CN113125606A - 一种同时测定9种n-亚硝胺类化合物含量的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种同时测定9种N‑亚硝胺类化合物含量的方法，属于分析检测技术领域。本发明提供的同时测定9种N‑亚硝胺类化合物含量的方法，包括以下步骤：将待测样本与内标物溶液混合进行前处理，得到待测液；所述待测样本包括尿液样本或血浆样本；将所述待测液进行超高效液相色谱‑串联四极杆复合线性离子阱质谱分析，得到待测液的色谱图；根据9种N‑亚硝胺类化合物的基质工作曲线或标准曲线与待测液的色谱图，得到待测样本中9种N‑亚硝胺类化合物的含量。本发明方法能够快速、准确的检测待测样本中9种N‑亚硝胺类化合物的含量。

Description

一种同时测定9种N-亚硝胺类化合物含量的方法
技术领域
本发明涉及分析检测技术领域，尤其涉及一种同时测定9种N-亚硝胺类化合物含量的方法。
背景技术
N-亚硝胺类(N-nitrosamines，NAs)化合物是一类危害性极高的化合物，它与苯并芘、黄曲霉毒素并称世界三大强致癌物质。N-亚硝胺类化合物主要包括N-亚硝基二甲胺(NDMA)、N-亚硝基甲基乙基胺(NMEA)、N-亚硝基二乙基胺(NDEA)、N-亚硝基二丙基胺(NDPA)、N-亚硝基吡咯烷(NPYR)、N-亚硝基吗啉(NMOR)、N-亚硝基哌啶(NPIP)、N-亚硝基二丁基胺(NDBA)和N-亚硝基二苯胺(NDPHA)等。大量试验研究表明，N-亚硝胺类化合物具有极强的毒性和致癌性，可以诱发哺乳动物体内几乎全部脏器和组织产生肿瘤，主要能诱发肝脏、肺、食道、鼻粘膜、膀胱、舌头、前胃和胰腺等肿瘤疾病。
目前，检测N-亚硝胺类化合物含量的常用方法包括气相色谱-热能分析仪法以及气相色谱-质谱法，如GB/T 5009.26-2016《食品安全国家标准食品中N-亚硝胺类化合物的测定》中公开的检测方法即为气相色谱-热能分析仪法和气相色谱-质谱法。但是，热能分析仪应用范围窄，仅局限于N-亚硝基二甲胺的分析，限制了其在检测其它N-亚硝胺类化合物中的应用，且仪器价格较贵，一般实验室都没有配备。同时，N-亚硝胺类化合物分子量小，亲水性强，对灵敏度要求高，而气相色谱-质谱法灵敏度较低，操作耗时，准确度和精密度难以把握。
发明内容
本发明的目的在于提供一种同时测定9种N-亚硝胺类化合物含量的方法，本发明建立了9种N-亚硝胺类化合物的超高效液相色谱-串联四极杆复合线性离子阱质谱检测方法，能够快速、准确的检测待测样本中9种N-亚硝胺类化合物的含量。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种同时测定9种N-亚硝胺类化合物含量的方法，所述N-亚硝胺类化合物为N-亚硝基二甲胺、N-亚硝基二乙基胺、N-亚硝基甲基乙基胺、N-亚硝基二丙基胺、N-亚硝基二丁基胺、N-亚硝基吡咯烷、N-亚硝基吗啉、N-亚硝基哌啶和N-亚硝基二苯胺，包括以下步骤：
将待测样本与内标物溶液混合进行前处理，得到待测液；所述待测样本包括尿液样本或血浆样本；
将所述待测液进行超高效液相色谱-串联四极杆复合线性离子阱质谱分析，得到待测液的色谱图；
当所述待测样本为尿液样本时，根据9种N-亚硝胺类化合物的基质工作曲线与待测液的色谱图，得到待测样本中9种N-亚硝胺类化合物的含量；所述基质工作曲线为含有内标物的空白待测样本中加标9种N-亚硝胺类化合物中待测物质量浓度与待测物色谱峰面积和内标物色谱峰面积的比值的线性回归方程；
当所述待测样本为血浆样本时，根据9种N-亚硝胺类化合物的标准曲线与待测液的色谱图，得到待测样本中9种N-亚硝胺类化合物的含量；所述标准曲线为含有内标物的9种N-亚硝胺类化合物混合标准溶液中待测物质量浓度与待测物色谱峰面积和内标物色谱峰面积的比值的线性回归方程；
所述超高效液相色谱-串联四极杆复合线性离子阱质谱的超高效液相色谱条件包括：
流动相：流动相包括流动相A和流动相B，所述流动相A为纯水，流动相B为乙腈；梯度洗脱程序：0～0.5min，5％流动相B；0.5～3.5min，流动相B由5％增加至90％；3.5min～6min，90％流动相B；6min～6.1min，流动相B由90％降至5％；6.1min～8min，5％流动相B；
质谱条件包括：
离子源模式：APCI正离子模式；扫描模式：MRM-IDA-EPI；电晕针电流：3.5mA；离子源温度：400℃；气帘气：35psi；碰撞气：Medium；雾化气：50psi。
优选地，所述内标物为N-亚硝基二丙基胺-D14。
优选地，所述超高效液相色谱的色谱柱为T3柱，规格为100mm×2.1mm，1.8μm。
优选地，所述超高效液相色谱的柱温为40℃。
优选地，所述超高效液相色谱的进样体积为20μL。
优选地，当所述待测样本为尿液样本时，所述混合前还包括：将尿液样本过0.22μm滤膜；所述内标物溶液的浓度为1μg/mL，所述尿液样本与内标物溶液的体积比为99：1。
优选地，当所述待测样本为血浆样本时，所述前处理包括以下步骤：
将血浆样本、内标物溶液、氯化钠与沉淀剂混合后进行沉淀处理，得到混合料液；所述内标物溶液的浓度为0.1μg/mL，所述血浆样本与内标物溶液的体积比为1：0.05；
将所述混合料液进行固液分离，将所得液体物料与水混合，之后经浓缩去除体系中沉淀剂，过0.22μm滤膜后得到待测液。
优选地，所述沉淀剂为乙腈，所述血浆样本、氯化钠、乙腈和水的用量比为1mL：0.3g：1mL：0.5mL。
优选地，所述沉淀处理在振荡条件下进行，所述沉淀处理的时间为3～7min。
优选地，所述浓缩的方式为氮气吹扫，所述氮气吹扫的温度为23～27℃。
本发明提供了一种同时测定9种N-亚硝胺类化合物含量的方法，所述N-亚硝胺类化合物为N-亚硝基二甲胺、N-亚硝基二乙基胺、N-亚硝基甲基乙基胺、N-亚硝基二丙基胺、N-亚硝基二丁基胺、N-亚硝基吡咯烷、N-亚硝基吗啉、N-亚硝基哌啶和N-亚硝基二苯胺，包括以下步骤：将待测样本与内标物溶液混合进行前处理，得到待测液；所述待测样本包括尿液样本或血浆样本；将所述待测液进行超高效液相色谱-串联四极杆复合线性离子阱质谱分析，得到待测液的色谱图；当所述待测样本为尿液样本时，根据9种N-亚硝胺类化合物的基质工作曲线与待测液的色谱图，得到待测样本中9种N-亚硝胺类化合物的含量；所述基质工作曲线为含有内标物的空白待测样本中加标9种N-亚硝胺类化合物中待测物质量浓度与待测物色谱峰面积和内标物色谱峰面积的比值的线性回归方程；当所述待测样本为血浆样本时，根据9种N-亚硝胺类化合物的标准曲线与待测液的色谱图，得到待测样本中9种N-亚硝胺类化合物的含量；所述标准曲线为含有内标物的9种N-亚硝胺类化合物混合标准溶液中待测物质量浓度与待测物色谱峰面积和内标物色谱峰面积的比值的线性回归方程。
本发明建立了待测样本中9种N-亚硝胺类化合物的超高效液相色谱-串联四极杆复合线性离子阱质谱(LC-MS/MS)检测方法，方法快速、灵敏，准确度高。血浆以及尿液这类生物样本复杂基质，研究血浆以及尿液中N-亚硝胺类化合物含量，可一定程度反映人体N-亚硝胺类化合物的暴露水平。本发明针对9种N-亚硝胺类化合物分子量小和较强极性的特点，选择APCI源比ESI源可获得更高灵敏度，且APCI源抗基质干扰能力强，适用于血浆以及尿液这类复杂基质样本中9种N-亚硝胺类化合物的检测；同时，本发明用QTRAP的增强子离子扫描功能(EPI)建立了9种N-亚硝胺类化合物的质谱库，对低浓度(如检出限浓度附近)样品进行谱库检索，其匹配度可以做为定性的依据，很好地解决了传统串联四极杆质谱对低浓度样品只能定量不能定性的问题，血浆以及尿液中N-亚硝胺类化合物浓度一般较低，这极大地提高了低浓度样品分析结果的可靠性。采用本发明提供的方法能够快速、准确的检测血浆以及尿液样本中9种N-亚硝胺类化合物的含量，可为评价居民通过饮食摄入和体内合成N-亚硝胺类化合物的健康风险提供基础数据，还可为正常人健康体检和癌症病人的早期筛查提供准确的数据，具有重大社会意义。
附图说明
图1为实施例1中尿样中9种N-亚硝胺类化合物(5.0μg/L)及内标物的MRM图谱；
图2为实施例1中EPI谱库图；
图3为实施例1中尿样中NDBA的EPI扫描图；
图4为实施例2中水中9种N-亚硝胺类化合物(5.0μg/L)及内标物的MRM图谱；
图5为实施例2中待测液中溶剂为超纯水时的总离子流图及NDMA、NMOR和NPYR的提取离子图；
图6为实施例2中待测液中溶剂为10％乙腈水溶液时的总离子流图及NDMA、NMOR和NPYR的提取离子图；
图7为实施例2中待测液中溶剂为50％乙腈水溶液时的总离子流图及NDMA、NMOR和NPYR的提取离子图；
图8为实施例2中EPI谱库图；
图9为实施例2中血浆样本中NPIP的EPI扫描图。
具体实施方式
本发明提供了一种同时测定9种N-亚硝胺类化合物含量的方法，所述N-亚硝胺类化合物为N-亚硝基二甲胺、N-亚硝基二乙基胺、N-亚硝基甲基乙基胺、N-亚硝基二丙基胺、N-亚硝基二丁基胺、N-亚硝基吡咯烷、N-亚硝基吗啉、N-亚硝基哌啶和N-亚硝基二苯胺，包括以下步骤：
将待测样本与内标物溶液混合进行前处理，得到待测液；所述待测样本包括尿液样本或血浆样本；
将所述待测液进行超高效液相色谱-串联四极杆复合线性离子阱质谱分析，得到待测液的色谱图；
当所述待测样本为尿液样本时，根据9种N-亚硝胺类化合物的基质工作曲线与待测液的色谱图，得到待测样本中9种N-亚硝胺类化合物的含量；所述基质工作曲线为含有内标物的空白待测样本中加标9种N-亚硝胺类化合物中待测物质量浓度与待测物色谱峰面积和内标物色谱峰面积的比值的线性回归方程；
当所述待测样本为血浆样本时，根据9种N-亚硝胺类化合物的标准曲线与待测液的色谱图，得到待测样本中9种N-亚硝胺类化合物的含量；所述标准曲线为含有内标物的9种N-亚硝胺类化合物混合标准溶液中待测物质量浓度与待测物色谱峰面积和内标物色谱峰面积的比值的线性回归方程；
所述超高效液相色谱-串联四极杆复合线性离子阱质谱的超高效液相色谱条件包括：
流动相：流动相包括流动相A和流动相B，所述流动相A为纯水，流动相B为乙腈；梯度洗脱程序：0～0.5min，5％流动相B；0.5～3.5min，流动相B由5％增加至90％；3.5min～6min，90％流动相B；6min～6.1min，流动相B由90％降至5％；6.1min～8min，5％流动相B；
质谱条件包括：
离子源模式：APCI正离子模式；扫描模式：MRM-IDA-EPI；电晕针电流：3.5mA；离子源温度：400℃；气帘气：35psi；碰撞气：Medium；雾化气：50psi。
本发明将待测样本与内标物溶液混合进行前处理，得到待测液。在本发明中，所述待测样本包括尿液样本或血浆样本。血浆以及尿液这类样本复杂基质，且血浆以及尿液中N-亚硝胺类化合物浓度一般较低，采用本发明提供的方法能够快速、准确的检测血浆样本以及尿液样本中9种N-亚硝胺类化合物的含量。本发明优选根据待测样本的具体种类选择相应的处理方式。
在本发明中，当所述待测样本为尿液样本时，所述混合前优选还包括：将尿液样本过0.22μm滤膜；具体的，将尿液样本过0.22μm滤膜后与内标物溶液混合，得到待测液。在本发明中，所述内标物溶液中内标物优选为N-亚硝基二丙基胺-D14；所述内标物溶液的浓度优选为1μg/mL，所述尿液样本与内标物溶液的体积比优选为99：1。
在本发明中，当所述待测样本为血浆样本时，所述前处理优选包括以下步骤：将血浆样本、内标物溶液、氯化钠与沉淀剂混合后进行沉淀处理，得到混合料液；将所述混合料液进行固液分离，将所得液体物料与水混合，之后经浓缩去除体系中沉淀剂，过0.22μm滤膜后得到待测液。在本发明中，所述内标物溶液中内标物优选为N-亚硝基二丙基胺-D14；所述内标物溶液的浓度优选为0.1μg/mL，所述血浆样本与内标物溶液的体积比优选为1：0.05。在本发明中，所述沉淀剂优选为乙腈，所述血浆样本、氯化钠、乙腈和水的用量比优选为1mL：0.3g：1mL：0.5mL。在本发明中，所述沉淀处理优选在振荡条件下进行，所述沉淀处理的时间优选为3～7min，更优选为5min。在本发明中，所述水优选为超纯水。在本发明中，所述浓缩的方式优选为氮气吹扫，所述氮气吹扫的温度优选为23～27℃，更优选为25℃。在本发明中，待测物极易挥发损失，本发明优选通过在氮气吹扫前加水保护待测物，且通过限定合适的氮气吹扫温度，能够有效避免待测物挥发造成的损失，进而有利于提高检测结果的准确性；同时，氮气吹扫后所得待测液中溶剂为水，能够避免因乙腈存在而导致的溶剂效应对待测物峰形及灵敏度的不良影响。
得到待测液后，本发明将所述待测液进行超高效液相色谱-串联四极杆复合线性离子阱质谱分析，得到待测液的色谱图。在本发明中，所述超高效液相色谱-串联四极杆复合线性离子阱质谱的超高效液相色谱条件包括：
流动相：流动相包括流动相A和流动相B，所述流动相A为纯水，流动相B为乙腈；梯度洗脱程序：0～0.5min，5％流动相B；0.5～3.5min，流动相B由5％增加至90％；3.5min～6min，90％流动相B；6min～6.1min，流动相B由90％降至5％；6.1min～8min，5％流动相B。
在本发明中，所述超高效液相色谱的色谱柱优选为T3柱，更优选为ACQUITY
Figure BDA0003026404820000061
HSS T3柱；所述色谱柱的规格优选为100mm×2.1mm，1.8μm；柱温优选为40℃；进样体积优选为20μL。
在本发明中，所述超高效液相色谱-串联四极杆复合线性离子阱质谱的质谱条件包括：
离子源模式：APCI正离子模式；扫描模式：MRM-IDA-EPI；电晕针电流：3.5mA；离子源温度：400℃；气帘气：35psi；碰撞气：Medium；雾化气：50psi。
当所述待测样本为尿液样本时，得到待测液的色谱图后，本发明根据9种N-亚硝胺类化合物的基质工作曲线与待测液的色谱图，得到待测样本中9种N-亚硝胺类化合物的含量。在本发明中，所述基质工作曲线为含有内标物的空白待测样本中加标9种N-亚硝胺类化合物中待测物质量浓度与待测物色谱峰面积和内标物色谱峰面积的比值的线性回归方程，具体的，所述基质工作曲线以待测物色谱峰面积和内标物色谱峰面积的比值为纵坐标，待测物质量浓度为横坐标。本发明优选将空白待测样本、内标物溶液与9种N-亚硝胺类化合物的混合标准溶液混合，之后按照上述超高效液相色谱条件以及质谱条件进行超高效液相色谱-串联四极杆复合线性离子阱质谱分析，根据待测物色谱峰面积和内标物色谱峰面积的比值以及待测物的质量浓度绘制基质工作曲线。本发明采用基质工作曲线能够避免基质效应对待测物检测结果造成的不良影响，有利于提高检测结果准确性。本发明根据9种N-亚硝胺类化合物的基质工作曲线与待测液的色谱图，可以得到待测液中9种N-亚硝胺类化合物的含量，进而得到待测样本中9种N-亚硝胺类化合物的含量。
当所述待测样本为血浆样本时，得到待测液的色谱图后，本发明根据9种N-亚硝胺类化合物的标准曲线与待测液的色谱图，得到待测样本中9种N-亚硝胺类化合物的含量。在本发明中，所述标准曲线为含有内标物的9种N-亚硝胺类化合物混合标准溶液中待测物质量浓度与待测物色谱峰面积和内标物色谱峰面积的比值的线性回归方程，具体的，所述标准曲线以待测物色谱峰面积和内标物色谱峰面积的比值为纵坐标，待测物质量浓度为横坐标。本发明优选将内标物溶液与9种N-亚硝胺类化合物的混合标准溶液混合，之后按照上述超高效液相色谱条件以及质谱条件进行超高效液相色谱-串联四极杆复合线性离子阱质谱分析，根据待测物色谱峰面积和内标物色谱峰面积的比值以及待测物的质量浓度绘制标准曲线。本发明根据9种N-亚硝胺类化合物的标准与待测液的色谱图，可以得到待测液中9种N-亚硝胺类化合物的含量，进而得到待测样本中9种N-亚硝胺类化合物的含量。
下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1检测尿液样本中9种N-亚硝胺类化合物含量
1、材料与方法
1.1材料
甲醇(HPLC级，德国Merck公司)；乙腈(HPLC级，德国Merck公司)；甲酸(HPLC级，阿拉丁公司)；乙酸铵(HPLC级，美国ACS公司)；9种N-亚硝胺类化合物即N-亚硝基二甲胺(NDMA)、N-亚硝基二乙基胺(NDEA)、N-亚硝基甲基乙基胺(NMEA)、N-亚硝基二丙基胺(NDPA)、N-亚硝基二丁基胺(NDBA)、N-亚硝基吡咯烷(NPYR)、N-亚硝基吗啉(NMOR)、N-亚硝基哌啶(NPIP)、N-亚硝基二苯胺(NDPHA)和内标物N-亚硝基二丙基胺-D14(NDPA-D14)均购自Enzo公司；9种N-亚硝胺类化合物用甲醇配制成混合标准溶液，并用甲醇稀释成每种N-亚硝胺类化合物浓度均为100mg/L的标准贮备溶液，-20℃冰箱中保存，使用时用纯水逐级稀释至所需浓度，作为混标使用液；内标物NDPA-D14用纯水逐级稀释至1μg/mL，作为内标使用液。
1.2仪器与试剂
30AD超高效液相色谱仪(日本岛津公司)；5500QTRAP串联四极杆线性离子阱质谱仪(美国AB SCIEX公司)；GradientA10 Mill-Q超纯水仪(法国Milli-pore公司)。
1.3样品前处理方法
取尿液样本过0.22μm滤膜，吸取990μL过滤后的尿液样本加入10μL内标使用液(1μg/mL)，混匀待测。
1.4UPLC-MS/MS条件
液相条件：色谱柱ACQUITY
Figure BDA0003026404820000081
HSS T3(100mm×2.1mm，1.8μm)，柱温：40℃，进样体积：20μL；流动相：流动相A为纯水，流动相B为乙腈，梯度洗脱程序如下：0～0.5min，5％流动相B；0.5～3.5min，流动相B由5％增加至90％；3.5min～6min，90％流动相B；6min～6.1min，流动相B由90％降至5％；6.1min～8min，5％流动相B。
质谱条件：离子源模式：大气压化学电离(APCI)正离子模式；扫描模式：MRM-IDA-EPI；电晕针电流(NC)：3.5mA；离子源温度(TEM)：400℃；气帘气(CUR)：35psi；碰撞气(CAD)：Medium；雾化气(GS1)：50psi。其它质谱参数：母离子(Q1)、子离子(Q3)、去簇电压(DP)和碰撞电压(CE)如表1所示。
表1 9种N-亚硝胺类化合物的质谱分析参数
化合物 保留时间 母离子(m/z) 子离子 DP(V) CE(eV)
NDMA 2.24 75.0 43.0/58.0 50 21/16
NMOR 2.65 117.1 87.0/86.0 40 15/17
NPYR 2.86 101.1 55.0/41.0 40 20/31
NMEA 2.88 89.0 61.0/43.0 40 18/14
NDEA 3.34 103.0 75.0/47.0 50 15/20
NPIP 3.42 115.1 69.0/41.0 40 18/27
NDPA 4.00 131.1 89.0/43.0 40 13/16
NDBA 4.51 159.2 103.0/57.0 50 14/15
NDPHA 4.54 169.1 66.0/114.9 60 37/54
NDPA-D14 3.96 145.1 97.1 40 15
2、结果与讨论
2.1质谱条件的优化与确认
2.1.1电离源和质谱条件优化
9种N-亚硝胺类化合物分子量小，为多肽类物质，具有较强极性，选择大气压化学电离正离子(APCI+)模式比电喷雾正离子(ESI+)模式电离可获得更高灵敏度，且APCI源抗基质干扰能力强，适用于尿液这一复杂基质中N-亚硝胺类化合物的检测。采用流动注射泵进样(采用较大流速有利于各物质的离子化)，对每种N-亚硝胺类化合物质量浓度均为1mg/L的混标使用液进行一级质谱扫描，确定其准分子离子峰；再对母离子进行二级质谱扫描，选择丰度较高的2种碎片离子作为定性与定量特征离子；然后通过优化，为各离子对选择最佳的去簇电压(DP)和碰撞能量(CE)。
2.1.2扫描模式的选择
尽管MRM的灵敏度非常高，但在定量分析复杂基质的样品时，仍会出现结果假阳性的风险问题。最典型情况是现在每个目标物都用两对MRM离子进行检测，其中一对离子进行定量分析，另一对离子与定量离子对的比值和标准品的相应比值进行比较来进行定性确认。实际工作中，即使有标准品，这种方法也会出现假阳性结果，特别是定量离子对的灵敏度远远高于定性离子对的灵敏度时。采用MRM-IDA-EPI模式，一次进样，不仅可得到高灵敏度的MRM定量结果，还可同时得到相应的二级全扫描质谱图(EPI)，通过质谱库检索的传统质谱定性工作流程，进行样品中待测物的定性确认。
2.2色谱条件的优化
本发明分别采用水-甲醇、水-乙腈、0.1％甲酸-乙腈和2mmol/L乙酸铵-乙腈作为流动相，在T3色谱柱(具体为ACQUITY
Figure BDA0003026404820000091
HSS T3色谱柱)和C18色谱柱上进行分离，结果表明，采用T3色谱柱时，各物质响应高，分离效果好。以T3色谱柱为分析柱、有机相为乙腈、水相为纯水时，各物质响应最高，分别加入甲酸、乙酸铵虽然能一定程降低噪声，但峰形无明显改善，灵敏度也无变化，综合考虑，确定流动相A为纯水，流动相B为乙腈。
2.3样品前处理方法优化和基质效应考察
本发明采用直接进样，操作简单、快速，灵敏度较高，故确定样品采用过0.22μm滤膜后直接进样测定。因尿液未经净化而直接上机测定，尿液基质效应需要进行考察。基质效应是指色谱分离时共洗脱的物质改变了待测成分的离子化效应，所引起的信号抑制或提高。基质效应影响大时会降低方法的灵敏度和准确性，给测定带来误差。本发明通过绘制标准曲线和基质工作曲线，具体是以色谱峰面积为纵坐标，质量浓度为横坐标，以基质工作曲线和标准曲线斜率的比值来考察9种N-亚硝胺类化合物在尿液中的基质效应。一般认为，基质工作曲线与标准曲线斜率的比值在85～115％之间不存在基质效应。结果表明，NDMA、NMOR和NMEA尿液基质中有较强基质抑制效应，NDPHA尿液基质中有较强基质增强效应，其它5种N-亚硝胺类化合物在尿液基质中无明显基质效应。由于9种N-亚硝胺类化合物没有一一对应的内标物，为得到准确结果，最终确定采用基质工作曲线进行校正。
2.4方法学实验结果
2.4.1方法的线性范围和检出限
取6个1mL进量瓶，分别吸取适量混标使用液，加入10μL内标使用液(1μg/mL)，用经0.22μm滤膜过滤的空白尿液样本定容至1.0mL，分别制备成浓度为0.2μg/L、0.5μg/L、1.0μg/L、2.0μg/L、5.0μg/L、20.0μg/L的基质标准溶液，在选定的色谱条件和质谱条件下对所述基质标准溶液进行测定，结果显示，9种N-亚硝胺类化合物均呈良好线性关系，相关系数(r)为0.9991～0.9999，根据尿液基质中定量离子对信噪比(S/N)为3的标准确定检出限(LOD)，信噪比(S/N)为10的标准确定定量限(LOQ)。具体结果见表2。尿液基质中9种N-亚硝胺类化合物(5.0μg/L)以及内标物的MRM图谱见图1。
2.4.2方法的回收率和精密度
对空白尿液样本加标，进行回收率和精密度实验，分别添加高、中、低三组浓度(分别为0.5μg/L、2.0μg/L和10.0μg/L)的标准溶液，混匀，放置5min以保证各组分充分混合，之后再按样品前处理方法进行操作，平行测定6次，回收率和精密度结果见表2。如表2所示，加标回收率为87.9～106.3％，相对标准偏差为2.3～11.8％。
表2 9种N-亚硝胺类化合物的方法学参数(n＝6)
Figure BDA0003026404820000101
Figure BDA0003026404820000111
2.5实际样品检测
对医院门诊病人13份尿样进行测定，其中NDBA检出率最高，检出率为73.3％，含量范围为0.048～0.093μg/L；NPIP检出率为33.3％，含量范围为0.06～0.54μg/L；NPYR检出率为13.3％，含量范围为0.038～0.047μg/L；其它6种N-亚硝胺类化合物都未检出。图2和图3为尿样中NDBA的IDA-EPI模式扫描的定性分析图谱，其中，图2为EPI谱库图(根据标准品的扫描图建立)，图3为尿样中NDBA的EPI扫描图。
由实施例1可知，本发明采用过0.22μm滤膜后直接进样的前处理方式，建立了人体尿液中9种N-亚硝胺类化合物的LC-MS/MS检测方法，方法快速、灵敏，准确度高；本发明针对9种N-亚硝胺类化合物分子量小和较强极性的特点，选择APCI源比ESI源可获得更高灵敏度，且APCI源抗基质干扰能力强，适用于尿液这一复杂基质样本中9种N-亚硝胺类化合物的检测；同时，本发明用QTRAP的增强子离子扫描功能(EPI)建立了9种N-亚硝胺类化合物的质谱库，对低浓度(如检出限浓度附近)样品进行谱库检索，其匹配度可以做为定性的依据，很好地解决了传统串联四极杆质谱对低浓度样品只能定量不能定性的问题，尿液中N-亚硝胺类化合物浓度一般较低，这极大地提高了低浓度样品分析结果的可靠性。
实施例2检测血浆样本中9种N-亚硝胺类化合物含量
1、材料与方法
1.1材料同实施例1
1.2仪器与试剂同实施例1
1.3样品前处理方法
吸取1mL血浆样本于10mL离心管，加入50μL内标使用液(0.1μg/mL)，混匀后加入0.3g氯化钠和1mL乙腈，振荡提取5min，转移液体至另一离心管中，在10000r/min条件下离心5min，向上清液中加入0.5mL超纯水后，25℃氮气吹扫去除体系中乙腈，至剩余约0.5mL，过0.22μm滤膜待测。
1.4UPLC-MS/MS条件
液相色谱条件以及质谱条件均同实施例1
2、结果与讨论
2.1色谱条件优化
本发明分别采用水-甲醇、水-乙腈、0.1％甲酸-乙腈和2mmol/L乙酸铵-乙腈作为流动相，在T3色谱柱(具体为ACQUITY
Figure BDA0003026404820000121
HSS T3色谱柱)和C18色谱柱上进行分离，结果表明，采用T3色谱柱时，各物质响应高，分离效果好。以T3色谱柱为分析柱、有机相为乙腈、水相为纯水时，各物质响应最高，分别加入甲酸、乙酸铵虽然能一定程降低噪声，但峰形无明显改善，灵敏度也无变化，综合考虑，确定流动相A为纯水，流动相B为乙腈。水中9种N-亚硝胺类化合物(5.0μg/L)以及内标物的MRM图谱见图4。
2.2待测液溶剂效应
N-亚硝胺类化合物极性较强，存在分子和离子两种形态。当待测液中有机相比例较高时，溶剂效应增强，NDMA、NMOR以及NPYR形态改变，色谱峰变矮变宽。本发明考察超纯水、10％乙腈水溶液、50％乙腈水溶液和乙腈作为待测液中溶剂时对目标物色谱峰峰形的影响。结果显示，待测液中溶剂为超纯水时各目标物峰形对称，灵敏度最高，乙腈含量超过10％时，NDMA峰形差，保留时间飘移，继续加大乙腈含量，其它目标物也会出现严重的前伸峰现象，具体如图5～7所示，图5～7分别为待测液中溶剂为超纯水、10％乙腈水溶液和50％乙腈水溶液时的总离子流图及NDMA、NMOR和NPYR的提取离子图。故本发明最终选择超纯水作为待测液中溶剂。
2.3样品前处理方法优化
血浆样本中化学性物质检测前处理一般使用固相萃取法。固相萃取法是血浆样本分析中最常用的分离富集方法，考虑到血浆样本一般取样少，固相萃取操作较复杂，N-亚硝胺类化合物洗脱液一般选用二氯甲烷，氮吹时极易造成目标物损失，且溶剂转换较难实现。本发明采用蛋白沉淀法对血浆样本进行前处理，操作简单快速。本发明同时比较了乙腈、甲醇和丙酮作为沉淀剂的效果，试验结果表明乙腈沉淀效果最好，蛋白沉淀较完全，且大多粘附在管壁，离心后易于分离，回收率也最高，样品本底不干扰测定。但只用乙腈沉淀，NDMA回收率较低，为75％左右，可能是蛋白沉淀物包裹了此物质。本发明分别采用10％甲醇-乙腈和1％乙酸-乙腈进行实验，结果NDMA的回收率提高10％，但其它几种N-亚硝胺类化合物的峰形和回收率会有较大影响。故本方法最终选用乙腈作为沉淀剂。本发明加入氯化钠可促进水相和乙腈相分层，并提高提取效率。本发明对沉淀处理后且经固液分离所得液体物料(即溶剂为乙腈)直接氮气吹扫至尽干，再用超纯水复溶作为待测液，发现大部分目标物的绝对回收率均小于70％。针对该问题，本发明在固液分离所得液体物料中加入超纯水后再进行在氮气吹扫，目标物可得到有效保护。其中，氮吹温度较高(如30～35℃)时，NDMA等极易挥发损失；氮吹温度较低时(如20℃)，氮吹时间较长也会导致待测物的损失。最终实验确定氮吹温度为25℃可获得满意结果。
2.4方法学实验结果
2.4.1方法的线性范围和检出限
取6个1mL进量瓶，分别吸取适量混标使用液，加入100μL内标使用液(0.1μg/mL)，用超纯水定容至1.0mL，制备成浓度为0.2μg/L、0.5μg/L、1.0μg/L、5.0μg/L、10.0μg/L、20.0μg/L的标准溶液，在选定的色谱条件和质谱条件下对所述标准溶液进行测定，结果显示，9种N-亚硝胺类化合物均呈良好线性关系，相关系数(r)为0.9993～0.9999，根据血浆加标样品图谱中定量离子对信噪比(S/N)为3的标准确定检出限(LOD)，信噪比(S/N)为10的标准确定定量限(LOQ)。具体结果见表3。
2.4.2方法的回收率和精密度
对空白血浆样本进行加标，进行回收率和精密度实验，分别添加高、中、低三组浓度(分别为0.5μg/L、2.0μg/L和10.0μg/L)的标准溶液，混匀，放置5min后再按样品前处理方法进行操作，平行测定6次，回收率和精密度结果见表3。如表3所示，加标回收率为75.4～113.3％，相对标准偏差为4.5～13.5％。
表3 9种N-亚硝胺类化合物的方法学参数(n＝6)
Figure BDA0003026404820000141
2.5实际样品检测
对医院门诊病人24份血浆样本进行测定，其中NDBA检出率最高，检出率为58.3％，含量范围为0.10～0.16μg/L；NPYR检出率为12.5％，含量范围为0.31～0.60μg/L；NPIP检出率为8.3％，含量范围为0.20～0.26μg/L；其它6种N-亚硝胺类化合物都未检出。
图8和图9为血浆样本中NPIP的IDA-EPI模式扫描的定性分析图谱，其中，图8为EPI谱库图(根据标准品的扫描图建立)，图9为血浆样本中NPIP的EPI扫描图。
由实施例2可知，本发明通过乙腈沉淀蛋白并提取目标物，且在氮气吹扫前加水以保护目标物，建立了人血浆中9种N-亚硝胺类化合物的LC-MS/MS检测方法，方法快速、灵敏，准确度高；本发明针对9种N-亚硝胺类化合物分子量小和较强极性的特点，选择APCI源比ESI源可获得更高灵敏度，且APCI源抗基质干扰能力强，适用于血浆这一复杂基质样本中9种N-亚硝胺类化合物的检测；同时，本发明用QTRAP的增强子离子扫描功能(EPI)建立了9种N-亚硝胺类化合物的质谱库，对低浓度(如检出限浓度附近)样品进行谱库检索，其匹配度可以做为定性的依据，这极大地提高了低浓度样品分析结果的可靠性。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种同时测定9种N-亚硝胺类化合物含量的方法，所述N-亚硝胺类化合物为N-亚硝基二甲胺、N-亚硝基二乙基胺、N-亚硝基甲基乙基胺、N-亚硝基二丙基胺、N-亚硝基二丁基胺、N-亚硝基吡咯烷、N-亚硝基吗啉、N-亚硝基哌啶和N-亚硝基二苯胺，包括以下步骤：
将待测样本与内标物溶液混合进行前处理，得到待测液；所述待测样本包括尿液样本或血浆样本；
将所述待测液进行超高效液相色谱-串联四极杆复合线性离子阱质谱分析，得到待测液的色谱图；
当所述待测样本为尿液样本时，根据9种N-亚硝胺类化合物的基质工作曲线与待测液的色谱图，得到待测样本中9种N-亚硝胺类化合物的含量；所述基质工作曲线为含有内标物的空白待测样本中加标9种N-亚硝胺类化合物中待测物质量浓度与待测物色谱峰面积和内标物色谱峰面积的比值的线性回归方程；
当所述待测样本为血浆样本时，根据9种N-亚硝胺类化合物的标准曲线与待测液的色谱图，得到待测样本中9种N-亚硝胺类化合物的含量；所述标准曲线为含有内标物的9种N-亚硝胺类化合物混合标准溶液中待测物质量浓度与待测物色谱峰面积和内标物色谱峰面积的比值的线性回归方程；
所述超高效液相色谱-串联四极杆复合线性离子阱质谱的超高效液相色谱条件包括：
流动相：流动相包括流动相A和流动相B，所述流动相A为纯水，流动相B为乙腈；梯度洗脱程序：0～0.5min，5％流动相B；0.5～3.5min，流动相B由5％增加至90％；3.5min～6min，90％流动相B；6min～6.1min，流动相B由90％降至5％；6.1min～8min，5％流动相B；
质谱条件包括：
离子源模式：APCI正离子模式；扫描模式：MRM-IDA-EPI；电晕针电流：3.5mA；离子源温度：400℃；气帘气：35psi；碰撞气：Medium；雾化气：50psi。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述内标物为N-亚硝基二丙基胺-D14。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述超高效液相色谱的色谱柱为T3柱，规格为100mm×2.1mm，1.8μm。
4.根据权利要求1或3所述的方法，其特征在于，所述超高效液相色谱的柱温为40℃。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述超高效液相色谱的进样体积为20μL。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，当所述待测样本为尿液样本时，所述混合前还包括：将尿液样本过0.22μm滤膜；所述内标物溶液的浓度为1μg/mL，所述尿液样本与内标物溶液的体积比为99：1。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，当所述待测样本为血浆样本时，所述前处理包括以下步骤：
将血浆样本、内标物溶液、氯化钠与沉淀剂混合后进行沉淀处理，得到混合料液；所述内标物溶液的浓度为0.1μg/mL，所述血浆样本与内标物溶液的体积比为1：0.05；
将所述混合料液进行固液分离，将所得液体物料与水混合，之后经浓缩去除体系中沉淀剂，过0.22μm滤膜后得到待测液。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述沉淀剂为乙腈，所述血浆样本、氯化钠、乙腈和水的用量比为1mL：0.3g：1mL：0.5mL。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述沉淀处理在振荡条件下进行，所述沉淀处理的时间为3～7min。
10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述浓缩的方式为氮气吹扫，所述氮气吹扫的温度为23～27℃。
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