CN107607631A - 一种快速检测石蒜属植物中力可拉敏含量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种快速检测石蒜属植物中力可拉敏含量的方法，包括：(1)配制待测样品液；(2)检测；(3)含量计算。本发明能够对石蒜属植物中的生物碱类物质力可拉敏进行快速提取并定性定量分析，大幅度缩短分析时间，可在6分钟之内完成检测程序，力可拉敏保留时间在3.6分钟以内，快速得到检测结果，大大提高了分析速度和准确性，为研究石蒜属植物中力可拉敏的积累规律和合成代谢调控提供了有效且准确的分析方法。
Description
技术领域
本发明属于生物碱类物质检测领域，特别涉及一种快速检测石蒜属植物中力可拉敏含量的方法。
背景技术
石蒜属(Lycoris spp.)是石蒜科(Amaryllidaceae)球根草本植物，很多种是中国特有的观赏和药用花卉，富含多种石蒜属植物特有的生物碱成分。迄今为止，从石蒜属植物中分离出超过500种结构各异的生物碱类化合物，植物化学研究表明，这类化合物具有多种药理学功能，药用价值极高。其中，力可拉敏在治疗老年痴呆症、脊髓灰质炎后遗症性瘫痪、坐骨神经炎方面有重要作用(Cortes et al.,2015)。至今，野生的石蒜资源仍然是药用力可拉敏最重要的来源，因此，对石蒜中力可拉敏的含量进行准确定性和定量分析是育种和生物碱类物质合成代谢研究的重要内容之一。
目前，对石蒜中力可拉敏含量进行分析的方法主要有薄层色谱分离技术(thinlayer chromatography，TLC)、高效液相色谱检测技术(high-performance liquidchromatography)、气相色谱-质谱联用分析技术(Gas Chromatography-MassSpectrometry)和高效液相色谱-电喷雾离子化-质谱联用分析技术(HPLC-electrosprayionization-mass spectrometry,HPLC-ESI-MS)。
李明凯(石蒜生物碱分析方法的建立及其生物合成的研究，安徽农业大学，2012：1-69)利用薄层色谱分离技术，实现了力可拉敏等生物碱类物质的初步分离，并且发现双向薄层色谱比单向色谱更适合多种不同生物碱类物质的分离，该方法主要通过与已知的生物碱标样(加兰他敏、力可拉敏、石蒜碱)的迁移率进行对比，实现对样品中生物碱种类的初步定性，但不能用于准确的结构和定量分析。
袁菊红等(袁菊红等，石蒜属不同种间生物碱含量差异性研究，江西农业大学学报，32(3)：0560-0565，2010)利用高效液相色谱检测技术，通过样品与已知的生物碱标准品在同样条件下的保留时间和峰面积的对比，进行了石蒜属不同植物中加兰他敏、力可拉敏和石蒜碱的定量研究，其单次提取石蒜鳞茎材料需要鲜样60g(含水量90％左右)，折合石蒜鳞茎干样6g，需要消耗乙酸乙酯75ml，氢氧化钠10ml，甲醇8ml，对植物样本和试剂消耗极大，同时，其仅采用HPLC的方法，根据物质的保留时间进行含量检测，无法对待测物质进行准确定性，因此物质定量结果不可靠，不能进行结构、定性和精确定量分析。
Chun等(Chun et al.,Isolation and identification of alkaloids andanthocyanins from flower and bulb of Lycoris radiata using HPLC and LC-ESI-MS，Journal of Agricultural Chemistry and Environment，2(1)：22-26，2013)采用HPLC-ESI-MS的方法，对石蒜中的力可拉敏进行定量分析，力可拉敏的洗脱时间为46.9min，HPLC分析时间相对较长，需要60分钟，其根据保留时间和母离子信息进行含量检测，此方法较袁菊红等的方法，准确性有所提升，但明显的缺陷在于，相同洗脱时间和母离子大小的物质成分可能有很多种，因此在定性定量准确性上仍有缺陷。
并且，现有技术中，还存在提取时间长，操作繁琐的问题，如袁菊红等的方法中，主要提取步骤为烘干、粉碎、过筛、润湿、乙酸乙酯浸提、水浴中回流、提取液滤出、乙酸乙酯水浴中回流、滤出提取液、乙酸乙酯水浴中回流、滤出提取液、合并回流的提取液、旋转蒸干、冷却、甲醇洗涤溶解、过滤等步骤，为力可拉敏的快速定量分析带来不便。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种快速检测石蒜属植物中力可拉敏含量的方法，该方法能够对石蒜属植物中的生物碱类物质力可拉敏进行快速提取并定性定量分析，大幅度缩短分析时间，可在6分钟之内完成检测程序，力可拉敏保留时间在3.6分钟以内，快速得到检测结果，大大提高了分析速度和准确性，为研究石蒜属植物中力可拉敏的积累规律和合成代谢调控提供了有效且准确的分析方法。
本发明提供了一种快速检测石蒜属植物中力可拉敏含量的方法，包括：
(1)称取待测石蒜属植物样品，冷冻干燥后研磨成粉，以醇类有机溶剂作为提取剂，超声提取、混匀、离心，合并上清，浓缩，再复溶，稀释至浓度1～100ng/ml，得待测样品溶液；
(2)利用液相色谱-串联二级质谱对待测样品溶液进行检测，获得样品中力可拉敏的峰面积数据；
其中，色谱条件如下：
液相色谱柱：硅胶型反相色谱柱；
柱温：40～50℃；
进样量：5～10μL；
流速：0.2～0.4ml/min；
流动相：流动相A：甲酸-水溶液，流动相B：乙腈或甲醇；
洗脱方法：梯度洗脱，洗脱时间≤6.0min，流动相A和流动相B的体积比为40～95：5～60；
质谱条件及扫描方式：
离子源：加热电喷雾离子源或电喷雾离子源；
离子源喷雾电压：2500～4500V；
扫描方式：正离子扫描下以一级质谱全扫描-数据依赖子离子扫描模式或多反应检测模式进行分析；
监测离子对：母离子m/z 290±1Da和至少一个力可拉敏的子离子；
力可拉敏保留时间：≤3.6min；
(3)根据步骤(2)的峰面积数据和力可拉敏的标准曲线获得样品溶液中力可拉敏的浓度，再结合步骤(1)中复溶溶剂体积以及样品干重，计算样品中力可拉敏的含量。
所述步骤(1)中的醇类有机溶剂为甲醇或乙醇，样品与提取剂的比例为0.2-1g:2-5ml。
所述步骤(1)中的超声提取时间为15-40min。
所述步骤(1)中的复溶的溶剂为流动相初始条件，即95vol％水-5vol％乙腈，含0.1v/v％甲酸。
所述步骤(2)中的甲酸-水溶液中的甲酸含量为0.1～1v/v％。
所述步骤(2)中的子离子的质荷比m/z范围为58～290Da。
优选的，所述子离子的质荷比m/z为233±1Da、215±1Da或189±1Da。
优选的，所述步骤(2)中的色谱条件及质谱条件为：柱温40℃，进样量5～10μL，流速0.2～0.4ml/min，离子源为加热电喷雾离子源，扫描方式为正离子Full MS/dd-MS2，离子源喷雾电压2500V，洗脱时间为6.0min，力可拉敏的保留时间为3.54～3.55min。
所述步骤(3)中的力可拉敏的标准曲线的获得方法为：取力可拉敏标准品，配制成浓度1ng/ml～100ng/ml的系列标准溶液，利用液相色谱-串联二级质谱对力可拉敏标准溶液进行测定，利用测得的峰面积数据和力可拉敏标准溶液浓度绘制标准曲线，得到线性方程。
测定力可拉敏标准溶液的色谱条件及质谱条件与步骤(2)相同。
本发明以高效液相色谱-加热电喷雾离子源-二级质谱(HPLC-HESI-MS/MS)技术为基础，进行梯度洗脱，将分析时间由现有技术高效液相色谱-电喷雾离子源-一级质谱(HPLC-ESI-MS)方法的60分钟缩短至6分钟以内，且串联了二级质谱，分析了力可拉敏子离子的信息，经方法学确认，取得了很好的提取和分析效果，大大提高了分析速度和准确性，为研究石蒜属力可拉敏的积累规律和合成代谢调控提供了一种有效且准确的分析方法。
本发明在处理待测样品时，选用的提取液较为安全，既能保证分析效果同时也可以提高操作的安全性。同时，进行提取时，消耗的植物样本和试剂量少，待测样品鲜重可低至0.2g，提取剂体积为2-5ml。在保证提取效果的前提下，极大节约了植物材料和提取试剂。并且，本发明采取快速简化的提取方法，经过2次以上超声波辅助提取15-40min，离心，蒸发，复溶，过滤，经计算，回收率达95％左右，提取过程快速简单，回收率高。
本发明在检测待测样品中力可拉敏含量时，在一定的保留时间范围内，没有其他特征离子对的干扰，因此，采用本发明的梯度洗脱方式，缩短检测程序时间，检测程序时间≤6min，力可拉敏的洗脱时间≤3.6min，优选3.54-3.55min，提高了检测速度。
本发明在检测时，液相色谱串联了二级质谱，通过物质的保留时间，母离子，子离子的三级信息整合，特别是二级质谱中多组母离子/子离子对的信息监测，能确保定性和定量的准确性。
本发明优选的方案中，采用加热电喷雾离子源(HESI)，待测物在正离子扫描下以Full MS/dd-MS2模式进行分析，在正离子模式下进行扫描，母离子[M+H]+m/z 290的响应值最高，再选择相对丰度较高两个子离子m/z215和m/z189为监测离子，可以大大提高灵敏度。
有益效果
本发明能够对石蒜属植物中的生物碱类物质力可拉敏进行快速提取并定性定量分析，大幅度缩短分析时间，可在6分钟之内完成检测程序，力可拉敏保留时间在3.6分钟以内，快速得到检测结果，通过二级质谱提供的力可拉敏母离子和子离子信息监测，能提高定性及定量分析的准确性，力可拉敏的回收率为94.8～96.1％，相对标准偏差(RSD)为1.0～6.5％，分离度为完全分离，实现力可拉敏的快速洗脱分离，可检测力可拉敏的多个母离子/子离子对信息，确保定性和定量的准确性，为研究石蒜属植物中力可拉敏的积累规律和合成代谢调控提供了有效且准确的分析方法。
附图说明
图1为本发明实施例1中的力可拉敏的标准曲线；
图2为本发明实施例1中的力可拉敏的色谱图；
图3为本发明实施例1中的力可拉敏的MS2质谱图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
1)绘制标准曲线
用分析天平精密称取力可拉敏标准品0.010g(Lycm，Lycoramine，C17H23NO3，分子量289.375)，用甲醇溶解并定容到100ml，得到其标准储备液，储备液浓度均为100μg/mL；
标准中间液：准确移取1mL标准储备液置于100mL容量瓶中，用甲醇定容配成1.0μg/mL的混合标准中间液；
标准工作液：根据需要移取适量混合标准中间液，分别用甲醇稀释成浓度1ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、50ng/mL和100ng/mL的标准工作溶液。
利用串联了二级质谱仪的色谱仪对力可拉敏标准溶液进行测定，利用测得的峰面积数据和力可拉敏标准溶液浓度绘制标准曲线，得到线性方程，参见图1。
结果表明力可拉敏在1ng/ml-100ng/ml的范围内其质量浓度与峰面积呈良好的线性关系，线性关系方程为Y＝632925X，相关系数R2＝0.9981，检出限及定量范围如表1所示：
表1
以实际检测时的S/N＝3确定方法的检出限为0.2ng/g，仪器的检出限为0.1ng/ml。
2)处理待测样品
以换锦花的鳞茎为待测样品0.2g(含水量90％左右)，冷冻干燥后，研磨成粉，得石蒜鳞茎干样0.02g，混匀后取石蒜鳞茎干样置于EP管中加入2mL 70％乙醇，超声提取28min，12000rpm离心10min，取上清，滤渣加入1.5mL 70％乙醇再次超声提取28min，涡旋1min，12000rpm离心10min，取上清，合并两次上清，氮吹浓缩至近干，1mL流动相初始条件(95vol％水-5vol％乙腈，含0.1v/v％甲酸)复溶，稀释D倍(本实施例中为100倍)至浓度1～100ng/ml，过0.22μm滤膜。
3)色谱检测
利用超高效液相色谱-热电喷雾离子源-二级质谱联用分析技术(UHPLC-HESI-MS/MS)，对待测样品进行检测，获得样品中力可拉敏的峰面积数据；
其中，色谱条件：
液相色谱柱：Waters BEH C18(2.1x 100mm,1.7μm)；
柱温：40℃；
进样量：5μL；
流速：0.2ml/min；
流动相：流动相A：甲酸体积分数为0.1％的甲酸-水溶液，流动相B：乙腈；
洗脱条件：梯度洗脱，洗脱程序为如下：
表2
色谱图参见图2，由图2可见，在上述条件下，力可拉敏洗脱时间为2.58min，且在程序分析时间内，无其他特征峰干扰，可实现完全分离。
质谱条件：
质谱采用的是Thermo ScientificTMQ ExactiveTM质谱检测系统，配有电喷雾(ESI)离子源和Xcalibur工作站。
离子源：加热电喷雾离子源(HESI)；
扫描方式：正离子扫描下以Full MS/dd-MS2模式进行分析；
一级质谱分辨率为70000，二级为35000；
离子源喷雾电压2500V；
毛细管温度350℃；
气体：氮气；鞘气流量：10；辅助气流量：2；
吹扫气流速：0；
S-透镜水平：55；
加热器温度40℃；
监测离子对：290.1/215.1和290.1/189.1，参见表3；
保留时间为3.54min；
表3目标化合物离子信息
质谱图参见图3，由图3可见，母离子[M+H]+m/z 290的响应值最高，相对丰度较高的两个子离子m/z215和m/z189为监测子离子。
4)含量计算
将待测样品的质谱峰面积数据代入步骤1)所得到的线性方程中，获得待测样品溶液中力可拉敏的浓度C(单位为ng/ml)，再根据步骤2)中复溶的流动相初始条件体积1ml，稀释倍数D，以及样品质量0.02g，带入含量计算公式I，计算样品中力可拉敏的含量m(单位为ng/g干重)。
含量计算公式I为：m＝(C×V×D)/M。
其中，m＝样品中力可拉敏含量，单位为ng/g干重；C＝待测溶液中力可拉敏浓度，单位ng/ml；V＝复溶的溶剂体积，单位为ml；D＝稀释倍数；M＝样品质量，干重，单位为g。
例如测定本实例中的某份换锦花鳞茎样本，C＝20.353ng/ml，V＝1ml，D＝100，M＝0.0265g，根据公式计算最后得出：m＝76802ng/g干重。
待测样品冷冻干燥后研磨成粉的重量为干重。
进一步，利用换锦花的鳞茎样品进行加标回收实验，在6μg/ml添加水平下进行加标回收率测定，按照步骤2-3)的方法进行，每个水平重复3次，结果测定到换锦花鳞茎样品中力可拉敏的含量在76802～108280ng/g(即0.076～0.108mg/g)干重之间，回收率为96.1％，RSD为6.5％，表明所建立的提取分析方法准确可靠。
实施例2
1)绘制标准曲线
用分析天平精密称取力可拉敏标准品0.010g(Lycm，Lycoramine，C17H23NO3，分子量289.375)，用甲醇溶解并定容到100ml，得到其标准储备液，储备液浓度均为100μg/mL；标准中间液：准确移取1mL标准储备液置于100mL容量瓶中，用甲醇定容配成1.0μg/mL的混合标准中间液；标准工作液：根据需要移取适量混合标准中间液，分别用甲醇稀释成浓度1ng/mL、2ng/mL、5ng/mL、25ng/mL、50ng/mL的标准工作溶液。
利用串联了二级质谱仪的色谱仪对力可拉敏标准溶液进行测定，利用测得的峰面积数据和力可拉敏标准溶液浓度绘制标准曲线。
结果表明力可拉敏在1ng/ml-100ng/ml的范围内其质量浓度与峰面积呈良好的线性关系，线性关系方程为Y＝1.0e6X-126075，相关系数R2＝0.9994，检出限及定量范围如表4所示：
表4
以实际检测时的S/N＝3确定方法的检出限为0.2ng/g，仪器的检出限为0.1ng/ml。
2)处理待测样品
以石蒜属植物中国石蒜的鳞茎为待测样品，待测样品冷冻干燥后，研磨成粉，混匀后取0.02g于EP管中加入2mL 70％乙醇，超声提取28min，12000rpm离心10min，取上清，滤渣加入1.5mL 70％乙醇再次超声提取28min，涡旋1min，12000rpm离心10min，取上清，合并两次上清，氮吹浓缩至近干，1mL流动相初始条件(95vol％水-5vol％乙腈，含0.1v/v％甲酸)复溶，稀释D倍(本实施例中为100倍)至浓度1～100ng/ml，过0.22μm滤膜，得待测样品溶液。
3)色谱检测
利用串联了二级质谱仪的液相色谱对待测样品进行检测，获得样品中力可拉敏的峰面积数据；
其中，色谱条件：
液相色谱柱：Waters BEH C18(2.1x 100mm,1.7μm)；
柱温：50℃；
进样量：10μL；
流速为0.4ml/min；
流动相：流动相A：甲酸体积分数为0.1％的甲酸-水溶液，流动相B：甲醇；
洗脱条件：梯度洗脱，洗脱程序如下
表5
| Time(min) | Flow rate(mL/min) | ％A | ％B |
| 0 | 0.4 | 95 | 5 |
| 3.5 | 0.4 | 40 | 60 |
| 4.5 | 0.4 | 40 | 60 |
| 4.51 | 0.4 | 95 | 5 |
| 6 | 0.4 | 95 | 5 |
在上述条件下，力可拉敏洗脱时间为2.50min，且在程序分析时间内，无其他特征峰干扰，可实现完全分离。
质谱条件：
质谱系统采用的是美国AB Sciex公司的Qtrap 6500质谱检测系统，配有电喷雾(ESI)离子源和Analyst 1.6.2工作站。
离子源：电喷雾离子源(ESI)；
扫描方式：正离子扫描下以多反应检测(MRM)模式进行分析；
离子源喷雾电压4500V；
温度：550℃；
气帘气30；
离子源Gas1：55；Gas2：55；
监测离子对：290.3/215.1和290.3/189.1；
保留时间为3.55min；
4)含量计算
将待测样品的质谱峰面积数据代入步骤1)所得到的线性方程中，获得待测溶液中力可拉敏的浓度C(单位为ng/ml)，再根据步骤2)中复溶的甲醇体积1ml，稀释倍数D，以及样品质量0.02g，带入含量计算公式I，计算样品中力可拉敏的含量m(单位为ng/g干重)。
含量计算公式I为：m＝(C×V×D)/M。
其中，m＝样品中力可拉敏含量，单位为ng/g干重；C＝待测溶液中力可拉敏浓度，单位ng/ml；V＝复溶的溶剂体积，单位为ml；D＝稀释倍数；M＝样品质量，干重，单位为g。
例如测定本实例中的某份中国石蒜鳞茎样本，C＝5.684ng/ml，V＝1ml，D＝100，M＝0.0204g，根据公式计算最后得出：m＝27860ng/g干重。
进一步，利用中国石蒜的鳞茎样品进行加标回收实验，在6μg/ml添加水平下进行加标回收率测定，按照步骤2-3)的方法进行，每个水平重复3次，结果测定到力可拉敏的含量在20648～27860ng/g(即0.020～0.027mg/g)干重之间，回收率为94.8％，RSD为1.0％，表明所建立的提取分析方法准确可靠。
Claims (8)
1.一种快速检测石蒜属植物中力可拉敏含量的方法，包括：
(1)称取待测石蒜属植物样品，冷冻干燥后研磨成粉，以醇类有机溶剂作为提取剂，超声提取、混匀、离心，合并上清，浓缩，再复溶，稀释至浓度1～100ng/ml，得待测样品溶液；
(2)利用液相色谱-串联二级质谱对待测样品溶液进行检测，获得样品中力可拉敏的峰面积数据；
其中，色谱条件如下：
液相色谱柱：硅胶型反相色谱柱；
柱温：40～50℃；
进样量：5～10μL；
流速：0.2～0.4ml/min；
流动相：流动相A：甲酸-水溶液，流动相B：乙腈或甲醇；
洗脱方法：梯度洗脱，洗脱时间≤6.0min，流动相A和流动相B的体积比为40～95：5～60；
质谱条件及扫描方式：
离子源：加热电喷雾离子源或电喷雾离子源；
离子源喷雾电压：2500～4500V；
扫描方式：正离子扫描下以一级质谱全扫描-数据依赖子离子扫描模式或多反应检测模式进行分析；
监测离子对：母离子m/z 290±1Da和至少一个力可拉敏的子离子；
力可拉敏保留时间：≤3.6min；
(3)根据步骤(2)的峰面积数据和力可拉敏的标准曲线获得样品溶液中力可拉敏的浓度，再结合步骤(1)中复溶溶剂体积以及样品干重，计算样品中力可拉敏的含量。
2.根据权利要求1所述的一种快速检测石蒜属植物中力可拉敏含量的方法，其特征在于：所述步骤(1)中的醇类有机溶剂为甲醇或乙醇，样品与提取剂的比例为0.2-1g:2-5ml。
3.根据权利要求1所述的一种快速检测石蒜属植物中力可拉敏含量的方法，其特征在于：所述步骤(1)中的超声提取时间为15-40min。
4.根据权利要求1所述的一种快速检测石蒜属植物中力可拉敏含量的方法，其特征在于：所述步骤(2)中的甲酸-水溶液中的甲酸含量为0.1～1v/v％。
5.根据权利要求1所述的一种快速检测石蒜属植物中力可拉敏含量的方法，其特征在于：所述步骤(2)中的子离子的质荷比m/z范围为58～290Da。
6.根据权利要求1或5所述的一种快速检测石蒜属植物中力可拉敏含量的方法，其特征在于：所述子离子的质荷比m/z为233±1Da、215±1Da或189±1Da。
7.根据权利要求1所述的一种快速检测石蒜属植物中力可拉敏含量的方法，其特征在于：所述步骤(2)中的色谱条件及质谱条件为：柱温40℃，进样量5～10μL，流速0.2～0.4ml/min，离子源为加热电喷雾离子源，扫描方式为正离子Full MS/dd-MS2，离子源喷雾电压2500V，洗脱时间为6.0min，力可拉敏的保留时间为3.54～3.55min。
8.根据权利要求1所述的一种快速检测石蒜属植物中力可拉敏含量的方法，其特征在于：所述步骤(3)中的力可拉敏的标准曲线的获得方法为：取力可拉敏标准品，配制成浓度1ng/ml～100ng/ml的系列标准溶液，利用液相色谱-串联二级质谱对力可拉敏标准溶液进行测定，利用测得的峰面积数据和力可拉敏标准溶液浓度绘制标准曲线，得到线性方程。
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106538383A (zh) * | 2016-11-01 | 2017-03-29 | 聊城大学 | 一种利用石蒜小鳞茎快繁培养产生加兰他敏、石蒜碱、力克拉敏的方法 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| DEEPALI KATOCH ET AL: "Simultaneous quantification of Amaryllidaceae alkaloids from Zephyranthes grandiflora by UPLC", 《JOURNAL OF PHARMACEUTICAL AND BIOMEDICAL ANALYSIS》 * |
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