CN104297377A - 一种植物甾醇的检测分析方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种植物甾醇的检测分析方法，该方法首次使用衍生化试剂4’-羧基罗丹明对植物甾醇进行衍生化，并利用多反应监测模式的超高效液相色谱三重四极杆串联质谱进行定性定量检测分析。该方法步骤为：首先利用超声辅助-分散液液微萃取技术提取植物甾醇，然后向所得植物甾醇萃取物中加入4’-羧基罗丹明乙腈溶液，2-氯-1-甲基碘代吡啶乙腈溶液和4-二甲氨基吡啶乙腈溶液，进行衍生化反应，最后通过超高效液相色谱三重四极杆串联质谱系统进行分析检测。该方法温和快速、灵敏度高，对于富含植物甾醇的植物油、饮料、药材的质量控制具有重要意义。

Description

一种植物甾醇的检测分析方法

技术领域

本发明涉及一种植物甾醇的检测分析方法，尤其是涉及一种利用4’-羧基罗丹明进行衍生化的植物甾醇的检测分析方法。 

背景技术

植物甾醇（Phytosterol）是以环戊烷全氢菲为骨架的一类物质，主要存在于植物的根、茎、叶、果实和种子中。近年来的研究表明，植物甾醇的营养价值高、生理活性强，具有降低血液胆固醇水平、防治冠状动脉粥样硬化、抗氧化、抗癌等药用和保健功能，在医学、食品、化妆品等领域引起广泛关注。

但植物甾醇分子缺少一个发色团或者质谱响应灵敏的分子部件，因此对于传统的紫外-可见、荧光及质谱检测的灵敏度都很低，难以进行检测。在这种情况下，使用衍生化技术提高灵敏度是一个很好的解决办法。中国专利（CN102967647A）公开了一种利用吡啶或氘代吡啶作为衍生试剂、三氟甲磺酸酐作为催化剂，通过电喷雾离子化-四极杆-飞行时间串联质谱对食用油中的甾醇类化合物的分析检测，提高了甾醇类化合物的检测灵敏度，但是该方法所采用的衍生试剂具有恶臭且强烈的刺激性，催化剂三氟甲磺酸酐具有强烈刺激性气味，环境不友好，对人体危害大，且衍生反应前需要进行提取后皂化处理，反应条件苛刻、过程繁琐，检测物质为特定的样品；中国专利（CN102978272A）利用多元有机酸或酸酐在催化剂作用下合成了植物甾醇多元酸单酯，但该方法反应时间长达6-72小时，反应温度高，能耗大。因此，利用环境友好的衍生化试剂，建立一种衍生化反应条件温和、简单快速、灵敏度高的测定植物甾醇的检测分析方法，对于食品和药品品质的评价具有十分重要的意义。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术存在的不足，提供一种利用环境友好的衍生化试剂，条件温和、简单快速、灵敏度高且适用性好的植物甾醇的检测分析方法。

本发明的技术方案为：

本发明提供了一种植物甾醇的检测分析方法，其特征在于：所述的植物甾醇在催化剂2-氯-1-甲基碘代吡啶（CMPI）和4-二甲氨基吡啶（DMAP）作用下，通过与衍生剂4’-羧基罗丹明(CSR)进行衍生化反应，得到的衍生化产物经滤膜过滤后利用超高效液相色谱三重四极杆串联质谱系统进行分析检测。

所述的检测分析方法是通过以下步骤进行：

a. 超声辅助-分散液液微萃取技术提取植物甾醇：取50-500μL植物甾醇样品溶液，加水定容至2-5 mL，调节pH为5-7，加入50-300μL的萃取剂和250-800μL的分散剂，超声波振荡萃取，离心分离，所得沉积相用氮气吹干后溶于适量乙腈，得到植物甾醇萃取物；

所述的萃取剂为二氯甲烷，三氯甲烷，三氯乙烯，四氯乙烯或氯苯；

所述的分散剂为丙酮，乙腈，甲醇或乙醇；

b.衍生化反应：向步骤a中的植物甾醇萃取物中加入衍生化试剂200-600μL的4’-羧基罗丹明乙腈溶液，100-300μL2-氯-1-甲基碘代吡啶乙腈溶液和100-300 μL 4-二甲氨基吡啶乙腈溶液，密封后摇匀，置于40-60℃水浴中反应15-40分钟，得到衍生化产物；

c.将步骤c中的衍生化产物经滤膜过滤后利用超高效液相色谱三重四极杆质谱系统进行定性定量分析检测。

所述的三氯甲烷，丙酮等化学试剂为分析纯，乙腈为高效液相色谱纯。

所述的植物甾醇样品溶液为富含植物甾醇的植物油、饮料、药材等实际样品。

所述的步骤a超声辅助-分散液液微萃取技术中，超声波震荡萃取时间为2分钟，离心3 min，转速为10000 r/m。

上述的超声辅助-分散液液微萃取技术，优化的萃取剂为三氯甲烷，优化的分散剂为甲醇。

所述的目标分析物植物甾醇是游离的豆甾醇、β-谷甾醇、菜油甾醇、菜籽甾醇或麦角甾醇。

所述的衍生化试剂4’-羧基罗丹明按照2012年Cardoso等报道的合成方法执行（European Journal of Organic Chemistry, 2012, 29, 5810–5817），经样品纯化和谱学表征对比后表明合成的4’-羧基罗丹明结构正确。采用高效液相色谱-二极管阵列检测器检测用于监控合成反应进程，经过三次微波辅助反应处理（每次15 min）即可获得最高收率。粗产品采用半制备液相色谱法进行纯化，得到纯度为99%的CSR，产率48%。

所述的步骤b中的4’-羧基罗丹明乙腈溶液的摩尔浓度为1×10^-4mol/L。 

所述2-氯-1-甲基碘代吡啶（CMPI）溶于乙腈中制成质量浓度为1-10%的溶液，2-氯-1-甲基碘代吡啶的摩尔数为4’-羧基罗丹明的500-10000倍，更优选的为7500倍。

所述的4-二甲氨基吡啶（DMAP）溶于乙腈中制成质量浓度为10-25%的溶液，4-二甲氨基吡啶的摩尔数为4’-羧基罗丹明的100-1000倍，更优选的为490倍。

所述的步骤b中衍生化反应优化的条件为；置于45℃水浴中反应30分钟。 

所述的步骤c衍生化产物经0.45 μm滤膜过滤后用超高效液相色谱三重四极杆质谱系统进行定性定量分析检测。

上述的超高效液相色谱三重四极杆串联质谱系统由安捷伦1290系列超高效液相色谱，配备安捷伦6460三重四极杆串联质谱系统组成。

上述的超高效液相色谱三重四极杆串联质谱系统中色谱分离使用安捷伦SB C18色谱柱：2.1 mm × 50 mm，1.8 μm，进样体积为2 μL，柱温30 °C，采用梯度洗脱法。

上述的梯度洗脱法，时间为5分钟，流速为0.2 mL/min，流动相A为5%乙腈水溶液含有0.1%甲酸，流动相B为乙腈含有0.1%甲酸，0 min流动相组成为50%A+50%B，5 min时10%A+90%B。

所述的超高效液相色谱三重四极杆串联质谱系统进行分析检测时的质谱的优选条件为：干燥气温度300 °C，流速10 L/min，喷雾器气压40 psi，鞘气温度280 °C，流速11 L/min，毛细管电压3.5 kV。

所述的游离的豆甾醇、β-谷甾醇、菜油甾醇、菜籽甾醇或麦角甾醇的结构式如下：

                                                               

本发明中首次使用的衍生化试剂4’-羧基罗丹明含有一个稳定的季铵型正电荷，因此，植物甾醇通过衍生化反应得到的植物甾醇衍生物进行检测时能够特异性的产生含有罗丹明结构的报告离子，带来显著的质谱增敏检测效果。以特征离子对及保留时间定性，外标法定量，带来了该检测方法极好的灵敏度、选择性和准确度，并且大大降低了基质干扰。五种游离的植物甾醇中都是只有一个羟基，该羟基能够活泼的与衍生化试剂4’-羧基罗丹明迅速反应，以豆甾醇为例的，4’-羧基罗丹明为衍生化试剂的衍生化反应过程如下所示：

 

本发明中采用超声辅助-分散液液微萃取技术提取富集在植物油、饮料、药材等实际样品中的植物甾醇，联合衍生化技术同时使用，具有简单、快速、高效、绿色等优点。

本发明的优点及有益效果：

1.本发明首次使用环境友好的4’-羧基罗丹明为衍生化试剂，衍生化反应温和快速，实现了目标分析物的高灵敏度、选择性和准确检测。

2.本发明所提供的检测分析方法，操作步骤简单，所需时间短。

3.本发明的检测分析方法针对富含植物甾醇的植物油、饮料、药材等多种实际样品，检测方法适用性好。

附图说明

图1为实施例1五种植物甾醇衍生物的质谱检测分离图。

图2为实施例1豆甾醇衍生物质谱裂解机理示意图。

图3为实施例2的质谱检测图谱。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明进行进一步的阐述，下述说明仅为了解释本发明，并不对其内容进行限定。

实施例1

植物甾醇的色谱分离和质谱定性定量分析：

植物甾醇标准品（购自中国生物制品检定所和Sigma试剂公司）用乙腈配制得到浓度为1.0 × 10^-5 mol/L的植物甾醇标准品溶液，向所述的标准品溶液中加入300μL4’-羧基罗丹明乙腈溶液，300μL CMPI乙腈溶液和300 μLDMAP乙腈溶液，4’-羧基罗丹明溶于乙腈得到1.0 × 10^-4mol/L4’-羧基罗丹明乙腈溶液，CMPI与DMAP分别配制成质量浓度5%与20%的乙腈溶液进行衍生化反应，制得植物甾醇衍生物。

使用酸性乙腈/水溶液（含0.1%甲酸）作为流动相，按照实验部分的梯度洗脱程序能得到较好的分离度，图1为五种植物甾醇衍生物的质谱检测分离图，五种分析物之间分离度良好。质谱分析实验结果表明，五种植物甾醇多反应监测模式（MRM）下产生相同的主要产物离子m/z 443.1和m/z 399.0，m/z443.1用作定量产物离子，m/z399.0用作定性产物离子。以豆甾醇衍生物为例，图2为豆甾醇衍生物质谱裂解机理示意图，母离子为[M]⁺  m/z为837.3能够产生两个特异性产物离子m/z 443.1 和 m/z 399.0。对MRM模式的参数进行了优化，五种植物甾醇衍生物的定量离子对、定性离子对、最优化碎裂电压（V）和电离能（V），以及分析方法的线性回归方程、相关系数、检出限、定量限见表1。

表1:

 实施例2

玉米油中游离植物甾醇的检测分析，包括以下操作步骤：

取100μL玉米油到离心管中，用去离子水定容到2mL。快速注入含80μL三氯甲烷及300μL甲醇的混合溶液。超声波震荡2min后，形成均匀的乳浊液体系，pH值为6，高速离心3min，转速10000 r/min。有机相沉积在离心管底部，用微量注射器吸取沉积相转移至另一小瓶中，氮气吹干后溶于乙腈。向小瓶中依次加入300μL1×10^-4mol/L的4’-羧基罗丹明乙腈溶液，200μL5w%CMPI乙腈溶液和200 μL18w%DMAP乙腈溶液，封口后摇匀，置于45 °C水浴中反应30min，得到衍生化产物。衍生化产物溶液经0.45μm滤膜过滤后进行UHPLC-MS/MS（MRM）分析检测，检测到某品牌玉米油中5种植物甾醇含量分别为: 麦角甾醇0.4±0.2 μg/g、菜籽甾醇1.7±0.5μg/g、豆甾醇986±24μg/g、菜油甾醇1828±25μg/g、β-谷甾醇5140±41μg/g（n=3），质谱检测图见图3。

实施例3

豆奶中游离植物甾醇的检测，包括以下操作步骤：

     取200μL豆奶加入高氯酸脱除蛋白，用去离子水定容到2mL。快速注入含80μL三氯甲烷及300μL甲醇的混合溶液。超声波震荡2min后，形成均匀的乳浊液体系，pH值为6，高速离心3min，转速10000r/min。有机相沉积在离心管底部，用微量注射器吸取沉积相转移至另一小瓶中，氮气吹干后溶于乙腈。向小瓶中依次加入200μL1×10^-4mol/L的 4’-羧基罗丹明乙腈溶液，200μL8w%CMPI乙腈溶液和200μL12w%DMAP乙腈溶液，封口后摇匀，置于45°C水浴中反应30min，得到衍生化产物。衍生化产物溶液经0.45μm滤膜过滤后进行UHPLC-MS/MS（MRM）分析检测，检测到某品牌豆奶中3种植物甾醇含量分别为: 豆甾醇73±8.5μg/mL、菜油甾醇59±7.6μg/mL、β-谷甾醇158±13μg/mL（n=3）。

实施例4

灵芝药材中游离植物甾醇的检测，包括以下操作步骤：

取0.1-0.5g灵芝药材粉末加入5mL甲醇提取，取2mL提取液氮吹干后加入去离子水2 mL。快速注入含80μL三氯甲烷及300μL甲醇的混合溶液。超声波震荡2min后，形成均匀的乳浊液体系，pH值为6，高速离心3min，转速10000r/min。有机相沉积在离心管底部，用微量注射器吸取沉积相转移至另一小瓶中，氮气吹干后溶于乙腈。向小瓶中依次加入500μL1×10^-4mol/L的4’-羧基罗丹明溶液，300 μL10w%CMPI乙腈溶液和300μL24w%DMAP乙腈溶液，封口后摇匀，置于45 °C水浴中反应30 min，得到衍生化产物。衍生化产物溶液经0.45μm滤膜过滤后进行UHPLC-MS/MS（MRM）分析检测，检测到灵芝药材中4种游离的植物甾醇含量分别为: 麦角甾醇315±24μg/g、豆甾醇166±15 μg/g、菜油甾醇27±3.5 μg/g、β-谷甾醇735±37μg/g（n=3）。

对比例1

该对比例过程与实施例2相同，不同在于衍生化反应过程中：衍生化试剂与衍生条件采用中国专利（CN102967647A）公开的利用吡啶作为衍生试剂，三氟甲磺酸酐作为催化剂。 

对比例2

    该对比例过程与实施例2相同，不同在于衍生化反应过程中，衍生化试剂与衍生条件采用中国专利（CN102978272A）公开的戊二酸作为衍生化试剂，催化剂为吡啶。

下表2为实施例2同对比例1和2的试验结果对比。

表2

      

从表2中可以看出，本发明利用4’-羧基罗丹明进行衍生化方法，灵敏度高，简单快速，4’-羧基罗丹明衍生化方法的检出限比对比例低10-150倍左右，本发明4’-羧基罗丹明、2-氯-1-甲基碘代吡啶和4-二甲氨基吡啶环境友好，无挥发性和刺激性气味。

为了验证所建立的分析方法的适用性，对准确度、精密度、重现性，以及实施例2-4三类实际样品中的回收率和基质效应都进行了详细的考察，详细数据见表3。

表3

             

     从表3中可以看出对于实际样品中5种植物甾醇，其线性范围在1–1000 μg mL^-1。检出限分布于0.005-0.015 ng mL^-1之间，定量限分布于0.015-0.050 ng mL^-1之间。结果表明，所建立的分析方法能够很好地应用于检测实际样品中的植物甾醇的含量。

 上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受实施例的限制，其它任何未背离本发明的精神实质与原理下所做的改变、修饰、组合、替代、简化均应为等效替换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种植物甾醇的检测分析方法，其特征在于：所述的植物甾醇在催化剂2-氯-1-甲基碘代吡啶和4-二甲氨基吡啶作用下，通过与衍生剂4’-羧基罗丹明进行衍生化反应，得到的衍生化产物经滤膜过滤后利用超高效液相色谱三重四极杆串联质谱系统进行分析检测。

2.根据权利要求1所述的检测分析方法，其特征在于：是通过以下步骤进行：

a. 超声辅助-分散液液微萃取技术提取植物甾醇：取50-500μL植物甾醇样品溶液，加水定容至2-5 mL，调节pH为5-7，加入50-300μL的萃取剂和250-800μL的分散剂，超声波振荡萃取，离心分离，所得沉积相用氮气吹干，得到植物甾醇萃取物；

所述的萃取剂为二氯甲烷，三氯甲烷，三氯乙烯，四氯乙烯或氯苯；

所述的分散剂为丙酮，乙腈，甲醇或乙醇；

b.衍生化反应：向步骤a中的植物甾醇萃取物中加入200-600μL4’-羧基罗丹明乙腈溶液，100-300μL2-氯-1-甲基碘代吡啶乙腈溶液和100-300μL4-二甲氨基吡啶乙腈溶液，密封后摇匀，置于40-60℃水浴中反应15-40分钟，得到衍生化产物；

c.将步骤c中的衍生化产物经滤膜过滤后利用超高效液相色谱三重四极杆质谱系统进行定性定量分析检测。

3.根据权利要求2所述的检测分析方法，其特征在于：步骤a中所述的萃取剂为三氯甲烷，分散剂为甲醇。

4.根据权利要求1-3任一项所述的检测分析方法，其特征在于：所述的植物甾醇是游离的豆甾醇、β-谷甾醇、菜油甾醇、菜籽甾醇或麦角甾醇。

5.根据权利要求2所述的检测分析方法，其特征在于：步骤b所述的4’-羧基罗丹明乙腈溶液的摩尔浓度为1×10^-4mol/L，2-氯-1-甲基碘代吡啶的摩尔数为4’-羧基罗丹明的500-10000倍，4-二甲氨基吡啶的摩尔数为4’-羧基罗丹明的100-1000倍。

6.根据权利要求5所述的检测分析方法，其特征在于：所述的2-氯-1-甲基碘代吡啶的摩尔数为4’-羧基罗丹明的7500倍，4-二甲氨基吡啶的摩尔数为4’-羧基罗丹明的490倍。

7.根据权利要求2所述的检测分析方法，其特征在于：所述步骤b衍生化反应的条件为：置于45℃水浴中反应30分钟。

8.根据权利要求1-2任一项所述的检测分析方法，其特征在于：所述的超高效液相色谱三重四极杆串联质谱系统中色谱分离使用安捷伦SB C18色谱柱：2.1 mm × 50 mm，1.8 μm，进样体积为2 μL，柱温30℃，采用梯度洗脱法。

9.根据权利要求8所述的检测分析方法，其特征在于：所述的梯度洗脱法，时间为5分钟，流速为0.2 mL/min，流动相A为5%乙腈水溶液含有0.1%甲酸，流动相B为乙腈含有0.1%甲酸，0 min流动相组成为50%A+50%B，5 min时10%A+90%B。

10.根据权利要求1-2任一项所述的检测分析方法，其特征在于：所述的超高效液相色谱三重四极杆串联质谱系统进行分析检测时的质谱的优选条件为：干燥气温度300℃，流速10 L/min，喷雾器气压40 psi，鞘气温度280℃，流速11 L/min，毛细管电压3.5 kV。