CN104076106A

CN104076106A - 适用食品接触类橡胶制品中9种n-亚硝胺的同时检测法

Info

Publication number: CN104076106A
Application number: CN201410337733.4A
Authority: CN
Inventors: 吴刚; 赵珊红; 王力君; 张明誉; 阮毅
Original assignee: Inspection & Quarantine Technology Center Of Zhejiang Entry-Exit Inspection & Quarantine Bureau
Current assignee: Inspection & Quarantine Technology Center Of Zhejiang Entry-Exit Inspection & Quarantine Bureau
Priority date: 2014-07-15
Filing date: 2014-07-15
Publication date: 2014-10-01
Anticipated expiration: 2034-07-15
Also published as: CN104076106B

Abstract

本发明公开了一种适用于食品接触类橡胶制品中9种N-亚硝胺的同时检测方法，包括以下步骤：利用待测样品建立迁移体系，从而获得迁移提取液；利用迁移提取液制备待测样品溶液，从而获得上层清液/滤液；将9种N-亚硝胺制备成标准溶液，配制成0.01～0.40μg/mL梯度的标准工作溶液；将梯度标准溶液、上层清液/滤液注入液相色谱-串联质谱仪，正离子多反应监测模式测定，最终获得待测样品中9种N-亚硝胺的各自含量。9种N-亚硝胺为：N-亚硝基二甲胺、N-亚硝基甲基乙基胺、N-亚硝基吗啉、N-亚硝基哌啶、N-亚硝基吡咯烷、亚硝基-二乙基胺、N-亚硝基二丁胺、二丙基亚硝胺、N-亚硝基二苯胺。

Description

适用食品接触类橡胶制品中9种N-亚硝胺的同时检测法

技术领域

本发明涉及一种适用于食品接触类橡胶制品中N-亚硝胺的检测方法。

背景技术

橡胶制品广泛应用于国防、工农业、服务行业等各个领域，在人们日常生活中也经常使用。从食品领域中的高压锅垫圈、各种玻璃瓶盖密封垫、生产各种液体调味品用的抽吸橡胶管等，生活用品中涉及到的乳胶手套、热水袋、球杆套、运动用球类、塑胶跑道等，计生用品中的安全套等到许多儿童用具如婴儿奶嘴、吸嘴、橡皮球、儿童车中的扶手、皮球、气球、巴比娃娃、橡皮擦、橡皮泥等等，橡胶制品比比皆是。

1982年，美国消费者产品安全委员会透露市场上的婴儿橡胶奶嘴和抚慰品可能含有致癌的N-亚硝胺类化合物。2001年从德国市场上随机抽选的16种乳胶玩具气球的样品中，有81％的样品N-亚硝胺及N-亚硝基化合物的迁移量超过限定标准；2003年从市场上随机抽选的l4种样品中，有93％的产品N-亚硝胺的迁移量超过限定标准。同年，荷兰市场上57个气球样品在1小时内迁移至人造唾液中的物质中全部检测出N-亚硝基二甲胺及其前体，60％的样品中检测出N-亚硝基二丁基胺及其前体，其余还检测出N-亚硝基二乙胺、N-亚硝基二苄胺等。最高的N-亚硝胺含量达630μg/kg，N-亚硝基化合物达5700μg/kg，仅有一个样品符合限量标准。2004年，德国的研究人员对德国市场上的32种乳胶避孕套中亚硝胺及亚硝基化合物的含量进行了检测，发现有29种避孕套中亚硝胺及亚硝基化合物的含量超过限量标准，含量为10～660μg/kg，是食物中亚硝胺暴露量的1.5～3倍。

N-亚硝胺是一类具有N-亚硝基官能团的化合物，其分子结构为：

目前在已发现的130多种N-亚硝胺类化合物中，80％以上的都是强致癌物。实验表明，N-亚硝胺类化合物对40种不同的动物显示出致癌作用，包括猿、猴等哺乳类动物，以及鸟、鱼和两栖类动物。

N-亚硝胺化合物的前体物硝酸盐、亚硝酸盐和胺类，广泛存在于人类生活环境和食品中，它们经过化学或生物途径合成多种多样的N-亚硝胺化合物，既可以在环境中外源性合成，又可以在体内进行内源性合成，无论是在气相或液相条件下，胺类和亚硝化试剂均可被催化而合成致癌性的亚硝胺。因此，N-亚硝胺化合物以微量成分分布于大气、水、土壤、食品、烟草、化工产品、农药和药物等人类环境介质中。

绝大多数橡胶制品都是通过高温硫化最终成型。在硫化过程中，仲胺基硫化促进剂和硫磺给予体分解后会释放出仲胺，与空气或配合剂中的氮氧化物在酸性条件生成N-亚硝胺。

在特定的使用环境下，这些N-亚硝胺类化合物被释放出，从而有可能对人体产生巨大的危害。

近年来国际上对某些促进剂在橡胶加工过程中易产生有害N-亚硝胺问题日益重视，有关N-亚硝胺化合物的生成、影响等研究成为全球橡胶促进剂研究领域的热点。我国在N-亚硝胺的研究中也做出了大量的努力。一方面，开发不产生N-亚硝胺物质的硫化促进剂，大力提倡并逐步使用不生成亚硝胺的促进剂代替现有生成亚硝胺的促进剂。但是，目前可用的不生成亚硝胺的促进剂品种非常有限。另一方面，积极开发制定N-亚硝胺的检测方法，并于2009年出台了橡胶制品中的N-亚硝胺的标准检测方法GB/T24153-2009，规定了N-亚硝胺限量值。但是该标准采用气相色谱-质谱法(GC-MS)方法，测试对象为橡胶弹性体，没有区分出普通橡胶和食品接触类橡胶，且检测低限为0.5mg/kg。而国外欧盟标准BS EN12868和美国标准ASTM F1313-90都针对了婴儿橡胶奶嘴及抚慰品，都严格规定了该类产品中N-亚硝胺的总含量不得超过≤10μg/kg。

EN-71-12:2013《玩具安全第12部分：N-亚硝胺和N-亚硝胺类物质》采用人工唾液进行模拟迁移，用盐酸溶液调节pH值后，用带大气压电离离子源(APCI)的液相色谱-串联质谱仪直接进行测定，测定低限为1μg/L。GB/T24153-2009《橡胶及弹性体材料N-亚硝基胺的测定》采用甲醇超声波提取，C₁₈固相萃取小柱净化，GC-MS测定，测定低限为0.5mg/kg；BS EN12868采用人工唾液进行模拟迁移后，用二氯甲烷提取，气相色谱(GC)热能检测器测定，对N-亚硝胺的测定低限为0.01mg/kg，对亚硝胺类物质的测定低限为0.1mg/kg。显然，我国目前的国家标准无法满足国际上对食品接触类橡胶制品中N-亚硝胺限量的要求。当前，国家正在制订与人体皮肤长期接触的橡胶制品和口腔等身体部位接触的橡胶制品中N-亚硝胺的限量和释放量，对橡胶制品会进行更严格的划分。因此，制订合适的分析方法，降低方法的检出限以适应新的国标是当务之急。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种定性、定量，灵敏度高的适用于食品接触类橡胶制品中N-亚硝胺的检测方法。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种适用于食品接触类橡胶制品中9种N-亚硝胺的同时检测方法，包括以下步骤：

1)、迁移体系的建立：

将待测样品剪碎后，作为试样；

称取10g试样(精确至0.01g)加入40～80.0mL(例如为60mL)人工唾液从而浸没试样，于35～40℃(较佳为37℃)水浴静置12～36小时，过滤，得迁移提取液；

备注说明：上述迁移体系的设置，便于样品中N-亚硝胺的迁移和平衡；

2)、制备待测样品溶液：

(A)将步骤1)所得的全部迁移提取液转入分液漏斗，先加入1～5mL的0.1～5mol/L的NaOH溶液(较佳为1mL的1mol/L的NaOH溶液)；再加入10～50mL(较佳为30mL)二氯甲烷振荡提取5～10分钟，静置1～10分钟，将下层萃取液过无水硫酸钠层，收集(可收集于平底烧瓶中；备注说明：若下层萃取液不能形成清晰溶液，而成为乳浊液，可通过1000～8000rpm离心1～5分钟处理)；再加入10～50mL(较佳为20mL)二氯甲烷到分液漏斗，对上层溶液进行重复提取一次(备注说明：即重复上述“提取5～10分钟，静置1～10分钟，将下层萃取液过无水硫酸钠层，收集)；合并两次萃取液；

(B)将步骤(A)收集所得的萃取液在旋转蒸发仪上30～50℃(较佳为40℃)减压浓缩近干，用乙腈与水按照1:1的体积比混合而得的混合溶液定容至1～10mL的整数刻度值(较佳为2mL)，得提取定容混合液；

(C)取上述提取定容混合液离心，或过0.22μm过滤膜；所得的上层清液/滤液置于进样瓶中密封，目的是供LC-MS/MS进行定性、定量分析；

上述离心为6000～20000转/分钟的高速离心；

备注说明：上述离心或者过滤膜只是对提取定容混合液进行净化，微乎其微的体积变化可不考虑。

3)、制备标准溶液：

(A)用有机溶剂分别溶解9种N-亚硝胺，从而分别配制成浓度均分别为100μg/mL的9种标准储备溶液；

备注说明：9种N-亚硝胺具体如表1所示。

表1、9种亚硝胺标准物质信息表

化合物中文名	化合物英文名	CAS No.	缩写	纯度(％)
					N-亚硝基二甲胺	N-nitrosodimethylamine	62-75-9	NDMA	98
N-亚硝基甲基乙基胺	N-nitrosomethylethylamine	10595-95-6	NMEL	99.3
					N-亚硝基吗啉	N-nitrosomorpholine	59-89-2	NMOR	99
N-亚硝基哌啶	N-nitrosopiperidine	100-75-4	NPIP	99.5
					N-亚硝基吡咯烷	N-nitrosopyrrolidine	930-55-2	NDPL	99
亚硝基-二乙基胺	N-nitrosodiethylamine	55-18-5	NDEA	99
					N-亚硝基二丁胺	N-nitrosodi-n-butylamine	924-16-3	NDBA	99
二丙基亚硝胺	N-nitrosodi-n-propylamine	621-64-7	NDPA	99
					N-亚硝基二苯胺	N-nitrosodiphenylamine	86-30-6	NPYL	99

(B)在有机溶剂中分别加入上述9种标准储备溶液，从而配制成9种N-亚硝胺浓度均分别为1～10μg/mL的混合标准工作溶液；

备注说明：在混合标准工作溶液中，9种N-亚硝胺的浓度是一致的；

(C)以乙腈与水的混合液作为溶剂，所述乙腈在溶剂中的体积浓度为10％～90％(较佳为50％)；

(D)用上述步骤C所得溶剂将亚硝胺的混合标准工作溶液溶解，配制成0.01～0.40μg/mL梯度的标准工作溶液(例如为0.01、0.05、0.1、0.2、0.4μg/mL)；

4)、将梯度标准溶液注入液相色谱-串联质谱仪，正离子多反应监测(MRM)模式测定，确定各亚硝胺的出峰位置，记录定量离子对的峰面积，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，制作标准曲线方程；

备注说明：所述浓度是指在“N-亚硝胺”在“梯度标准溶液”中的浓度，即，在上述步骤D中所设定的浓度。

5)、取步骤2)所得的上层清液/滤液替代上述步骤4)中的梯度标准溶液，其余按照步骤4)所述方法测定上层清液/滤液中9种N-亚硝胺的峰面积，按照步骤4)所得的标准曲线方程计算，得到上层清液/滤液中9种N-亚硝胺的各自含量，最终获得待测样品中9种N-亚硝胺的各自含量。

备注说明：上述步骤5)中的“按照步骤4)所得的标准曲线方程计算，得到上层清液/滤液中9种N-亚硝胺的各自含量，最终获得待测样品中9种N-亚硝胺的各自含量”属于本行业的常规技术。

作为本发明的适用于食品接触类橡胶制品中9种N-亚硝胺的同时检测方法的改进：所述9种N-亚硝胺为：N-亚硝基二甲胺、N-亚硝基甲基乙基胺、N-亚硝基吗啉、N-亚硝基哌啶、N-亚硝基吡咯烷、亚硝基-二乙基胺、N-亚硝基二丁胺、二丙基亚硝胺、N-亚硝基二苯胺。

作为本发明的适用于食品接触类橡胶制品中9种N-亚硝胺的同时检测方法的改进：所述步骤4)中：

液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)检测用的液相色谱条件为：流速：0.2～0.8mL/min(较佳为0.3mL/min)；柱温：20～45℃(较佳为40℃)；进样体积：1～10μL(较佳为5μL)；流动相由乙腈和体积浓度为0.05～0.5％(较佳为0.1％)的甲酸水溶液组成；乙腈为流动相A，体积浓度为0.05～0.5％(较佳为0.1％)的甲酸水溶液为流动相B；

梯度洗脱程序为：

0～4.5min时，10％A～90％A；4.5～4.6min时，90％A～10％A；

液相色谱-串联质谱检测用的质谱条件为：离子源为电喷雾离子源(ESI)；检测方式为正离子多反应监测(MRM)模式；毛细管电压为2～4kV(较佳为3kV)；离子源温度为80～150℃(较佳为140℃)；脱溶剂气温度为150～380℃；脱溶剂气流速为200～800L/h(较佳为600L/h)；锥孔反吹气流速为10～60L/h(较佳为50L/h)；离子驻留时间均为0.03～0.2s；锥孔电压为10～40V；碰撞电压5～30V；

N-亚硝基二甲胺(NDMA)的定量离子对为74.95＞43.06，定性离子对为74.95＞32.97；

N-亚硝基吗啉(NMOR)的定量离子对为116.96＞86.8，定性离子对为116.96＞44.96；

N-亚硝基二苯胺(NPYL)的定量离子对为100.97＞55.11，定性离子对为74.95＞59.01；

N-亚硝基甲基乙基胺(NMEL)的定量离子对为88.9＞60.99，定性离子对为88.9＞43.93；

亚硝基-二乙基胺(NDEA)的定量离子对为103.14＞75.17，定性离子对为103.14＞47；

N-亚硝基哌啶(NPIP)的定量离子对为115.08＞69.1，定性离子对为115.08＞41.19；

二丙基亚硝胺(NDPA)的定量离子对为130.9＞43.05，定性离子对为130.9＞88.88；

N-亚硝基二丁胺(NDBA)的定量离子对为159.13＞57.09，定性离子对为159.13＞103.01；

N-亚硝基吡咯烷(NDPL)的定量离子对为199.21＞169.08，定性离子对为199.21＞65.97。

具体而言：9种亚硝胺的质谱选择离子参数与检测低限如下表2所示。

表2.9种亚硝胺的质谱选择离子参数与检测低限表

注：*离子对用于定量。

作为本发明的适用于食品接触类橡胶制品中9种N-亚硝胺的同时检测方法的改进：液相色谱柱为：AcquityHSS T3，1.8μm，2.1×50mm或相当者。

作为本发明的适用于食品接触类橡胶制品中9种N-亚硝胺的同时检测方法的改进：所步骤3)中(具体为步骤3)中的步骤(A)和步骤(B))的有机溶剂为甲醇、乙腈。

作为本发明的适用于食品接触类橡胶制品中9种N-亚硝胺的同时检测方法的改进：所步骤1)中，将待测样品剪碎成10mm×10mm的小片，作为试样。

在本发明中，人工模拟唾液是“参照GB/T18886-2002”配制而得的，配方具体如下：乳酸(CH₃CH(OH)COOH)3.0g；尿素(H₂NCONH₂)0.2g；氯化钠(NaCl)4.5g；氯化钾(KCl)0.3g；硫酸钠(Na₂SO₄)0.3g；氯化铵0.4g，用蒸馏水定容为1L。

本发明与现有技术相比具有以下显著效果：

(1)采用电喷雾离子源(ESI)检测方式的LC-MS/MS方法能够准确定性、定量，灵长度高的特点，直接进行测定，所得结果比气相色谱-质谱更准确可靠。

(2)本方法利用超高效液相色谱(UPLC)系统的特有超高压优势和HSS T3柱具备小颗粒的所有潜能和优势以及亲水性的特点，它完全兼容纯水相流动相，具有极低的键合相流失，LC-MS本底信号极低，特别对极性化合物在提高分离度的同时获得更快的分析速度，由于色谱峰变得更窄，峰高也就更高了，从而获得了更高的灵敏度。采用电喷雾正离子模式，采用7个通道分别分时段同时采集的不同N-亚硝胺的总离子流色谱图，大大提高了方法的检测灵敏度。

(3)本发明公开的测定方法在0.01～0.4μg/mL线性关系较好，线性相关系数为0.99以上，方法最低检出限为0.01μg/kg，远低于采用GC-MS方法的GB/T24153-2009，也低于采用大气压化学电离(APCI)检测方式的LC-MS/MS方法EN71-12:2013。

总体而言，本发明所述的样品提取方法为人工模拟唾液体系进行迁移，迁移物采用二氯甲烷进行提取，采用LC-MS/MS法对提取液进行测定，液相色谱条件采用常用的乙腈和甲酸水溶液，采用梯度洗脱方式在4.6分钟内将目标物与其他成份进行有效分离，远低于GB/T24153-2009方法的26分钟，以及EN71-12:2013的14.5分钟，达到快速测定的目的，对食品接触类橡胶制品中N-亚硝胺能同时进行准确的定性、定量确证，最低测定低限0.01μg/kg，最高测定低限为0.52μg/kg，远远低于GB/T24153-2009方法的检测低限0.5mg/kg和EN71-12:2013方法的检测低限1μg/L，先进性与创新性非常明显。

备注说明：GB/T24153-2009采用甲醇超声波提取，C₁₈固相萃取小柱净化，GC-MS测定，测定低限为0.5mg/kg；BS EN12868采用人工唾液进行模拟迁移后，用二氯甲烷提取，气相色谱(GC)热能检测器测定，对N-亚硝胺的测定低限为0.01mg/kg，对亚硝胺类物质的测定低限为0.1mg/kg。EN-71-12:2013采用人工唾液进行模拟迁移，用氢氧化钠溶液调节pH值后，用带大气压电离离子源(APCI)的液相色谱-串联质谱仪直接进行测定，测定低限为1μg/L。而本发明采用人工唾液进行模拟迁移，用氢氧化钠溶液调节pH值后，用二氯甲烷提取，浓缩、定容后，用带电喷雾离子源(ESI)的液相色谱-串联质谱仪进行测定，每种物质采用一对定量离子对和一对定性离子对同时进行测定，既能准备定性，又能准确对测定物质进行定量，方法灵敏度高，最低测定低限0.01μg/kg，最高测定低限为0.52μg/kg，具有明显的先进性。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1是9种亚硝胺的液相色谱-串联质谱总离子流色谱图；

按保留时间从小到大的顺序，从下至上分别为：N-亚硝基二甲胺(NDMA)、N-亚硝基吗啉(NMOR)、N-亚硝基二苯胺(NPYL)、N-亚硝基甲基乙基胺(NMEL)、亚硝基-二乙基胺(NDEA)和N-亚硝基哌啶(NPIP)、二丙基亚硝胺(NDPA)、N-亚硝基二丁胺(NDBA)和N-亚硝基吡咯烷(NDPL)；

备注说明：(NDEA)和N-亚硝基哌啶(NPIP)的出峰时间较为接近，色谱峰较难分开，在同一通道进行采集；N-亚硝基二丁胺(NDBA)和N-亚硝基吡咯烷(NDPL)的出峰时间较为接近，色谱峰能够完全分开，为了测定方便，仍在同一通道进行采集。

图2～图8是9种亚硝胺的液相色谱-串联质谱多反应离子监测质谱图。

具体如下：

图2是通道1中NDMA的液相色谱-串联质谱多反应监测质谱图；

上图为N-亚硝基二甲胺(NDMA)的定量离子对质谱图，下图为N-亚硝基二甲胺(NDMA)的定性离子对质谱图；

图3是通道2中NMOR的液相色谱-串联质谱多反应监测质谱图；

上图为N-亚硝基吗啉(NMOR)的定量离子对质谱图，下图为N-亚硝基吗啉(NMOR)的定性离子对质谱图；

图4是通道3中NPYL的液相色谱-串联质谱多反应监测质谱图；

上图为N-亚硝基二苯胺(NPYL)的定量离子对质谱图，下图为N-亚硝基二苯胺(NPYL)的定性离子对质谱图；

图5是通道4中NMEL的液相色谱-串联质谱多反应监测质谱图；

上图为N-亚硝基甲基乙基胺(NMEL)的定量离子对质谱图，下图为N-亚硝基甲基乙基胺(NMEL)的定性离子对质谱图；

图6是通道5中NDEA和NPIP的液相色谱-串联质谱多反应监测质谱图；

从上至下分别为：N-亚硝基哌啶(NPIP)的定量离子对质谱图，N-亚硝基哌啶(NPIP)的定性离子对质谱图；亚硝基-二乙基胺(NDEA)的定量离子对质谱图，亚硝基-二乙基胺(NDEA)的定性离子对质谱图；

图7是通道6中NDPA的液相色谱-串联质谱多反应监测质谱图；

上图为二丙基亚硝胺(NDPA)的定性离子对质谱图，下图为二丙基亚硝胺(NDPA)的定量离子对质谱图；

图8是通道7中NDBA和NDPL的液相色谱-串联质谱多反应监测质谱图；

从上至下分别为：N-亚硝基吡咯烷(NDPL)的定量离子对质谱图和定性离子对质谱图；N-亚硝基二丁胺(NDBA)的定性离子对质谱图和定量离子对质谱图。

具体实施方式

以下结合实施例和对比例对本发明进行阐述，然而本发明的保护范围并非仅仅局限于以下实施例。所属技术领域的普通技术人员依据本发明公开的内容，均可实现本发明的结果。1试剂和材料

除非另有说明，在分析中所用试剂均为HPLC级，所有用水均为一级水。

1.1甲醇：HPLC级。

1.2乙腈：HPLC级。

1.3二氯甲烷：HPLC级。

1.4甲酸：HPLC级，纯度≥96％。

1.50.1％(体积％)甲酸溶液：量取1mL甲酸，用水定容为1L。以下简称：0.1％甲酸。

1.6乳酸：AR级。

1.7尿素：AR级。

1.8氯化钠：AR级。

1.9氯化钾：AR级。

1.10无水硫酸钠：AR级。

1.11氯化铵：氯化铵。

1.12人工模拟唾液(g/L)配方参照GB/T18886-2002：乳酸(CH3CH(OH)COOH)3.0g；尿素(H₂NCONH₂)0.2g；氯化钠(NaCl)4.5g；氯化钾(KCl)0.3g；硫酸钠(Na2SO4)0.3g；氯化铵0.4g，用蒸馏水定容为1L。

1.130.22μm过滤膜。

1.14标准品(9种亚硝胺，见表1)。

1.15标准储备溶液

用乙腈分别将表1中的亚硝胺标准物质溶解，配制成浓度均为100μg/mL的9种标准储备溶液；

注：标准储备溶液在0℃～4℃冰箱中保存有效期为12个月。

1.16工作溶液：

用乙腈将上述亚硝胺的9种标准储备溶液溶解，配制成9种N-亚硝胺的浓度均为1～10μg/mL的混合标准工作溶液。

用乙腈+水(1+1，v/v)将标准储备溶液稀释成浓度为0.01，0.05，0.1，0.2，0.4μg/mL的混合标准工作溶液，现配现用。

备注说明：

乙腈+水(1+1，v/v)，即，由该乙腈+水所得的混合液中，乙腈的体积浓度为50％。

以0.01μg/mL为例，即，在该稀释后的混合标准工作溶液中，9种N-亚硝胺的浓度均分别为0.01μg/mL。

2设备和仪器

2.1 超高压液相色谱-串联质谱联用仪(UPLC-MS/MS)：配有ESI离子源。

2.2 恒温水浴器。

2.3 分流漏斗振荡器。

2.4 离心机。

2.5 旋转蒸发浓缩仪。

2.6 天平：精确至0.001g和0.0001g。

2.7 离心管：具塞，50mL。

2.8 其他玻璃器皿。

实施例1、一种适用于食品接触类橡胶制品中9种N-亚硝胺的同时检测方法，包括以下步骤：

1)、制备人工模拟唾液：

人工模拟唾液(g/L)配方参照GB/T18886-2002：乳酸(CH₃CH(OH)COOH)3.0g；尿素(H₂NCONH₂)0.2g；氯化钠(NaCl)4.5g；氯化钾(KCl)0.3g；硫酸钠(Na₂SO₄)0.3g；氯化铵0.4g，用蒸馏水定容为1L；

2)、迁移体系的建立

取待测样品，将其剪碎成约10mm×10mm小片，混匀，作为试样。

称取10.0g试样，精确至0.01g，置于具塞锥形瓶中，加入60.0mL人工唾液浸没样品，37℃水浴静置36小时；过滤，得迁移提取液；

3)、制备待测样品溶液

(1)取全部的迁移提取液转入分液漏斗，加入1mL的1mol/L的NaOH溶液；再加入30mL二氯甲烷振荡提取10分钟，静置10分钟，将下层萃取液过无水硫酸钠层，收集于平底烧瓶中(备注说明：若下层萃取液不能形成清晰溶液，而成为乳浊液，可通过4000rpm离心3分钟处理)。再加入20mL二氯甲烷到分液漏斗，对上层溶液重复提取一次(即，重复上述“提取10分钟，静置10分钟，将下层萃取液过无水硫酸钠层，收集)。合并两次提取液(即，合并两次萃取液)。

(2)将步骤(1)收集的提取液(萃取液)在旋转蒸发仪上40℃减压浓缩近干，用乙腈+水(1+1，v/v)准确定容至2mL；得提取定容混合液；

所述乙腈+水(1+1，v/v)，即为乙腈与水按照1:1的体积比混合而得的混合溶液；

(3)取上述提取定容混合液过0.22μm过滤膜，所得的滤液置于进样瓶中密封，目的是供LC-MS/MS进行定性、定量分析；

上述离心一般为高速离心，例如8000转/分钟；

4)、制备标准溶液

(1)用乙腈分别将表1中的9种亚硝胺标准物质溶解，从而分别配制成浓度均分别为100μg/mL的9种N-亚硝胺的标准储备溶液；

(2)用乙腈将上述亚硝胺的标准储备溶液溶解，配制成9种N-亚硝胺的浓度均为10μg/mL的混合标准工作溶液；

(3)以乙腈+水(1+1，v/v)的混合液作为溶剂，将亚硝胺的标准储备溶液溶解，配制成0.01，0.05，0.1，0.2，0.4μg/mL等5个浓度的梯度标准溶液。

备注说明：即，上述溶剂中乙腈的体积浓度为50％。

5)、将上述梯度标准溶液注入液相色谱-串联质谱仪，正离子多反应监测(MRM)模式测定，确定亚硝胺出峰位置，记录定量离子对的峰面积，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，制作标准曲线方程。具体如下：

(1)液相色谱条件为：

色谱柱：AcquityHSS T3，1.8μm，2.1×50mm或相当者；

柱温：40℃；

进样体积：5μL；

流动相由乙腈(又称流动相A)和0.1％甲酸(又称流动相B)组成；梯度洗脱程序见表3：

表3.液相色谱流动相洗脱梯度表

Time(min)	flow(ml/min)	乙腈	0.1％甲酸	梯度曲线
					0	0.3	10	90	initial
4.5	0.3	90	10	6
					4.6	0.3	10	90	6

(2)质谱条件为：

A)离子源：电喷雾离子源；

B)检测方式：正离子多反应监测(MRM)模式；

C)毛细管电压：3KV(负离子)；

D)离子源温度：140℃；

E)脱溶剂气温度:380℃；

F)脱溶剂气流速：600L/h；

G)锥孔反吹气流速：50L/h；

H)其他质谱条件参见表2。

本发明公开的液相色谱-串联质谱法在浓度为0.01，0.05，0.1，0.2，0.4μg/mL时，9种亚硝胺线性关系均较好，见表4。

表4.液相色谱-串联质谱法测定9种亚硝胺的线性方程与线性相关系数

化合物	线性方程	线性相关系数(r²)	LOD(μg/kg)
				N-亚硝基二甲胺(NDMA)	y＝29517.1x+1618.4	0.996261	0.45
N-亚硝基吗啉(NMOR)	y＝28861.8x+5.1	0.999403	0.04
				N-亚硝基二苯胺(NPYL)	y＝87559.8x+156.2	0.999873	0.47
N-亚硝基甲基乙基胺(NMEL)	y＝9546.5x-16.4	0.998608	0.33
				亚硝基-二乙基胺(NDEA)	y＝1321.9x-1.0	0.999322	0.52
N-亚硝基哌啶(NPIP)	y＝25356.8x+80.0	0.999692	0.31
				二丙基亚硝胺(NDPA)	y＝45362.7x-81.9	0.999744	0.45
N-亚硝基二丁胺(NDBA)	y＝218624x+213.6	0.999980	0.02
				N-亚硝基吡咯烷(NDPL)	y＝254253x+778.9	0.999438	0.01

备注说明：

上述表4中，x代表浓度，μg/mL，y代表峰面积。

6)、取步骤3)所得的滤液按步骤5)方法测定待测样品溶液中的亚硝胺(即以5μL的滤液替代5μL的梯度标准溶液，其余等同)，利用所建立的标准曲线(线性方程)，得液液中亚硝胺含量；再根据样品稀释倍数(即样品1g与滤液之间的换算关系)；得到待测样品中的亚硝胺含量。

7)、定性分析

对应步骤6)，在相同试验条件下，样品中待测物与同时检测的标准物质具有相同的保留时间，且样品定性离子的相对丰度与浓度接近的标准溶液谱图中对应的定性离子的相对丰度进行比较，若偏差不超过表5规定的范围，则可判定样品中存在对应的待测物。

表5.定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差

相对离子丰度，％	＞50	＞20～50	＞10～20	≤10
					允许的最大偏差，％	±20	±25	±30	±50

8)、定量分析

对应步骤6)，本方法采用外标法定量，根据样液中被测物质含量情况，选定浓度相近的标准工作溶液，对标准工作溶液与样液等体积参插进样测定，标准工作溶液和待测样液中亚硝胺的响应值均应在仪器的线性范围内。

注1：如果样液的检测响应值超出仪器检测的线性范围，可适当稀释后测定。

注2：在上述色谱条件下，亚硝胺的液相色谱-串联质谱总离子流色谱图及多反应离子监测(MRM)质谱图参见图1～8。

9)、检测低限

以3倍信噪比(S/N＝3)确定最低检出浓度，本方法对食品接触类橡胶制品中N-亚硝胺的测定低限见表4。

实验1、样品添加回收率实验及精密度实验

用事先用本发明方法确认已知仅含有0.67mg/kg N-亚硝基二甲胺(NDMA)的乳胶奶嘴，加入亚硝胺混合标准溶液进行了添加回收率试验，使其在样品中的浓度分别为0.5mg/kg、1.0mg/kg和2.0mg/kg，每组重复6次，得到的样品添加回收率试验对应的样品浓度见表6。

表6、乳胶奶嘴样品中添加回收率试验对应的样品浓度(n＝6)

实验2、实际样品检测

将乳胶奶嘴按上述操作步骤，进行迁移、提取、浓缩、定容，每个样品平行6次，用液相色谱-串联质谱法进行测定，得到的样品测定结果见表7。

表7、乳胶奶嘴样品测定结果(n＝6)

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims

1.适用于食品接触类橡胶制品中9种N-亚硝胺的同时检测方法，其特征在于包括以下步骤：

1)、迁移体系的建立：

将待测样品剪碎后，作为试样；

称取10g试样加入40～80.0mL人工唾液从而浸没试样，于35～40℃水浴静置12～36小时，过滤，得迁移提取液；

2)、制备待测样品溶液：

(A)将步骤1)所得的全部迁移提取液转入分液漏斗，先加入1～5mL的0.1～5mol/L的NaOH溶液；再加入10～50mL二氯甲烷振荡提取5～10分钟，静置1～10分钟，将下层萃取液过无水硫酸钠层，收集；再加入10～50mL二氯甲烷到分液漏斗，对上层溶液进行重复提取一次；合并两次萃取液；

(B)将步骤(A)收集所得的萃取液在旋转蒸发仪上30～50℃减压浓缩近干，用乙腈与水按照1:1的体积比混合而得的混合溶液定容至1～10mL的整数刻度值，得提取定容混合液；

(C)取上述提取定容混合液离心，或过0.22μm过滤膜；所得的上层清液/滤液置于进样瓶中密封；

上述离心为6000～20000转/分钟的高速离心；

3)、制备标准溶液：

(C)以乙腈与水的混合液作为溶剂，所述乙腈在溶剂中的体积浓度为10％～90％；

(D)用上述步骤C所得溶剂将亚硝胺的混合标准工作溶液溶解，配制成0.01～0.40μg/mL梯度的标准工作溶液；

4)、将梯度标准溶液注入液相色谱-串联质谱仪，正离子多反应监测模式测定，确定各亚硝胺的出峰位置，记录定量离子对的峰面积，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，制作标准曲线方程；

2.根据权利要求1所述的适用于食品接触类橡胶制品中9种N-亚硝胺的同时检测方法，其特征是：所述9种N-亚硝胺为：N-亚硝基二甲胺、N-亚硝基甲基乙基胺、N-亚硝基吗啉、N-亚硝基哌啶、N-亚硝基吡咯烷、亚硝基-二乙基胺、N-亚硝基二丁胺、二丙基亚硝胺、N-亚硝基二苯胺。

3.根据权利要求2所述的适用于食品接触类橡胶制品中9种N-亚硝胺的同时检测方法，其特征是：所述步骤4)中：

液相色谱-串联质谱检测用的液相色谱条件为：流速：0.2～0.8mL/min；柱温：20～45℃；进样体积：1～10μL；流动相由乙腈和体积浓度为0.05～0.5％的甲酸水溶液组成；乙腈为流动相A，体积浓度为0.05～0.5％的甲酸水溶液为流动相B；

梯度洗脱程序为：

0～4.5min时，10％A～90％A；4.5～4.6min时，90％A～10％A；

液相色谱-串联质谱检测用的质谱条件为：离子源为电喷雾离子源；检测方式为正离子多反应监测模式；毛细管电压为2～4kV；离子源温度为80～150℃；脱溶剂气温度为150～380℃；脱溶剂气流速为200～800L/h；锥孔反吹气流速为10～60L/h；离子驻留时间均为0.03～0.2s；锥孔电压为10～40V；碰撞电压5～30V；

N-亚硝基二甲胺的定量离子对为74.95＞43.06，定性离子对为74.95＞32.97；

N-亚硝基吗啉的定量离子对为116.96＞86.8，定性离子对为116.96＞44.96；

N-亚硝基二苯胺的定量离子对为100.97＞55.11，定性离子对为74.95＞59.01；

N-亚硝基甲基乙基胺的定量离子对为88.9＞60.99，定性离子对为88.9＞43.93；

亚硝基-二乙基胺的定量离子对为103.14＞75.17，定性离子对为103.14＞47；

N-亚硝基哌啶的定量离子对为115.08＞69.1，定性离子对为115.08＞41.19；

二丙基亚硝胺的定量离子对为130.9＞43.05，定性离子对为130.9＞88.88；

N-亚硝基二丁胺的定量离子对为159.13＞57.09，定性离子对为159.13＞103.01；

N-亚硝基吡咯烷的定量离子对为199.21＞169.08，定性离子对为199.21＞65.97。

4.根据权利要求3所述的适用于食品接触类橡胶制品中9种N-亚硝胺的同时检测方法，其特征是：所述液相色谱柱为：AcquityHSS T3，1.8μm，2.1×50mm。

5.根据权利要求4所述的适用于食品接触类橡胶制品中9种N-亚硝胺的同时检测方法，其特征是：所述步骤3)中的有机溶剂为甲醇、乙腈。

6.根据权利要求5所述的适用于食品接触类橡胶制品中9种N-亚硝胺的同时检测方法，其特征是：所述步骤1)中，将待测样品剪碎成10mm×10mm的小片，作为试样。