CN111057068B - 检测神经鞘氨醇葡萄糖苷和神经鞘氨醇半乳糖苷的多通道质谱衍生试剂及其制备方法与应用 - Google Patents

检测神经鞘氨醇葡萄糖苷和神经鞘氨醇半乳糖苷的多通道质谱衍生试剂及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于分析化学技术领域，具体涉及一种检测神经鞘氨醇葡萄糖苷(GlcS)和神经鞘氨醇半乳糖苷(GalS)的多通道质谱衍生试剂及其制备方法与应用，尤其是涉及设计合成并利用CH3/CH2D/CHD2/13CD3/CD3/C2H5/C2H3D2/C2H2D3/C2D5‑哌嗪‑左氧氟沙星‑N‑羟基琥珀酰亚胺甲酸酯作为多通道质谱衍生试剂对8份生物样本中的GlcS和GalS同时分离与定量分析。该衍生试剂的结构式为：
Figure 100004_DEST_PATH_IMAGE002
。本发明首次设计合成多通道质谱衍生试剂，衍生化反应条件温和，反应速度快，衍生产物稳定，显著提高了分析物的色谱分离度和质谱检测灵敏度、准确度及分析通量。

Description

检测神经鞘氨醇葡萄糖苷和神经鞘氨醇半乳糖苷的多通道质 谱衍生试剂及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于分析化学技术领域，具体涉及一种同时衍生和分离检测神经鞘氨醇葡萄糖苷(GlcS)和神经鞘氨醇半乳糖苷(GalS)的多通道质谱衍生试剂及其制备方法与应用，尤其是涉及设计合成并利用CH3/CH2D/CHD2/13CD3/CD3/C2H5/C2H3D2/C2H2D3/C2D5-哌嗪-左氧氟沙星-N-羟基琥珀酰亚胺甲酸酯(CH3/CH2D/CHD2/13CD3/CD3/C2H5/C2H3D2/C2H2D3/C2D5-ALSF)作为多通道质谱衍生试剂对8份生物样本中的GlcS和GalS同时分离与定量分析。
背景技术
GlcS和GalS分别是鞘氨醇的1-羟基分别与半乳糖和葡萄糖结合的溶血糖鞘脂。GlcS可在葡萄糖脑苷脂酶缺乏症引起的戈谢病中积聚。与GlcS类似的是，GalS是一种具有高度细胞毒性的脂质，可在溶血体酶半乳糖苷神经酰胺酶缺乏症引起的致命性神经退行性疾病克拉伯病中积聚。
将GlcS和GalS用作生物标志物的难点在于二者的分离检测困难，因为它们是一对同分异构体，在生物样本中的浓度极低且基质复杂，极难实现二者同时分离与定量。此外，临床测试和现代生命科学研究中对实现GlcS和GalS同时分离和高通量检测有着强烈需求。因此，建立一种快速高效、高通量、高准确度、高灵敏度、高特异性的生物样本前处理技术及仪器分析方法十分必要。Zhang等人(Analyst，2017，142:3380–3387)和Sidhu等人(Biomedical Chromatography，2018，32:e4235)分别公开了一种利用D5-GlcS和D5-GalS作为内标，采用亲水相互作用色谱串联质谱法用于GlcS和GalS的检测，但是该类研究方法分析通量较低，且所使用的同位素内标物价格昂贵且往往难以购买，致使该方法的通用性较差。Zama等人(Glycobiology，2009，19:767–775)和Orvisky等人(Molecular Genetics andMetabolism，2002，76:262–270)公开了用4-氟-7-硝基苯并呋喃或邻苯二甲醛作为衍生化试剂，衍生后通过高效液相色谱法对生物样本中的GlcS和GalS进行检测，但该类方法检测限较高，灵敏度和准确度差，且不能实现生物样本中GlcS和GalS的高通量检测。因此，开发一种经济适用、高灵敏度、高准确度、高通量的GlcS和GalS同时分离与检测的分析方法具有十分重要的意义。
发明内容
本发明的目的在于解决现有技术存在的不足，本发明提供了一种检测神经鞘氨醇葡萄糖苷(GlcS)和神经鞘氨醇半乳糖苷(GalS)的多通道质谱衍生试剂。
本发明还提供了一种上述本发明多通道质谱衍生试剂的制备方法及其应用，本发明首次设计合成9种质谱衍生试剂CH3/CH2D/CHD2/13CD3/CD3/C2H5/C2H3D2/C2H2D3/C2D5-ALSF，其中选择CH3-ALSF与GlcS和GalS的衍生物用作质谱定量的内标物，选择CH2D/CHD2/13CD3/CD3/C2H5/C2H3D2/C2H2D3/C2D5-ALSF分别衍生8份待测生物样本，以目标衍生物的结构类似物(C3H7-哌嗪-左氧氟沙星-N-羟基琥珀酰亚胺甲酸酯(C3H7-ALSF)-GlcS)为虚拟模板合成DMMIPs用于上述内标及生物样本混合液中GlcS和GalS衍生物的萃取富集，并联合超高效液相色谱三重四极杆质谱检测实现一次液-质联用进样对8份生物样本中的GlcS和GalS同时分离与定量分析。采用内标法定量，所建立的方法具有高通量、高灵敏度、高准确度、高选择性、经济适用的优点。利用DMMIPs作为萃取材料，相比于传统的样品前处理方法，具有吸附快速、效率高、易分离等优点。
本发明为了实现上述目的所采用的技术方案为：
本发明提供了一种检测神经鞘氨醇葡萄糖苷和神经鞘氨醇半乳糖苷的多通道质谱衍生试剂，所述试剂的结构式如下：
Figure GDA0002415649740000021
所述X为CH3、CH2D、CHD2、13CD3、CD3、C2H5、C2H3D2、C2H2D3或C2D5。
本发明还提供了一种上述多通道质谱衍生试剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)将100mL乙腈和10.038g碳酸氢铵加到圆底烧瓶中，并在室温下搅拌1分钟，然后将1.5g左氧氟沙星添加到该混合物中，并在室温下搅拌1分钟，随后，在3分钟内滴加48.6mmol CH3I、CH2DI、CHD2I、13CD3I、CD3I、C2H5Br、C2H3D2I、C2H2D3I、C2D5I或C3H7Br，并将混合物在室温下搅拌180h，反应后，进行减压蒸馏，将得到的粉末在80℃下真空干燥，得产物；
(2)将1.0g产物溶于60mL含1.6g N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的氯仿中，在干燥条件下，缓慢加入40ml含有5.3g 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)盐酸二乙二酰亚胺(EDC·HCL)的乙腈，并将圆底烧瓶用锡箔包裹，将混合物在室温下搅拌26小时，反应后，将其减压蒸馏，并从无水乙醇中重结晶，得到淡黄色的衍生试剂CH3/CH2D/CHD2/13CD3/CD3/C2H5/C2H3D2/C2H2D3/C2D5/C3H7-ALSF。
本发明还提供了一种上述多通道质谱衍生试剂用于检测神经鞘氨醇葡萄糖苷和神经鞘氨醇半乳糖苷的方法，包括以下步骤：首先使用CH3/CH2D/CHD2/13CD3/CD3/C2H5/C2H3D2/C2H2D3/C2D5-哌嗪-左氧氟沙星-N-羟基琥珀酰亚胺甲酸酯(CH3/CH2D/CHD2/13CD3/CD3/C2H5/C2H3D2/C2H2D3/C2D5-ALSF)作为质谱衍生试剂，其中选择CH3-ALSF与GlcS和GalS的衍生物用作内标，选择CH2D/CHD2/13CD3/CD3/C2H5/C2H3D2/C2H2D3/C2D5-ALSF分别衍生8份生物样本，选择C3H7-哌嗪-左氧氟沙星-N-羟基琥珀酰亚胺甲酸酯(C3H7-ALSF)-GlcS用作虚拟模板合成虚拟表面磁性分子印迹聚合物(DMMIPs)用于内标及待测样品混合液中GlcS和GalS衍生物的选择性萃取，利用超高效液相色谱三重四极杆串联质谱对待测样品中的GlcS和GalS的同时分离与定量分析。
上述检测方法具体包括以下步骤：
a.衍生反应过程：将50μL标准品混合溶液和8份等体积的标准品混合溶液或待测样品分别添加到装有200-350μL pH 8.4-9.5的H3BO3-Na2B4O7缓冲液的离心管中，将200-300μL CH2D/CHD2/13CD3/CD3/C2H5/C2H3D2/C2H2D3/C2D5-ALSF-分散剂溶液分别添加到8份等体积的标准品混合溶液或生物样本中组成待测物溶液，将200-300μL CH3-ALSF-分散剂溶液添加到混合标准品溶液中组成内标物混合溶液，摇匀后密封，进行衍生反应，将200-300μL的50％甲酸溶液添加到每个试管中，衍生反应结束后，将CH3-ALSF衍生的标准品混合溶液和CH2D/CHD2/13CD3/CD3/C2H5/C2H3D2/C2H2D3/C2D5-ALSF衍生的标准品混合溶液或待测样品在10.0mL离心管中等体积混合，即得到内标物和待测物混合溶液；
b.磁固相萃取过程：向内标物和待测物混合溶液加入8-12mg DMMIPs，用200-300μL，pH 8.8的H3BO3-Na2B4O7缓冲液调节溶液pH值为8.3-9.2。剧烈摇动溶液5-15分钟以达到吸附平衡，最后，用外部磁铁分离DMMIPs(15-30s)，并用200-300μL的洗脱剂洗脱1-3分钟，过滤洗脱液，并将其用乙腈定容至200μL，得到萃取后的内标物和待测物混合溶液；
c.将步骤b中的萃取后的内标物和待测物混合溶液经滤膜过滤后利用超高效液相色谱三重四极杆质谱系统进行定性定量分析检测。
进一步的，所述50μL混合标准品溶液是由25μL浓度为2×10-8mol/L的GlcS和25μL浓度为2×10-8mol/L的GalS组成；所述的洗脱剂为体积为1:1的甲醇/水、乙醇/水、乙腈/水、丙酮/水溶液，以及分别含有0.01％、0.05％、0.15％、0.20％甲酸的体积为1:1的甲醇/水溶液；所述的分散剂为丙酮，乙腈，甲醇或乙醇；优化的，所述洗脱剂为含有0.01％甲酸的体积为1:1的甲醇/水溶液；所述分散剂为乙腈。
进一步的，步骤(a)中，所述CH3/CH2D/CHD2/13CD3/CD3/C2H5/C2H3D2/C2H2D3/C2D5-ALSF-分散剂溶液的摩尔浓度为2.5×10-8mol/L；所述衍生反应为在水浴45-55℃中超声波振荡反应下进行2-5分钟。
本发明所使用的所述DMMIPs采用以下方法制备而成：在剧烈搅拌下，将1.0g三氯化铁六水合物，2.0g无水乙酸钠和6.5g 1，6-己二胺依次分散在30mL乙二醇中，将混合物在室温下连续搅拌直至混合物变为透明溶液，然后，将上述溶液转移到衬有聚四氟乙烯的高压釜中，并在200℃下反应24小时；将获得的产物用水和乙醇洗涤三次，然后在60℃下真空干燥24小时，将100mg所得产物，200mg 4-甲酰基苯硼酸和250mg硼氢化钠在无水甲醇(25mL)中超声处理20分钟，以获得均匀的分散溶液；将获得的均匀溶液在65℃下回流24小时，最后，将产物用水和甲醇洗涤三次，将获得的产物在真空烘箱中在60℃下干燥24小时；将50mg的产物和0.42mg的C3H7-ALSF与GlcS的衍生物依次分散在30mL pH 8.0的磷酸盐缓冲液中。将混合物在25℃下搅拌1h，然后用pH 8.0的磷酸缓冲液漂洗3次。将获得的均匀溶液在65℃下回流24小时。随后，将预产物溶解在10mL的乙腈溶剂中，然后添加0.14mg丙烯酰胺，并将混合物超声处理15.0min，然后将混合物放入黑暗中12小时以形成预聚合溶液。在超声波振动15.0分钟下，将1.97mg乙二醇二甲基丙烯酸酯和0.1mg偶氮二异丁腈均匀分散在预聚合溶液中。然后将溶液转移到含有70mL乙腈的三颈烧瓶中。在60℃下充入氮气并连续搅拌24小时。通过磁铁分离获得DMMIPs，并在索氏提取器中用含0.10％甲酸的体积为1:1的甲醇和H2O溶液洗涤，直到在溶液中未检测到模板分子为止。最后，溶液用甲醇洗涤至中性，磁铁分离后在60℃下真空干燥24小时，所的固体即为DMMIPs。
进一步的，所述的C3H7-ALSF与GlcS的衍生物C3H7-ALSF-GlcS采用以下方法制备而成：将0.5mg GlcS溶于5mL pH 8.8的H3BO3-Na2B4O7缓冲液中，在搅拌下将4mg C3H7-ALSF与5mL乙腈缓慢加入上述溶液中，在室温下连续搅拌2.5小时后，通过减压蒸馏除去乙腈，通过过滤获得黄色沉淀物，在乙醇/水中结晶后，获得为白色晶体的C3H7-ALSF-GlcS。
本发明所使用的的超高效液相色谱三重四极杆串联质谱系统中色谱分离使用安捷伦SB C18色谱柱：2.1mm×50mm，1.8μm，进样体积为2μL，柱温30℃，采用梯度洗脱法。
上述的梯度洗脱法，时间为2min，流速为0.2mL/min，流动相A为10％乙腈水溶液含有0.1％甲酸，流动相B为乙腈含有0.1％甲酸，0min流动相组成为50％A+50％B，0.5min时22％A+78％B，1.5min时8％A+92％B，1.6min时2％A+98％B，2.0min时0％A+100％B。
本发明所使用的的超高效液相色谱三重四极杆串联质谱系统进行分析检测时的质谱的条件为：干燥气温度300℃，流速10L/min，喷雾器气压40psi，鞘气温度280℃，流速11L/min，毛细管电压3.5kV。
本发明流动相中各分数均指体积分数。
所述的目标分析物结构式如下所示：
Figure GDA0002415649740000041
本发明首次使用9种分别含有一个分子内永久正电荷的多通道质谱衍生试剂，因此，8份生物样本中的GlcS和GalS通过衍生化反应得到的衍生物进行检测时能够特异性的产生含有不同同位素标签和左氧氟沙星结构的子离子，带来显著的质谱增敏检测效果。以特征离子对及保留时间进行定性和定量，结合内标法，带来了该检测方法极好的灵敏度、选择性、准确度，并且大大降低了基质效应，实现了GlcS和GalS的高通量分析。GlcS和GalS都含有氨基，能够与衍生化试剂CH3/CH2D/CHD2/13CD3/CD3/C2H5/C2H3D2/C2H2D3/C2D5-ALSF迅速反应，CH3/CH2D/CHD2/13CD3/CD3/C2H5/C2H3D2/C2H2D3/C2D5-ALSF作为衍生化试剂的衍生化反应过程如下所示：
Figure GDA0002415649740000051
本发明采用多通道质谱衍生试剂联合DMMIPs提取富集多份生物样本中的GlcS和GalS，具有经济适用、高通量、高效灵敏等优点。多通道质谱衍生试剂联合DMMIPs是一种良好的富集痕量组分、降低基质干扰、提高方法灵敏度和实现样品高通量分析的的前处理技术，联合超高效液相色谱三重四极杆质谱检测可实现一次液质联用进样对8份生物样本中的GlcS和GalS同时分离与定量分析，具有显著优势。
本发明的优点及有益效果：
1.本发明首次设计合成多通道质谱衍生试剂CH3/CH2D/CHD2/13CD3/CD3/C2H5/C2H3D2/C2H2D3/C2D5-ALSF，衍生化反应条件温和，反应速度快，衍生产物稳定，显著提高了分析物的色谱分离度和质谱检测灵敏度、准确度及分析通量。
2.本发明所提供的DMMIPs萃取的前处理技术，通过硼亲和pH响应机制结合分子印迹特异性空间匹配腔捕获并释放GlcS和GalS的衍生物，联合超高效液相色谱三重四极杆质谱检测手段，具有特异性好、准确度高、灵敏度高的优点。
3.本发明的检测分析方法成功应用于含有GlcS和GalS的人体血浆或血清样本中，分析方法适用性好，对于戈谢病、克拉伯病等相关疾病的鉴别和诊断、疾病过程的监测、治疗方法的建立、乃至新药的开发都具有潜在的巨大价值。
附图说明
图1为多通道质谱衍生试剂衍生化结合磁分散固相萃取和超高相液相色谱策略原理示意图。
图2为实施例1中九种质谱衍生试剂的GlcS和GalS衍生物的质谱检测分离图。
图3为实施例1中CH3-ALSF与GlcS(A)和GalS(B)衍生物的质谱裂解机理示意图。
图4为实施例3中模拟戈谢病人血浆中GlcS和GalS衍生产物质谱检测分离图。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明进行进一步的阐述，下述说明仅为了解释本发明，并不对其内容进行限定。
本发明中衍生化萃取物经0.22μm滤膜过滤后利用超高效液相色谱三重四极杆串联质谱系统进行分析检测，图1为多通道质谱衍生试剂衍生化结合磁分散固相萃取和超高相液相色谱策略原理示意图。
本发明所使用的多通道质谱衍生化试剂合成方法如下：将100mL乙腈和10.038g碳酸氢铵加到圆底烧瓶中，并在室温下搅拌1分钟。然后将1.5g左氧氟沙星添加到该混合物中，并在室温下搅拌1分钟。随后，在3分钟内滴加48.6mmol CH3I，并将混合物在室温下搅拌180h。反应后，进行减压蒸馏，将得到的粉末在80℃下真空干燥。将约1.0g产物溶于60mL含1.6g N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的氯仿中。在干燥条件下，缓慢加入40ml含有5.3g 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)盐酸二乙二酰亚胺(EDC·HCL)的乙腈，并将圆底烧瓶用锡箔包裹。将混合物室温下搅拌26小时。反应后，将其减压蒸馏，并从无水乙醇中重结晶，得到淡黄色的CH3-ALSF。CH2D/CHD2/13CD3/CD3/C2H5/C2H3D2/C2H2D3/C2D5-ALSF的合成过程只有在“在3分钟内滴加48.6mmol CH3I”部分CH3I分别换用CH2DI，CHD2I，13CD3I，CD3I，C2H5Br，C2H3D2I，C2H2D3I，C2D5I试剂，其余实验步骤相同。另外所述的C3H7-ALSF的合成过程同样也是上述部分中的CH3I换用了C3H7Br，其他实验步骤也与上述过程完全相同。CH3/CH2D/CHD2/13CD3/CD3/C2H5/C2H3D2/C2H2D3/C2D5/C3H7-ALSF的合成产率都在55％-65％之间。
本发明所使用的DMMIPs采用以下方法制备而成：在剧烈搅拌下，将三氯化铁六水合物(1.0g)，无水乙酸钠(2.0g)和1，6-己二胺(6.5g)依次分散在乙二醇(30mL)中。将混合物在室温下连续搅拌直至混合物变为透明溶液(30min)。然后，将上述溶液转移到衬有聚四氟乙烯的高压釜中，并在200℃下反应24小时。将获得的产物用水和乙醇洗涤三次，然后在60℃下真空干燥24小时。将100mg所得产物，200mg 4-甲酰基苯硼酸和250mg硼氢化钠在无水甲醇(25mL)中超声处理20分钟，以获得均匀的分散溶液。将获得的均匀溶液在65℃下回流24小时。最后，将产物用水和甲醇洗涤三次。将获得的产物在真空烘箱中在60℃下干燥24小时。将50mg的前一步产物和0.42mg的C3H7-ALSF与GlcS的衍生物依次分散在30mL pH 8.0的磷酸盐缓冲液中。将混合物在25℃下搅拌1h，然后用pH 8.0的磷酸缓冲液漂洗3次。将获得的均匀溶液在65℃下回流24小时。随后，将预产物溶解在10mL的乙腈溶剂中，然后添加0.14mg丙烯酰胺，并将混合物超声处理15.0min，然后将混合物放入黑暗中12小时以形成预聚合溶液。在超声波振动15.0分钟下，将1.97mg乙二醇二甲基丙烯酸酯和0.1mg偶氮二异丁腈均匀分散在预聚合溶液中。然后将溶液转移到含有70mL乙腈的三颈烧瓶中。在60℃下充入氮气并连续搅拌24小时。通过磁铁分离获得DMMIPs，并在索氏提取器中用含0.10％甲酸的体积为1:1的甲醇和H2O溶液洗涤，直到在溶液中未检测到模板分子为止。最后，溶液用甲醇洗涤至中性，磁铁分离后在60℃下真空干燥24小时，所的固体即为DMMIPs。
实施例1
去脂血浆中GlcS和GalS加标样品的色谱分离和质谱定性定量分析：
GlcS和GalS分别用乙腈配置得到1×10-6mo/L的标准品储备溶液，然后用去脂血浆配制分别得到浓度为0.02/0.02，0.2/0.2，2.0/2.0，20.0/20.0，50.0/50.0，100.0/100.0，400.0/400.0，800.0/800.0nmol/L的GlcS和GalS混合标准溶液，加标后溶液的浓度范围涵盖了戈谢病或克拉伯病患者血浆内GlcS/GalS含量范围。CH3/CH2D/CHD2/13CD3/CD3/C2H5/C2H3D2/C2H2D3/C2D5-ALSF溶于乙腈得到2.5×10-8mol/L衍生试剂乙腈溶液；从8份去脂血浆混标溶液和单份乙腈混标溶液中分别取50μL混标溶液置于1.5mL离心管中，分别添加300μLH3BO3-Na2B4O7(pH 8.8)缓冲溶液，将200μL CH3-ALSF-乙腈溶液(乙腈作为分散剂，当该处分散剂改用丙酮，甲醇或乙醇时，分析物衍生效率处于乙腈做分散剂时的40-92％之间)添加到乙腈混标溶液中；同时向8份去脂血浆混标溶液中分别添加200μL CH2D/CHD2/13CD3/CD3/C2H5/C2H3D2/C2H2D3/C2D5-ALSF-乙腈溶液，上述溶液摇匀后密封，衍生反应在水浴40℃中超声波振荡反应下进行5分钟。为了终止每个衍生反应，将200μL的50％甲酸溶液添加到每个试管中。衍生反应结束后，将CH3-ALSF衍生的混合标准品乙腈溶液和CH2D/CHD2/13CD3/CD3/C2H5/C2H3D2/C2H2D3/C2D5-ALSF衍生的混合标准品去脂血浆溶液在10.0mL离心管中等体积混合，加入8mg DMMIPs，用200μL的H3BO3-Na2B4O7(pH 8.8)缓冲液调节溶液pH为8.3。剧烈摇动溶液5分钟以达到吸附平衡。最后，用外部磁体分离DMMIPs(15s)，并用200μL的含0.10％甲酸的体积为1:1的甲醇/水溶液洗脱1分钟(含0.10％甲酸的体积为1:1的甲醇/水溶液作为洗脱剂，当该处洗脱剂改用体积为1:1的甲醇/水、乙醇/水、乙腈/水、丙酮/水，以及分别含有0.01％、0.05％、0.15％、0.20％甲酸的体积为1:1的甲醇/水溶液时，分析物萃取效率处于乙腈做洗脱剂时的52-96％之间)。过滤洗脱液，并将其用乙腈定容至200μL，衍生化产物萃取溶液经有机系滤膜过滤后进样2μL，进行UHPLC-MS/MS(MRM)分析检测，所述的梯度洗脱法，时间为2.0min，流速为0.2mL/min，流动相A为10％乙腈水溶液含有0.1％甲酸，流动相B为乙腈含有0.1％甲酸，0min流动相组成为50％A+50％B，0.5min时22％A+78％B，1.5min时8％A+92％B，1.6min时2％A+98％B，2.0min时0％A+100％B；质谱的条件为：干燥气温度300℃，流速10L/min，喷雾器气压40psi，鞘气温度280℃，流速11L/min，毛细管电压3.5kV。
按照上述梯度洗脱程序能得到较好的分离度，图2为九种质谱衍生试剂衍生的GlcS和GalS衍生物的质谱检测分离图谱，18种衍生产物之间分离度良好且保留时间相对紧凑。质谱分析实验结果表明，GlcS和GalS衍生产物多反应监测模式下分别都产生m/z359.2、360.2、361.2、362.2、363.2、373.2、375.2、376.2、378.2的特征产物离子，并结合保留时间对分析物进行定性和定量。上述18种衍生产物都是在酰胺键处发生断裂，因此其质谱碎裂模式具有一致性。以CH3-ALSF与GlcS/GalS的衍生物为例，图3为CH3-ALSF与GlcS和GalS的衍生物质谱裂解机理示意图，母离子为[M]+m/z 819.5能够产生m/z 359.2的特异性子离子。对MRM模式的参数进行了优化，18种衍生产物的保留时间、定量离子对、最优化碎裂电压(V)和碰撞能(eV)，以及分析方法的线性范围、相关系数、检出限、定量限见表1。
表1
Figure GDA0002415649740000081
实施例2
模拟戈谢病人血清中GlcS和GalS的检测分析，包括以下操作步骤：
从当地医院取8份健康人体血清样品于离心管中均匀混合中，并在4℃下快速离心，取500μL血清样品并加入500μL甲醇置于1.5mL离心管中，涡旋振荡1.5分钟并离心去除蛋白质沉淀，取40μL置于1.5mL离心管中，一式8份制备，然后往其中七份中分别加入10μL浓度分别为25.0，50.0，100.0，300.0，500.0，1000.0，4000.0nmol/L乙腈稀释的GlcS标准溶液，加标后溶液的浓度范围涵盖了戈谢病患者血清内GlcS含量范围。剩余一份加入10μL乙腈溶液作为对照。另外取50μL的混标乙腈溶液(由浓度为1×10-8mol/L GalS、浓度为1×10-8mol/L GlcS组成)于1.5mL离心管中，向8份血清样品及一份混标乙腈溶液中分别添加350μL H3BO3-Na2B4O7(pH 9.5)缓冲溶液，将300μL浓度为2.5×10-8mol/L CH3-ALSF-乙腈溶液添加到混标乙腈溶液中；同时向8份血清样品中分别添加300μL浓度为2.5×10-8mol/L CH2D/CHD2/13CD3/CD3/C2H5/C2H3D2/C2H2D3/C2D5-ALSF-乙腈溶液，上述溶液摇匀后密封，衍生反应在水浴50℃中超声波振荡反应下进行3分钟。为了终止每个衍生反应，将300μL的50％甲酸溶液添加到每个试管中。衍生反应结束后，将CH3-ALSF衍生的混标乙腈溶液和CH2D/CHD2/13CD3/CD3/C2H5/C2H3D2/C2H2D3/C2D5-ALSF衍生的血清溶液在10.0mL离心管中等体积混合，加入12mg DMMIPs，用300μL的H3BO3-Na2B4O7(pH 8.8)缓冲液调节溶液pH为8.1。剧烈摇动溶液15分钟以达到吸附平衡。最后，用外部磁体分离DMMIPs(30s)，并用300μL的含0.10％甲酸的体积为1:1的甲醇/水溶液洗脱3分钟。过滤洗脱液，并将其用乙腈定容至200μL，按照上述液相、质谱条件进行UHPLC-MS/MS(MRM)分析，检测到8份血清样品中GlcS含量(n＝3)分别为7.736nmol/L、12.758nmol/L、22.735nmol/L、62.698nmol/L、102.686nmol/L、216.796nmol/L、815.772nmol/L、2.137nmol/L，GalS含量(n＝3)分别为1.819nmol/L、1.828nmol/L、1.806nmol/L、1.798nmol/L、1.832nmol/L、1.792nmol/L、1.813nmol/L、1.809nmol/L。
实施例3
模拟戈谢病人血浆中GlcS和GalS的检测，包括以下操作步骤：
从当地医院取8份健康人体血浆在含乙二胺四乙酸(EDTA)的试管中均匀混合，并在4℃下快速离心，取2mL血浆样品并加入8mL甲醇置于15.0mL离心管中，涡旋振荡2分钟并离心去除蛋白质沉淀，取40μL置于1.5mL离心管中，一式8份制备，然后往其中七份中分别加入10μL浓度分别为25.0，50.0，100.0，300.0，500.0，1000.0，4000.0nmol/L乙腈稀释的GlcS标准溶液，加标后溶液的浓度范围涵盖了戈谢病患者血浆内GlcS含量范围，剩余一份加入10μL乙腈溶液作为对照。另外取50μL的混标乙腈溶液(由浓度为1×10-8mol/L GalS、浓度为1×10-8mol/L GlcS组成)于1.5mL离心管中，向8份血浆样品及一份混标乙腈溶液中分别添加230μL H3BO3-Na2B4O7(pH 8.4)缓冲溶液，将250μL浓度为2.5×10-8mol/L CH3-ALSF-乙腈溶液添加到混标乙腈溶液中；同时向8份血浆样品中分别添加250μL浓度为2.5×10-8mol/LCH2D/CHD2/13CD3/CD3/C2H5/C2H3D2/C2H2D3/C2D5-ALSF-乙腈溶液，上述溶液摇匀后密封，衍生反应在水浴55℃中超声波振荡反应下进行5分钟。为了终止每个衍生反应，将300μL的50％甲酸溶液添加到每个试管中。衍生反应结束后，将CH3-ALSF衍生的混标乙腈溶液和CH2D/CHD2/13CD3/CD3/C2H5/C2H3D2/C2H2D3/C2D5-ALSF衍生的混标血浆溶液在10.0mL离心管中等体积混合，加入10mg DMMIPs，用250μL的H3BO3-Na2B4O7(pH 8.8)缓冲液调节溶液pH为9.0。剧烈摇动溶液8分钟以达到吸附平衡。最后，用外部磁体分离DMMIPs(20s)，并用250μL的含0.10％甲酸的体积为1:1的甲醇/水溶液洗脱2分钟。过滤洗脱液，并将其用乙腈定容至200μL，按照上述液相、质谱条件进行UHPLC-MS/MS(MRM)分析，检测到8份血浆样品内GlcS含量(n＝3)分别为7.436nmol/L、11.958nmol/L、21.435nmol/L、67.698nmol/L、109.686nmol/L、195.796nmol/L、823.772nmol/L、2.225nmol/L，GalS含量(n＝3)分别为1.819nmol/L、1.828nmol/L、1.806nmol/L、1.798nmol/L、1.832nmol/L、1.792nmol/L、1.813nmol/L、1.809nmol/L，该样品质谱检测图见图4。
对比例1
该对比例过程与实施例2在研究的生物样本方面相同，且都应用了衍生化反应，不同在于衍生化反应过程中，衍生化试剂与衍生条件采用参考文献(Glycobiology，2009，19:767–775)公开的邻苯二甲醛作为衍生试剂，并在衍生化反应结束后采用高效液相色谱检测。由于文献中未涉及检出限和回收率，在本发明专利中根据文献中所给的优化条件在本实验室利用邻苯二甲醛作为衍生试剂对该方法在血清加标样品中进行检出限和回收率的测定，结果见表二。
对比例2
该对比例过程与实施例3在研究的生物样本方面相同，且都应用了衍生化反应，不同在于衍生化反应过程中，衍生化试剂与衍生条件采用参考文献(Molecular Geneticsand Metabolism，2002，76:262–270)公开的4-氟-7-硝基苯并呋喃作为衍生试剂，并在衍生化反应结束后进行高效液相色谱检测。由于文献中未涉及检出限和回收率，在此根据文献中所给的优化条件在本实验室利用4-氟-7-硝基苯并呋喃作为衍生试剂对该方法在血浆加标样品中进行检出限和回收率的测定，结果见表二。
对比例3
该对比例过程与实施例2在研究的生物样本和检测方法方面相同，不同在于样品前处理过程中，采用Sidhu等人(Biomedical Chromatography，2018，32:e4235)公开的使用D5-GlcS和D5-GalS作为内标，然后结合液相色谱串联质谱法对GlcS和GalS进行检测。未使用衍生试剂衍生和未进行DMMIPs磁固相萃取。
对比例4
该对比例过程与实施例3在研究的生物样本和检测方法方面相同，不同在于样品前处理过程中，采用Zhang等人(Analyst，2017，142:3380–3387)公开的使用D5-GlcS和D5-GalS作为内标，然后结合液相色谱串联质谱法对GlcS和GalS进行检测。未使用衍生试剂衍生和未进行DMMIPs磁固相萃取。
下表2为实施例2和3同对比例1-4的试验结果对比。
表2
Figure GDA0002415649740000111
从表2中可以看出，与相关报道相比，本发明利用9种质谱衍生试剂CH3/CH2D/CHD2/13CD3/CD3/C2H5/C2H3D2/C2H2D3/C2D5-ALSF进行衍生化方法，衍生条件温和，迅速，灵敏度高。多通道质谱衍生试剂结合DMMIPs的方法的检出限比对比例低40-1000倍左右。该方法回收率结果良好，对分析方法的准确度提供了保障，并在很大程度上实现了生物样本的高通量检测。
为了验证所建立的分析方法的适用性，对准确度、精密度，以及实施例2，3两类实际样品中的基质效应进行了详细考察，结果见表3。
表3
Figure GDA0002415649740000121
由表1，表2和表3可知，对于生物样本中GlcS和GalS，其线性范围在0.02–800nmol/L，检出限和定量限分别在5pmol/L和0.02nmol/L左右。结果表明，所建立的分析方法具有高通量，高灵敏度，高准确度，高选择性等优势，有效降低了基质干扰，能够实现同时分离与检测人体血清或血浆样品中GlcS和GalS含量。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受实施例的限制，其它任何未背离本发明的精神实质与原理下所做的改变、修饰、组合、替代、简化均应为等效替换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (2)

1.一种检测神经鞘氨醇葡萄糖苷和神经鞘氨醇半乳糖苷的多通道质谱衍生试剂，其特征在于，所述试剂的结构式如下：
Figure DEST_PATH_IMAGE002
；
所述X为CH3、CH2D、CHD2、13CD3、CD3、C2H5、C2H3D2、C2H2D3、C2D5。
2.一种如权利要求1所述的多通道质谱衍生试剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将100 mL乙腈和10.038 g 碳酸氢铵加到圆底烧瓶中，并在室温下搅拌1分钟，然后将1.5 g左氧氟沙星添加到该混合物中，并在室温下搅拌1分钟，随后，在3分钟内滴加48.6mmol CH3I、CH2DI、CHD2I、13CD3I、CD3I、C2H5Br、C2H3D2I、C2H2D3I、C2D5I，并将混合物在室温下搅拌180h，反应后，进行减压蒸馏，将得到的粉末在80 ℃下真空干燥，得产物；
（2）将1.0g产物溶于60 mL含1.6 g N-羟基琥珀酰亚胺(NHS) 的氯仿中，在干燥条件下，缓慢加入40 ml含有5.3 g 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)盐酸二乙二酰亚胺(EDC•HCL)的乙腈，并将圆底烧瓶用锡箔包裹，将混合物在室温下搅拌26小时，反应后，将其减压蒸馏，并从无水乙醇中重结晶，得到淡黄色的衍生试剂CH3-ALSF、CH2D-ALSF、CHD2-ALSF、13CD3-ALSF CD3-ALSF、C2H5-ALSF、C2H3D2-ALSF、C2H2D3-ALSF、C2D5 –ALSF；
所述CH3-ALSF的结构式为：
Figure DEST_PATH_IMAGE004
；
所述CH2D-ALSF的结构式为：
Figure DEST_PATH_IMAGE006
所述CHD2-ALSF的结构式为：
Figure DEST_PATH_IMAGE008
；
所述13CD3-ALSF的结构式为：
Figure DEST_PATH_IMAGE010
；
所述CD3-ALSF的结构式为：
Figure DEST_PATH_IMAGE012
；
所述C2H5-ALSF的结构式为：
Figure DEST_PATH_IMAGE014
；
所述C2H3D2-ALSF的结构式为：
Figure DEST_PATH_IMAGE016
；
所述C2H2D3-ALSF的结构式为：
Figure DEST_PATH_IMAGE018
；
所述C2D5 –ALSF的结构式为：
Figure DEST_PATH_IMAGE020
。
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