CN109298151A - 一种能识别多种环境内分泌干扰物的检测方法 - Google Patents

一种能识别多种环境内分泌干扰物的检测方法 Download PDF

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张璐
张启睿
庄益琳
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Abstract

本发明公开了一种能识别多种环境内分泌干扰物的检测方法。本方法具体包括卵粒获取和预处理，活体染毒和样本收集，样本预处理及分子标志物EcR、Usp、E74表达量测定，孵化率终点观测，数据统计与显著性分析。本发明的优点在于，基于摇蚊卵活体（in vivo）染毒的激素调节通路基因测试技术耗时短、方法简单，检测灵敏度高于现有摇蚊内分泌干扰性测试标准方法，测试结果便于揭示受试物质影响摇蚊内分泌系统的内在机理。

Description

一种能识别多种环境内分泌干扰物的检测方法
技术领域
本发明属于水生毒理学领域，具体涉及一种能识别多种环境内分泌干扰物的检测方法。
背景技术
摇蚊(Chironomidae，non-biting midges)，属昆虫纲双翅目长角亚目摇蚊科，是淡水水域中底栖动物的主要类群之一，其种类大约可占水域底栖生物总量的50-90％。摇蚊是一类全变态昆虫，生命周期为12～65d。条件适宜的情况下行孤雌生殖，每只雌蚊单次平均产卵量约500 个。由于较短的生命周期、较高的繁殖量、易饲养、对水环境胁迫敏感等特点，摇蚊早已成为国内外实验室广泛使用的模式生物，用于指示农药、化学品等有毒有害物质对底栖生物的急慢性危害。而鉴于其显著的变态生活史特征，经合组织(OECD)已将其羽化、繁殖、性分化等生命特征作为筛查环境内分泌干扰物(EDCs)的评估终点并建立了一系列标准测试导则，包括OECD TG218、TG219和TG233。
然而目前用于EDCs识别的摇蚊慢性毒性测试均以摇蚊幼虫为试验材料，试验周期长 (17～100d)，水-沉积物测试系统配制过程复杂、受试物质可能在水-沉积物界面发生复杂迁移转化而导致接触受试生物的生物有效态减少，受试物质难以在静态条件下维持目标浓度。此外，羽化率、羽化时间、繁殖率、性别比等指标须在摇蚊羽化后同时测定，测试终点响应晚、工作量大，且上述测试终点均为个体或种群的终极危害响应，无法从分子水平揭示受试物质可能的内分泌干扰作用机理。上述缺陷为以摇蚊作为受试生物的环境内分泌干扰物识别增加了成本和技术难度。
摇蚊是一类全变态昆虫，其全生命过程经过卵-幼虫-蛹-成虫4个阶段。使用摇蚊卵作为试验材料的优势显著：产卵量大，每虫每次300颗以上，实验室条件饲养繁育操作简单，材料易得、成本低；源于统一卵串的卵粒遗传信息相对对等，有效降低基因试验的背景噪音；卵是摇蚊发育初始阶段，是各器官形成和发育的关键阶段，可能是观测基于发育毒性的内分泌干扰终点的最佳时期。但蚊卵的特殊构造和生物特性也给试验带来一定技术难度：卵粒被薄膜包覆于卵串内，粘性很大，且单个卵粒小，卵粒难以物理分解，且卵孵化的一龄幼虫形体小、活动快，以幼虫为指标计数孵化率困难。解决上述问题是开展摇蚊卵毒性测试的前提。
蜕皮激素通路是昆虫调节内分泌的主要途径之一。EcR、USP是昆虫蜕皮激素受体，起到控制生物基本发育和生理途径的转录因子的作用，且只有当EcR和USP(超气门蛋白)形成异源二聚体才能与MH(类固醇激素在血浆循环中转运到其靶器官，并在进入细胞后发挥作用，作为该核受体的配体并改变基因转录)在细胞核内形成转录复合体从而调节蜕皮激素应答基因的转录水平。E74是蜕皮激素调节通路的早期响应基因，在变态中起到重要的作用，同时在卵泡发育过程中显示出时间依赖的表达模式。目前蜕皮激素受体EcR和USP、蜕皮激素调节因子E74已经广泛应用于外源性物质对果蝇、蜜蜂、家蚕等昆虫的内分泌干扰性研究。然而由于不同物种基因差异性，上述研究中的昆虫激素受体无法直接作为摇蚊敏感内分泌干扰性标志物，相关测试方法不适用于摇蚊。
发明内容
本发明的目的是克服现有摇蚊内分泌干扰毒性测试方法的缺陷，提供一种能识别多种环境内分泌干扰物的检测方法。
为了达到上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种能识别多种环境内分泌干扰物的摇蚊卵分子标志物包括蜕皮激素受体基因EcR和 Usp、早期响应基因E74。
一种能识别多种环境内分泌干扰物的伸展摇蚊卵活体检测方法包含以下步骤：
(1)卵粒获取和预处理
将摇蚊放入20L左右玻璃缸中，加入除氯自来水，并用纱网罩盖在缸上，温和曝气。初期幼虫(孵化后10天内)每只每天喂食0.25-0.5mg鱼食，孵化10天后每只每天0.5-1.0mg鱼食。每周换水一次。实验前24h将繁育摇蚊的缸壁上的卵串清理干净，第2天用大口径吸管从繁育缸缸壁吸出新产出的<24h卵串，放入除氯自来水中备用。
(2)活体染毒和样本收集
实验前将卵串置于透明的玻璃纤维纸上，调整其形状至自然伸展，对折玻璃纸将卵串轻夹在中间，用手术剪从中部快速将卵串剪成两段，展开玻璃纸，快速将两段卵串分别放入对照组和处理组中。所有处理组均设置对应的对照组，其中的卵均来自同一卵串。
至少设置5个不同浓度处理组，每个处理组至少9个平行，其中3个平行用于24h基因测试，3个平行用于48h基因测试，剩余3个平行用于卵孵化终点观测。在显微镜下观测未孵化卵数量。
(3)样本预处理及分子标志物EcR、Usp、E74表达量测定
基因表达试验中，分别在24h和48h测定处理组和对照组卵中EcR、Usp、E74基因表达量。用0.2％次氯酸钠溶液冲洗掉卵串表面粘膜，并用试验用水(1*PBS溶液)反复冲洗、离心3次并重悬。使用Trlzol试剂并按照其说明书提取处理组和对照组卵中的总RNA，利用分光光度计检测RNA的浓度和纯度；使用hifi-mmlv cDNA kit第一链合成试剂盒将提取的摇蚊总RNA反转录成cDNA，根据标志物基因序列设计并合成相应的引物(表1)，对蜕皮激素受基因EcR和Usp、早期响应基因E74表达量进行荧光定量PCR(RT-PCR)测定。
3.1引物扩增
EcR、Usp、E74的引物序列分别为：
表1用于荧光定量PCR的伸展摇蚊的引物序列
3.2总RNA提取、质量鉴定和目标基因RT-PCR扩增
使用Trlzol试剂并按照其说明书提取总RNA，利用分光光度计检测RNA的浓度和纯度；使用hifi-mmlv cDNA kit第一链合成试剂盒将提取的摇蚊总RNA反转录成cDNA，根据标志物基因序列设计并合成相应的引物序列(表1)进行荧光定量PCR(RT-PCR)。以空白对照组为参照，计算不同浓度处理组中分子标志物EcR、Usp、E74的表达量。
(4)孵化率终点观测
卵孵化试验中，自0h开始每隔24h分别观测处理组和对照组中未孵化卵的数目，直至对照组中80％卵完成孵化(通常为72h)。
(5)数据统计与显著性分析
基因表达试验中，以GAPDH、Actinβ为内参，计算不同浓度处理组中分子标志物EcR、 Usp、E74的表达量；以对照组中来自同一卵串的虫卵中基因表达量为参照，计算处理组目标基因的相对表达量。卵孵化毒性试验中，以对照组中来自同一卵串的虫卵孵化率为参照，计算处理组卵孵化抑制率。分别以蜕皮激素信号基因相对表达量、卵孵化抑制率为毒性终点建立具有统计学意义的剂量-效应关系。最后采用统计学方法计算最大无显著诱导或抑制效应的浓度 NOEC或10％抑制浓度EC10。能够诱导产生显著剂量-效应关系的受试物质可判定其对摇蚊具有相应的内分泌干扰作用，NOEC值或EC10值可表征受试物产生内分泌干扰效应的强度。具体地，如果能同时引起EcR、Usp和E74表达量变化并呈现显著剂量-效应关系，表明受试物能干扰蜕皮激素的作用；如果能引起EcR或E74中一种标志物表达量显著变化并呈现显著剂量-效应关系，表明受试物可能会干扰蜕皮激素的作用；若受试物浓度与孵化率之间存在显著剂量-效应关系，表明受试物具有相应的内分泌干扰作用。通过分子水平毒性终点和个体水平毒性终点(孵化率)结果的对照，可判定受试物对摇蚊是否具有内分泌干扰效应，且可判定其机理是否基于干扰蜕皮激素调节导致。
本发明具有如下有益效果：
1.耗时短、方法简单；
2.检测灵敏度不低于现有摇蚊内分泌干扰性测试标准方法。
3.测试结果便于揭示受试物质影响摇蚊内分泌系统的内在机理。
附图说明：
图1暴露于BPP 24h后摇蚊卵中分子标志物EcR、Usp、E74的相对表达量。
图2暴露于BPP 48h后摇蚊卵中分子标志物EcR、Usp、E74的相对表达量。
图3暴露于BPF 24h后摇蚊卵中分子标志物EcR、Usp、E74的相对表达量。
图4暴露于BPF 48h后摇蚊卵中分子标志物EcR、Usp、E74的相对表达量。
图5暴露于BPS 24h后摇蚊卵中分子标志物EcR、Usp、E74的相对表达量。
图6暴露于BPS 48h后摇蚊卵中分子标志物EcR、Usp、E74的相对表达量。
黑色的虚线表示空白对照组的基因表达量为1，*表示显著性水平p<0.05。
具体实施方式
以下结合附图对本发明做进一步详细说明。
本具体实施例仅仅是对本发明的解释，其并不是对本发明的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本发明的权利要求范围内都受到专利法的保护。
实施例1
按照本方法开展BPP、BPF、BPS对摇蚊卵孵化率影响并测定分子标志物EcR、Usp、E74 的表达，筛选内分泌干扰物。
将伸展摇蚊(Chironomus tentans)放入20L左右玻璃缸中，加入除氯自来水，并用纱网罩盖在缸上，温和曝气。初期幼虫(孵化后10天内)每只每天喂食0.25-0.5mg鱼食，孵化10天后每只每天0.5-1.0mg鱼食。每周换水一次。在环境条件光：暗＝16:8h，温度(23±1)℃，光照强度800～1000lux，湿度为85％下驯养并用于试验。实验前24h将繁育摇蚊的缸壁上的卵串清理干净，第2天用大口径吸管从繁育缸缸壁吸出新产出的<24h卵串，放入除氯自来水中备用。
采取储备液稀释法配制不同浓度的受试物溶液。其中，BPP的浓度为0.01mg/L、0.05mg/L、 0.1mg/L、0.5mg/L、1mg/L；BPF浓度为0.05mg/L、0.1mg/L、0.5mg/L、1mg/L和5mg/L； BPS浓度为0.1mg/L、1mg/L、2mg/L、5mg/L、10mg/L，每个浓度均对应设置一个不含受试物的对照组。每个浓度组或对照组9个平行。实验前将卵串置于透明的玻璃纤维纸上，调整其形状至自然伸展，对折玻璃纸将卵串轻夹在中间，用手术剪从中部快速将卵串剪成两段，展开玻璃纸，快速将两段卵串分别放入对照组和处理组中。所有处理组均设置对应的对照组，其中的卵均来自同一卵串。将卵粒混合液较平均地滴入每个浓度组水溶液中，在体式显微镜底下观察加入卵粒的数量，确保每个测试组含有约200～400个卵粒。连续暴露72h，于24h、48h 分别取3个平行样本测试蜕皮激素受基因EcR和Usp、早期响应基因E74表达量。至80％空白对照卵孵化成1龄期幼虫(通常为72h)时，观察各浓度剩余3个平行中孵化出幼虫数量，统计其孵化率。
总RNA提取、质量鉴定和目标基因RT-PCR扩增：用0.2％次氯酸钠溶液冲洗掉卵串表面粘膜，并用试验用水(1*PBS溶液)反复冲洗、离心3次并重悬。使用Trlzol试剂盒并按照其说明书提取总RNA，利用分光光度计检测RNA的浓度和纯度；使用试剂盒将提取的摇蚊总RNA反转录成cDNA，根据表1中的引物序列进行荧光定量PCR(RT-PCR)。以对照组为参照，计算不同浓度处理组中分子标志物EcR、Usp、E74的相对表达量。
卵孵化试验中，自0h开始每隔24h分别观测处理组和对照组中未孵化卵的数目，直至对照组中80％卵完成孵化(通常为72h)。
基因表达试验中，以GAPDH、Actinβ为内参，计算不同浓度处理组中分子标志物EcR、 Usp、E74的表达量；以对照组中来自同一卵串的虫卵中基因表达量为参照，计算处理组目标基因的相对表达量。卵孵化毒性试验中，以对照组中来自同一卵串的虫卵孵化率为参照，计算处理组卵孵化抑制率。分别以蜕皮激素信号基因相对表达量、卵孵化抑制率为毒性终点建立具有统计学意义的剂量-效应关系。最后采用统计学方法计算最大无显著诱导或抑制效应的浓度 NOEC或10％抑制浓度EC10。能够诱导产生显著剂量-效应关系的受试物质可判定其对摇蚊具有相应的内分泌干扰作用，NOEC值或EC10值可表征受试物产生内分泌干扰效应的强度。具体地，如果能同时引起EcR、Usp和E74表达量变化并呈现显著剂量-效应关系，表明受试物能干扰蜕皮激素的作用；如果能引起EcR或E74中一种标志物表达量显著变化并呈现显著剂量-效应关系，表明受试物可能会干扰蜕皮激素的作用；若受试物浓度与孵化率之间存在显著剂量-效应关系，表明受试物具有相应的内分泌干扰作用。通过分子水平毒性终点和个体水平毒性终点(孵化率)结果的对照，可判定受试物对摇蚊是否具有内分泌干扰效应，且可判定其机理是否基于干扰蜕皮激素调节导致。
如图1和图2所示，24h时，BPP处理组相比空白对照(表达量＝1)而言，0.1mg/L及以上浓度能引起三种分子标志物表达量的显著上升，24h-LOEC均为0.1mg/L。暴露48h后，0.05mg/L及以上浓度处理组的表达量显著高于空白对照组，且呈显著剂量-效应关系(见表2)。 0.5mg/L及1mg/L处理组BPP对三种分子标志物的活性效应较24h减弱，但仍然显著高于空白对照组，48h-LOEC为0.1mg/L。上述结果表明BPP能干扰蜕皮激素作用。
如图3和图4所示，暴露于BPF的摇蚊卵，24h时EcR基因的表达量随着浓度上升而增大(拟合优度为0.8017)，1mg/L及以上浓度处理组与对照组相比显著上升(Dunnett-ttest，p<0.05)，对其它基因的表达量无显著影响，EcR-24h-LOEC为1mg/L。48h时，0.5mg/L及以上浓度的处理组EcR和Usp基因表达量显著增加，48h-LOEC均为0.5mg/L，Usp基因的48h-LOEC为 1mg/L。三种基因的表达量均与浓度呈显著剂量-效应关系(见表2)，说明BPF能干扰蜕皮激素的作用。从24h至48h三种基因的表达量变化可以看出，EcR基因响应最快，其次是E74 基因，最后是Usp基因。
如图5和图6所示，在BPS处理组中，24h时E74和Usp基因的表达量均与暴露浓度正相关(拟合优度在0.86及以上)，2mg/L及以上浓度组E74表达量显著上升，24h-LOEC为2mg/L。 EcR、Usp在高浓度组(5mg/L和10mg/L)也显著高于空白对照组，24h-LOEC均为5mg/L。48h时，三种分子标志物相对表达量均与浓度正相关(拟合优度在0.8以上)，且呈显著上升趋势，48h-LOEC与24小时相同，表明BPS能干扰蜕皮激素作用过程。从24h至48h，三种基因的表达量无明显变化，表明BPS对蜕皮激素通路的作用不随暴露时间变化。
根据72h观察的孵化率，不同浓度的BPP、BPF、BPS均对孵化率产生了显著的抑制效应，72h-LOEC分别为0.5mg/L、0.1mg/L、1mg/L。BPP和BPF处理组孵化率随浓度增高显著降低，BPF暴露组浓度与孵化抑制率之间呈显著剂量-效应关系(拟合优度为0.89)(见表3)，说明BPP和BPF具有相应的内分泌干扰作用，BPS可能具有相应内分泌干扰作用。
综上所述，本案例以摇蚊卵中3种分子标志物(EcR、Usp、E74)的相对表达量和个体水平的孵化率为毒性终点，测定了潜在内分泌干扰物对摇蚊的内分泌干扰效应，结果表明三种受试物均对多个基因的表达量有显著影响，且呈现剂量-效应关系，并在个体水平上显示了相应的内分泌干扰作用，证实了这三种物质的内分泌干扰性。本方法耗时短-48h～72h，方法简单-样本处理、mRNA提取方便快捷，检测灵敏度高-分别在BPP、BPF、BPS浓度仅为0.05、0.5、2mg/L 时便有响应。
表2三种分子标志物与受试物浓度间的剂量-效应关系
注：数据使用Excel 2010拟合。y-分子标志物相对表达量，x-受试物浓度(mg/L)以10为底的对数(log10)，R2- 拟合优度。
表3受试物浓度与孵化率抑制率间的剂量-效应关系
注：数据使用Excel 2010中拟合。y-相对于空白对照的孵化率抑制率，x-受试物浓度(mg/L)以10为底的对数(log10)，R2-拟合优度。
实施例2
按照OECD TG219方法(水体加标法摇蚊毒性试验)测试BPP对摇蚊的内分泌干扰性， OECD TG233方法(水体加标法摇蚊全生命周期实验)测试BPS、BPF对摇蚊的内分泌干扰性，验证摇蚊卵分子标志物筛查内分泌干扰物的准确性。
(1)水-沉积物系统
制备水-沉积物系统方法主要参考《化学品测试方法-生物系统效应卷》(第二版)以及OECD 化学品测试导则，选取粉末状的泥炭，用磨土机细(颗粒大小≤1mm)，并放置烘箱中烘干，加入适量去离子水并放置在室温下用搅拌机搅拌2-3d，用CaCO3调节pH至6.5±0.5。然后加入高岭土和石英砂和适量的去离子水混合均匀。整个体系的组分分配如下：(干重)泥炭(4％～5％)， (干重)高岭土(20％)，(干重)石英砂(75％，粒径在50～200μm)。每个烧杯(500mL) 中的沉积物均为100g，倒入培养基(350mL上覆水)，最终水份含量为50，水-沉积物体系中水层：沉积物层高度比＝4:1。将该体系放置在实验条件下沉淀7d后开始进行实验。
(2)水体加标法摇蚊毒性试验
BPP浓度设置为0.01mg/L、0.05mg/L、0.1mg/L、0.5mg/L、1mg/L，每个浓度4个平行，每个平行烧杯中20只幼虫。实验开始前3-4d从培育缸中取出摇蚊新卵串放置呈有培养基的六孔板中，在摇蚊卵孵化出来后用胶头滴管将一龄幼虫随机加入含有沉积物和水的烧杯中。向烧杯中加入幼虫时应停止水柱的曝气，加入幼虫后再曝气24h，然后将受试物加标到上覆水柱中，再提供轻微曝气。使用吸液管将小体积的受试物溶液加入到水面下，小心混合上覆水而不搅动沉积物。每日记录羽化数量、性别和数目，计算完全羽化的雄蚊和雌蚊的发育率和羽化率。
(3)水体加标法全生命周期实验
BPS水体加标法设置空白对照组、溶剂对照组、0.5、1、2、4和8mg/L浓度组，BPF设置空白对照组、0.05、0.1、0.5、1和5mg/L浓度组。每个浓度8个平行，每个平行的烧杯中 20只一龄幼虫。
实验开始前3-4d从培育缸中取出摇蚊新卵串放置呈有培养基的六孔板中，在摇蚊卵孵化出来后用胶头滴管将第一代幼虫(P代)随机加入各烧杯中，烧杯中含有沉积物-水系统。在将幼虫放入容器的同时停止曝气，并保持24h。加入第一代第一龄期幼虫48h后，将受试物加标到上覆层水柱中，再次提供轻微曝气。加入受试物时需将少量的受试物贮备液注入水表面以下的水柱中，然后小心地对上覆水层进行搅拌混合，避免搅动沉积物。加入受试物后，暴露正式开始。等到P代摇蚊羽化后，每天都将羽化出的摇蚊吸出并按照不同浓度放置在新的烧杯中(每个烧杯中有1/4的受试溶液)。且每日记录羽化数量和产卵数量，并将产出卵串吸出放置六孔板中待孵化出一龄期幼虫(即子代幼虫F1)，再将F1代加入新的水-沉积物体系中进行第二代摇蚊全生命周期实验。
(4)数据分析
羽化率、发育率、性别比和繁殖力用单因素方差分析(Dunnett’s tests，ANOVA，SPSS 19.0)，确定空白组与受试物处理组的差异显著性。
(5)结果
在全生命周期试验中，用超高效液相色谱法分析了水体和沉积物中BPS和BPF的分布情况，两种受试物随着时间的增加，在水-沉积物体系中的总体浓度是呈现下降的趋势，说明可能在会环境中降解但是时间较长，速度较为缓慢。根据OECD导则，通过对理论添加浓度进行时间加权平均计算，得到水体中的BPS时间加权平均浓度为0.197、0.304、1.098、1.443和 1.78mg/L，BPF时间加权平均浓度为0.0241、0.0427、0.285、0.496和2.43mg/L，所以摇蚊全生命周期毒性试验中BPS和BPF浓度全由时间加权平均浓度表示。在摇蚊毒性试验(OECD TG219)中，BPP浓度保持在初始浓度的80％～120％之间，所以结果以设置浓度表示。
5.1羽化率
本案例主要测试了两代摇蚊(亲代：P代；子代：F1代)暴露于BPS、BPF及BPP不同浓度下的个体指标的变化。结果显示，BPS浓度为1.443mg/L、BPF浓度为0.496mg/L时，P 代总羽化率显著下降，说明此浓度严重抑制了摇蚊的正常羽化。同样浓度的暴露也影响了其子代F1代的羽化率，在1.098mg/L BPS、0.285mg/L BPF及其更高浓度的影响下，处理组的羽化率与对照组相比显著下降，F1代雄性最低羽化率为15％；可见，BPS和BPF对F1代摇蚊的羽化率影响较为明显。对于BPP处理组，雌性和雄性的羽化率均呈现下降趋势，0.05mg/L 及更高暴露浓度下雌性、雄性及总体羽化率均显著下降。
5.2发育率
BPS、BPF和BPP水体加标法P代和F1代的发育速率结果显示，BPS处理组中P代雄性的发育率均要高于雌性的发育率，在1.780mg/L浓度的影响下，雄性的发育率最高达到0.070，可见P代摇蚊的雄性发育比雌性摇蚊要早，发育时间更短。相比于对照组(ck和solck)，P 代雌性发育率在BPS各浓度的刺激下发育速率更快。但是BPS的处理并没有显著影响到P代摇蚊雌雄总的发育率。而在BPS的持续暴露中，摇蚊F1代的发育率受到了显著的影响，在BPS中高浓度的影响下(1.098-1.780mg/L)，雌性发育率超过了雄性发育率，且在1.780mg/L 浓度时，雌性发育率和总发育率与对照组(ck和sol ck)相比均显著升高，说明BPS促进了摇蚊雌性的发育速度，也缩短了摇蚊整体的发育时间。对于BPF处理组，浓度为0.496mg/L显著提高了P代总发育率，2.430mg/L时P代雌性和总体发育率均显著上升，但对雄性的发育率无显著影响；对于F1代，0.285mg/L及以上浓度显著提高了雌性的发育率，对雄性无显著影响，表明BPF提高了雌性发育速度。对于BPP浓度组，雌雄总发育率均较对照组有上升，0.1 mg/L及以上浓度下，雄性和总体发育率显著上升。
5.3雌雄比
BPF和BPS对摇蚊P代雌性比在统计学上无显著差异，而对F1代的雌性比有显著影响，暴露于2.43mg/L BPF、1.78mg/L BPS的浓度下时，雌性比(BPF：1.40、BPS：1.23)明显偏离对照组雌性比(BPF ck：0.90；BPS ck：0.86，sol ck：0.85)。所以，BPF和BPS能够干扰摇蚊子代的性别分化，抑制摇蚊的雄激素效应，促使摇蚊向雌性的方向发展，从而影响摇蚊的繁殖生长。与BPF和BPS相反，暴露于0.1mg/L及以上浓度BPP的摇蚊雌雄比显著低于空白对照组，提示高浓度的BPP会促使摇蚊向雄性的方向发展。
5.4繁殖力
与空白对照相比，摇蚊两代的繁殖力在BPS和BPF的影响下没有显著的变化。对BPS浓度组，P代和F1代最高的繁殖力分别为0.90和0.88卵/雌。且两代繁殖力都在高浓度(1.780mg/L) 的影响下下滑，达到最低0.70和0.63卵/雌。
5.5BPS、BPF及BPP毒性总结
通过水体加标法的全生命周期实验，BPS、BPF、BPP对伸展摇蚊全生命周期的四个指标的响应情况汇总于表4。BPS对P代总羽化率的NOEC为1.098mg/L，而BPS对P代的发育率、雌性比和繁殖力均无显著的影响；而在对F1代的实验中发现BPS对摇蚊雄性和总体的羽化NOEC为0.304mg/L，对雌性和总体的发育率和雌性比NOEC为1.443mg/L。BPF对P代雄性和总体羽化率的NOEC分别0.496mg/L和0.285mg/L，对P代的雌性和总体发育率NOEC 均为0.285mg/L，雌雄比NOEC为0.496mg/L，对繁殖力无显著的影响；对F1代，雌雄羽化率NOEC为0.285mg/L，总体羽化率NOEC为0.0427mg/L，雌性和总体发育率NOEC分别为 0.0427mg/L和0.285mg/L，雌雄比NOEC为0.496mg/L，对繁殖力无显著影响。对于BPP处理组，雌雄总羽化率NOEC均为10mg/L，雌雄总发育率NOEC均为50mg/L，雌雄比NOEC 为50mg/L。
伸展摇蚊全生命周期实验结果证实了BPS、BPF、BPP对摇蚊羽化、雌雄比例、发育有干扰作用，即对伸展摇蚊有内分泌干扰效应。与实施案例1的结果一致，表明了本发明的科学性和准确性。此外，本发明方法暴露时间和操作步骤远少于OECD TG219、233方法；响应灵敏度(BPS、BPF、BPP的48h-LOEC分别为2、0.5、0.05mg/L，详见案例1)与OECD TG219、 233方法相当(本案例中BPS、BPF、BPP对四种检测指标的综合LOEC分别为1.098、0.285、 0.05mg/L)；便于揭示受试物质影响摇蚊内分泌系统的内在机理。
表4.BPS、BPF、BPP对伸展摇蚊四种检测指标的响应
注：↑表示该指标与对照组(ck和sol ck)相比显著增加；↓表示该指标与对照组(ck和sol ck)相比显著降低；表中的数字表示受试物浓度，单位是mg/L
实施例3
按照本方法开展BPP、BPF、BPS对幼虫中分子标志物EcR、Usp、E74表达的影响，验证摇蚊卵分子标志物筛查内分泌干扰物相对于幼虫响应的敏感性。
从培育的摇蚊中选取新卵串6个，每个卵串分开培育直至发育成四龄期幼虫，从3个卵串中分别取出幼虫用于实验，BPS浓度为0.1、1、2、5、10mg/L，BPF浓度为0.05、0.1、0.5、1和5mg/L，BPP浓度为0.01、0.05、0.1、0.5、1mg/L，每个浓度组对应设置一组不含受试物的空白对照组，每个浓度组或对照组8个平行。每个卵串中的幼虫对应一组实验(一组实验即包括对照组和处理组)。暴露24h和48h后取出每个烧杯中存活的摇蚊测定分子标志物的表达量。
总RNA的提取、质量鉴定和目标基因RT-PCR扩增方法与卵中分子标志物影响实验相同。
实验结果显示，24h时，与空白对照组相比，BPF对E74、Usp基因的表达量无显著影响，仅在5mg/L时显著降低EcR基因的表达量。48h时，1mg/L及以上浓度处理组EcR和E74 表达量显著上升，Usp基因在5mg/L时显著上升，表明BPF在较高浓度(1mg/L及以上)及下影响摇蚊幼虫的蜕皮激素调节作用。
实验结果显示，24h时，BPP在较高浓度(1mg/L)时显著提高了EcR和Usp基因的相对表达量，E74基因也在0.5mg/L时显著提高。48h时(，d)0.1mg/L及以上处理组E74基因显著上升，0.5mg/L及以上处理组EcR和Usp基因相对表达量显著上升，表明BPP在0.1mg/L 及以上浓度下影响摇蚊幼虫的蜕皮激素调节作用。
实验结果显示，24h时，BPS在5mg/L及以上浓度显著提高了EcR和E74基因的相对表达量，Usp基因在10mg/L时显著提高。48h时，5mg/L及以上浓度显著提高了三种分子标志物的相对表达量，表明BPS在5mg/L及以上浓度下影响摇蚊幼虫的蜕皮激素调节作用。
因此，根据摇蚊幼虫中分子标志物测定的结果，BPF、BPP和BPS基于分子标志物表达量的LOEC值分别为1、0.1、5mg/L，此结果高于本发明实施案例1中的LOEC值(BPF、BPP、BPS对3种分子标志物表达量的NOEC分别为0.5、0.05、2mg/L)，具体对比结果见表5，表明本发明的检测灵敏度高于现有摇蚊内分泌干扰性测试标准方法。
表5.摇蚊卵和幼虫三种检测指标对BPS、BPF、BPP响应的对比
注：↑表示该指标与对照组相比显著增加；↓表示该指标与对照组相比显著降低；表中的数字表示受试物浓度，单位是mg/L。

Claims (6)

1.一种能识别多种环境内分泌干扰物的检测方法，其特征包括以下步骤：
步骤1，卵粒获取和预处理；
步骤2，活体染毒和样本收集；
步骤3，样本预处理及分子标志物EcR、Usp、E74表达量测定；
步骤4，孵化率终点观测；
步骤5，数据统计与显著性分析。
2.根据权利要求1所述的能识别多种环境内分泌干扰物的检测方法，其特征在于，所述的步骤1包括：将摇蚊放入玻璃缸中，加入除氯自来水，并用纱网罩盖在缸上，温和曝气，每周换水一次，实验前24 h将繁育摇蚊的缸壁上的卵串清理干净，第2天用大口径吸管从繁育缸缸壁吸出新产出的小于24 h卵串，放入除氯自来水中备用。
3.根据权利要求1所述的能识别多种环境内分泌干扰物的检测方法，其特征在于，所述的步骤2包括：将卵串置于透明的玻璃纤维纸上，调整其形状至自然伸展，对折玻璃纸将卵串轻夹在中间，用手术剪从中部快速将卵串剪成两段，展开玻璃纸，快速将两段卵串分别放入对照组和处理组中；所有处理组均设置对应的对照组，其中的卵均来自同一卵串，至少设置5个不同浓度处理组，每个处理组至少9个平行，其中3个平行用于24h基因测试，3个平行用于48h基因测试，剩余3个平行用于卵孵化终点观测，在显微镜下观测未孵化卵数量。
4.根据权利要求1所述的能识别多种环境内分泌干扰物的检测方法，其特征在于，所述的步骤3包括：用次氯酸钠溶液冲洗掉卵串表面粘膜，并用试验用水反复冲洗、离心并重悬，提取处理组和对照组卵中的总RNA，利用分光光度计检测RNA的浓度和纯度；将提取的摇蚊总RNA反转录成cDNA，根据标志物基因序列设计并合成相应的引物，对蜕皮激素受体基因EcR和Usp、早期响应基因E74表达量进行荧光定量PCR测定。
5.根据权利要求1所述的能识别多种环境内分泌干扰物的检测方法，其特征在于，所述的步骤4包括：卵孵化试验中，自0h开始每隔24h分别观测处理组和对照组中未孵化卵的数目，直至对照组中80%卵完成孵化。
6.根据权利要求1所述的能识别多种环境内分泌干扰物的检测方法，其特征在于，所述的步骤5包括：基因表达试验中，以GAPDH、Actin β为内参，计算不同浓度处理组中分子标志物EcR、Usp、E74的表达量；以对照组中来自同一卵串的虫卵中基因表达量为参照，计算处理组目标基因的相对表达量；卵孵化毒性试验中，以对照组中来自同一卵串的虫卵孵化率为参照，计算处理组卵孵化抑制率，分别以蜕皮激素信号基因相对表达量、卵孵化抑制率为毒性终点建立具有统计学意义的剂量-效应关系，最后采用统计学方法计算最大无显著诱导或抑制效应的浓度NOEC或10%抑制浓度EC10。
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