CN106018612A - 一种环境与食品中多种内分泌干扰物的检测分析方法 - Google Patents

一种环境与食品中多种内分泌干扰物的检测分析方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于分析化学技术领域，具体涉及一种环境与食品中多种内分泌干扰物的检测分析方法，该检测分析方法利用4’‑碳酰氯‑罗丹明作为衍生试剂，超声辅助‑原位衍生‑分散液液微萃取联合超高效液相色谱三重四极杆质谱检测的多种内分泌干扰物进行分析。本发明首次使用含有一个分子内永久正电荷的4’‑碳酰氯‑罗丹明作为衍生试剂，测定23种内分泌干扰物，采用串联质谱多反应监测模式，结合内标法定量，该方法环境友好、简单快速、灵敏度高、选择性好，回收率结果良好，且有效降低了实际样品的基质干扰。本方法适用于多种环境和食品样品中内分泌干扰物的检测分析，对于环境和食品的监督和评价提供了一种准确、可靠的技术手段。

Description

一种环境与食品中多种内分泌干扰物的检测分析方法
技术领域
本发明属于分析化学技术领域,具体涉及一种环境与食品中多种内分泌干扰物的检测分析方法，尤其是涉及一种利用4’-碳酰氯-罗丹明作为衍生试剂，超声辅助-原位衍生-分散液液微萃取联合超高效液相色谱三重四极杆质谱检测的多种内分泌干扰物分析方法。
背景技术
内分泌干扰物 (Endocrine disruptors chemicals，EDCs)，又称环境雌激素，是一类能模拟和干扰人或动物体内雌激素的正常合成、运输、结合等过程的外源性干扰物质，主要包括生物体内存在的雌酮（E1）、17β-雌二醇（E2）、雌三醇（E3），以及人工合成的17α-乙炔雌二醇（EE2）、己烯雌酚（DES）、烷基酚、双酚A（BPA）、对羟基苯甲酸酯类、多氯联苯、多溴联苯、二恶英、邻苯二甲酸酯等相关化合物。近年来，因其分布广泛，能在极低的浓度产生内分泌干扰效应，已引起人们的广泛关注和深入研究。研究结果表明，EDCs与不孕症，性早熟，糖尿病，肥胖症以及前列腺癌，乳腺癌等内分泌失调相关疾病密切相关。
但多种内分泌干扰物在环境与食品中的浓度极低，通常为ng/L甚至 pg/L，且受环境复杂基质干扰较大，因此，建立快速、高效的环境与食品前处理技术及仪器分析方法十分必要。中国专利（CN102043028A）公开了一种利用N，O-双(三甲基硅基)三氟乙酰胺（BSTFA）与吡啶作为衍生试剂，通过气相色谱-质谱联用仪对雌酮和17β-雌二醇、乙烯雌酚、壬基酚、辛基酚分析检测方法，衍生时间长，且衍生试剂易水解，灵敏度低；中国专利（CN103185762A）利用丹酰氯衍生食品中的雌酮和17β-雌二醇、乙烯雌酚、辛基酚，但该方法衍生反应温度高，时间长，且试剂本身及衍生产物易分解。因此，开发一种衍生反应条件温和、快速、灵敏度高、多种成分同时检测的分析方法，对于环境和食品中内分泌干扰物检测分析具有十分重要的意义。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术存在的不足，首次使用了4’-碳酰氯-罗丹明作为衍生试剂对内分泌干扰物进行原位衍生，通过内标法定量，建立一种简单、快速、高灵敏、多成分同时检测的超声辅助-原位衍生-分散液液微萃取联合超高效液相色谱三重四极杆质谱检测的分析方法。利用溴苯作萃取剂，替代了传统的毒性强的氯代溶剂，具有环境友好的优点。
本发明为了实现上述目的所采用的技术方案为：
本发明提供了一种环境与食品中多种内分泌干扰物的检测分析方法，所述的内分泌干扰物通过与衍生剂4’-碳酰氯-罗丹明进行超声辅助-原位衍生-分散液液微萃取，得到的衍生化产物经滤膜过滤后利用超高效液相色谱三重四极杆串联质谱系统进行分析检测。
上述检测分析方法具体通过以下步骤实现的：
a. 超声辅助-原位衍生-分散液液微萃取过程：取10-100 µL标准品混合溶液或待测样品，加入30 µL内标物溶液、800-1000 µL pH 8.0-11.5的 NaHCO3-Na2CO3缓冲溶液，加入离心管中，最后注入60-200 µL萃取剂和200-300 µL 4’-碳酰氯-罗丹明-分散剂溶液，摇匀后密封，在温度10-60 ºC水浴中超声波振荡反应1-5分钟；离心分离，所得沉积相取出后用乙腈定容到200 µL，得衍生化产物溶液；
所述内标物溶液是由10 µL浓度为1×10-5 mol/L雌酚酮-2,4,16,16-d4、10 µL浓度为1×10-5 mol/L双酚A-d16和10 µL浓度为1×10-5 mol/L甲基-4 -羟基苯甲酸酯-2,3,5,6-d4组成；
所述的萃取剂为1-溴-3-甲基丁烷，溴环己烷，溴苯和1-溴丁烷；
所述的分散剂为丙酮，乙腈，甲醇或乙醇；
b.将步骤a中的衍生化产物溶液经滤膜过滤后利用超高效液相色谱三重四极杆质谱系统进行定性定量分析检测。
进一步的，所述待测样品中的内分泌干扰物包括雌酮、17β-雌二醇、雌三醇、17α-乙炔雌二醇、己烯雌酚、壬基酚、辛基酚、双酚A、2,2-二(4-羟基苯基)丁烷、4,4’-亚乙基双苯酚、4,4二羟基二苯基甲烷、4,4-二羟基二苯砜、六氟双酚A、4,4’-(1-苯乙基) 双酚、4-溴双酚A、及对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸异丙酯、对羟基苯甲酸丁酯、对羟基苯甲酸异丁基酯、对羟基苯甲酸苄酯、三氯生。
进一步的，步骤a中所述的萃取剂最优化的为溴苯；所述分散剂最优化的为乙腈。
进一步的，步骤a所述的4’-碳酰氯-罗丹明-分散剂溶液的摩尔浓度为1×10-2 mol/L。
本发明所使用的衍生试剂4’-碳酰氯-罗丹明采用以下方法制备而成：将0.922 g 4’-羧基-罗丹明加入30 mL氯化亚砜，滴入0.1 mL N,N-二甲基甲酰胺，磁力搅拌，升温至50～80℃，反应5～6 h，减压蒸除氯化亚砜，冷却至室温，得紫色固体，用乙醚重结晶，得紫色针状晶体即为4’-碳酰氯-罗丹明。
进一步的，步骤a中，所述超声波频率为40 KHz。
本发明所使用的超高效液相色谱三重四极杆串联质谱系统中色谱分离使用安捷伦SB C18色谱柱：2.1 mm × 50 mm，1.8 µm，进样体积为2 µL，柱温30℃，采用梯度洗脱法。
上述的梯度洗脱法，时间为20 min，流速为0.2 mL/min，流动相A为5%乙腈水溶液含有0.1%甲酸，流动相B为乙腈含有0.1%甲酸，0 min流动相组成为80%A+20%B，5 min时65%A+35%B，10 min时15%A+85%B，15 min时5%A+95%B，20 min时0%A+100%B。
进一步的，所述的超高效液相色谱三重四极杆串联质谱系统进行分析检测时的质谱的条件为：干燥气温度300℃，流速10 L/min，喷雾器气压40 psi，鞘气温度280℃，流速11 L/min，毛细管电压3.5 kV。
本发明流动相中各分数均指体积分数。
所述的目标分析物结构式如下所示：
本发明首次使用含有一个分子内永久正电荷的4’-碳酰氯-罗丹明衍生化试剂，因此，内分泌干扰物通过衍生化反应得到的衍生物进行检测时能够特异性的产生含有罗丹明结构的子离子，带来显著的质谱增敏检测效果。以特征离子对及保留时间进行定性和定量，结合内标法，带来了该检测方法极好的灵敏度、选择性和准确度，并且大大降低了基质效应。23种内分泌干扰物和3种内标物中都含有酚羟基，能够与衍生化试剂4’-碳酰氯-罗丹明迅速反应，以雌酮为例，4’-碳酰氯-罗丹明作为衍生化试剂的衍生化反应过程如下所示：
本发明采用超声辅助-原位衍生-分散液液微萃取技术提取富集生活废水、河流沉积物、鱼肉等实际样品中的内分泌干扰物，具有简单、快速、高效、绿色等优点。原位衍生化联合超声辅助-分散液液微萃取是一种良好的富集痕量组分、降低基质干扰、提高方法灵敏度的前处理技术，联合超高效液相色谱三重四极杆质谱检测多种内分泌干扰物，具有显著优势。
本发明的优点及有益效果：
1. 本发明首次使用环境友好的4’-碳酰氯-罗丹明为衍生化试剂，衍生化反应条件温和，反应速度快，衍生产物稳定，显著提高了分析物的色谱分离度和检测灵敏度。
2. 本发明所提供的超声辅助-原位衍生-分散液液微萃取的前处理技术，联合超高效液相色谱三重四极杆质谱检测手段，具有简单、快速、准确、高灵敏、环境友好的优点。
3. 本发明的检测分析方法成功应用于可能含有内分泌干扰物的生活废水、河流沉积物、鱼肉等多种实际样品，分析方法适用性好。
附图说明
图1为实施例1中23种内分泌干扰物和3种内标物衍生物的质谱检测分离图。
图2为实施例1中雌酮衍生物质谱裂解机理示意图。
图3为实施例2废水中内分泌干扰物和内标物的衍生物质谱检测分离图谱。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明进行进一步的阐述，下述说明仅为了解释本发明，并不对其内容进行限定。
本发明中衍生化萃取物经0.45 μm滤膜过滤后利用超高效液相色谱三重四极杆串联质谱系统进行分析检测。
本发明所使用的衍生化试剂4’-碳酰氯-罗丹明合成方法如下：将0.922 g 4’-羧基-罗丹明(2 mmol，合成方法参考申请人发表的论文Journal of Chromatography A, 2016, 1437: 49–57.)，30.0 mL氯化亚砜加入100 mL单口烧瓶中，滴入0.1 mL N,N-二甲基甲酰胺，磁力搅拌，升温至50～80℃，反应5～6 h，减压蒸除氯化亚砜，冷却至室温，得紫色固体。用乙醚重结晶，得到0.42 g紫色针状晶体即为4’-碳酰氯-罗丹明，收率45.5％。
实施例1
23种内分泌干扰物和3种内标物的色谱分离和质谱定性定量分析：
23种内分泌干扰物和3种内标物标准品（购自Sigma 和Aladdin试剂公司）用乙腈配制得到浓度为1.0 × 10-5 mol/L的内分泌干扰物标准品溶液，从每个单标储备液中各取 0.2 mL定容至 10 mL得到内分泌干扰物的混标储备液。4’-碳酰氯-罗丹明溶于乙腈得到1.0 × 10-2 mol/L衍生试剂乙腈溶液；取70 µL标准品溶液置于1.5 mL的离心管中，加入30 µL内标物溶液（内标物溶液为10 µL浓度为1×10-5 mol/L雌酚酮-2,4,16,16-d4、10 µL浓度为1×10-5 mol/L双酚A-d16、10 µL浓度为1×10-5 mol/L甲基-4 -羟基苯甲酸酯-2,3,5,6-d4），加入1000 µL NaHCO3-Na2CO3（pH 9.5）缓冲溶液，随后立即加入90 µL溴苯（作为萃取剂，当该处萃取剂改用1-溴-3-甲基丁烷，溴环己烷或1-溴丁烷时，分析物萃取效率处于溴苯做萃取剂时的40-92%之间）和200 µL 摩尔浓度为1×10-2 mol/L 4’-碳酰氯-罗丹明-乙腈溶液（乙腈作为分散剂，当该处分散剂改用丙酮，甲醇或乙醇时，分析物萃取效率处于乙腈做分散剂时的45-89%之间），漩涡混匀器震荡5 s使溶液混合均匀。在25 ºC超声振荡1 min后，高速离心2 min，转速12000 r/min。有机相沉积在离心管底部，用微量注射器吸取沉积相转移至另一小瓶中，用乙腈定容至200 µL。衍生化产物溶液经有机系滤膜过滤后进样2 µL，进行UHPLC-MS/MS（MRM）分析检测，所述的梯度洗脱法，时间为20 min，流速为0.2 mL/min，流动相A为5%乙腈水溶液含有0.1%甲酸，流动相B为乙腈含有0.1%甲酸，0 min流动相组成为80%A+20%B，5 min时65%A+35%B，10 min时15%A+85%B，15 min时5%A+95%B，20 min时0%A+100%B；质谱的条件为：干燥气温度300℃，流速10 L/min，喷雾器气压40 psi，鞘气温度280℃，流速11 L/min，毛细管电压3.5 kV。
按照上述梯度洗脱程序能得到较好的分离度，图1为23种内分泌干扰物和3种内标物衍生物的质谱检测分离图，26种分析物之间分离度良好。质谱分析实验结果表明，23种内分泌干扰物和3种内标物多反应监测模式（MRM）下产生相同的主要子离子m/z 443.10和m/z 398.10，m/z 398.10用作定量子离子，m/z 443.10用作定性子离子。以雌酮衍生物为例，图2为雌酮衍生物质谱裂解机理示意图，母离子为[M]+ m/z 695.38能够产生两个特异性子离子m/z 443.10 和 m/z 398.10。对MRM模式的参数进行了优化，23种内分泌干扰物和3种内标物衍生物的定量离子对、定性离子对、最优化碎裂电压（V）和电离能（V），以及分析方法的线性范围、相关系数、检出限、定量限见表1。
表1
实施例2
生活废水中内分泌干扰物的检测分析，包括以下操作步骤：
取1000 µL生活废水用0.45 µm水系滤膜过滤，加HCl调节pH至6.0，然后取100 µL水样置于1.5 mL离心管中，加入30 µL内标物溶液（10 µL浓度为1×10-5 mol/L雌酚酮-2,4,16,16-d4、10 µL浓度为1×10-5 mol/L双酚A-d16、10 µL浓度为1×10-5 mol/L甲基-4 -羟基苯甲酸酯-2,3,5,6-d4），加入800 µL NaHCO3-Na2CO3（pH 11.5）缓冲溶液，并快速注入含200 µL溴苯及300 µL摩尔浓度为1×10-2mol/L的4’-碳酰氯-罗丹明-乙腈溶液，漩涡混匀器震荡5 s使溶液混合均匀。在25 ºC超声振荡1 min后，高速离心2 min，转速12000 r/min。有机相沉积在离心管底部，用微量注射器吸取沉积相转移至另一小瓶中，用乙腈定容至200 µL，按照上述液相、质谱条件进行UHPLC-MS/MS（MRM）分析。检测到某生活废水中内分泌干扰物含量（n=3）分别为: E1 7.6 ng/L、E2 5.5 ng/L、OP 4.0 ng/L、NP 5.8 ng/L、BPA 21 ng/L、BPF1.15 ng/L、BPS 0.51 ng/L、BPAF 23.2 ng/L、MeP 1.1 ng/L、iPrP 3.4 ng/L、BuP 62.5 ng/L、iBuP 50.2 ng/L、TCS 72 ng/L，该样品质谱检测图见图3。
实施例3
河流沉积物中内分泌干扰物的检测，包括以下操作步骤：
参考文献（Journal of Chromatography A，2013，1305: 17–26），取河流沉积物样品0.8 g置于20 mL离心管中，加入3 mL甲醇，进行30 min超声波提取，离心10 min，过滤，并转移上清液到小瓶中，如上所述，残留物再次萃取；上清液合并旋转蒸发至1 mL左右，用超纯水定容至10 mL，取90 µL置于1.5 mL离心管中，加入30 µL内标物溶液（10 µL浓度为1×10-5 mol/L雌酚酮-2,4,16,16-d4、10 µL浓度为1×10-5 mol/L双酚A-d16、10 µL浓度为1×10-5 mol/L甲基-4 -羟基苯甲酸酯-2,3,5,6-d4），加入900 µL pH 8.0的 NaHCO3-Na2CO3缓冲溶液，并快速注入含120 µL1-溴-3-甲基丁烷及200 µL摩尔浓度为1×10-2 mol/L的4’-碳酰氯-罗丹明-乙腈溶液，漩涡混匀器震荡5 s使溶液混合均匀；在60 ºC超声振荡1 min后，高速离心2 min，转速12000 r/min。有机相沉积在离心管底部，用微量注射器吸取沉积相转移至另一小瓶中，用乙腈定容至200 µL，按照上述液相、质谱条件进行UHPLC-MS/MS（MRM）分析。检测到某河底污泥中11种内分泌干扰物含量（n=3）分别为: EE2 0.08 ng/g、OP 1.0 ng/g、NP 2.7 ng/g、BPA 17.6 ng/g、BPF 5.84 ng/g、BPS 2.1 ng/g、BPAF 74.7 ng/g、TBBPA 1.2 ng/g、MeP 0.19 ng/g、PrP 0.47 ng/g、TCS 2.93 ng/g。
实施例4
鱼肉中内分泌干扰物的检测，包括以下操作步骤：
参考文献（Journal of Chromatography A，2013，1305: 17–26），0.8 g鱼肉样品放入一个5 mL离心管中，加入1 mL超纯水混合，放在在微波炉30 s，之后加入3 mL甲醇，将混合物超声萃取30 min。然后在4C高速冷冻离心10 min，在冰箱4C放置1 h后将上清液通过0.45 μm有机系滤膜过滤去除悬浮脂质。提取物旋转蒸发至近干，并用超纯水稀释到40 mL。然后取10 µL倒入1.5 mL离心管中，加入30 µL内标物溶液（10 µL浓度为1×10-5 mol/L雌酚酮-2,4,16,16-d4、10 µL浓度为1×10-5 mol/L双酚A-d16、10 µL浓度为1×10-5 mol/L甲基-4 -羟基苯甲酸酯-2,3,5,6-d4），加入1000 µL pH 9.5的 NaHCO3-Na2CO3缓冲溶液，并快速注入含60 µL溴苯及200 µL摩尔浓度为1×10-2 mol/L的4’-碳酰氯-罗丹明-乙腈溶液，漩涡混匀器震荡5 s使溶液混合均匀。在室温10 ºC下超声辅助反应5 min后，形成均匀的乳浊液体系，高速离心2 min，转速12000 r/min。有机相沉积在离心管底部，用微量注射器吸取沉积相转移至另一小瓶中，用乙腈定容至200 µL，按照上述液相、质谱条件进行UHPLC-MS/MS（MRM）分析检测，未检测到某鱼肉中含有内分泌干扰物。
对比例1
该对比例过程与实施例2相同，不同在于衍生化反应过程中，衍生化试剂与衍生条件采用中国专利（CN103185762A）公开的丹酰氯作为衍生试剂。
对比例2
该对比例过程与实施例2相同，不同在于衍生化反应过程中，衍生化试剂与衍生条件采用中国专利（CN102043028A）公开的N，O-双 ( 三甲基硅烷基) 三氟乙酰胺作为衍生化试剂。
对比例3
该对比例操作步骤与实施例2相同，不同在于样品前处理过程中，采用中国专利（CN 105334282A）公开的未使用衍生试剂衍生和未进行超声辅助-分散液液微萃取。
对比例4
该对比例过程与实施例2相同，不同在于样品前处理过程中，采用中国专利（CN 105334282A）公开的未使用衍生试剂衍生和未进行超声辅助-分散液液微萃取。
下表2为实施例2同对比例1-4的试验结果对比。
表2
从表2中可以看出，与相关报道相比，本发明利用4’-碳酰氯-罗丹明进行衍生化方法，衍生条件温和、快速，灵敏度高，4’-碳酰氯-罗丹明衍生化方法的检出限比对比例低10-100倍左右。超声辅助-原位衍生-分散液液微萃取技术的回收率结果良好，对分析方法的准确度提供了保障。
为了验证所建立的分析方法的适用性，对准确度、精密度，以及实施例2-4三类实际样品中的回收率和基质效应都进行了详细考察，结果见表3。
表3
由表2和表3可知，对于实际样品中23种内分泌干扰物，其线性范围在0.007–200 ng/L，检出限分布于0.002-0.015 ng/L之间，定量限分布于0.007-0.059 ng mL-1之间。结果表明，所建立的分析方法灵敏度高，回收率好，有效降低了基质干扰，能够很好地应用于检测上述三种实际样品中的多种内分泌干扰物的含量。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受实施例的限制，其它任何未背离本发明的精神实质与原理下所做的改变、修饰、组合、替代、简化均应为等效替换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种环境与食品中多种内分泌干扰物的检测分析方法，其特征在于：所述的内分泌干扰物通过与衍生剂4’-碳酰氯-罗丹明进行超声辅助-原位衍生-分散液液微萃取，得到的衍生化产物经滤膜过滤后利用超高效液相色谱三重四极杆串联质谱系统进行分析检测。
2.根据权利要求1所述的检测分析方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
a. 超声辅助-原位衍生-分散液液微萃取过程：取10-100 µL标准品混合溶液或待测样品，加入30 µL内标物溶液、800-1000 µL pH 8.0-11.5的 NaHCO3-Na2CO3缓冲溶液，加入离心管中，最后注入60-200 µL萃取剂和200-300 µL 4’-碳酰氯-罗丹明-分散剂溶液，摇匀后密封，在温度10-60 ºC水浴中超声波振荡反应1-5分钟；离心分离，所得沉积相取出后用乙腈定容到200 µL，得衍生化产物溶液；
所述内标物溶液是由10 µL浓度为1×10-5 mol/L雌酚酮-2,4,16,16-d4、10 µL浓度为1×10-5 mol/L双酚A-d16和10 µL浓度为1×10-5 mol/L甲基-4 -羟基苯甲酸酯-2,3,5,6-d4组成；
所述的萃取剂为1-溴-3-甲基丁烷，溴环己烷，溴苯和1-溴丁烷；
所述的分散剂为丙酮，乙腈，甲醇或乙醇；
b.将步骤a中的衍生化产物溶液经滤膜过滤后利用超高效液相色谱三重四极杆质谱系统进行定性定量分析检测。
3.根据权利要求2所述的检测分析方法，其特征在于，所述待测样品中的内分泌干扰物包括雌酮、17β-雌二醇、雌三醇、17α-乙炔雌二醇、己烯雌酚、壬基酚、辛基酚、双酚A、2,2-二(4-羟基苯基)丁烷、4,4’-亚乙基双苯酚、4,4二羟基二苯基甲烷、4,4-二羟基二苯砜、六氟双酚A、4,4’-(1-苯乙基) 双酚、4-溴双酚A、及对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸异丙酯、对羟基苯甲酸丁酯、对羟基苯甲酸异丁基酯、对羟基苯甲酸苄酯、三氯生。
4.根据权利要求2或3所述的检测分析方法，其特征在于，步骤a中所述的萃取剂为溴苯；所述分散剂为乙腈。
5.根据权利要求2或3所述的检测分析方法，其特征在于：步骤a所述的4’-碳酰氯-罗丹明-分散剂溶液的摩尔浓度为1×10-2 mol/L。
6.根据权利要求5所述的检测分析方法，其特征在于，所述4’-碳酰氯-罗丹明采用以下方法制备而成：将0.922 g 4’-羧基-罗丹明加入30 mL氯化亚砜，滴入0.1 mL N,N-二甲基甲酰胺，磁力搅拌，升温至50～80℃，反应5～6 h，减压蒸除氯化亚砜，冷却至室温，得紫色固体，用乙醚重结晶，得紫色针状晶体即为4’-碳酰氯-罗丹明。
7.根据权利要求2所述的检测分析方法，其特征在于：步骤a中，所述超声波频率为40 KHz。
8.根据权利要求1-7任一项所述的检测分析方法，其特征在于：所述的超高效液相色谱三重四极杆串联质谱系统中色谱分离使用安捷伦SB C18色谱柱：2.1 mm × 50 mm，1.8 µm，进样体积为2 µL，柱温30℃，采用梯度洗脱法。
9.根据权利要求8所述的检测分析方法，其特征在于：所述的梯度洗脱法，时间为20 min，流速为0.2 mL/min，流动相A为5%乙腈水溶液含有0.1%甲酸，流动相B为乙腈含有0.1%甲酸，0 min流动相组成为80%A+20%B，5 min时65%A+35%B，10 min时15%A+85%B，15 min时5%A+95%B，20 min时0%A+100%B。
10.根据权利要求9所述的检测分析方法，其特征在于：所述的超高效液相色谱三重四极杆串联质谱系统进行分析检测时的质谱的条件为：干燥气温度300℃，流速10 L/min，喷雾器气压40 psi，鞘气温度280℃，流速11 L/min，毛细管电压3.5 kV。
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