CN114965751B - 一种测定诃子中化学成分含量的方法 - Google Patents

一种测定诃子中化学成分含量的方法 Download PDF

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Abstract

本申请提供了一种测定诃子中化学成分含量的方法，采用超高效液相色谱‑质谱联用，快速检测诃子中阿江榄仁酸、山楂酸、科罗索酸、诃子次酸、1,2,3,4,6‑O‑五没食子酰葡萄糖、柯里拉京、鞣花酸、没食子酸、没食子酸甲酯、没食子酸乙酯、原儿茶酸、诃子鞣酸、槲皮素、诃子林鞣酸、芦丁的含量。本申请提供的方法操作简单、灵敏度高、分析速度快、专属性强，可以用于诃子的质量控制。

Description

一种测定诃子中化学成分含量的方法
技术领域
本申请涉及中药成分测定技术领域，特别是涉及一种测定诃子中化学成分含量的方法。
背景技术
诃子为使君子科植物诃子Terminalia chebula Retz.或绒毛诃子Terminaliachebula Retz.var.tomentella Kurt.的干燥成熟果实，诃子性平，味苦、酸、涩，归肺、大肠经，功效涩肠止泻，敛肺止咳，降火利咽。主治久泻久痢，便血脱肛，肺虚喘咳，久嗽不止，咽痛音哑。诃子具有较大的药用价值，但是不同药材的质量参差不齐，难以对其质量进行评价。
诃子中化学成分丰富多样，其中，酚酸类、鞣质类、三萜类、黄酮类等化合物是诃子发挥药理活性的重要物质基础。目前，关于诃子的质量控制研究主要以鞣质类和酚酸类化合物作为指标性成分，对其他成分研究较少。关于诃子成分含量的测定方法有滴定法、比色法、薄层扫描法及高效液相色谱法，其中，滴定法主要用于测定诃子鞣质类化合物，但是选择性较差；比色法多用于测定诃子鞣质、酚酸类化合物；薄层扫描法用于测定没食子酸的含量，但是重现性差，受显色条件及制剂中的其他成分干扰较大；高效液相色谱法应用较多，但方法耗时长、灵敏度低。因此，需要一种高效、快速、高灵敏度的检测方法，测定诃子中化学成分的含量，为诃子的质量评价及药效物质基础的研究提供依据。
发明内容
本申请的目的在于提供一种测定诃子中化学成分含量的方法，以实现同时测定诃子中15种化学成分的含量，可用于诃子的质量控制。具体技术方案如下：
本申请提供了一种测定诃子中化学成分含量的方法，其特征在于，采用超高效液相色谱-质谱联用(UPLC-MS/MS)，测定诃子中化学成分的含量；所述化学成分包括阿江榄仁酸、山楂酸、科罗索酸、诃子次酸、1,2,3,4,6-O-五没食子酰葡萄糖、柯里拉京、鞣花酸、没食子酸、没食子酸甲酯、没食子酸乙酯、原儿茶酸、诃子鞣酸、槲皮素、诃子林鞣酸、芦丁；所述方法包括：
(1)建立各化学成分的标准曲线；
以80-100vol％甲醇为溶剂，配制5-12个含有不同已知浓度的各化学成分的混合对照品溶液；其中，阿江榄仁酸浓度为1-800ng/mL；柯里拉京浓度为1-30000ng/mL；槲皮素浓度为0.4-400ng/mL；诃子次酸浓度为20-55000ng/mL；诃子鞣酸浓度为4-55000ng/mL；诃子林鞣酸浓度为10-30000ng/mL；科罗索酸浓度为0.1-800ng/mL；芦丁、没食子酸甲酯、没食子酸乙酯浓度为0.2-800ng/mL；没食子酸浓度为10-30000ng/mL；鞣花酸浓度为5-30000ng/mL；山楂酸浓度为0.1-800ng/mL；1,2,3,4,6-O-五没食子酰葡萄糖糖浓度为3-30000ng/mL；原儿茶酸浓度为2-8000ng/mL；
在相同的色谱条件和质谱条件下，将体积为V1的各混合对照品溶液分别注入超高效液相色谱仪中，通过质谱检测，根据各化学成分的特征离子确定各化学成分的色谱峰，并获得各化学成分的色谱峰面积；
以各化学成分的色谱峰的峰面积为纵坐标，以各化学成分的浓度为横坐标，分别建立各化学成分的标准曲线；
(2)获得供试品溶液中各化学成分的色谱峰面积；
取质量为M的供试样品，以体积为V2的60-80vol％甲醇为溶剂进行提取，取上清液过滤后得到供试品溶液，其中，M/V2为(1-3):10mg/mL；
在与步骤(1)中相同的色谱条件和质谱条件下，取体积为V1的供试品溶液注入超高效液相色谱仪中，通过质谱检测，根据各化学成分的特征离子确定各化学成分的色谱峰，并获得各化学成分的色谱峰面积；
(3)确定供试品中各化学成分的含量；
根据已建立的各化学成分的标准曲线，由供试品溶液中各化学成分的色谱峰面积，分别计算出供试品溶液中各化学成分的浓度C1，按照公式C＝C1×V2/M分别计算出供试品溶液中各化学成分的含量C。
本申请提供的一种测定诃子中化学成分含量的方法，采用UPLC-MS/MS，通过合理选择色谱条件和质谱条件，可以同时测定诃子中15种化学成分的含量，且所述方法具有操作简单、灵敏度高、准确度高、分析速度快、专属性强等优势，可用于诃子的质量控制，为诃子的质量评价及其药效物质基础的研究提供依据。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，还可以根据这些附图获得其他的实施例。
图1A为实施例1中标6的混合对照品溶液的多反应离子监测图(MRM图)；
图1B为批次2的诃子中15种化学成分的MRM图；
图中各数字标号分别代表：1.诃子次酸；2.没食子酸；3.原儿茶酸；4.柯里拉京；5.没食子酸甲酯；6.诃子鞣酸；7.芦丁；8.诃子林鞣酸；9.1,2,3,4,6-O-五没食子酰葡萄糖；10.鞣花酸；11.没食子酸乙酯；12.槲皮素；13.阿江榄仁酸；14.山楂酸；15.科罗索酸。
具体实施方式
下面将结合本申请实施例中的附图，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员基于本申请所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。
本申请提供了一种测定诃子中化学成分含量的方法，其特征在于，采用UPLC-MS/MS，测定诃子中化学成分的含量；所述化学成分包括阿江榄仁酸、山楂酸、科罗索酸、诃子次酸、1,2,3,4,6-O-五没食子酰葡萄糖、柯里拉京、鞣花酸、没食子酸、没食子酸甲酯、没食子酸乙酯、原儿茶酸、诃子鞣酸、槲皮素、诃子林鞣酸、芦丁；所述方法包括：
(1)建立各化学成分的标准曲线；
以80-100vol％甲醇为溶剂，配制5-12个含有不同已知浓度的各化学成分的混合对照品溶液；其中，阿江榄仁酸浓度为1-800ng/mL；柯里拉京浓度为1-30000ng/mL；槲皮素浓度为0.4-400ng/mL；诃子次酸浓度为20-55000ng/mL；诃子鞣酸浓度为4-55000ng/mL；诃子林鞣酸浓度为10-30000ng/mL；科罗索酸浓度为0.1-800ng/mL；芦丁、没食子酸甲酯、没食子酸乙酯浓度为0.2-800ng/mL；没食子酸浓度为10-30000ng/mL；鞣花酸浓度为5-30000ng/mL；山楂酸浓度为0.1-800ng/mL；1,2,3,4,6-O-五没食子酰葡萄糖糖浓度为3-30000ng/mL；原儿茶酸浓度为2-8000ng/mL；
在相同的色谱条件和质谱条件下，将体积为V1的各混合对照品溶液分别注入超高效液相色谱仪中，通过质谱检测，根据各化学成分的特征离子确定各化学成分的色谱峰，并获得各化学成分的色谱峰面积；
以各化学成分的色谱峰的峰面积为纵坐标，以各化学成分的浓度为横坐标，分别建立各化学成分的标准曲线；
(2)获得供试品溶液中各化学成分的色谱峰面积；
取质量为M的供试样品，以体积为V2的60-80vol％甲醇为溶剂进行提取，取上清液过滤后得到供试品溶液，其中，M/V2为(1-3):10mg/mL；
在与步骤(1)中相同的色谱条件和质谱条件下，取体积为V1的供试品溶液注入超高效液相色谱仪中，通过质谱检测，根据各化学成分的特征离子确定各化学成分的色谱峰，并获得各化学成分的色谱峰面积；
(3)确定供试品中各化学成分的含量；
根据已建立的各化学成分的标准曲线，由供试品溶液中各化学成分的色谱峰面积，分别计算出供试品溶液中各化学成分的浓度C1，按照公式C＝C1×V2/M分别计算出供试品溶液中各化学成分的含量C。
本申请提供的一种测定诃子中化学成分含量的方法，采用UPLC-MS/MS，通过合理选择色谱条件和质谱条件，能够实现诃子中15种化学成分含量的测定。其中，所述15种化学成分包括：鞣质类化合物：柯里拉京、诃子次酸、诃子鞣酸、诃子林鞣酸、鞣花酸和1,2,3,4,6-O-五没食子酰葡萄糖；酚酸类化合物：没食子酸、没食子酸甲酯、没食子酸乙酯和原儿茶酸；黄酮类化合物：槲皮素和芦丁；三萜类化合物：阿江榄仁酸、科罗索酸和山楂酸。
在本申请的一些实施方式中，所述混合对照品溶液中，阿江榄仁酸、没食子酸甲酯、没食子酸乙酯、芦丁、山楂酸、科罗索酸浓度为1-500ng/mL；柯里拉京、诃子林鞣酸、没食子酸、鞣花酸、1,2,3,4,6-O-五没食子酰葡萄糖浓度为50-25000ng/mL；槲皮素浓度为0.4-200ng/mL；诃子次酸、诃子鞣酸浓度为100-50000ng/mL；原儿茶酸浓度为10-5000ng/mL。
本申请对混合对照品溶液的配制方式没有特别的限定，只要能够实现本申请的目的即可，例如可以先配制混合对照品储备液，其中各成分的浓度大于或等于所述混合对照品溶液中各化学成分的浓度，然后通过稀释获得所述混合对照品溶液或直接用作混合对照品溶液。
在本申请的一些实施方式中，在步骤(1)中，以80-100vol％甲醇为溶剂，配制含有各化学成分的混合对照品储备液，所述混合对照品储备液中，阿江榄仁酸、没食子酸甲酯、没食子酸乙酯、芦丁、山楂酸、科罗索酸浓度为500-800ng/mL；柯里拉京、诃子林鞣酸、没食子酸、鞣花酸、1,2,3,4,6-O-五没食子酰葡萄糖浓度为25000-30000ng/mL；槲皮素浓度为200-400ng/mL；诃子次酸、诃子鞣酸浓度为50000-55000ng/mL；原儿茶酸浓度为5000-8000ng/mL；
以80-100vol％甲醇为溶剂稀释所述混合对照品储备液，获得所述5-12个含有不同已知浓度的各化学成分的混合对照品溶液。
其中，用于配制所述混合对照品储备液的溶剂和用于稀释所述混合对照品储备液的溶剂可以相同，也可以不同，优选地，用于配制所述混合对照品储备液的溶剂和用于稀释所述混合对照品储备液的溶剂相同，更优选地，用于配制所述混合对照品储备液的溶剂和用于稀释所述混合对照品储备液的溶剂为甲醇。
本申请中，所用于建立标准曲线的混合对照品溶液可包括所述混合对照品储备液；本申请对所述混合对照品储备液的配制没有特别的限定，只要能够实现本申请的目的即可，示例性地，可通过优先单独配制各化学成分的储备液，再分别取各化学成分的储备液，配制所述混合对照品储备液。
在本申请的一些实施方式中，在步骤(2)中，所述提取为超声提取，提取功率为150-350W，提取频率为40-60kHz，提取时间为20-60分钟。
通过采用本申请供试品溶液的制备方法，实现获得包括15种化学成分的供试品溶液，使得诃子中化学成分含量的检测结果更加全面、准确、可信；其中，通过超声提取，获得包括15种化学成分的供试品溶液，用于测定各化学成分含量，使得各化学成分含量的检测结果更准确。
在本申请的一些实施方式中，所述色谱条件包括：色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱；流动相：A相为体积分数为0.05-0.15％的甲酸水溶液，B相为乙腈；采用体积分数30-97％A相，3-70％B相，梯度洗脱；柱温25-35℃；流速:1-1.5分钟，0.1-0.5mL/分钟；1.5-13分钟，0.1-0.7mL/分钟；进样体积V1：0.5-2μL。
优选地，所述色谱条件包括：流动相：A相为体积分数为0.08-0.12％的甲酸水溶液，B相为乙腈；柱温：28-32℃；流速:1-1.5分钟，0.2-0.3mL/分钟；1.5-13分钟，0.2-0.5mL/分钟；进样体积V1：0.8-1.5μL。
申请人在研究中发现，采用本申请的梯度洗脱，能够使诃子中15种化学成分获得更好的分离效果，优选地，在本申请的一些实施方式中，所述梯度洗脱具体为：0-1.5分钟，3％-5％B；1.5-3分钟，5％-25％B；3-7分钟，25％-55％B；7-8分钟，55％-70％B；8-13分钟，70％-70％B。
本申请中对质谱的种类没有特别的限定，只要能够实现本申请的目的即可，例如可以采用三重四级杆质谱。为了有效获得色谱分离后的各化学成分的特征离子，以便于获得更准确的各化学成分的鉴定结果，在本申请的一些实施方式中，所述质谱为三重四级杆质谱，所述质谱条件包括：离子源为电喷雾离子源；检测模式为多反应离子监测，负离子扫描模式；干燥气温度：250-350℃；干燥气流速：5-10L/分钟；雾化器压力：30-40psi。
优选地，所述质谱条件包括：干燥气温度：280-320℃；干燥气流速：6-8L/分钟；雾化器压力：34-36psi。
在本申请的一些实施方式中，所述各化学成分的特征离子包括：
Figure BDA0003628157150000061
下面对本申请所需的仪器、试剂和药材进行说明。
仪器
Agilent 6470型三重四级杆质谱仪(美国Agilent公司)；Agilent 1290型超高效液相色谱仪(美国Agilent公司)；Agilent MassHunter分析软件(美国Agilent公司)；Milli-Q IQ 7005超纯水制备仪(Millipore公司)；5424R型高速离心机(德国Eppendorf公司)；AS 60/220.R2型十万分之一天平(波兰Radwag公司)；S0200涡旋混合器(美国Labnet公司)；ZZ-L6DT超声清洗槽(天津知著科技有限公司)。
试剂
阿江榄仁酸(DST201024-240)、山楂酸(DST200313-039)、科罗索酸(DST200819-005)、诃子次酸(DST200610-244)、1,2,3,4,6-O-五没食子酰葡萄糖(DSTDW000101)、柯里拉京(DST200114-012)、鞣花酸(DSTDR000401)、没食子酸(DSTDM000801)、没食子酸甲酯(DST200424-077)、没食子酸乙酯(DSTDM006301)、原儿茶酸(DSTDY008101)、诃子鞣酸(DSTDY008101)、槲皮素(DST180521-028)、诃子林鞣酸(DST200817-065)购自成都德思特生物技术有限公司，芦丁(T10J10Z90356)购自上海源叶生物科技有限公司。
甲醇(色谱纯)、乙腈(色谱纯)购自Fisher公司；甲酸(色谱纯)购自ROE公司；超纯水由Milli-Q超纯水制备仪制备。
药材
柯子药材产自安徽、云南等地，10个批次的诃子信息如表1所示。
表1 10个批次诃子的信息
Figure BDA0003628157150000071
以下实施例中所涉及的试剂与药材如无特殊说明均可来源于市售或按照本领域公知方法取得。
实施例1
(1)建立各化学成分的标准曲线
分别精密称取阿江榄仁酸、山楂酸、科罗索酸、诃子次酸、1,2,3,4,6-O-五没食子酰葡萄糖、柯里拉京、鞣花酸、没食子酸、没食子酸甲酯、没食子酸乙酯、原儿茶酸、诃子鞣酸、槲皮素、诃子林鞣酸、芦丁对照品5.0mg，用甲醇溶解配制为1mg/mL的对照品储备溶液，置于4℃冰箱储存备用。
精确量取各对照品储备液适量，用甲醇配制成混合对照品储备液，记为标1，其中，阿江榄仁酸、没食子酸甲酯、没食子酸乙酯、芦丁、山楂酸、科罗索酸500ng/mL，柯里拉京、诃子林鞣酸、没食子酸、鞣花酸、1,2,3,4,6-O-五没食子酰葡萄糖25000ng/mL，槲皮素200ng/mL，诃子次酸、诃子鞣酸50000ng/mL，原儿茶酸5000ng/mL；将混合对照品储备液用水依次稀释2.5、2、2、2.5、2、2、2.5、2倍，得到包含混合对照品储备液在内的9个含有不同已知浓度的各化学成分的混合对照品溶液，依次标记为标1-标9。
在相同的色谱条件和质谱条件下，分别取1μL各混合对照品溶液注入超高效液相色谱仪中，通过质谱检测，根据各化学成分的特征离子确定各化学成分的色谱峰，并获得各化学成分的色谱峰面积；
其中，所述色谱条件包括：色谱柱ACQUITY
Figure BDA0003628157150000082
HSS T3(2.1×100mm,1.8μm)。流动相A相为0.1％的甲酸水溶液，B相为乙腈；洗脱方法：0-1.5分钟，3％-5％B；1.5-3分钟，5％-25％B；3-7分钟，25％-55％B；7-8分钟，55％-70％B；8-13分钟，70％-70％B；柱温：30℃；流速：0-1.5分钟，0.25mL/分钟；1.5-13分钟，0.3mL/分钟；进样量：1μL。
所述质谱为三重四级杆质谱，所述质谱条件包括：离子源为电喷雾离子源；检测模式为多反应离子监测，负离子扫描模式；干燥气温度：300℃；干燥气流速：7L/分钟；雾化器压力：35psi；15种化学成分的特征离子及相应质谱参数如表2所示。
表2 15种化学成分的特征离子及相应质谱参数
Figure BDA0003628157150000081
Figure BDA0003628157150000091
以各化学成分色谱峰的峰面积(y)为纵坐标，以各化学成分的浓度(x)为横坐标，用加权最小二乘法进行回归计算，权重系数为1/x，建立15种化学成分的标准曲线，得到各化学成分的线性方程及相关系数r；将标9的混合对照品溶液逐步稀释后，分别以信噪比(signal-noise ratio，S/N)＝10时各对照品的浓度作为各化学成分的最低定量限(LLOQ)，结果见表3；其中，标6的混合对照品溶液的MRM图如图1A所示，可见15种化学成分之间互不干扰，各化学成分的色谱峰对称性良好，分离度高。
表3 15种化学成分的标准曲线及最低定量限
Figure BDA0003628157150000092
(2)获得供试品溶液中各化学成分的色谱峰面积：
精密称取5.0mg诃子粉末，加70％甲醇25mL，超声提取30分钟，提取功率250W，提取频率50KHz，超声后取出放至室温，甲醇补足失重，摇匀，取上清液，14000r/分钟离心10分钟，取上清液用0.22μm有机微孔滤膜过滤，该滤液为供试品溶液，放于4℃冰箱保存备用。在与步骤(1)中相同的色谱条件和质谱条件下，取1μL的供试品溶液注入超高效液相色谱仪中，通过质谱检测，根据各化学成分的特征离子确定各化学成分的色谱峰，并获得各化学成分的色谱峰面积；
(3)确定供试品中各化学成分的含量；
根据已建立的各化学成分的标准曲线，由供试品溶液中各化学成分的色谱峰面积，分别计算出供试品溶液中各化学成分的浓度C1，按照公式C＝C1×V2/M＝C1×25mL/5.0mg分别计算出批次1供试品溶液中各化学成分的含量C，得到批次1供试品溶液中15种化学成分的含量结果，如表4.1所示，基于1ng/mg＝1μg/g，将诃子中各化学成分含量的单位以μg/g表示。
实施例2-10
除了分别取表1中批次2至批次10的诃子替换实施例1中批次1的诃子外，其余与实施例1相同，分别得到批次2至批次10的诃子中15种化学成分的含量，结果见表4.1和表4.2所示，其中，批次2的诃子中15种化学成分的MRM图如图1B所示。
表4.1不同批次诃子中15种化学成分的含量(一)(μg/g,n＝3)
Figure BDA0003628157150000101
表4.2不同批次诃子中15种化学成分的含量(二)(μg/g,n＝3)
Figure BDA0003628157150000111
方法学验证
精密度试验
日内精密度：精密称取批次2的诃子粉末5.0mg，按实施例1的方法制备供试品溶液，按实施例1的色谱条件和质谱条件进样分析，重复进样6次，记录各化学成分的峰面积；分别计算15种化学成分的峰面积的平均值及相对标准偏差(RSD)值，结果见表5。从表5可以看出，15种化学成分峰面积的RSD值范围在0.6％-5.8％之间，结果表明本申请的方法日内精密度良好。
表5 15种化学成分日内精密度(n＝6)
Figure BDA0003628157150000112
Figure BDA0003628157150000121
日间精密度：精密称取批次2的诃子粉末5.0mg，按实施例1的方法制备供试品溶液，按实施例1的色谱条件和质谱条件进样分析，重复进样2次，连续进样3天，记录各化学成分的峰面积；分别计算15种化学成分峰面积的平均值及其RSD值，结果见表6。从表6可以看出，15种化学成分峰面积的RSD值在1.4％-5.0％之间，结果表明本申请的方法日间精密度良好。
表6 15种化学成分日间精密度(n＝6)
Figure BDA0003628157150000122
Figure BDA0003628157150000131
重复性试验
精密称取批次2诃子6份，每份5.0mg，按实施例1的方法制备供试品溶液，分别按实施例1的色谱条件和质谱条件进样分析，记录各化学成分的峰面积；根据实施例1中各化学成分的标准曲线，分别计算15种化学成分的浓度，并计算各化学成分浓度的平均值及RSD值，结果见表7。从表7可以看出，15种化学成分浓度的RSD值在1.4％-7.0％之间，结果表明本申请的方法重复性较好。
表7 15种化学成分的重复性(n＝6,ng/mL)
Figure BDA0003628157150000132
稳定性试验
精密称取批次2的诃子粉末5mg，按实施例1的方法制备供试品溶液，按实施例1的色谱条件和质谱条件，分别于0、2、4、6、8、12小时进样分析，记录各化学成分的峰面积；分别计算15种化学成分峰面积的平均值及RSD值，结果见表8。从表8可以看出，15种化学成分峰面积的RSD值在2.3％-6.8％之间，结果表明本申请的供试品溶液在室温放置12小时条件下稳定性良好。
表8 15种化学成分的稳定性(n＝6)
Figure BDA0003628157150000141
加样回收率试验
精密称取批次2的诃子粉末6份，每份2.5mg，配制15种化学成分的各对照品溶液，各化学成分浓度分别为：柯里拉京、诃子林鞣酸、没食子酸、鞣花酸、1,2,3,4,6-O-五没食子酰葡萄糖、诃子次酸、诃子鞣酸1mg/mL，阿江榄仁酸、没食子酸甲酯、没食子酸乙酯、芦丁、原儿茶酸10μg/mL，槲皮素、山楂酸、科罗索酸1μg/mL；分别取各对照品溶液：柯里拉京53μL、诃子林鞣酸210μL、没食子酸23μL、鞣花酸90μL、1,2,3,4,6-O-五没食子酰葡萄糖41μL、诃子次酸64μL、诃子鞣酸250μL，阿江榄仁酸58μL、没食子酸甲酯36μL、没食子酸乙酯10μL、芦丁18μL、原儿茶酸46μL，槲皮素14μL、山楂酸19μL、科罗索酸25μL，加至待测样品中，各化学成分的加入值如表9所示，按实施例1的方法制备各加标样品的供试品溶液，分别按实施例1的色谱条件和质谱条件进样分析，记录各化学成分的峰面积；根据实施例1中各化学成分的标准曲线，分别计算各加标样品中15种化学成分的浓度，得到各加标样品中15种化学成分的含量，根据加样回收率(％)＝(测得值-原始值)/加入值×100％计算各加标样品的加样回收率，并计算各化学成分的加样回收率的平均回收率及RSD值，结果见表9。表9结果显示15种化学成分的平均回收率在94.7％-100.6％之间，其RSD值在1.9％-6.2％之间，结果表明本申请的方法准确度好。
表9 15种化学成分的加样回收率(n＝6)
Figure BDA0003628157150000151
综上所述，本申请提供的诃子中化学成分含量的测定方法，采用UPLC-MS/MS法，通过合理选择色谱条件和质谱条件，可以同时测定诃子中阿江榄仁酸、山楂酸、科罗索酸、诃子次酸、1,2,3,4,6-O-五没食子酰葡萄糖、柯里拉京、鞣花酸、没食子酸、没食子酸甲酯、没食子酸乙酯、原儿茶酸、诃子鞣酸、槲皮素、诃子林鞣酸和芦丁的含量，此方法操作简单、灵敏度高、准确度高、分析速度快、专属性强，可以为诃子的质量评价及其药效物质基础的研究提供依据。
以上所述仅为本申请的较佳实施例，并非用于限定本申请的保护范围。凡在本申请的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均包含在本申请的保护范围内。

Claims (9)

1.一种测定诃子中化学成分含量的方法，其特征在于，采用超高效液相色谱-质谱联用，测定诃子中化学成分的含量；所述化学成分包括阿江榄仁酸、山楂酸、科罗索酸、诃子次酸、1,2,3,4,6-O-五没食子酰葡萄糖、柯里拉京、鞣花酸、没食子酸、没食子酸甲酯、没食子酸乙酯、原儿茶酸、诃子鞣酸、槲皮素、诃子林鞣酸、芦丁；所述方法包括：
(1)建立各化学成分的标准曲线；
以80-100vol％甲醇为溶剂，配制5-12个含有不同已知浓度的各化学成分的混合对照品溶液；其中，阿江榄仁酸浓度为1-800ng/mL；柯里拉京浓度为1-30000ng/mL；槲皮素浓度为0.4-400ng/mL；诃子次酸浓度为20-55000ng/mL；诃子鞣酸浓度为4-55000ng/mL；诃子林鞣酸浓度为10-30000ng/mL；科罗索酸浓度为0.1-800ng/mL；芦丁、没食子酸甲酯、没食子酸乙酯浓度为0.2-800ng/mL；没食子酸浓度为10-30000ng/mL；鞣花酸浓度为5-30000ng/mL；山楂酸浓度为0.1-800ng/mL；1,2,3,4,6-O-五没食子酰葡萄糖浓度为3-30000ng/mL；原儿茶酸浓度为2-8000ng/mL；
在相同的色谱条件和质谱条件下，将体积为V1的各混合对照品溶液分别注入超高效液相色谱仪中，通过质谱检测，根据各化学成分的特征离子确定各化学成分的色谱峰，并获得各化学成分的色谱峰面积；
以各化学成分的色谱峰的峰面积为纵坐标，以各化学成分的浓度为横坐标，分别建立各化学成分的标准曲线；
其中，所述色谱条件包括：色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱；流动相：A相为体积分数为0.05-0.15％的甲酸水溶液，B相为乙腈；采用体积分数30-97％A相，3-70％B相，梯度洗脱；所述梯度洗脱具体为：0-1.5分钟，3％-5％B；1.5-3分钟，5％-25％B；3-7分钟，25％-55％B；7-8分钟，55％-70％B；8-13分钟，70％-70％B；
(2)获得供试品溶液中各化学成分的色谱峰面积；
取质量为M的供试样品，以体积为V2的60-80vol％甲醇为溶剂进行提取，取上清液过滤后得到供试品溶液，其中，M/V2为(1-3):10mg/mL；
在与步骤(1)中相同的色谱条件和质谱条件下，取体积为V1的供试品溶液注入超高效液相色谱仪中，通过质谱检测，根据各化学成分的特征离子确定各化学成分的色谱峰，并获得各化学成分的色谱峰面积；
(3)确定供试品中各化学成分的含量；
根据已建立的各化学成分的标准曲线，由供试品溶液中各化学成分的色谱峰面积，分别计算出供试品溶液中各化学成分的浓度C1，按照公式C＝C1×V2/M分别计算出供试品中各化学成分的含量C。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述混合对照品溶液中，阿江榄仁酸、没食子酸甲酯、没食子酸乙酯、芦丁、山楂酸、科罗索酸浓度为1-500ng/mL；柯里拉京、诃子林鞣酸、没食子酸、鞣花酸、1,2,3,4,6-O-五没食子酰葡萄糖浓度为50-25000ng/mL；槲皮素浓度为0.4-200ng/mL；诃子次酸、诃子鞣酸浓度为100-50000ng/mL；原儿茶酸浓度为10-5000ng/mL。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(1)中，以80-100vol％甲醇为溶剂，配制含有各化学成分的混合对照品储备液，所述混合对照品储备液中，阿江榄仁酸、没食子酸甲酯、没食子酸乙酯、芦丁、山楂酸、科罗索酸浓度为500-800ng/mL；柯里拉京、诃子林鞣酸、没食子酸、鞣花酸、1,2,3,4,6-O-五没食子酰葡萄糖浓度为25000-30000ng/mL；槲皮素浓度为200-400ng/mL；诃子次酸、诃子鞣酸浓度为50000-55000ng/mL；原儿茶酸浓度为5000-8000ng/mL；
以80-100vol％甲醇为溶剂稀释所述混合对照品储备液，获得所述5-12个含有不同已知浓度的各化学成分的混合对照品溶液。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(2)中，所述提取为超声提取，提取功率为150-350W，提取频率为40-60kHz，提取时间为20-60分钟。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其特征在于，所述色谱条件还包括：
柱温25-35℃；流速:1-1.5分钟，0.1-0.5mL/分钟；1.5-13分钟，0.1-0.7mL/分钟；进样体积V1：0.5-2μL。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述色谱条件包括：流动相：A相为体积分数为0.08-0.12％的甲酸水溶液，B相为乙腈；柱温：28-32℃；流速:1-1.5分钟，0.2-0.3mL/分钟；1.5-13分钟，0.2-0.5mL/分钟；进样体积V1：0.8-1.5μL。
7.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其特征在于，所述质谱为三重四级杆质谱，所述质谱条件包括：离子源为电喷雾离子源；检测模式为多反应离子监测，负离子扫描模式；干燥气温度：250-350℃；干燥气流速：5-10L/分钟；雾化器压力：30-40psi。
8.根据权利要求7所述的方法，其中，所述质谱条件包括：干燥气温度：280-320℃；干燥气流速：6-8L/分钟；雾化器压力：34-36psi。
9.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其特征在于，所述各化学成分的特征离子包括：
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