CN117907509A - 芦笋药材指纹图谱的构建及指标性成分含量的测定方法 - Google Patents
芦笋药材指纹图谱的构建及指标性成分含量的测定方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及中药质量分析检测技术领域，具体涉及一种芦笋药材指纹图谱的构建及指标性成分含量的测定方法，包括：取芦笋药材制备为供试品溶液；精密吸取所述供试品溶液进行超高效液相色谱‑质谱检测，得到所述芦笋药材的指纹图谱；其中，超高效液相色谱‑质谱检测的色谱条件包括：采用的流动相为：流动相A为甲醇：乙腈混合溶液，其中，甲醇和乙腈的体积比为1：8~12；流动相B为含0.04%~0.06%体积浓度的乙酸水；采用梯度洗脱方式；采用的固定相为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱。本发明的方法构建得到的指纹图谱能够更全面地反映芦笋药材的化学成分，提高芦笋药材质量控制的准确性和全面性，以便更好地评价芦笋药材的整体质量。
Description
技术领域
本发明涉及中药质量分析检测技术领域，具体涉及一种芦笋药材指纹图谱的构建及指标性成分含量的测定方法。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
芦笋为百合科植物石刁柏(Asparagus officinalis L.)的新鲜或干燥嫩茎。具有清热利湿；活血散结等功效。采用有效的技术手段对芦笋药材和饮片(以下统称为芦笋药材)质量进行一致性评价，才能保证芦笋药材的安全有效和质量可控。
然而，现今尚未建立起对芦笋质量进行一致性评价的控制标准。2020版《中国药典》尚未收载该品种，各省的标准中也仅是规定了芦笋的含氮量，目前的研究工作难以有效控制芦笋药材的整体质量。
因此，急需开发一种构建芦笋药材指纹图谱的方法以及芦笋指标性成分含量测定的方法以应用于芦笋药材的质量评价。
发明内容
为了解决现有技术中存在的技术问题，本发明提供了一种芦笋药材指纹图谱的构建及指标性成分含量的测定方法，应用于芦笋药材的质量评价。
具体地，本发明的技术方案如下所述：
本发明的第一方面，提供一种芦笋药材指纹图谱的构建方法，包括以下步骤：
取芦笋药材制备为供试品溶液；
精密吸取所述供试品溶液进行超高效液相色谱-质谱检测，得到所述芦笋药材的指纹图谱；
其中，所述超高效液相色谱-质谱检测的色谱条件包括：采用的流动相为：流动相A为甲醇：乙腈混合溶液，其中，所述甲醇和乙腈的体积比为1：8～12；流动相B为含0.04％～0.06％体积浓度的乙酸水；采用梯度洗脱方式，所述梯度洗脱方式为：0～4min：流动相A的体积分数从5％变化至10％，流动相B的体积分数从95％变化至90％；4～8min：流动相的体积分数A从10％变化至20％，流动相B的体积分数从90％变化至80％；8～13min：流动相A的体积分数从20％变化至22％，流动相B的体积分数从80％变化至78％；13～20min：流动相A的体积分数从22％变化至55％，流动相B的体积分数从78％变化至45％；20～25min：流动相A的体积分数从55％变化至90％，流动相B的体积分数从45％变化至10％；25～30min：流动相A的体积分数从90％变化至90％，流动相B的体积分数从10％变化至10％；采用的固定相为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱。
在一个或多个实施例中，所述超高效液相色谱-质谱检测的色谱条件还包括：所述流动相的流速为0.3～0.5mL/min，优选为0.4mL/min。
在一个或多个实施例中，所述超高效液相色谱-质谱检测的色谱条件还包括：所述色谱柱的柱温为35～45℃，优选为40℃。
在一个或多个实施例中，所述色谱柱为ACQUITY UPLC HSS T3(2.1×100mm，1.8μm)色谱柱。
在一个或多个实施例中，所述超高效液相色谱-质谱联用法的色谱条件包括：流动相：流动相A为甲醇：乙腈体积比1：10混合溶液，流动相B为含0.05％体积浓度的乙酸水。
在一个或多个实施例中，所述超高效液相色谱-质谱联用法的质谱条件包括：离子源为ESI；电离模式为负离子模式；离子化电压(IS)-4500V，离子化温度(TEM)550℃，喷雾器(Gas1)55L/min，气帘气(CUR)30L/min，喷撞气(CAD)7L/min，辅助加热气(Gas2)55L/min；扫描模式：全扫描；扫描范围：m/z 100～1100。
在一个或多个实施例中，所述供试品溶液的制备方法包括：采用提取液对芦笋药材和饮片进行提取、过滤，得到供试品溶液；
所述提取液为甲醇水溶液，所述甲醇水溶液中甲醇的体积分数为30％～100％，优选地，所述提取液为100％甲醇溶液。
在一个或多个实施例中，所述供试品溶液的制备方法包括：向芦笋药材中添加100％甲醇溶液；100kHZ、30℃条件下超声提取30分钟；经100％甲醇溶液补重后过滤；滤液经0.22μm滤膜过滤后，获得所述供试品溶液。
在一个或多个实施例中，所述构建方法还包括：取原儿茶酸、香草酸、阿魏酸、芦丁、柚皮苷、橙皮苷、肉桂酸、原薯蓣皂苷制备为对照品溶液；精密吸取所述对照品溶液进行超高效液相色谱-质谱检测，得到对照品色谱图，参照所述对照品色谱图，对所述芦笋药材的指纹图谱上的共有色谱峰进行标定。其中超高效液相色谱-质谱检测的条件与上述供试品溶液的检测条件相同。
优选地，所述对照品溶液的溶剂为甲醇。
在一个或多个实施例中，所述指纹图谱中包含20个特征峰，其中，峰2为原儿茶酸、峰4为香草酸、峰7为阿魏酸、峰8为芦丁、峰9为柚皮苷、峰10为橙皮苷、峰12为肉桂酸、峰13为原薯蓣皂苷。
优选地，以峰12为S峰，峰1～峰11及峰13～峰20相对于S峰的相对保留时间范围分别为：0.104～0.110、0.192～0.199、0.244～0.252、0.389～0.398、0.409～0.420、0.542～0.546、0.597～0.602、0.646～0.653、0.776～0.798、0.827～0.846、0.932～0.940、1.097～1.111、1.205～1.219、1.334～1.357、1.449～1.469、1.508～1.529、1.554～1.575、1.630～1.652、1.665～1.689。
优选地，以峰12为S峰，峰1～峰11及峰13～峰20相对于S峰的相对保留时间RSD值分别为：1.62％、0.90％、0.85％、0.50％、0.67％、0.22％、0.20％、0.31％、0.73％、0.74％、0.24％、0.42％、0.37％、0.54％、0.43％、0.45％、0.45％、0.47％、0.46％。
本发明的第二方面，提供一种芦笋药材中指标性成分含量的测定方法，包括：向待测芦笋药材中加入提取液进行提取得到待测样品溶液；取原儿茶酸、香草酸、阿魏酸、芦丁、柚皮苷、橙皮苷、肉桂酸、原薯蓣皂苷加入溶剂制备得到对照品溶液；精密称取所述待测样品溶液和所述对照品溶液分别进行超高效液相色谱-质谱检测，得到所述待测芦笋药材和饮片的待测图谱和所述标准品溶液的对照图谱；根据所述对照品溶液的浓度、所述对照品溶液在所述对照图谱中的峰面积、以及所述待测芦笋药材与所述对照品溶液相对应的成分在所述待测图谱中的峰面积，计算所述待测芦笋药材中指标性成分原儿茶酸、香草酸、阿魏酸、芦丁、柚皮苷、橙皮苷、肉桂酸、原薯蓣皂苷的含量；所述超高效液相色谱-质谱检测的条件与第一方面所述的检测条件相同，此处不再赘述。
在一个或多个实施例中，所述提取液为甲醇水溶液，所述甲醇水溶液中甲醇的体积分数为30％～100％；对照品溶液的溶剂为甲醇。
在一个或多个实施例中，所述对照品溶液的浓度与所述对照品溶液在所述对照图谱中的峰面积之间满足以下关系：所述原儿茶酸的第一回归方程为y＝25618.77145x+86493.5(r＝0.9998)，线性范围为2.0537-513.4135ng/mL，检测限为0.8929ng/mL(S/N≥3)；所述香草酸的第二回归方程为y＝13736.69335x+21663.31103(r＝0.9999)，线性范围为2.0460-511.5000ng/mL，检测限为0.9161ng/mL(S/N≥3)；所述阿魏酸的第三回归方程为y＝40296.0x+233153(r＝0.9994)，线性范围为2.1364-534.1050ng/mL，检测限为0.3009ng/mL(S/N≥3)；所述芦丁的第四回归方程为y＝12753.05735x+674008(r＝0.9996)，线性范围为18.9452-4736.3050ng/mL，检测限为0.3333ng/mL(S/N≥3)；所述柚皮苷的第五回归方程为y＝8085.51214x+62163.9(r＝0.9999)，线性范围为1.0939-273.4752ng/mL，检测限为0.0957ng/mL(S/N≥3)；所述橙皮苷的第六回归方程为y＝13379.98453x+595595(r＝0.9996)，线性范围为8.2400-2060.0000ng/mL，检测限为0.0772ng/mL(S/N≥3)；所述肉桂酸的第七回归方程为y＝29028.85577x+403980(r＝0.9993)，线性范围为4.2563-1064.0760ng/mL，检测限为0.6650ng/mL(S/N≥3)；所述原薯蓣皂苷的第八回归方程为y＝1678.98789x+1502000(r＝0.9996)，线性范围为390.8000-39080.0000ng/mL，检测限为0.3457ng/mL(S/N≥3)；其中，所述回归方程中，横坐标为所述对照品溶液浓度，纵坐标为所述对照图谱中的所述峰面积。
优选地，所述指标性成分原儿茶酸、香草酸、阿魏酸、芦丁、柚皮苷、橙皮苷、肉桂酸、原薯蓣皂苷的MRM扫描参数为：
本发明具有以下有益效果：
本发明提供的芦笋药材指纹图谱的构建及指标性成分含量的测定方法，通过优化后的高效液相色谱条件，实现了对芦笋药材中不同类型指标性成分的有效分离和对指纹图谱色谱峰的指认及鉴定，同时建立了芦笋药材中指标性成分的定量分析方法。构建得到的指纹图谱能够更全面地反映芦笋药材的化学成分，提高芦笋药材质量控制的准确性和全面性，以便更好地评价芦笋药材的整体质量。
稳定、全面地完善了芦笋药材的评价标准，保证了药材临床使用的有效性，为整体性控制芦笋药材品质提供了参考。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1示出了本发明实施例1中洗脱方法为洗脱方法02的情况下的供试品溶液的UPLC-MS图谱；
图2示出了本发明实施例1中对照品溶液的UPLC-MS图谱；
图3示出了本发明实施例1中供试品溶液的UPLC-MS图谱；
图4示出了本发明实施例1中提供的15批芦笋药材的指纹图谱；
图5示出了本发明实施例1中提供的15批芦笋药材指纹图谱以平均数法生成的指纹图谱对照图谱；
图6示出了本发明实施例2中洗脱方法为洗脱方法-1的情况下的对照品溶液的UPLC-MS图谱；
图7示出了本发明实施例2中洗脱方法为洗脱方法-2的情况下的对照品溶液的UPLC-MS图谱；
图8示出了本发明实施例2中混合对照品溶液的UPLC-MS对照图谱；
图9示出了本发明实施例2中待测样品溶液的UPLC-MS图谱。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本申请使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
以下实施例中所提及的原料、试剂或装置，如无特殊说明，均可从商业途径得到，或通过已知现有的方式获得。
本发明中所采用芦笋药材的产地信息如表1所示。
表1：15批芦笋药材产地信息
*表格S1-S7为白芦笋饮片，S8-S11为绿芦笋饮片，S12-S14为白芦笋药材，S15为绿芦笋药材。
实施例一
芦笋药材指纹图谱的构建方法：
本实施例提供了一种芦笋药材指纹图谱的构建方法，包括：取芦笋药材制备为供试品溶液；取原儿茶酸、香草酸、阿魏酸、芦丁、柚皮苷、橙皮苷、肉桂酸、原薯蓣皂苷制备为对照品溶液；将供试品溶液和对照品溶液分别注入超高效液相色谱-质谱联用仪，根据超高效液相色谱-质谱联用法，获得芦笋药材的指纹图谱。以下提供了具体的构建方法。
1.供试品溶液的制备
精确称量0.50g芦笋药材粉末过二号筛(误差小于0.50mg)，加入100％的甲醇溶液25ml，100kHZ、30℃条件下超声30min，过滤，滤液过0.22μm滤膜，即得UPLC-MS指纹图谱供试品溶液。
2.对照品溶液的制备
分别称取原儿茶酸、香草酸、阿魏酸、芦丁、柚皮苷、橙皮苷、肉桂酸、原薯蓣皂苷对照品适量，加甲醇溶解，分别制成浓度为102.6827μg/mL、102.3000μg/mL、106.8210μg/mL、94.7261μg/mL、91.1584μg/mL、103.0000μg/mL、106.4076μg/mL、97.7000μg/mL的对照品储备液，再取适量对照品储备液，以50％甲醇为稀释溶剂，制成浓度分别为0.5134μg/mL、0.5115μg/mL、0.5341μg/mL、12.3144μg/mL、0.2735μg/mL、8.2400μg/mL、1.0641μg/mL、39.0800μg/mL的混合标准品溶液。
3.超高效液相色谱-质谱联用法条件优化
取预设量的对照品溶液和供试品溶液，注入UPLC-MS液质联用仪，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以流动相A为甲醇：乙腈(体积比1：10)混合溶液为流动相A，含0.05％体积浓度的乙酸水为流动相B进行梯度洗脱，构建芦笋药材的UPLC-MS指纹图谱。
质谱检测条件为：离子源为ESI；电离模式为负离子模式；扫描模式为全扫描；扫描范围：m/z 100-1100；离子化电压(IS)-4500V，离子化温度(TEM)550℃，喷雾器(Gas1)55L/min，气帘气(CUR)30L/min，喷撞气(CAD)7L/min，辅助加热气(Gas2)55L/min。
3.1液相色谱洗脱方法的优化
初步尝试液相洗脱方法01为：
0～4min：流动相B的体积分数从95％变化至90％；
4～10min：流动相B的体积分数从90％变化至75％；
10～17min：流动相B的体积分数从75％变化至73％；
17～23min：流动相B的体积分数从73％变化至45％；
23～27min：流动相B的体积分数从45％变化至10％；
27～30min：流动相B的体积分数从10％变化至10％。
在此洗脱条件下，部分特征峰极基线未能分离，分离度较差；基于此实验结果优化出洗脱方法02，梯度洗脱方法为：
0～4min：流动相B的体积分数从95％变化至90％；
4～8min：流动相B的体积分数从90％变化至80％；
8～13min：流动相B的体积分数从80％变化至78％；
13～20min：流动相B的体积分数从78％变化至45％；
20～25min：流动相B的体积分数从45％变化至10％；
25～30min：流动相B的体积分数从10％变化至10％。
在此洗脱条件下，共有峰的峰形与分离度都较为理想，结果如图1所示，图1示出了本发明实施例1中洗脱方法为洗脱方法02的情况下的供试品液相色谱图谱。
表2：UPLC-MS指纹图谱梯度洗脱表
3.2液相色谱条件的确定
色谱柱为ACQUITY UPLC HSS T3(2.1×100mm，1.8μm)色谱柱，流速为0.4mL/min，柱温为40℃。洗脱液为甲醇：乙腈(体积比1：10)混合溶液(流动相A)以及含0.05％体积浓度的乙酸水溶液(流动相B)。进样量2μL。基于3.1选出最优洗脱程序如下，得到对照品溶液和供试品溶液的UPLC-MS图谱见，图2示出了本发明实施例1中对照品溶液的UPLC-MS图谱；图3示出了本发明实施例1中供试品溶液的UPLC-MS图谱。
0～4min：流动相A的体积分数从5％变化至10％，流动相B的体积分数从95％变化至90％；
4～8min：流动相A的体积分数从10％变化至20％，流动相B的体积分数从90％变化至80％；
8～13min：流动相A的体积分数从20％变化至22％，流动相B的体积分数从80％变化至78％；
13～20min：流动相A的体积分数从22％变化至55％，流动相B的体积分数从78％变化至45％；
20～25min：流动相A的体积分数从55％变化至90％，流动相B的体积分数从45％变化至10％；
25～30min：流动相A的体积分数从90％变化至90％，流动相B的体积分数从10％变化至10％。
4.UPLC-MS指纹图谱化学成分鉴定
采用UPLC-MS法，对对照品溶液及供试品溶液进行检测，通过比对化合物的色谱峰保留时间、精确分子量及二级质谱图裂解规律，共确定了8个色谱峰所对应的化合物，分别为原儿茶酸(峰2)、香草酸(峰4)、阿魏酸(峰7)、芦丁(峰8)、柚皮苷(峰9)、橙皮苷(峰10)、肉桂酸(峰12)、原薯蓣皂苷(峰13)。
以峰12为S峰，峰1～峰11及峰13～峰20的相对保留时间范围分别为:0.104～0.110、0.192～0.199、0.244～0.252、0.389～0.398、0.409～0.420、0.542～0.546、0.597～0.602、0.646～0.653、0.776～0.798、0.827～0.846、0.932～0.940、1.097～1.111、1.205～1.219、1.334～1.357、1.449～1.469、1.508～1.529、1.554～1.575、1.630～1.652、1.665～1.689。
以峰12为S峰，峰1～峰11及峰13～峰20的相对保留时间RSD值分别为:1.62％、0.90％、0.85％、0.50％、0.67％、0.22％、0.20％、0.31％、0.73％、0.74％、0.24％、0.42％、0.37％、0.54％、0.43％、0.45％、0.45％、0.47％、0.46％。
5.方法学验证
方法学验证项目包括精密度、稳定性和重复性
5.1指纹图谱精密度
取芦笋药材(S3)，按“实施例一，1”项下方法制备供试品溶液，按“实施例一，3”项下色谱条件，连续进样6次，记录色谱图，以峰12为S峰，峰1～峰11及峰13～峰20的相对保留时间RSD值分别为0.93％、0.49％、0.61％、0.23％、0.20％、0.20％、0.35％、0.13％、0.49％、0.16％、0.12％、0.23％、0.22％、0.28％、0.30％、1.59％、0.23％、0.23％、0.26％；相对峰面积RSD值分别为1.28％、0.78％、1.05％、1.27％、1.72％、1.02％、0.99％、0.67％、1.91％、0.59％、2.12％、0.45％、0.36％、0.90％、0.78％、2.21％、1.68％、1.24％、1.71％，表明仪器精密度良好。
5.2指纹图谱稳定性
取同一份供试品溶液(S3)，按“实施例一，3”项下色谱条件，分别于室温放置0、2、4、8、12和24h时进行测定，以峰12为S峰，峰1～峰11及峰13～峰20的相对保留时间RSD值分别为1.35％、0.76％、1.01％、0.69％、0.61％、0.39％、0.51％、0.38％、0.63％、0.51％、0.58％、0.42％、0.38％、0.35％、0.36％、0.41％、0.37％、0.33％、0.43％；相对峰面积RSD值分别为2.73％、1.78％、2.31％、2.20％、1.44％、2.38％、1.56％、2.83％、2.70％、2.44％、1.70％、1.83％、1.95％、0.99％、2.81％、0.91％、2.20％、1.38％、2.60％，表明供试品在室温放置24h内稳定。
5.3指纹图谱重复性
取同一批次芦笋药材(S3)，按“实施例一，1”项下方法平行制备6份供试品溶液，按“实施例一，3”项下色谱条件分别进样，以峰12为S峰，峰1～峰11及峰13～峰20的相对保留时间RSD值分别为1.37％、0.85％、0.52％、0.35％、0.25％、0.20％、0.19％、0.18％、0.24％、0.20％、0.30％、0.43％、0.40％、0.51％、0.48％、0.48％、0.46％、0.47％、0.48％，相对峰面积RSD值分别为1.35％、1.06％、1.37％、2.14％、2.24％、2.02％、1.73％、2.97％、2.33％、2.07％、1.87％、0.83％、0.96％、1.33％、2.19％、2.27％、1.88％、1.33％、2.62％，表明该方法重复性良好。
6.指纹图谱相似性评价
将15批芦笋药材供试品溶液的ULC-MS离子流图txt格式导入《中国色谱指纹图谱相似度评价系统》(2012版)软件中，以肉桂酸(峰12)为参照峰，建立15批芦笋药材指纹图谱，如图4所示，图4示出了本发明实施例1中提供的15批芦笋药材的指纹图谱，按平均数法生成对照图谱，如图5所示，图5示出了本发明实施例1中提供的15批芦笋药材指纹图谱以平均数法生成的指纹图谱对照图谱，计算相似度。结果显示，15批芦笋药材指纹图谱相似度在0.852～0.976之间，表明该指纹图谱可以比较好地评价芦笋药材的质量。具体相似度结果见表3，其中样品标号可参见表1。
表3：15批芦笋药材LC-MS指纹图谱相似度
实施例二
本实例提供了一种芦笋药材指标性成分含量的测定方法，包括：取待测芦笋药材制备为待测样品溶液；
取原儿茶酸、香草算、阿魏酸、芦丁、柚皮苷、橙皮苷、肉桂酸、原薯蓣皂苷制备为对照品溶液；
将待测样品溶液和对照品溶液分别注入超高效液相色谱-质谱联用仪，根据超高效液相-质谱联用法，获得待测芦笋药材的待测图谱和对照溶液的对照图谱；根据对照品溶液的浓度、对照品溶液在对照图谱中的峰面积、以及待测芦笋药材与对照品溶液相对应的成分在待测图谱中的峰面积，计算待测芦笋药材中指标性成分原儿茶酸、香草酸、阿魏酸、芦丁、柚皮苷、橙皮苷、肉桂酸、原薯蓣皂苷的含量。以下，提供了具体的测定方法。
1.对照品的质谱多反应监测模式(multiple reaction monitoring，MRM)检测参数基于8个对照品(包括原儿茶酸、香草酸、阿魏酸、芦丁、柚皮苷、橙皮苷、肉桂酸、原薯蓣皂苷)，建立15批芦笋样品的MRM定量方法，MRM参数如表4。
表4：8个对照品的MRM检测参数
2.定量方法实验条件优化
初步尝试液相洗脱方法-1为：
0～6min：流动相B的体积分数从95％变化至70％；
6～25min：流动相B的体积分数从70％变化至60％；
25～27min：流动相B的体积分数从60％变化至40％；
27～30min：流动相B的体积分数从40％变化至10％；
30～35min：流动相B的体积分数从10％变化至10％。
在此洗脱条件下芦丁、柚皮苷、橙皮苷被同时洗脱，基线未能分离，如图6所示，图6示出了本发明实施例2中洗脱方法为洗脱方法-1的情况下的对照品溶液的UPLC-MS图谱；基于此实验结果优化出洗脱方法-2，洗脱梯度为：
0～4min：流动相B的体积分数从95％变化至90％；
4～8min：流动相B的体积分数从90％变化至80％；
8～13min：流动相B的体积分数从80％变化至78％；
13～20min：流动相B的体积分数从78％变化至45％；
20～25min：流动相B的体积分数从45％变化至10％；
25～30min：流动相B的体积分数从10％变化至10％。
在此条件下各成分间均有较好的分离度，如图7所示，图7示出了本发明实施例2中洗脱方法为洗脱方法-2的情况下的对照品溶液的UPLC-MS图谱。
3.定量方法实验条件的确定
UPLC-QQQ-MS条件为：色谱柱为ACQUITY UPLC HSS T3(2.1×100mm，1.8μm)色谱柱，流速为0.4mL/min，柱温为40℃。洗脱液为甲醇：乙腈(体积比1：10)混合溶液(流动相A)以及含0.05％体积浓度的乙酸水溶液(流动相B)，进样量为2μL，梯度洗脱按下述程序进行，混合对照品溶液的UPLC-MS对照图谱及待测样品溶液的UPLC-MS图谱对比见图8和图9，其中，图8示出了本发明实施例2中混合对照品溶液的UPLC-MS对照图谱；图9示出了本发明实施例2中待测样品溶液的UPLC-MS图谱。
0～4min：流动相A的体积分数从5％变化至10％，流动相B的体积分数从95％变化至90％；
4～8min：流动相A的体积分数从10％变化至20％，流动相B的体积分数从90％变化至80％；
8～13min：流动相A的体积分数从20％变化至22％，流动相B的体积分数从80％变化至78％；
13～20min：流动相A的体积分数从22％变化至55％，流动相B的体积分数从78％变化至45％；
20～25min：流动相A的体积分数从55％变化至90％，流动相B的体积分数从45％变化至10％；
25～30min：流动相A的体积分数从90％变化至90％，流动相B的体积分数从10％变化至10％。
质谱检测采用负离子模式；以MRM模式测定分析物，离子化电压(IS)-4500V，离子化温度(TEM)550℃，喷雾器(Gas1)55L/min，气帘气(CUR)30L/min，喷撞气(CAD)7L/min，辅助加热气(Gas2)55L/min。
4.待测样品溶液的制备
精确称量0.50g芦笋药材粉末(过二号筛)，加入100％甲醇25ml，超声30min(100kHZ、30℃)，过滤，滤液过0.22μm滤膜，即得芦笋药材待测样品溶液。
5.方法学验证
方法学验证项目包括检测限与定量限、线性范围、精密度、准确度、回收率和稳定性
5.1检测限、定量限和线性范围
标准溶液的配制：取原儿茶酸、香草酸、阿魏酸、芦丁、柚皮苷、橙皮苷、肉桂酸、原薯蓣皂苷对照品约10mg，精密称定，加入50％甲醇溶解，分别制成质量浓度为102.6827μg/mL、102.3000μg/mL、106.8210μg/mL、94.7261μg/mL、91.1584μg/mL、103.0000μg/mL、106.4076μg/mL、97.7000μg/mL的对照储备液，取适量对照品储备液，以50％甲醇制成每1mL含原儿茶酸0.5134μg、香草酸0.5115μg、阿魏酸0.5341μg、芦丁12.3144μg、柚皮苷0.2735μg、橙皮苷8.2400μg、肉桂酸1.0641μg、原薯蓣皂苷39.0800μg的混合标准品溶液。
将混合对照品溶液梯度稀释，制备一系列线性工作液。将一系列线性工作液注入超高效液相色谱-质谱联用仪，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，进行线性回归，获得标准曲线，并计算回归方程与相关系数，8个指标成分的线性关系见表5。
表5：8个成分的线性回归分析
5.2精密度试验
取同一混合对照品溶液，在“实施例二，3”项下条件连续进样6次，测定峰面积，计算原儿茶酸、香草酸、阿魏酸、芦丁、柚皮苷、橙皮苷、肉桂酸、原薯蓣皂苷峰面积的RSD分别为1.37％、1.25％、2.79％、2.79％、1.61％、1.81％、0.66％、1.44％，表明仪器精密度良好。
5.3稳定性试验
取同一份供试品溶液(S3)，按“实施例二，3”项下条件，分别于室温放置0、2、4、8、12和24h，测定峰面积，计算得原儿茶酸、香草酸、阿魏酸、芦丁、柚皮苷、橙皮苷、肉桂酸、原薯蓣皂苷峰面积的RSD分别为1.15％、1.54％、1.71％、0.54％、1.92％、2.42％、2.56％、0.68％，表明供试品在室温放置24h内稳定。
5.4重复性试验
取同一批芦笋样品(S3)，按“实施例二，4”项下方法平行制备6份供试品溶液，按“实施例二，3”项下条件进样分析，计算得原儿茶酸、香草酸、阿魏酸、芦丁、柚皮苷、橙皮苷、肉桂酸、原薯蓣皂苷的平均含量分别为1.9644μg/g、6.4386μg/g、3.3797μg/g、2.3397μg/g、0.2585μg/g、0.3441μg/g、52.2118μg/g、715.3371μg/g，RSD分别为3.53％、1.28％、1.77％、2.16％、3.84％、9.06％、1.94％、0.69％。
5.5加标回收率试验
精密称取已知待测成分含量的芦笋样品(S3)0.25g，共6份，按“实施例二，4”项下方法制备样品溶液，按“实施例二，3”项下条件进样分析，测定峰面积，计算得8个成分得平均加标回收率为119.35％、86.58％、80.23％、106.36％、101.88％、85.11％、84.34％、101.88％，RSD分别为0.36％、2.13％、1.70％、0.83％、3.32％、1.75％、0.66％、1.43％，具体结果见表6.
表6：8个成分的加标回收率(n＝6)
6.15批芦笋药材指标性成分含量测定
对15批次的芦笋药材中的8种成分进行含量测定，其中不同批次的芦笋药材的制备方法参照“实施例二，4”项下待测样品溶液的制备；其中液质检测参数参照“实施例二，3”项下定量方法；根据液质检测结果分析不同批次的芦笋药材成分及含量，15批次芦笋药材中原儿茶酸的含量为0.0872-2.1154μg/g，香草酸的含量为0.9088-11.0452μg/g，阿魏酸的含量为0.7646-21.6540μg/g，芦丁的含量为0.0054-527.1102μg/g，柚皮苷的含量为0.0809-10.4682μg/g，橙皮苷的含量为0.0881-245.5533μg/g，肉桂酸的含量为6.9906-84.8560μg/g，原薯蓣皂苷的含量为0.5949-2384.4689μg/g，具体测定结果见表7。
表7：15批芦笋药材中指标性成分定量结果
综上所述，本发明提供了一种芦笋药材指纹图谱的构建及指标性成分含量的测定方法，该方法弥补了之前芦笋质量标准不完善的问题，优化液相洗脱方法，有效分离指标性成分化合物峰，在此基础上建立LC-MS指纹图谱，15批芦笋药材相似度在0.852～0.976之间，表明该指纹图谱可以比较好地评价芦笋药材的质量。基于针对指标性成分分离的液相条件，建立UPLC-QQQ-MS定量检测方法，对芦笋药材中指标性成分原儿茶酸、香草酸、阿魏酸、芦丁、柚皮苷、橙皮苷、肉桂酸、原薯蓣皂苷进行含量测定，结果显示不同产地芦笋药材样品中原儿茶酸的含量为0.0872-2.1154μg/g，香草酸的含量为0.9088-11.0452μg/g，阿魏酸的含量为0.7646-21.6540μg/g，芦丁的含量为0.0054-527.1102μg/g，柚皮苷的含量为0.0809-10.4682μg/g，橙皮苷的含量为0.0881-245.5533μg/g，肉桂酸的含量为6.9906-84.8560μg/g，原薯蓣皂苷的含量为0.5949-2384.4689μg/g，该方法完善了芦笋的评价标准，为芦笋整体、全面质量控制提供了参考。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种芦笋药材指纹图谱的构建方法，其特征在于，包括：
取芦笋药材制备为供试品溶液；
精密吸取所述供试品溶液进行超高效液相色谱-质谱检测，得到所述芦笋药材的指纹图谱；
其中，所述超高效液相色谱-质谱检测的色谱条件包括：采用的流动相为：流动相A为甲醇：乙腈混合溶液，其中，所述甲醇和乙腈的体积比为1：8~12；流动相B为含0.04%~0.06%体积浓度的乙酸水；采用梯度洗脱方式，所述梯度洗脱方式为：0～4 min：流动相A的体积分数从5%变化至10%，流动相B的体积分数从95%变化至90%；4～8 min：流动相的体积分数A从10%变化至20%，流动相B的体积分数从90%变化至80%；8～13 min：流动相A的体积分数从20%变化至22%，流动相B的体积分数从80%变化至78%；13～20 min：流动相A的体积分数从22%变化至55%，流动相B的体积分数从78%变化至45%；20～25 min：流动相A的体积分数从55%变化至90%，流动相B的体积分数从45%变化至10%；25～30 min：流动相A的体积分数从90%变化至90%，流动相B的体积分数从10%变化至10%；采用的固定相为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述超高效液相色谱-质谱检测的色谱条件还包括：
所述流动相的流速为0.3~0.5 mL/min。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述超高效液相色谱-质谱检测的色谱条件还包括：
所述色谱柱的柱温为35~45℃。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述色谱柱为ACQUITY UPLC HSS T3（2.1×100mm，1.8 μm）色谱柱。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述取芦笋药材制备为供试品溶液的制备方法包括：
采用提取液对芦笋药材进行提取、过滤，得到供试品溶液；
所述提取液为甲醇水溶液，所述甲醇水溶液中甲醇的体积分数为30%～100%。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述构建方法还包括：
取原儿茶酸、香草酸、阿魏酸、芦丁、柚皮苷、橙皮苷、肉桂酸、原薯蓣皂苷制备为对照品溶液；
精密吸取所述对照品溶液进行超高效液相色谱-质谱检测，得到对照品色谱图，参照所述对照品色谱图，对所述芦笋药材的指纹图谱上的共有色谱峰进行标定。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述对照品溶液的溶剂为甲醇。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述指纹图谱中包含20个特征峰，其中，峰2为原儿茶酸、峰4为香草酸、峰7为阿魏酸、峰8为芦丁、峰9为柚皮苷、峰10为橙皮苷、峰12为肉桂酸、峰13为原薯蓣皂苷。
9.一种芦笋药材中指标性成分含量的测定方法，其特征在于，包括：
向待测芦笋药材中加入提取液进行提取得到待测样品溶液；
取原儿茶酸、香草酸、阿魏酸、芦丁、柚皮苷、橙皮苷、肉桂酸、原薯蓣皂苷加入溶剂制备得到对照品溶液；
精密称取所述待测样品溶液和所述对照品溶液分别进行超高效液相色谱-质谱检测，得到所述待测芦笋药材和饮片的待测图谱和所述标准品溶液的对照图谱；
根据所述对照品溶液的浓度、所述对照品溶液在所述对照图谱中的峰面积、以及所述待测芦笋药材与所述对照品溶液相对应的成分在所述待测图谱中的峰面积，计算所述待测芦笋药材中指标性成分原儿茶酸、香草酸、阿魏酸、芦丁、柚皮苷、橙皮苷、肉桂酸、原薯蓣皂苷的含量；
所述超高效液相色谱-质谱检测的条件如权利要求1至4中任一项定义。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述提取液为甲醇水溶液，所述甲醇水溶液中甲醇的体积分数为30%～100%；对照品溶液的溶剂为甲醇。
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