CN103185762A - 一种分析测定食品中多种内分泌干扰物的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于食品检验领域，涉及食品内内分泌干扰物的分析测定方法，具体涉及一种分析测定奶粉和液态奶中多种内分泌干扰物的方法。本发明采用水溶解样品，加入与水混溶的有机溶剂超声提取待测物后，加入钠盐，使有机溶剂与水相分离，实现液液萃取；取定量有含有待测物的机溶剂，经C18填料的固相萃取净化，丹酰氯衍生后，用超高效液相色谱串联四极杆飞行时间质谱仪同时分析测定食品中26种4类内分泌干扰物。本发明方法能弥补现有技术中不能实现一次色谱进样同时分析食品中多种内分泌干扰物的缺陷，同时能提高四极杆飞行时间质谱仪的灵敏度，实现食品中内分泌干扰物四极杆飞行时间质谱仪的准确分析。

Description

一种分析测定食品中多种内分泌干扰物的方法

技术领域

本发明属于食品检验领域，涉及食品内内分泌干扰物的分析测定方法，具体涉及一种分析测定奶粉和液态奶中多种内分泌干扰物的方法。尤其是采用固相萃取-超高效液相色谱串联四极杆飞行时间质谱分析方法同时分析奶粉和液态奶中26种4类内分泌干扰物的方法。

背景技术

研究显示，内分泌干扰物能够干扰内分泌系统，给动物或者人造成有害影响的往往是自然的或者与人类活动相关的化合物。据文献报道，暴露于内分泌干扰物与性早熟，前列腺癌，子宫癌和乳腺癌等激素相关疾病的发生有关。食品是人们暴露于内分泌干扰物的重要途径。牛奶和奶制品作为日常生活中重要的食品之一，其安全受到人们的强烈关注。然而，据调查，奶牛的现代养殖为了提高牛奶产量，需要使奶牛不断的受孕，尽可能延长产奶期，同时缩短干涸期，这种养殖方式导致了大部分牛奶来自于怀孕中奶牛，因此有可能使牛奶中的内性激素(孕激素、雄激素和雌激素、)的含量增加。有报道，牛奶的消费量与卵巢癌、乳腺癌和前列腺有关，同时已在牛奶或者奶制品中检测出孕酮、雄烯二酮、雌酮和雌二醇等内源性激素。烷基酚类(如辛基酚和壬基酚)和双酚A是常用的工业原料，主要用于烷基酚聚氧乙烯醚，环氧树脂和聚碳酸酯的生产，最终制成产品，如婴儿奶瓶等。该些产品在反复使用或者加热等因素的作用下，可直接或者降解后释放出烷基酚单体和双酚A进入到食品中。有研究在牛奶，奶粉和婴儿配方食品中已经检测出壬基酚和双酚A等酚类。为保障牛奶及其奶制品的安全，评价人群通过食品暴露于内分泌干扰物的程度，探讨内分泌干扰物与疾病的关系，建立牛奶和奶制品中多种内分泌干扰物的有效分析方法是第一步。

目前，食品中内分泌干扰物的分析方法主要为气相色谱质谱联用法和液相色谱三重四极杆质谱联用法。由于气相色谱质谱联用法在分析内分泌干扰物时需要衍生化，而且灵敏度低于液相色谱三重四极杆质谱联用法，所以前者在食品内分泌干扰物分析中的地位，正在逐步被后者取代。液相色谱三重四极杆质谱联法在分析孕激素和雄激素时，一般在离子源为阳离子模式下分析，采用的流动相为甲醇和水，可以加甲酸或者不加；而在雌激素和酚类(烷基酚和双酚A)分析时，一般在离子源为阴离子模式下分析，采用的流动相为乙腈和水，可以加氨水或者不加。然而，在研究中需要同时分析孕激素、雄激素、雌激素和酚类时，是将它们分为2组，即孕激素、雄激素与雌激素和酚类，按上述分析方法分2次测定，既耗时又费溶剂。

三重四极杆在定量分析时，通常采用多反应监测模式用以获得较高的灵敏度，然而在此模式下检测离子以外的用于结构解释的碎片离子信息被丢弃；而在离子全扫描模式下，又损失较大的灵敏度。四极杆飞行时间质谱仪可以较高灵敏度获得全部碎片离子的精确分子量，克服了三重四极杆不能兼顾结构解释和灵敏度的困境。因此在定量分析中，四极杆飞行时间质谱仪也逐渐受到关注。然而，在食品内分泌干扰物分析中，由于内分泌干扰物的含量常常极低(ng/kg或者pg/kg级)，此浓度水平与四极杆飞行时间质谱仪的检出限接近，四极杆飞行时间质谱仪难以准确分析食品中内分泌干扰物。因此，有关领域需要寻求及建立一次色谱进样实现上述4类内分泌干扰物同时准确分析测定的方法。尤其是改善四极杆飞行时间质谱仪灵敏度，以使其能适应食品中内分泌干扰物的准确分析。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种食品内内分泌干扰物的分析测定方法，具体涉及一种分析测定奶粉和液态奶中多种内分泌干扰物的方法。尤其是采用固相萃取-超高效液相色谱串联四极杆飞行时间质谱分析方法同时分析奶粉和液态奶中26种4类内分泌干扰物的方法。

本发明方法能弥补现有技术中不能实现一次色谱进样同时分析所述述4类内分泌干扰物的缺陷，同时能提高四极杆飞行时间质谱仪的灵敏度，实现食品中内分泌干扰物四极杆飞行时间质谱仪的准确分析。

本发明所述的奶粉和液态奶中26种4类内分泌干扰物包括下述10种雌激素包括雌三醇、β-雌二醇、α-雌二醇、马烯雌甾酮、17α-乙炔雌二醇、雌酮、己烯雌酚、己二烯雌酚、己烷雌酚和2-甲氧雌二醇；7种孕激素包括孕酮、醋酸甲地孕酮、醋酸氯地孕酮、炔诺酮、21α-羟孕酮、17α-羟孕酮和甲基炔诺酮；3种酚类包括双酚A、4-tert-丁基酚和4-tert-辛基酚；6种雄性激素包括睾酮、雄烯二酮、康力龙、甲睾酮、群勃龙和诺龙。

本发明采用下述技术方案分析测定食品中多种内分泌干扰物：

用水充分溶解样品，加入与水混溶的有机溶剂超声提取待测物后，加入钠盐，使有机溶剂与水相分离，实现液液萃取；取定量有含有待测物的机溶剂，经C18填料的固相萃取净化，丹酰氯衍生(使雌激素和酚类的离子化方式从阴离子模式转变为阴离子模式)后，超高效液相色谱串联四极杆飞行时间质谱仪分析。

具体而言，本发明的分析测定食品中多种内分泌干扰物的方法，其特征在于，其包括步骤：

1)样品前处理：

取一定量样品用水充分溶解后，加入有机溶剂超声提取待测物(如果为液态奶侧直接加入有机溶剂超声提取待测物)，加入钠盐，通过离心使水相与有机相分离；取含有待测物的有机溶剂提取液，用微氮气流吹至近干后，纯水复溶后，过C18填料固相萃取小柱，用乙腈水溶液洗脱待测物后；向洗脱液中加入钠盐，通过离心使乙腈与水相分离；取乙腈提取液，用微氮气流吹至近干后，用丹酰氯衍生在60℃反应一定时间得待测物，冷却至室温后，直接进样分析；

本发明所述待测物为雄激素、孕激素和丹酰化雌激素和酚类的溶液；尤其包括10种雌激素：雌三醇、β-雌二醇、α-雌二醇、马烯雌甾酮、17α-乙炔雌二醇、雌酮、己烯雌酚、己二烯雌酚、己烷雌酚和2-甲氧雌二醇；7种孕激素：孕酮、醋酸甲地孕酮、醋酸氯地孕酮、炔诺酮、21α-羟孕酮、17α-羟孕酮和甲基炔诺酮；3种酚类：双酚A、4-tert-丁基酚和4-tert-辛基酚；6种雄性激素：睾酮、雄烯二酮、康力龙、甲睾酮、群勃龙和诺龙。

本发明中，加入的钠盐为氯化钠或者硫酸钠，优选加入氯化钠；

本发明中，所说的有机溶剂选自乙腈或者丙酮，其中优选乙腈；

本发明中，所说的固相萃取乙腈洗脱溶液浓度为1；50-80，其中优选1∶60；

本发明中，所说的衍生化温度为60-80℃，其中优选60℃；

本发明中，所说的衍生化时间为10-30分钟，其中优选10分钟；

2)超高效液相色谱串联四极杆飞行时间质谱仪测定

色谱柱采用C18柱，流动相为10Mm的甲酸铵水溶液和乙腈溶液，离子源采用阳离子模式；

其中，色谱条件：色谱柱：C18(柱长：100mm柱内径：2.1mm填料粒径：1.7μm)；流动相：10mM的乙酸铵的甲醇和水；流速：0.3mL/min；梯度洗脱；色谱柱温度：40℃；进样量为：10μL；

质谱条件：电喷雾离子源(阳离子模式)；雾化气：氮气；碰撞气：氩气；毛细管电压：3.0kV；去溶剂气温度：400℃；去溶剂气流量：600L/h；源温度：120℃；采样锥电压：40V；锥孔气流量：40L/h。

3)计算浓度：

采用基质匹配内标法，以峰面积计算样品中26种内分泌干扰物的含量。

本发明方法的优点在于：

1，实现一次色谱进样同时分析4类内分泌干扰物，

2，同时能提高四极杆飞行时间质谱仪的灵敏度，实现食品中内分泌干扰物四极杆飞行时间质谱仪的准确分析。

为了便于理解，以下将通过具体的附图和实施例对本发明的分析测定食品中多种内分泌干扰物的方法进行详细地描述。需要特别指出的是，具体实例和附图仅是为了说明，显然本领域的普通技术人员可以根据本文说明，在本发明的范围内对本发明做出各种各样的修正和改变，这些修正和改变也纳入本发明的范围内。

附图说明

图1为雌激素母离子提取色谱图。

图2为雄激素和酚类母离子提取色谱图。

图3为孕激素母离子提取色谱图。

具体实施方式

实施例1 测定奶粉中26种内分泌干扰物

1，仪器和试剂：

ACQUITY超高效液相色谱仪(美国Waters)，SYNAPT G2高分辨率飞行时间质谱仪(美国Waters)，2200T超声波清洗器(上海安谱)，TGL-10B高速台式离心机(上海安亭)，KD200氮气吹扫仪(杭州奥盛)；12位固相萃取仪(德国CNW)；C18固相萃取柱(上海迪马，500mg，3mL)；LC-MS级乙腈(美国Fisher)，LC-MS级纯水(美国Fisher)，LC-MS级乙酸乙酯(美国Fisher)，优级纯氯化钠(上海国药集团)。

标准品：10种雌激素、7种孕激素和3种酚类均购于美国Sigma，6种雄激素购于德国Dr.Ehrenstorfer；标准品纯度均大于97.8％。标准储备溶液的配置：分别称取标准品10.0mg于10mL棕色容量瓶中，用甲乙腈定容之刻度，摇匀得到1.0mg/mL的标准溶液，于-20℃保存。混合标准工作溶液的配置：用乙腈/水(10/90，V/V)稀释标准储备液(1.0mg/mL)1000倍得到1ug/mL的混合标准溶液，然后逐级稀释得到所需的不同浓度的标准工作溶液。

2，分析方法

2.1 样品前处理

称取混匀的奶粉样品4.0g，置于50mL具塞塑料离心管中，加入10mL纯水，充分混匀，超声波提取10min后，加入20mL乙腈，振摇2min，再次超声波提取10min，然后加入3g氯化钠，振摇2min，离心10min(7000rpm)，取10mL上清液于5.0mL离心管中；加入3mL正己烷，振摇1min后，静置5min，去除上层正己烷，重复操作1次，下层乙腈提取液用微氮气流吹至近干(约剩余100μL)，剩余物用2mL纯水复溶后，待净化；

预先依次用6mL乙腈和5％乙腈水溶液活化平衡C18固相萃取小柱后，将上述2mL待净化液全部上柱，再用10mL60％乙腈水溶液洗脱待测物；上样和洗脱的流速控制在3mL/min；向洗脱液中加入1.5g氯化钠，振摇混匀静置分层后，取3mL上层乙腈，用氮气流吹至近干，剩余物用于丹酰氯衍生；

向上述剩余物中加入100μL碳酸钠缓冲溶液(pH＝10.0)和100μL丹酰氯丙酮溶液(1mg/mL)，漩涡混匀，60℃水浴条件下，反应20min，冷却至室温后，直接进样分析。

2.2 色谱条件和质谱条件

Waters ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱(100mm×2.1mm，1.8μm)；流动相：0.1％甲酸的水溶液(A)和0.1％甲酸的乙腈溶液(B)；梯度洗脱程序：0-1min内保持10％B，1-3min内10％B线性升至50％B，3-11min内50％B线性升至80％B，11-18min内80％B线性升至95％B，18-21min内95％B线性升至100％B，21-21.5min内100％B线性降至10％B，21.5-24min内保持10％B；流速：0.3mL/min；柱温：40℃；样品室温度：5℃；进样量：10μL。

ESI阳离子模式；毛细管电压3.0Kv；锥孔电压：40Kv；提取锥电压：4v；离子源温度：120℃；脱溶剂气(氮气)温度：400℃；锥孔气流量：40L/h；脱溶剂气流量：600L/h；碰撞气：氩气；MS模式采集参数：质量范围：100-800Da，扫描时间：0.2s。

2.3 标准曲线和检出限

用经检测26种内分泌干扰物含量均低于检出限的空白奶粉作为基质样品，按所述样品前处理方法得到经C18固相萃取净化后的乙腈样品处理液。将标准曲线的6个浓度水平制备在6份完全相同的3mL该处理液中，之后的衍生、分析与样品的操作一致。6个浓度水平分别为0.5、1.0、2.0、5.0、20和100ng/mL。各浓度水平内标浓度均为5.0ng/mL。标准曲线的绘制是基于在MS模式下提取窗口为0.02Da的母离子的提取色谱图峰面积。以各待测物的母离子色谱峰面积与内标母离子色谱峰面积之比乘以内标的质量浓度(Y)为纵坐标，各待测物的质量浓度(X)为横坐标绘制内标法校准曲线。以3倍信噪比(S/N)对应的样品中待测物浓度作为检出限(LOD)，10倍信噪比(S/N)对应的样品中待测物浓度作为定量限(LOQ)，获得各待测物的检出限和定量限。结果显示(如表1所示)，相关系数均大于0.995，定量限和检出限分别为0.007-0.2μg/kg和0.002-0.05μg/kg。

表1 26种内分泌干扰物的线性方程、相关系数、检出限和定量限

2.4 准确度和精密度

在空白奶粉中添加低中高不同浓度水平的26种内分泌干扰物，添加水平为0.5、5和20μg/kg，每个水平重复5次，用基质内标法测定回收率和精密度，结果如表2所示，回收率为82％～118％，精密度相对标准偏差为1.4％～18.6％。

表2 以基质内标法测定空白样品中添加26种内分泌干扰物的回收率和相对标准偏差(n＝5)

利用本方法对所购买的4种常见不同品牌的4份奶粉(适用对象为0～3岁的婴儿和幼儿)进行分析测定，结果显示，4份奶粉样品中均检测出孕酮和雄烯二酮，浓度分别为1.2-32.0μg/kg(平均为10.7μg/kg)和0.29-1.2μg/kg(平均为0.83μg/kg)。图1显示了加标样品母离子提取色谱图(加标量为20μg/kg)。

实施例2 测定纯牛奶中26种内分泌干扰物

1，仪器和试剂与实施例1相同。

2，分析方法：除在样品前处理里“取混匀的牛奶样品10mL，置于50mL具塞塑料离心管中，加入20mL乙腈，振摇2min，超声波提取10min……”与实施例1不同外，其余步骤与实施例1相同。

3，样品测定的结果

采用本发明方法对购买的3种常见不同品牌的3份全脂牛奶进行分析测定，结果显示，3份牛奶样品中均检测出孕酮和雄烯二酮，浓度分别为8.1-12.7μg/L(平均为10.1μg/L)和0.39-0.79μg/L(平均为0.61μg/L)。

Claims (10)

1.一种分析测定食品中多种内分泌干扰物的方法，其特征在于，该方法中，采用水溶解样品，加入与水混溶的有机溶剂超声提取待测物后，加入钠盐，使有机溶剂与水相分离，实现液液萃取；取定量有含有待测物的机溶剂，经C18填料的固相萃取净化，丹酰氯衍生后，用超高效液相色谱串联四极杆飞行时间质谱仪分析测定食品中多种内分泌干扰物。

2.按权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的多种内分泌干扰物为奶粉和液态奶中26种4类内分泌干扰物，包括雌三醇、β-雌二醇、α-雌二醇、马烯雌甾酮、17α-乙炔雌二醇、雌酮、己烯雌酚、己二烯雌酚、己烷雌酚和2-甲氧雌二醇；孕酮、醋酸甲地孕酮、醋酸氯地孕酮、炔诺酮、21α-羟孕酮、17α-羟孕酮和甲基炔诺酮；双酚A、4-tert-丁基酚和4-tert-辛基酚；睾酮、雄烯二酮、康力龙、甲睾酮、群勃龙和诺龙。

3.按权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的方法其包括步骤：

1)样品前处理：

取样品用水充分溶解后，加入有机溶剂超声提取待测物，加入钠盐，离心使水相与有机相分离；取含有待测物的有机溶剂提取液，用微氮气流吹至近干后，纯水复溶，过C18填料固相萃取小柱，用乙腈水溶液洗脱待测物；向洗脱液中加入钠盐，离心使乙腈与水相分离；取乙腈提取液，用微氮气流吹至近干，用丹酰氯衍生在60℃反应得待测物，冷却至室温后，直接进样分析；

2)超高效液相色谱串联四极杆飞行时间质谱仪测定：

色谱柱采用C18柱，流动相为10Mm的甲酸铵水溶液和乙腈溶液，离子源采用阳离子模式；

其中，色谱条件：色谱柱：C18；柱长：100mm；柱内径：2.1mm；填料粒径：1.7μm；流动相：10mM的乙酸铵的甲醇和水；流速：0.3mL/min；梯度洗脱；色谱柱温度：40℃；进样量为：10μL；

质谱条件：电喷雾离子源采用阳离子模式；雾化气：氮气；碰撞气：氩气；毛细管电压：3.0kV；去溶剂气温度：400℃；去溶剂气流量：600L/h；源温度：120℃；采样锥电压：40V；锥孔气流量：40L/h。

3)计算浓度：

采用基质匹配内标法，以峰面积计算样品中26种内分泌干扰物的含量。

4.按权利要求1或2或3所述的方法，其特征在于，所述的有机溶剂选自乙腈或者丙酮。

5.按权利要求1或2或3所述的方法，其特征在于，所述的钠盐选自氯化钠或者硫酸钠。

6.按权利要求1或2或3所述的方法，其特征在于，所述的钠盐选自氯化钠。

7.按权利要求1或2或3所述的方法，其特征在于，所述的固相萃取乙腈洗脱液浓度为1∶50-80。

8.按权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的固相萃取乙腈洗脱液浓度为1∶60。

9.按权利要求1或2或3所述的方法，其特征在于所述的衍生化温度为60-80℃。

10.按权利要求1或2或3所述的方法，其特征在于，所述的衍生化时间为10-30分钟。

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