CN114295754B

CN114295754B - 一种全自动在线检测水中抗生素的方法

Info

Publication number: CN114295754B
Application number: CN202111661234.7A
Authority: CN
Inventors: 石浚哲; 沈斐; 许燕娟; 章嘉晴; 魏竹秋; 魏焕平; 陈丽珠
Original assignee: Wuxi Environmental Monitoring Center Of Jiangsu Province
Current assignee: Wuxi Environmental Monitoring Center Of Jiangsu Province
Priority date: 2021-12-30
Filing date: 2021-12-30
Publication date: 2023-12-08
Anticipated expiration: 2041-12-30
Also published as: CN114295754A

Abstract

本发明公开了一种全自动在线检测水中抗生素的方法。所述方法通过将固相萃取、高效液相色谱及质谱串联实现全自动在线检测系统水中抗生素。本发明通过对在线固相萃取及高效液相色谱工艺参数、流动相种类、时间及配比等的限定，构建了一种全自动在线检测水中抗生素的方法，实现了水中常见磺胺类、β‑内酰胺类、喹诺酮类、大环内酯类和四环素类33种抗生素类物质的全自动实时在线快速检测。

Description

一种全自动在线检测水中抗生素的方法

技术领域

本发明涉及分析检测技术领域，特别涉及一种全自动在线检测水中抗生素的方法。

背景技术

自1929年发现青霉素并用于临床以来，已有百余种抗生素被开发利用，它们对治疗感染性疾病发挥了巨大作用，有效地保障了人类的生命和健康。另外，抗生素还被大量用于畜牧业和水产养殖业防治感染性疾病，并用作抗菌生长促进剂加快动物的生长。根据其结构与性质的不同，抗生素可分为磺胺类、喹诺酮类、大环内脂类、β-内酰胺类、氨基糖甙类、四环素类、多肽类、氯霉素类以及其它抗生素。抗生素类物质由于其使用量大，来源广泛且难于降解，多数属于持久性污染物，当其进人自然环境后，就会对水环境造成持久性污染。在2017年至2019年一项抗生素调查中发现，南京市饮用水源中以大环内酯类(42.98％)检出较多，其次是磺胺类(25.94％)和喹诺酮类(22.52％)，其中氧氟沙星和磺胺嘧啶浓度较高，最高检出浓度分别为35.2ng/L和25.9ng/L。2019年，松花江流域哈尔滨段4大类12种常见抗生素检测结果表明，12种抗生素的春、夏、秋、冬四个季节总浓度分别为39.7、9.6、27.5和136.2ng/L。国内严峻的抗生素污染情况表明，抗生素污染已经逐渐显现，其关注度也日益升高。因此，开发水环境中抗生素含量的检测新技术，对于正确评估水体抗生素污染的程度，为环境管理提供技术支持和数据支撑具有重要的现实意义。

目前，水环境中抗生素的测定方法主要分为微生物法、酶联免疫吸附法(ELISA)、毛细管电泳法(CE)、高效液相色谱法(HPLC-UV)和液相色谱串联质谱联用法(LC-MS/MS)。微生物检测法所用时间较长，敏感性差，易受其他抗生素干扰。酶联免疫吸附法抗体制备不易，监测时间长，且假阳性出现概率大。毛细管电泳技术虽然具有高效、快速、分离模式多等优势，但是抗生素所带电荷的多少和正负均随环境条件而发生改变，导致了其重现性较差，目前在抗生素类物质检测领域应用并不是很多。高效液相色谱法是目前检测抗生素常用的分析方法之一，也是我国饲料中抗生素检测的国家标准方法(GB/T 19542-2007)，但是该方法灵敏度低，因此在定性定量上都存在困难，无法满足水环境中痕量测定的要求。此外，紫外、二极管阵列和荧光质谱检测器仅能用于特定结构的抗生素类检测，局限性较大。而质谱检测器则不存在类似问题，因此质谱检测器更适用于不同种类的抗生素检测。国内近年来出台的抗生素标准均以液相色谱串联质谱联用法来进行测定，如《化妆品中8种磺胺类抗生素的测定液相色谱-串联质谱法》(DB37/T 3029-2017)，《畜禽肉中十六种磺胺类药物残留量的测定液相色谱-串联质谱法》(GB/T 20759-2006)、《猪粪中抗生素残留量检测方法液相色谱-质谱/质谱法》(DB12/T 952-2020)和《口腔卫生产品中十三种抗生素药物的检测方法液相色谱-质谱/质谱法》(SN/T 3645-2013)。美国环保署于2007年公布了高效液相色谱质谱联用法测定水、土壤、沉积物、生物固体中的药物和个人护理品的的标准方法《Method1694:Pharmaceuticals and Personal Care Products in Water,Soil,Sediment,andBiosolids by HPLC/MS/MS》并沿用至今。由于水环境中的抗生素含量较低，其水体浓度普遍处于痕量及微量水平，需要高效的分析方法，以获得更高的选择性和灵敏度，从而能够准确地测定抗生素的残留。水环境中抗生素样品预处理通常使用固相萃取法、固相微萃取和液液萃取法，纯化和浓缩分析物，从而获得灵敏、重复性更好的结果。但是上述前处理方法，均需要人工进行萃取实验，工作量较大，前处理及分析测试时间较长。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供了一种全自动在线检测水中抗生素的方法。本发明将在线固相萃取、高效液相色谱及质谱联用，通过对在线固相萃取及高效液相色谱工艺参数、流动相种类、时间及配比等的限定，构建了一种全自动在线检测水中抗生素的方法，实现了水中常见磺胺类、β-内酰胺类、喹诺酮类、大环内酯类和四环素类33种抗生素类物质的全自动实时在线快速检测。

本发明的技术方案如下：

一种全自动在线检测水中抗生素的方法，所述方法通过将固相萃取、高效液相色谱及质谱串联实现全自动在线检测系统水中抗生素；

所述方法包括如下步骤：

(1)样品预处理；

(2)将预处理的样品加入在线固相萃取柱，进行固相萃取；所述固相萃取以流动相A、流动相B、流动相C，按照体积比进行梯度洗脱，梯度洗脱程序为：0～0.5min为100％流动相A，0.5～4.5min为98％的流动相A与2％的流动相B，4.5～7.5min为100％流动相C，7.5～13min为100％的流动相A；

(3)固相萃取后的样品通入高效液相色谱进行洗脱分离，用质谱仪对洗脱液进行检测。

进一步地，步骤(1)中，所述样品预处理的具体方法为：将样品离心、过滤去除颗粒物，用甲酸调pH至2～3。

进一步地，所述离心的速度为5000～6000rpm，时间为5～10min；所述甲酸为质量百分数≥98％的甲酸。

进一步地，步骤(2)中，所述样品的进样量为0.5～5mL；所述在线固相萃取柱为Waters Oasis HLB。

进一步地，步骤(2)中，所述流动相A为含1v/v％甲酸的超纯水溶液；流动相B为含0.1v/v％甲酸的甲醇溶液；所述流动相C由甲醇、丙酮、正己烷组成，甲醇、丙酮、正己烷的体积比为1：1：1。

进一步地，步骤(2)中，所述梯度洗脱的流速为：0～3.5min，流速为2.0mL/min；3.5～4.5min，流速为0.01mL/min；4.5～13min，流速为2.0mL/min。

进一步地，步骤(3)中，所述高效液相色谱为Waters公司的ACQUITY UPLC；所述高效液相色谱所用色谱柱为C18液相色谱柱2.1mm×100mm×1.7μm，柱温为30～40℃。

进一步地，步骤(3)中，所述高效液相色谱以流动相A₁、流动相B₁按体积比进行梯度洗脱，梯度洗脱的程序为：0～4.5min为95％的流动相A₁和5％的流动相B₁，4.5～8.5min流动相B₁由5％增至95％，同时流动相A₁从95％降低至5％，8.5～9.5min为95％的流动相B₁与5％的流动相A₁，9.5～11min，流动相A₁从5％升至95％，流动相B₁从95％降至5％，11～12min；流动相为95％的流动相A₁与5％的流动相B₁；所述流动相A₁为含甲酸和氨水的水溶液，水溶液中甲酸的体积浓度为0.1％，氨水的体积浓度为0.3％；所述流动相B₁为乙腈溶液；所述梯度洗脱的流速为：0～4.5min，流速为0.1mL/min，4.5～12min，流速为0.4mL/min。

进一步地，步骤(3)中，所述质谱仪为爱博才思API4000+串联质谱仪；质谱的检测条件为：喷雾电压为5500V，气帘气为20Psi，雾化气为55Psi，辅助加热气为60Psi，喷针温度为450℃。

进一步地，所述抗生素为磺胺类、喹诺酮类、β-内酰胺类、大环内酯类和四环素类抗生素。

进一步地，所述抗生素具体为：磺胺甲基嘧啶、磺胺甲氧嗪、磺胺甲恶唑、磺胺对甲氧嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶磺胺异恶唑、磺胺甲噻二唑、磺胺噻唑、磺胺二甲氧嘧啶、磺胺氯哒嗪、磺胺邻二甲氧嘧啶、磺胺间二甲氧嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺苯吡唑、磺胺吡啶、西诺沙星、诺氟沙星、环丙沙星、依诺沙星、洛美沙星、沙氟沙星、氧氟沙星、氟罗沙星、达氟沙星、司帕沙星、恩诺沙星、替米考星、克林霉素、金霉素、强力霉素、四环素、土霉素。

样品预处理可通过自动站水泵抽水及过滤实现，从而实现自动站实时在线监测点位监测水中抗生素。

本发明有益的技术效果在于：

(1)本发明通过在线固相萃取小柱，实现水中抗生素的快速富集，整个富集时间仅需要4.5min，富集结束后，通过甲醇/水(1:49)清洗固相萃取小柱，除去基质干扰，提高了检测灵敏度。

(2)本发明通过优化液相色谱条件，使用含0.1％甲酸和0.3％氨水的水溶液，改善了抗生素峰形和色谱峰分离度，将不同种类抗生素进行分离，满足分析检测的要求。

(3)本发明通过在线固相萃取小柱与超高效液相色谱串联质谱联用，样品仅需过滤后由仪器自动完成所有分析步骤，实现了全自动化操作，全部测定时间仅需12min，检出限为0.2～1.5ng/L，由于自动化运行，减少了人为操作所带来的误差。

(4)本发明通过对在线固相萃取及高效液相色谱工艺参数、流动相种类、时间及配比等的限定，构建了一种全自动在线检测水中抗生素的方法，缩短了分析时间，增加了净化清洗步骤减少了基质干扰现象的发生，实现了水中33种抗生素的时实同步检测。

附图说明

图1为本发明实施例1的抗生素色谱图。

图2为本发明对比例1的抗生素色谱图。

图3为本发明对比例2的抗生素色谱图。

图4为本发明对比例3的抗生素色谱图。

图5为本发明实施例1与对比例4中复杂基质样品中抗生素色谱图比较图。

图中：图5-1为对比例4中复杂基质样品抗生素加标所得的色谱图；图5-2为实施例1中复杂基质样品抗生素加标所得的色谱图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例，对本发明进行具体描述。

实施例1

一种全自动在线检测水中33种抗生素的方法，所述方法包括如下步骤：

(一)试剂配置：分别配制质量百分数为98％甲酸；含1v/v％甲酸的超纯水溶液作为流动相A；含0.1v/v％甲酸的甲醇作为流动相B；甲醇、丙酮、正己烷按体积比1：1：1配制流动相C；含甲酸和氨水的水溶液为流动相A₁，水溶液中甲酸的体积浓度为0.1％，氨水的体积浓度为0.3％；乙腈溶液为流动相B₁。

(二)样品预处理：

(1)取实际水样，加入10ng/L浓度的抗生素标准品得到待测样品，采用6000rmp离心10min，取上清液后滤膜过滤方式将颗粒物去除，再经0.22μm孔径滤膜过滤。

(2)加入质量百分数为98％的甲酸调节其pH值，调节pH值至2，放入样品瓶中待测。

(三)在线固相萃取：

所用在线萃取设备由沃特世ACQUITY UPLC四元溶剂管理器(SPE泵)、2777高压样品管理器组成。

在线固相萃取小柱为Oasis HLB(2.1×30mm i.d.，20μm)；进样量5.0mL。

流动相A、B、C按照体积比进行梯度洗脱的过程为：0～0.5min，流动相为A所占比例为100％；0.5～4.5min流动相为A所占比例为98.0％，流动相B所占比例为2.0％；4.5～7.5min流动相C所占比例为100％；7.5～13min流动相为A所占比例为100％。

梯度洗脱过程的流速设置为：0～3.5min流动相流速为2.0mL/min，3.5～4.5min流动相流速为0.01mL/min，4.5～13min流动相流速为2.0mL/min。

(四)超高效液相色谱条件：

所用超高效液相色谱设备包括沃特世ACQUITY UPLC二元溶剂管理器(分析泵)和ACQUITY UPLC色谱柱加热器冷却器；色谱柱为Acquity BEH130(100mm×2.1mm i.d.，1.7μm)；色谱柱柱温为40℃；

流动相A₁、B₁按照体积比进行梯度洗脱的过程为：初始流动相A₁为所占比例为95％，流动相B₁为5％；4.5～8.5min流动相B₁所占比例从5％升至95％，同时，流动相A₁所占比例从95％降至5％；8.5～9.5min流动相B₁所占比例为95％流动相A₁所占比例为5％；9.5～11.0min流动相A₁所占比例从5％升至95％，同时流动相B₁所占比例从95％降至5％；11.0～12.0min流动相A₁所占比例为95％，流动相B₁所占比例为5％。

梯度洗脱过程的流速为：0～4.5min流动相流速为0.1mL/min，4.5～12.0min流动相流速为0.4mL/min。

(五)串联质谱条件：

所用串联质谱设备为爱博才思API4000⁺串联质谱仪。

采用多反应监测(MRM)模式，使用ESI+源分析，喷雾电压为5500V，气帘气(CurtainGAS)为20Psi，雾化气(GSl)为55Psi，辅助加热气(GS2)为60Psi，喷针温度(TEM)为450℃。

特征离子经过对去簇电压和碰撞能量等因素的优化，确定了质谱分析参数，本发明所检测的33种抗生素的质谱分析参数如表1所示。

表1

实施例2

实施例2与实施例1的不同在于，步骤(二)样品预处理：

(1)取实际水样，加入10ng/L的抗生素标准品得到待测样品，采用6000rmp离心10min，取上清液后滤膜过滤方式将颗粒物去除，再经0.22μm孔径滤膜过滤。

步骤(三)在线固相萃取中，进样量为5.0mL。

其余条件与实施例1相同。

实施例3

实施例3与实施例1的不同在于，步骤(二)样品预处理：

(2)加入质量百分数为98％的甲酸调节其pH值，调节pH值至2～3，放入样品瓶中待测。

步骤(三)在线固相萃取中，进样量为5.0mL。

其余条件与实施例1相同。

对比例1

与实施例1所述原料及方法相同，不同仅在于将步骤(四)中的高效液相色谱的流动相A₁换成水溶液其余不变。

图2为对比例1的抗生素总离子流色谱图。如图2所示，对比例1中梯度洗脱条件下抗生素分离效果不理想，色谱峰展宽严重，保留时间发生重叠、无法进行有效的分离。可见，需要配合特定的液相色谱条件才能实现优异的分离检测效果。

对比例2

与实施例1所述原料及方法相同，不同仅在于改变步骤(四)中的高效液相色谱的流动相A₁，其他不变：对比例2中流动相A₁为0.1％甲酸和0.1％氨水水溶液，流动相B₁为乙腈溶液。

图3为对比例2的抗生素总离子流色谱图。由图3可知，对比例2中梯度洗脱条件下抗生素色谱峰响应强度较低，灵敏度较差。

对比例3

与实施例1所述原料及方法相同，不同仅在于改变步骤(四)中的高效液相色谱的流动相，其他不变：对比例3中流动相A₁为0.1％甲酸和0.2％氨水水溶液，流动相B₁为乙腈溶液。

图4为对比例3的抗生素总离子流色谱图。由图4可知，对比例3中梯度洗脱条件下抗生素色谱峰响应比对比例2中有所变强。

对比例4

与实施例1所述原料及方法相同，不同仅在于改变步骤(三)中的在线固相萃取洗脱程序，其他不变：

对比例4的在线固相萃取处理流动相条件为：初始流动相为A所占比例为100％，0.5min～4.5min流动相为A所占比例为100％，4.5min～7.5min流动相C所占比例为100％，7.5min～13min流动相为A所占比例为100％。

对比例5

与实施例1所述原料及方法相同，不同仅在于改变步骤(三)中的固相萃取程序，其他不变：

本对比例前处理改为手动固相萃取，萃取柱为500mg/6mL HLB固相萃取小柱，10mL甲醇活化小柱，5mL/min上样1000mL样品，含2％甲醇的纯水溶液洗涤小柱，10mL甲醇溶液洗脱，萃取液经氮吹浓缩至1mL经0.22μm滤膜过滤后上液相色谱串联质谱进行测定。

所需前处理时间为5小时左右，而实施例1仅需13min即可完成样品富集、洗脱和检测。

测试例：

1.标准曲线和检出限：

用超纯水配制1ng/L～40ng/L的33种抗生素标准溶液，在实施例1所限定的仪器条件下检测，记录峰面积，绘制峰面积-浓度标准曲线。33种抗生素的标准曲线、相关系数和检出限(n＝7)结果如见表2所示。

表2

由表2可知：标准曲线线性相关系数大于0.9950，检出限0.2～1.5ng/L，能够满足水中抗生素的测定。

2.检测的精密度和准确度测试：

取地表水，加入抗生素标准品，使样品中抗生素浓度为2ng/L，10ng/L和20ng/L，按照实施例1所述的方法进行样品预处理，先采用6000rmp离心10min，取上清液后滤膜过滤方式将颗粒物去除，再经0.22μm孔径的聚偏氟乙烯滤膜过滤。

回收率的计算公式为：K(％)＝(A-B)/C×100％ (1)

式中：A：加入标准物质的样品测得量，单位ng/L，B：样品中该物质的测得量，单位ng/L，C：加入的标准物质量，单位ng/L。

在此条件下，本发明提取地表水实际样品进行精密度和准确度实验，结果见表3(n＝7)。

表3

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由表3可知，地表水中抗生素回收率在76.6～118％，偏差在2.4～7.9％，精密度和准确度良好。

图5为复杂基质样品中抗生素总离子流色谱图比较图。图5-1为对比例4中基质较为复杂的实际样品加标所得的抗生素总离子流色谱图；图5-2为实施例1中基质较为复杂的实际样品加标所得的抗生素总离子流色谱图。由图5-1可知，受基质效应影响，响应值明显偏低，导致化合物响应降低；由图5-2可知，实施例1在基质较为复杂的实际样品加标实验中发现，干扰基质能够有效去除，基质效应改善明显，化合物响应降低恢复正常。

图1为本发明实施例1的抗生素总离子流色谱图。由图1可知，峰形形状、响应和分离度良好。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims

1.一种全自动在线检测水中抗生素的方法，其特征在于，所述方法通过将固相萃取、高效液相色谱及质谱串联实现全自动在线检测水中抗生素；

所述方法包括如下步骤：

（1）样品预处理；

（2）将预处理的样品加入在线固相萃取柱，进行固相萃取；所述固相萃取以流动相A、流动相B、流动相C，按照体积比进行梯度洗脱，梯度洗脱程序为：0~0.5min为100%流动相A，0.5~4.5min为98%的流动相A与2%的流动相B，4.5~7.5min为100%流动相C，7.5~13min为100%的流动相A；

（3）固相萃取后的样品通入高效液相色谱进行洗脱分离，用质谱仪对洗脱液进行检测；

所述抗生素为磺胺类、喹诺酮类、β-内酰胺类、大环内酯类和四环素类抗生素；

步骤（1）中，所述样品预处理的具体方法为：将样品离心、过滤去除颗粒物，用甲酸调pH至2~3；

步骤（3）中，所述高效液相色谱为Waters公司的ACQUITY UPLC；所述高效液相色谱所用色谱柱为C18液相色谱柱2.1mm×100mm×1.7µm，柱温为30~40℃；

步骤（3）中，所述高效液相色谱以流动相A₁、流动相B₁按体积比进行梯度洗脱，梯度洗脱的程序为：0~4.5min为95%的流动相A₁和5%的流动相B₁，4.5~8.5min流动相B₁由5%增至95%，同时流动相A₁从95%降低至5%，8.5~9.5min为95%的流动相B₁与5%的流动相A₁，9.5~11min，流动相A₁从5%升至95%，流动相B₁从95%降至5%，11~12min；流动相为95%的流动相A₁与5%的流动相B₁；所述流动相A₁为含甲酸和氨水的水溶液，水溶液中甲酸的体积浓度为0.1%，氨水的体积浓度为0.3%；所述流动相B₁为乙腈溶液；所述梯度洗脱的流速为：0~4.5min，流速为0.1mL/min，4.5~12min，流速为0.4mL/min；

所述抗生素为磺胺甲基嘧啶、磺胺甲氧嗪、磺胺甲恶唑、磺胺对甲氧嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺异恶唑、磺胺甲噻二唑、磺胺噻唑、磺胺二甲氧嘧啶、磺胺氯哒嗪、磺胺邻二甲氧嘧啶、磺胺间二甲氧嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺苯吡唑、磺胺吡啶、磺胺喹恶啉、西诺沙星、诺氟沙星、环丙沙星、依诺沙星、洛美沙星、沙氟沙星、氧氟沙星、氟罗沙星、达氟沙星、司帕沙星、恩诺沙星、替米考星、克林霉素、金霉素、强力霉素、四环素、土霉素；

所述在线固相萃取柱为Waters Oasis HLB；

步骤（2）中，所述流动相A为含1v/v%甲酸的超纯水溶液；流动相B为含0.1v/v%甲酸的甲醇溶液；所述流动相C由甲醇、丙酮、正己烷组成，甲醇、丙酮、正己烷的体积比为1：1：1；

质谱的检测条件为：喷雾电压为5500 V，气帘气为20 Psi，雾化气为55 Psi，辅助加热气为60 Psi，喷针温度为450℃。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述离心的速度为5000~6000rpm，时间为5~10min；所述甲酸为质量百分数≥98%的甲酸。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2）中，所述样品的进样量为0.5~5mL。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2）中，所述梯度洗脱的流速为：0~3.5min，流速为2.0mL/min；3.5~4.5min，流速为0.01mL/min；4.5~13min，流速为2.0mL/min。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（3）中，所述质谱仪为爱博才思API4000+串联质谱仪。