均值（Y）对质量浓度( X，μg /L) 进行线性回归分析，最终得到9种植物B族维生素的线性方程和相关系数(R2)；以信噪比( S/N)为3确定9种B族维生素的检出限( LOD) ，具体结果如下表：
（三）定性或定量测定
采用步骤（二）中相同测定方法对步骤（一）中样品进行测定，然后利用步骤（二）中所得线性曲线计算获得步骤（一）中样品中的维生素B族具体类型和含量。
现有技术中，针对B族维生素检测测定时，一般仅针对其中一种维生素进行测定，检测对象较单一，并且灵敏度较低。本申请针对此缺陷进行了改进。通过对液质联用技术的进一步优化、改进，尤其是通过对质谱分析中子母离子对高响应值的确定，使得相关测定结果较为稳定、重现性好，杂质干扰较少，定量结果也更优。
总体上，本申请采用液质联用分析新鲜烟叶样品中相关维生素B族成分含量时，具有：前样品处理简单，定量定性时分辨率高、灵敏度高、快速简便、干扰小、适用于复杂基质样品等优点，尤其是可对较宽浓度范围全九种植物内源性B族维生素同时测定，而且测定时间较短，一个样本检测仅需18min，并且该检测方法灵敏度高、精密度好、加标回收率高，因此具有较好的实用价值和推广应用意义。
附图说明
图1为九种植物内源性B族维生素标准样品的离子流TIC图；
图2为不同地区烟草样品的检测结果对比图；
图3为流动相的优化；
图4为样品提取液的优化。
具体实施方式
下面结合实施例对本申请做进一步的解释说明。
实施例1
本实施例首先就相关标准曲线绘制及液相质谱联用分析过程中的相关参数选择过程简要介绍如下。
（一）配制标准溶液
利用超纯水配制维生素B1、维生素B2、维生素B3、维生素B5、维生素B6、维生素B7和维生素B9、维生素B12和维生素B16母液（母液浓度0.1mg/ml）以及其混合标准工作溶液；
其中：
VB1、VB2、VB3、VB16标准曲线的系列浓度为10、25、50、100、250、500、750、1000ng/ml；
VB5标准曲线的系列浓度为50、100、250、500、1000、2000、2500ng/ml；
VB6和VB9标准曲线的系列浓度为0.1、0.5、1、10、25、50、100 ng/ml；
VB7标准曲线的系列浓度为0.1、0.5、1、10、25、50、100、200、250 ng/ml；
VB12标准曲线的系列浓度为0.01、0.05、0.1、0.5、1、10、25、50、100ng/ml。
（二）进行液相色谱、质谱检测；
液相色谱检测分析时，具体操作参数参考如下：
色谱柱：Waters公司ACOUTITY UPLC HSS T3柱，规格2.1×100mm，1.8μm；
色谱分析时：柱温40℃；进样量：1μL；
以流动相A/B相进行梯度洗脱：
流动相A，10mmol/L的甲酸铵水溶液（pH=5），
流动相B，0. 1%甲酸-甲醇溶液；
流速：0.3 mL min-1；
梯度洗脱程序：
0~2.5 min内B相由0%升至10.00%，
2.5~5.0 min内B相升至10.50%，
5.0~7.0 min内B相升至10.90%，
7.0~7.1 min时B相升至30.33%，
7.1~10.1 min时B相升至30.50%，
10.1~15.0 min时B相升至45.00%，
15.0~15.1 min时B相升至100.00%，
15.1~18.0 min时B相保持在100.00%。
需要说明的是，在选择流动相A（10mmol/L的甲酸铵水溶液）最适pH时，前期实验过程中，发明人分别配制pH=2、3、4、5、6的甲酸铵水溶液作为流动相，以考察不同pH的甲酸铵水溶液作为流动相时对质谱离子源的离子化的增强效果。实验过程中，以10为底的面积的对数作为选择标准，每一pH测定3次，取平均值。结果表明（如图3所示）：VB2、VB5、VB7、VB9、VB12在甲酸铵pH为5时信号强度最好，其他4种则是在甲酸铵pH为6时响应值最高；但另一方面，由于VB9、VB12在植物体内的含量较少，且信号强度较弱，所以优先考虑这两种物质响应值较高时所对应的甲酸铵pH。也因此，最终综合选择pH=5的甲酸铵水溶液作为流动相。
质谱分析时，质谱条件参考设置为：
离子源：电喷雾离子源；正离子扫描；多反应监测；
干燥气温度：290℃，干燥气流量：12 L min-1；
雾化器压力：40 psi；鞘气温度：200℃，鞘气流量：11L min-1；
正离子电离模式下毛细管电压：4 kV，负离子电离模式下喷雾电压：3.5 kV。
各B族维生素样品MRM模式（multi reaction monitoring，多反应检测扫描）下特征碎片离子参考如下：
。
需要说明的是，九种B族维生素的子母离子对响应值结果如图1所示。分析可以看出，所选择的九种B族维生素的子母离子对响应值高且结果稳定、重现性好，杂质干扰也较少，因此可作为定量离子用于对应维生素的定量分析。
（三）绘制标准测定曲线
分别配制用于正离子扫描模式的系列浓度的混合标准溶液，并进行测定，每个浓度平行测定3 次，以目标组分定量离子的峰面积平均值（Y）对质量浓度( X，μg /L) 进行线性回归分析，最终得到9种植物B族维生素的线性方程和相关系数(R2)；以信噪比( S/N)为3确定9种B族维生素的检出限( LOD) ，具体结果如下表：
。
（四）回收率效果评价
以1μg/L、250μg/L和1g/L三个水平的混合标准溶液为例，进行回收率试验，每个水平重复5次，结果如下表所示。
9种植物B族维生素的加标回收率和RSD ( n = 3)：
。
从上表结果可以看出，其平均回收率在76.49%~117.00%之间，这一结果表明该测定方法可靠性较高，可以用于实际测定分析。
实施例2
本实施例中，发明人分别对采自河南、贵州、湖南三个地方的烟叶样品中维生素B含量进行测定，具体过程简要解释如下。
（一）对新鲜烟叶进行预处理
首先，将各新鲜烟叶样品利用液氮速冻，冷冻干燥后粉碎机打碎（粉碎200目），备用；
其次，以0.5 mmol/L盐酸溶液作为提取液，每20mg粉碎烟叶样品中，加入提取液1mL，40℃避光萃取（采用美国sonics公司的超声波细胞破碎仪超声辅助萃取40min）；
最后，将上述混合体系进行离心（离心温度4℃，20000转离心10 min），取上清液，利用0.45μm滤膜过滤，取滤液进行测定。
针对提取液的选择，需要说明的是，由于烟叶样品成分比较复杂，在电喷雾离子源中电离时，存在离子增强和离子抑制效应，并且大部分B族维生素在弱酸的环境下稳定，但在pH＜2.0时会被破坏。因此，需要选择合适的提取液，确保B族维生素尽可能少降解，获得较高响应信号以便于定量。
基于B族维生素的性质和相似相溶原理，最终选择稀盐酸溶液作为提取液，而为确定合适的稀盐酸溶液浓度，发明人考察了0、0.05、0.5、1.5、5、15、50mmol/L的稀盐酸溶液作为提取液的效果，图4显示了不同浓度的稀盐酸溶液作为提取液对VB7检测响应的影响，当稀盐酸溶液浓度为0.5mmol/L时，VB7的响应值达到最高，其他8种B族维生素的变化趋势与VB7相似。因此最终选用0.5mmol/L的盐酸溶液作为提取液。
（二）具体测定分析
采用实施例1中相同测定方法对步骤（一）中样品进行测定，然后利用实施例1中所得线性曲线计算获得步骤（一）中样品中的维生素B族具体类型和含量。
测定结果绘制如图2所示，具体而言：
河南烟草中：维生素B1、维生素B2、维生素B3、维生素B5、维生素B6、维生素B7、维生素B9、维生素B12和维生素B16的含量分别为：10800ng/g，119000ng/g，67600ng/g，478000ng/g，491ng/g，67600ng/g，33200ng/g，163ng/g，106000ng/g；
贵州烟草中：维生素B1、维生素B2、维生素B3、维生素B5、维生素B6、维生素B7、维生素B9、维生素B12和维生素B16的含量分别为：36900ng/g，513000ng/g，187000ng/g，316000ng/g，544ng/g，10300ng/g，6250ng/g，92.5ng/g，117000ng/g；
湖南烟草中：维生素B1、维生素B2、维生素B3、维生素B5、维生素B6、维生素B7、维生素B9、维生素B12和维生素B16的含量分别为：3600ng/g，34000ng/g，94500ng/g，139000ng/g，539ng/g，1230ng/g，77.3ng/g，88ng/g，114000ng/g。
从上述结果可以看出，各地烟草在B族维生素含量方面表现出明显差异，基于这一特点，无论对于烟叶配方选择、还是对于烟草培育都具有一定的技术意义。
进一步地，以河南烟叶样品为例，在同一天内进行5次平行测定及分5天测定，测定结果的相对标准偏差表示该方法的日内精密度和日间精密度，结果如下表所示。
日内精密度( RSD，%，n = 5)、日间精密度( RSD，%，n = 5)：
。
从上述结果可以看出，该检测方法的精密度高、稳定性好，可以用于大批量样品的分析。
Claims (2)
1.一种新鲜烟叶中内源水溶性B族维生素的检测方法，其特征在于，该检测方法针对新鲜烟叶中内源水溶性B族维生素进行检测，具体用于同时对维生素B1、维生素B2、维生素B3、维生素B5、维生素B6、维生素B7和维生素B9、维生素B12和维生素B16进行定性和定量检测，该方法具体包括如下步骤：
（一）对新鲜烟叶进行预处理
（1）首先，将新鲜烟叶液氮速冻、干燥后粉碎100~300目，备用；
（2）其次，以0.5 mmol/L盐酸溶液作为提取液，每20mg粉碎烟叶样品中，加入提取液1.0mL，40℃避光、超声辅助萃取40min；
（3）最后，将上述混合体系离心，取上清液，对上清液利用0.45μm滤膜过滤，取滤液进行测定；
（二）利用HPLC-MS/MS绘制标准曲线
（1）首先，利用超纯水配制维生素B1、维生素B2、维生素B3、维生素B5、维生素B6、维生素B7和维生素B9、维生素B12和维生素B16母液以及其混合标准工作溶液；
（2）其次，进行液相色谱、质谱检测；
液相色谱检测分析时，具体操作参数为：
色谱柱：Waters公司ACOUTITY UPLC HSS T3柱，规格2.1×100mm，1.8μm；
色谱分析时：柱温40℃；进样量：1μL；
以流动相A/B相进行梯度洗脱：
流动相A，10mmol/L的甲酸铵水溶液，
流动相B，0. 1%甲酸-甲醇溶液；
流速：0.3 mL min-1；
梯度洗脱程序为：
0~2.5 min内B相由0%升至10.00%，
2.5~5.0 min内B相升至10.50%，
5.0~7.0 min内B相升至10.90%，
7.0~7.1 min时B相升至30.33%，
7.1~10.1 min时B相升至30.50%，
10.1~15.0 min时B相升至45.00%，
15.0~15.1 min时B相升至100.00%，
15.1~18.0 min时B相保持在100.00%；
质谱分析时，质谱条件设置为：
离子源：电喷雾离子源；正离子扫描；多反应监测；
干燥气温度：290℃，干燥气流量：12 L min-1；
雾化器压力：40 psi；鞘气温度：200℃，鞘气流量：11L min-1；
正离子电离模式下毛细管电压：4 kV，负离子电离模式下喷雾电压：3.5 kV；
各B族维生素样品MRM模式下特征碎片离子如下：
（3）最后，分别配制用于正离子扫描模式的系列浓度的混合标准溶液，并进行测定，以目标组分定量离子的峰面积平均值Y对质量浓度X进行线性回归分析，最终得到线性方程；
（三）定性或定量测定
采用步骤（二）中相同测定方法对步骤（一）中样品进行测定，判定样品中的维生素B族的具体类型，并利用步骤（二）中所得线性曲线分别计算获得步骤（一）中样品中各类型维生素B族的含量。
2.如权利要求1所述新鲜烟叶中内源水溶性B族维生素的检测方法，其特征在于，步骤（二）的步骤（3）中，具体回归方程为：
。
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