CN108348506A - 包含治疗剂的治疗性纳米粒及其制备和使用方法 - Google Patents

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Abstract

一般来说，本公开涉及纳米粒，其包含内‑溶酶体破坏剂、核酸和聚合物。其他方面包括制备和使用这样的纳米粒的方法。

Description

包含治疗剂的治疗性纳米粒及其制备和使用方法
相关申请
本申请要求2015年8月21日提交的美国临时申请号62/208,361，2015年10月7日提交的美国临时申请号62/238,400，2015年10月16日提交的美国临时申请号62/242,515，2016年1月15日提交的美国临时申请号62/279,295以及2016年6月13日提交的62/349,377的优先权，它们各自以其整体并入。
背景
将某些药物递送至患者(例如，靶向特定组织或细胞类型或靶向具体疾病组织但不靶向正常组织)或控制药物释放的系统长久以来一直被认为是有益的。
例如，包括活性药物并且，例如，靶向特定组织或细胞类型或靶向具体疾病组织但不靶向正常组织的治疗剂可减少未被靶向的身体组织中的药物的量。在治疗诸如癌症(其中期望细胞毒性剂量的药物递送至癌细胞而不杀死周围的非癌组织)的病况时，这是特别重要的。有效药物靶向可减少抗癌疗法中常见的不期望和有时危及生命的副作用。此外，这样的治疗剂可使药物到达它们以其它方式不能到达的某些组织。
提供控制释放和/或靶向疗法的治疗剂还必须能够递送有效量的药物，其在其它纳米粒递送系统中是已知的限制。例如，制备具有与各纳米粒缔合的适量药物、同时保持纳米粒的大小足够小以具有有利递送性质的纳米粒系统可为一个挑战。
核酸(诸如治疗性siRNA、mRNA或反义核酸)的治疗性递送需要有效且无毒的递送方法。然而，在这样的递送中存在重大挑战，包括，例如，核酸被核酸酶降解和/或缺乏有效转运至细胞或细胞核中。包括核酸的纳米粒制剂通常受阻于不期望的性质，例如，爆发性释放特征和核酸降解。
因此，存在对纳米粒治疗剂和制备这样的纳米粒的方法的需求，其能递送核酸分子至细胞中同时还能防止核酸分子的降解。
发明概述
本文描述的是治疗性和/或药学上可接受的聚合物纳米粒(其包括核酸和疏水性抗衡离子)，以及制备和使用这样的纳米粒的方法。例如，本文提供的是药学上可接受的纳米粒，其包含核酸和疏水性抗衡离子剂；以及约50重量％至约99.75重量％的二嵌段聚(乳)酸-聚(乙)二醇共聚物或二嵌段聚(乳酸-共-乙醇酸)-聚(乙)二醇共聚物。所述疏水性抗衡离子剂可以是，例如，内体和/或溶酶体破坏剂(例如，内-溶酶体破坏剂)。
所涵盖的纳米粒可包括核酸(诸如那些选自：反义化合物、mRNA、短干扰RNA(siRNA)、双链RNA(dsRNA)、微-RNA(miRNA)、核仁小RNA(sno-RNA)、Piwi-相互作用RNA(piRNA)和短发夹RNA(shRNA)分子)。例如，所涵盖的核酸可以是寡核苷酸(例如，反义)、适体、载体、苏糖核酸、二醇核酸(GNA)以及锁核酸(LNA)。在一些实施方案中，纳米粒包括未修饰的核酸。
在一些方面，本文提供的纳米粒包括核酸和疏水性抗衡离子剂，疏水性抗衡离子剂的logP是约2或更大，例如，logP为约2至约3。
应该理解，纳米粒可包含一个核酸分子或多个核酸分子。所述多个核酸分子可包含一种或多种类型或种类的核酸分子。例如，纳米粒可同时包含miRNA和shRNA。
附图简述
图1是形成所公开的纳米粒的乳化方法的流程图。
图2A和2B显示所公开的乳化方法的流程图。
图3是核酸(诸如ssDNA)核酸酶稳定性试验的流程图。
图4是形成所公开纳米粒的乳化方法的流程图。
图5描述用于体外释放试验的基于染料和基于HPLC的定量的比较。
图6描述含有双十二烷基溴化铵作为抗衡离子或内-溶酶体剂的纳米粒在指定的抗衡离子剂与寡核苷酸比率下的寡核苷酸随时间的体外释放。
图7描述含有氯丙嗪作为抗衡离子或内-溶酶体剂的纳米粒在指定的抗衡离子剂与寡核苷酸比率下的寡核苷酸随时间的体外释放。
图8描述负载核酸和指定抗衡离子或内-溶酶体逃脱剂(escape agent)的纳米粒的zeta电位。
图9描述相对于裸露的ssDNA，封装在纳米粒中的ssDNA的核酸酶降解的稳定性。
图10A-1、10A-2、10A-3、10B-1、10B-2和10B-3包括所涵盖的疏水性抗衡离子剂，诸如内-溶酶体破坏剂。
图11描述使用细乳液后(post fine emulsion)添加抗衡离子随后加入寡核苷酸的制备方法制备的纳米粒的释放曲线。
图12描述含有月桂酰精氨酸乙酯作为抗衡离子的纳米粒在指定的抗衡离子剂与寡核苷酸比率下的寡核苷酸随时间的体外释放。
图13描述含有脱氢松香胺(leelamine)作为抗衡离子的纳米粒在指定的抗衡离子剂与寡核苷酸比率下的寡核苷酸随时间的体外释放。
图14描述ASO-抗衡离子纳米粒的释放曲线。
图15A和15B描述蛋白质印迹结果。
图16A-16C描述ASO从纳米粒释放24、48或72小时后游离ASO对比纳米粒制剂1、2、3和4的剂量-反应曲线。图16D描述相对于游离ASO处理组计算的各纳米粒制剂的IC50值来用于计算在37℃孵育24、48和72小时后从纳米粒中释放的ASO的相对百分比。
图17A描述KB细胞(表皮样癌)的荧光显微照片，显示荧光标记的叶酸靶向的纳米粒(红色箭头表示)、溶酶体(绿色箭头表示)和细胞核(蓝色箭头表示)的内化及相对亚细胞定位。图17B描述在0分钟、15分钟和60分钟时结合的叶酸靶向的纳米粒的内化百分比。
图18A和图18描述细胞试验结果。图18A描述通过活细胞分析系统测量的相对eGFR荧光结果。图18B报告实时PCR转录结果。
图19A、19B和19C描述用游离siRNA(图19A)、PTNP-siRNA(图19B)和B890-siRNA(图19C)进行的细胞试验的结果。
图20A、20B、20C和20D描述在78小时时多种siRNA制剂的细胞试验的结果。
图21A-21C描述细胞试验的结果，特别是未处理细胞在0和88小时时的细胞试验中的荧光。
图22A-22C描述细胞试验的结果，特别是B890-siRNA纳米粒和多塞平在0和88小时时的细胞试验中的荧光。
发明详述
本文描述的是包含核酸的聚合物纳米粒，以及制备和使用这样的治疗性纳米粒的方法。在一些实施方案中，所公开的纳米粒包含离子对，离子对包含核酸分子和疏水性抗衡离子(诸如内-溶酶体破坏剂)。例如，这样的公开的纳米粒可实现有效转染。此外，在某些实施方案中，包含疏水性抗衡离子剂(诸如内-溶酶体破坏剂)和/或在疏水性抗衡离子剂存在下制备的纳米粒可呈现改善的核酸分子完整性。例如，如一旦向患者给药，包含核酸的公开的纳米粒除了实现有效转染外可基本上防止核酸降解。
不期望受限于任何理论，相信所公开的包含至少一种核酸的纳米粒通过与疏水性抗衡离子剂(诸如内-溶酶体破坏剂)形成离子对而具有显著改善的核酸完整性和/或转染。应该理解，术语“离子对”不限于1:1的比率，而是指相反电荷的离子以任何比率被相互吸引。例如，带八个负电荷的核酸分子可与带八个正电荷的分子“配对”。因此，如本文所使用的，离子对是通过库伦吸引而保持在一起的一对带相反电荷的离子。如本文所涵盖的，离子对形成可导致纳米粒具有例如增加的药物负载。由于在水溶液中的核酸的溶解度降低，例如在一些实施方案中，也可能发生使核酸从纳米粒中较缓慢地释放。此外，将核酸与大疏水性抗衡离子复合可减缓核酸在聚合物基质内的扩散。应该注意的是，离子对在本文中也可称为复合物。有利地，离子对的形成不需要疏水性基团与治疗剂的共价缀合。
不期望受限于任何理论，相信离子对的强度影响所涵盖的纳米粒的药物负载和释放速率。例如，可通过增加核酸的pKa与疏水性抗衡离子剂(诸如内-溶酶体破坏剂)的pKa之间的差异大小增加离子对的强度，如下文更详细的讨论。而且，不期望受限于任何理论，相信离子对形成的条件影响所涵盖的纳米粒的药物负载和释放速率。
本文所公开的纳米粒包括一种、两种、三种或更多种的生物相容性和/或生物降解的聚合物。例如，所涵盖的纳米粒可包含约35重量％至约99.75重量％，在一些实施方案中约50重量％至约99.75重量％，在一些实施方案中约50重量％至约99.5重量％，在一些实施方案中约50重量％至约99重量％，在一些实施方案中约50重量％至约98重量％，在一些实施方案中约50重量％至约97重量％，在一些实施方案中约50重量％至约96重量％，在一些实施方案中约50重量％至约95重量％，在一些实施方案中约50重量％至约94重量％，在一些实施方案中约50重量％至约93重量％，在一些实施方案中约50重量％至约92重量％，在一些实施方案中约50重量％至约91重量％，在一些实施方案中约50重量％至约90重量％，在一些实施方案中约50重量％至约85重量％，在一些实施方案中约60重量％至约85重量％，在一些实施方案中约65重量％至约85重量％，以及在一些实施方案中约50重量％至约80重量％的一种或多种包含生物降解的聚合物及聚(乙二醇)(PEG)的嵌段共聚物，以及约0重量％至约50重量％的生物降解的均聚物。
所公开的纳米粒可包含核酸。术语核酸可包括任何被掺入或可以掺入寡核苷酸链的化合物和/或物质。根据所公开的纳米粒使用的示例性核酸包括但不限于以下的一种或多种：DNA、RNA、其杂交体、RNAi诱导剂、RNAi剂、反义RNA、核酶、催化DNA、诱导三螺旋形成的RNA、适体和载体。核酸可以是单链(有义或无义)或双链。纳米粒可以包含小核酸分子，诸如短干扰RNA(siRNA)、双链RNA(dsRNA)、微-RNA(miRNA)、核仁小RNA(sno-RNA)、Piwi-相互作用RNA(piRNA)和短发夹RNA(shRNA)分子。示例性核酸包括核糖核酸(RNA)、转运RNA(tRNA)、脱氧核糖核酸(DNA)、苏糖核酸(TNA)、二醇核酸(GNA)、锁核酸(LNA)或其杂交体。在其他实施方案中，信使RNA(mRNA)或非编码RNA(ncRNA)可以掺入纳米粒中。此外，核酸可以是antagomir、antimir或U1衔接子。在本文提供的实施方案中是纳米粒，其包含反义寡核苷酸(例如，包括至少一个硫代磷酸酯核苷间键的反义寡核苷酸，诸如与编码人STAT3的核酸互补(例如，与GENBANK登记号NM_139276.2的区段(诸如核酸碱基3061-3031)互补)的反义化合物)，和/或诸如WO2014070868中公开的那些，其在此援引加入。例如，本文提供的是包含CTATTTGGATGTCAGC并具有硫代磷酸酯核苷间键的序列，其中每个胞嘧啶是5-甲基胞嘧啶并且核苷1-3和14-16中的每一个都包括cEt部分。
所公开的纳米粒的一些实施方案包括未修饰的核酸。在其他实施方案中，核酸是修饰的。修饰可包括本领域已知的任何修饰，包括但不限于磷酸二酯骨架的修饰、核糖2’OH基团的修饰以及核糖环和核苷碱基的修饰。例如，磷酸骨架的修饰可包括硫代磷酸酯(PS)修饰，其中非桥接磷酸氧被硫替换。另外，其他修饰包括二硫代磷酸酯和膦酰乙酸酯。参见美国专利号6,143,881、5,587,361和5,599,797，其援引加入。其他修饰包括2’O-甲基(2’OMe)、2’氟(2’F)、2’甲氧基乙基(2’-O-MOE)、2’氟阿糖基(Fluorarabino,FANA)、2’-H、2’-硫脲嘧啶、锁核酸(LNA)、桥接核酸(BNA)、乙烯桥接核酸(ENA)、己糖醇核酸(HNA)、阿卓糖醇核酸(ANA)、环己烯核酸(CeNA)、未锁核酸(UNA)、4’硫(4’-S)和3’反转脱碱基端帽。在一些实施方案中，可通过硼烷磷酸酯(PB)键、膦酰乙酸酯(Pac)键或硫代膦酰乙酸酯骨架键取代天然磷酸二酯键来修饰核酸。在一些实施方案中，核酸可包括多于一种修饰。在一些实施方案中，核酸可包含多于两种的修饰。
在一些实施方案中，核酸可选自单链、双链或三链核酸。具有生物活性(例如，介导基因表达改变)的单链核酸分子的实例包括反义核酸分子、酶促核酸分子或核酶以及2-5寡腺苷酸核酸分子。具有介导基因表达改变的生物活性的三链核酸分子的实例包括形成三链体的寡核苷酸。具有介导基因表达改变的生物活性的双链核酸分子的实例包括dsRNA和siRNA。例如，干扰素介导的蛋白激酶PKR的诱导可通过长双链RNA的非序列特异性方式激活(参见，例如，Wu和Kaufman,1997,J.Biol.Chem.,272,1921-6)。该通路可能在通过核糖核酸酶L介导的RNA切割方面与2,5-连接的寡腺苷酸(2-5A)系统具有共同特征(参见，例如，Coleet al.,1997,J.Biol.Chem.,272,19187-92)。
在一些实施方案中，所涵盖的核酸可以是基于核酸的化合物和/或组合物。例如，所涵盖的核酸可以是多功能短干扰核酸(多功能siNA)分子，其调节生物系统(细胞、组织或生物体)中的一种或多种基因的表达。多功能短干扰核酸或多功能siNA分子也被涵盖，并可以是基因表达的序列特异性调节的有效调节子(多功能siNA分子代表一类多聚核苷酸分子，其被设计为使得多功能siNA构建体中的每条链包含与一个或多个靶核酸分子中的不同核酸序列互补的核苷酸序列)。
应该理解，在一些实施方案中，核酸可以与另外的化学或生物种类缔合(即，通过键或连接基)。例如，本文所涵盖的是与酶、核酸酶、蛋白质、肽、另一种核酸、分子或化合物缔合的核酸。例如，在一些实施方案中，所涵盖的核酸是引导RNA以及酶是Cas9(例如CRISPR/cas9中的)。在一些实施方案中，核酸可以与ZNF(锌指核酸酶)或TALEN(转录激活因子样效应核酸酶)缔合。
在一些实施方案中，所公开的纳米粒可包含约0.2重量％至约35重量％、约0.2重量％至约20重量％、约0.2重量％至约10重量％、约0.2重量％至约5重量％、约0.5重量％至约5重量％、约0.75重量％至约5重量％、约1重量％至约5重量％、约2重量％至约5重量％、约3重量％至约5重量％、约1重量％至约20重量％、约2重量％至约20重量％、约5重量％至约20重量％、约1重量％至约15重量％、约2重量％至约15重量％、约3重量％至约15重量％、约4重量％至约15重量％、约5重量％至约15重量％、约1重量％至约10重量％、约2重量％至约10重量％、约3重量％至约10重量％、约4重量％至约10重量％、约5重量％至约10重量％、约10重量％至约30重量％或约15重量％至约25重量％的核酸。
在某些方面所公开的纳米粒包含疏水性抗衡离子，其在跨细胞/转胞作用、胞吞作用、内吞作用或生物合成转运功能中是有效的。应该理解，转胞作用可包括受体介导的转胞作用。还应该理解，内吞作用也可包括任何类型的受体介导的内吞作用。例如，内吞作用可能涉及细胞膜穴样凹陷，即具有发生内吞作用可能的质膜内陷。内吞作用还可包括网格蛋白介导的内吞作用。在所公开的纳米粒的一些实施方案中，疏水性抗衡离子是内-溶酶体破坏剂，其能破坏内体的膜。
在某些实施方案中，所公开的纳米粒包含疏水性抗衡离子剂(诸如，内-溶酶体破坏剂)，和/或通过包括疏水性抗衡离子剂(诸如内-溶酶体破坏剂)的方法制备。相比没有疏水性抗衡离子剂(诸如内-溶酶体破坏剂)的纳米粒，这样的纳米粒可以实现有效转染同时保持核酸的完整性。例如，没有纳米粒的核酸的转染可导致核酸降解，使其在治疗上无用。
在某些实施方案中，所公开的纳米粒与疏水性抗衡离子(诸如内-溶酶体破坏剂)缔合。例如，所公开的纳米粒可以在具有疏水性抗衡离子的溶液中。在其他实施方案中，所公开的纳米粒在进一步包含疏水性抗衡离子的药物组合物中。
所公开的纳米粒涵盖使用任何合适的疏水性抗衡离子剂(诸如内-溶酶体破坏剂)。例如，内-溶酶体破坏剂可以是任何分子、离子或化合物，例如，其能够基本上避免和/或限制细胞的内体或溶酶体的过程。如本文所涵盖的，内吞作用是进入细胞的途径。在内吞作用过程中，内体形成。内-溶酶体破坏剂能够破坏内体的膜并且逃脱运输至溶酶体以破坏。这样的剂可包括具有与内体或溶酶体成熟、加工和/或再循环有关的作用机制的化合物。示例性的疏水性抗衡离子剂(诸如内-溶酶体破坏剂)优选为带正电荷并且能够与核酸形成离子对，和/或具有大于约1或大于约2的log P，例如，约2至约4或更大。示例性疏水性抗衡离子剂(其可以是内-溶酶体破坏剂)包括粉防己碱、去甲替林、阿司咪唑、特非那定、perhexaline、美吡拉敏、羟嗪、阿利马嗪、氰美马嗪、地布卡因、派氰嗪、硫丙拉嗪、苯海索、脱氢松香胺、乙基月桂酰精氨酸盐、丙嗪、他莫昔芬、氯米酚、雷洛昔芬、枸橼酸他莫昔芬、托瑞米芬、枸橼酸氯米酚、枸橼酸托瑞米芬、维拉帕米、地尔硫卓、氨氯地平、硝苯地平、盐酸维拉帕米、尼莫地平、非洛地平、尼卡地平、尼索地平氯维地平、伊拉地平、群多普利/维拉帕米、地昔帕明、丙咪嗪、阿米替林、去甲替林、氯丙咪嗪、多塞平、阿莫沙平、曲米帕明、普罗替林、胺碘酮、利多卡因、索他洛尔、决奈达隆、氟卡胺、普鲁卡因胺、普罗帕酮、奎尼丁、多非力特、美西律、伊布利特、丙吡胺、帕罗西汀、氟西汀、舍曲林、依他普仑、西酞普兰、氟伏沙明、盐酸帕罗西汀、奈法唑酮、氢溴酸西酞普兰、草酸依他普仑、奥氮平/氟西汀、氯环嗪、阿莫地喹、甲硫达嗪、氯喹、奎宁、阿托伐醌/氯胍、阿托伐醌、氟西汀、甲氟喹、伯氨喹、奎纳克林、奎尼丁、卤泛群、氯喹、莫能菌素、氯环嗪、安曲非宁、阿立哌唑、比氟诺西、依匹唑派、卡比米嗪、环丙沙星、达哌唑、羟丙哌嗪、依吡哌唑、依托哌酮、伊曲康唑、酮康唑、左羟丙哌嗪、美吡哌唑、米安色林、萘哌地尔、奈法唑酮、烟胺哌嗪、奥苷哌汀、泊沙康唑、曲唑酮、乌美螺酮、乌拉地尔、维司力农、鲁巴唑酮、阿卡嗪、巴托拉嗪、比氟诺西、沃替西汀、维拉佐酮、托吡哌唑、索奈哌唑、帕多芦诺、萘基哌嗪(Naphthylpiperazine)、Naluzotan、洛吡哌唑、氟辛克生、氟普拉嗪、氟班色林、恩沙库林、恩吡哌唑、依托拉嗪、依吡哌唑、UNC 7938、鞘氨醇、十二烷基咪唑、巴弗洛霉素A1、喹诺酮、奥美拉唑、埃索美拉唑、泮托拉唑、兰索拉唑、雷贝拉唑、右兰索拉唑、布雷菲德菌素A、Golgicide、Dyasore、Pitstop、阿莫地喹、EGA(4-溴苯甲醛N-(2,6-二甲基苯基)缩氨基脲)、氟西汀、帕罗西汀、舍曲林、甲硫达嗪、吩噻嗪、异丙嗪、丙氯拉嗪、三氟拉嗪、氟奋乃静、甲哌氯丙嗪、癸氟奋乃静、盐酸异丙嗪、奎宁、卡西霉素、甲氟喹、阿普林定、丙吡胺、氟卡胺、利多卡因、美西律、喷替索胺、普罗帕酮、赛庚啶阿扎他定、酮替芬、氯雷他定、苯噻啶、阿米替林、普萘洛尔、卢帕他定、地普托品、氨磺必利、去甲替林、环苯扎林、奥克替林、布替林、伊普吲哚、三甲丙咪嗪、黄酮哌酯、桂利嗪氯米帕明、氟西汀、丙嗪、丙咪嗪、舍曲林、卡马西平、ay9944、氯丙咪嗪、氯氮平、氟卡胺、氟哌啶醇、酮康唑、氧氟沙星、哌克昔林、索他洛尔、他莫昔芬、齐美利定、赛庚啶、托瑞米芬、氟奋乃静、三氟拉嗪、苯噻啶、CGS 12066B、普鲁氯嗪、多塞平、酮替芬、拉西地平、sb 205607、洛非帕明、米非司酮、clobenpropit、沙美特罗、氮卓斯汀、氮卓斯汀、依匹斯汀、地氯雷他定、am-251、吲达曲林、奈非那韦、氟哌啶醇、苯丙哌林、M-帕罗西汀、卡维地洛、钙泊三醇、奋乃静、吩噻嗪、氯普噻吨、地昔帕明、丁卡因、艾芬地尔、U18666A、苯海拉明等。图10A-1、10A-2、10A-3、10B-1、10B-2和10B-3描述可以是疏水性抗衡离子剂的其他化合物。
在实施方案中，疏水性抗衡离子剂可以是由以下表示的化合物：
例如，其可改善siRNA递送。
在一些实施方案中，疏水性抗衡离子剂(诸如内-溶酶体破坏剂)可以完全地避免内体和溶酶体过程，或可减少内体或溶酶体过程的发生。如本文所涵盖的，疏水性抗衡离子剂(诸如内-溶酶体破坏剂)与核酸形成离子对。疏水性抗衡离子剂(诸如内-溶酶体破坏剂)减少核酸-内-溶酶体逃脱剂离子对复合物从内体和/或溶酶体过程的发生。疏水性抗衡离子剂(诸如内-溶酶体破坏剂)的实例可包括地昔帕明、胺碘酮、氟西汀氯环嗪、阿莫地喹、帕罗西汀、他莫昔芬、维拉帕米、硫利达嗪、氯喹、氯丙嗪、莫能菌素、鞘氨醇、十二烷基咪唑、巴弗洛霉素A1、golgicide、dyasore、Pitstop、EGA(4-溴苯甲醛N-(2,6-二甲基苯基)缩氨基脲)、舍曲林、卡西霉素、甲氟喹、伯氨喹、奎纳克林、卤泛群、奎宁、硬脂酰胺、油胺、二油基胺、N-甲基-N,N-二油基胺、和N,N-二甲基油胺、DODAC(双油酰基二甲基氯化铵)、DDAB(二甲基双十八烷基铵)、DMAB(双十二烷基二甲基溴化铵)、DOPE(二油酰磷脂酰乙醇胺)、DSDMA(1,2-二硬脂基氧基-N,N-二甲基-3-氨基丙烷)、DODMA(1,2-二油基氧基-N,N-二甲基-3-氨基丙烷)、3β-[N-(N',N'-二甲基氨基乙烷)-氨基甲酰基]胆固醇盐酸盐(DC-胆固醇·盐酸)、DMRIE、LIPOFECTIN(包含DOTMA和DOPE的市售的阳离子脂质体，购自GIBCO/BRL，GrandIsland,N.Y.,USA)、LIPOFECTAMINE(包含DOSPA和DOPE的市售的阳离子脂质体，购自GIBCO/BRL)、TRANSFECTAM(包含DOGS的市售的阳离子脂质，购自Promega Corp.,Madison,Wis.,USA),DOTMA(1,2-二-O-十八烯基-3-三甲基铵丙烷)、二烯丙基二甲基氯化铵、二甲基双十八烷基氯化铵、DOTAP(1,2-二油酰基-3-三甲基铵-丙烷(氯化物盐))、DODAP(1,2-二油酰氧基-3-二甲基氨基-丙烷)、1-油酰基-2-羟基-3-N,N-二甲基氨基丙烷、1,2-二酰基-3-N,N-二甲基氨基丙烷、1,2-二癸酰基-1-N,N-二甲基氨基丙烷2、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、溶血磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰乙醇胺、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二油酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰胆碱或二亚油酰磷脂酰胆碱、二酰基磷脂酰胆碱、二酰基磷脂酰乙醇胺、鞘氨醇和具有另外的脂肪酸链或烷基(连接到任一侧羟基和/或连接到氨基官能团)的鞘氨醇衍生物、多胺(诸如腐胺、尸胺、亚精胺和精胺)和聚乙烯亚胺(PEI)。应该理解，疏水性抗衡离子剂可以是衍生自药学上可接受的有机无毒碱的盐，包括以下的盐：伯胺、仲胺和叔胺、被取代的胺(包括天然存在的被取代的胺)、环胺和碱性离子交换树脂，诸如精氨酸、甜菜碱咖啡因、胆碱、N,N.sup.1二苄基乙二胺、二乙胺、2-二乙基氨基乙醇、2-二甲基氨基乙醇、乙醇胺、乙二胺、N-乙基吗啉、N-乙基哌啶、葡糖胺、氨基葡糖、组氨酸、海巴明(hydrabamine)、异丙胺、赖氨酸、甲基葡萄糖胺、吗啉、哌嗪、哌啶、聚胺树脂、普鲁卡因、嘌呤、可可碱、三乙胺、三甲胺、三丙胺、氨丁三醇等。碱可以是氨、阴离子交换树脂(例如消胆胺树脂)、精氨酸、苯乙苄胺、苄星、叔丁胺、胆碱、地阿诺、二乙醇胺、二乙胺、吡咯乙醇、乙二胺、海巴明、咪唑、赖氨酸、吗啉、4-(2-羟乙基)、哌嗪、吡咯烷、1-(2-羟乙基)、三乙醇胺和氨丁三醇。
在一些实施方案中，核酸和疏水性抗衡离子剂(诸如内-溶酶体破坏剂)(在本文中也称为抗衡离子)形成离子对。在一些实施方案中，抗衡离子或内-溶酶体逃脱剂的数量与核酸分子有关以平衡电荷或实现离子对的约10至约-10mV(或例如，约20mV至约-20mV，或约5至-5mV)的zeta电位。如果需要，可以使用内-溶酶体逃脱剂和无活性疏水性阳离子的组合来调节EE剂的剂量以实现期望的活性。例如，如果核酸分子具有20个负电荷，则20个抗衡离子可与单个核酸分子结合。在这个实例中，核酸分子与抗衡离子的比率是1:20。应当理解，该比率会取决于核酸分子和疏水性抗衡离子剂(诸如内-溶酶体破坏剂)上的电荷数量。
在一些实施方案中，疏水性抗衡离子剂(诸如内-溶酶体破坏剂)的logP为约2至约15，在一些实施方案中为约1至约2，在一些实施方案中为约5至约15，在一些实施方案中为约5至约10，在一些实施方案中为约2至约8，在一些实施方案中为约4至约8，在一些实施方案中为约2至约7，或在一些实施方案中为约4至约7。在一些情形下，疏水性酸的logP可大于约2，大于约4，大于约5或大于约6。
在一些情形下，疏水性抗衡离子剂(诸如内-溶酶体破坏剂)在溶液中(即核酸溶液)的浓度可为约1重量％至约30重量％，在一些实施方案中为约2重量％至约30重量％，在一些实施方案中为约3重量％至约30重量％，在一些实施方案中为约4重量％至约30重量％，在一些实施方案中为约5重量％至约30重量％，在一些实施方案中为约6重量％至约30重量％，在一些实施方案中为约8重量％至约30重量％，在一些实施方案中为约10重量％至约30重量％，在一些实施方案中为约12重量％至约30重量％，在一些实施方案中为约14重量％至约30重量％，在一些实施方案中为约16重量％至约30重量％，在一些实施方案中为约1重量％至约5重量％，在一些实施方案中为约3重量％至约9重量％，在一些实施方案中为约6重量％至约12重量％，在一些实施方案中为约9重量％至约15重量％，在一些实施方案中为约12重量％至约18重量％，以及在一些实施方案中为约15重量％至约21重量％。在某些实施方案中，抗衡离子在核酸溶液中的浓度可以是至少约1重量％，在一些实施方案中至少约2重量％，在一些实施方案中至少约3重量％，在一些实施方案中至少约5重量％，在一些实施方案中至少约10重量％，在一些实施方案中至少约15重量％，以及在一些实施方案中至少约20重量％。
在某些实施方案中，疏水性抗衡离子剂(诸如内-溶酶体破坏剂)与核酸的摩尔比(例如，最初配制纳米粒期间和/或在纳米粒中)可以为约0.25:1至约6:1，在一些实施方案中为约0.25:1至约5:1，在一些实施方案中为约0.25:1至约4:1，在一些实施方案中为约0.25:1至约3:1之间，在一些实施方案中为约0.25:1至约2:1，在一些实施方案中为约0.25:1至约1.5:1，在一些实施方案中为约0.25:1至约1:1，在一些实施方案中为约0.25:1至约0.5:1，在一些实施方案中为约0.5:1至约6:1，在一些实施方案中为约0.5:1至约5:1，在一些实施方案中为约0.5:1至约4:1，在一些实施方案中为约0.5:1至约3:1，在一些实施方案中为约0.5:1至约2:1，在一些实施方案中为约0.5:1至约1.5:1，在一些实施方案中为约0.5:1至约1:1，在一些实施方案中为约0.5:1至约0.75:1，在一些实施方案中为约0.75:1至约2:1，在一些实施方案中为约0.75:1至约1.5:1，在一些实施方案中为约0.75:1至约1.25:1，在一些实施方案中为约0.9:1至约1.1:1，在一些实施方案中为约0.95:1至约1.05:1，在一些实施方案中为约1:1，在一些实施方案中为约0.75:1至约1:1，在一些实施方案中为约1:1至约6:1，在一些实施方案中为约1:1至约5:1，在一些实施方案中为约1:1至约4:1，在一些实施方案中为约1:1至约3:1，在一些实施方案中为约1:1至约2:1，在一些实施方案中为约1:1至约1.5:1，在一些实施方案中为约1.5:1至约6:1，在一些实施方案中为约1.5:1至约5:1，在一些实施方案中为约1.5:1至约4:1，在一些实施方案中为约1.5:1至约3:1，在一些实施方案中为约2:1至约6:1，在一些实施方案中为约2:1至约4:1，在一些实施方案中为约3:1至约6:1，在一些实施方案中为约3:1至约5:1，以及在一些实施方案中为约4:1至约6:1。
在一些情形下，疏水性抗衡离子剂(诸如内-溶酶体破坏剂)与核酸的初始摩尔比(即，配制纳米粒期间)可以不同于疏水性抗衡离子剂(诸如内-溶酶体破坏剂)与核酸在纳米粒中的摩尔比(即，除去未封装的疏水性抗衡离子剂(诸如内-溶酶体破坏剂)和核酸之后)。在其他情形下，疏水性抗衡离子剂(诸如内-溶酶体破坏剂)与核酸的初始摩尔比(即，配制纳米粒期间)可以基本上相同于疏水性抗衡离子剂(诸如内-溶酶体破坏剂)与核酸在纳米粒中的摩尔比(即，除去未封装的疏水性抗衡离子剂(诸如内-溶酶体破坏剂)和核酸之后)。
在一些情况下，含有核酸的溶液可与含有聚合物的溶液分开制备，然后可在纳米粒配制前组合这两种溶液。例如，在一个实施方案中，第一溶液含有核酸和疏水性抗衡离子剂(诸如内-溶酶体破坏剂)，第二溶液含有聚合物和任选存在的疏水性抗衡离子剂(诸如内-溶酶体破坏剂)。其中第二溶液不含有疏水性抗衡离子剂(诸如内-溶酶体破坏剂)的制剂，例如，可有利于最小化方法中使用的疏水性抗衡离子剂(诸如内-溶酶体破坏剂)的量，或在一些情况下最小化疏水性抗衡离子剂(诸如内-溶酶体破坏剂)与，例如，聚合物(可在疏水性抗衡离子剂(诸如内-溶酶体破坏剂)存在下降解)之间的接触时间。在其他情况下，可制备含有核酸、聚合物以及疏水性抗衡离子剂(诸如内-溶酶体破坏剂)的单一溶液。
在一些实施方案中，可在配制纳米粒之前形成核酸-疏水性抗衡离子剂(诸如内-溶酶体破坏剂)离子对。例如，可在配制所涵盖的纳米粒之前制备含有离子对的溶液(例如，通过制备含有合适量的核酸及疏水性抗衡离子剂(诸如内-溶酶体破坏剂)的溶液)。在其他实施方案中，可在配制纳米粒期间形成所述离子对。例如，可在制备纳米粒的方法步骤期间(例如，在乳液形成之前和/或在乳液形成期间)组合含有核酸的第一溶液和含有疏水性抗衡离子剂(诸如内-溶酶体破坏剂)的第二溶液。在某些实施方案中，可在将核酸及疏水性抗衡离子剂(诸如内-溶酶体破坏剂)封装于所涵盖的纳米粒中之前形成离子对。在其他实施方案中，例如，可在封装核酸及疏水性抗衡离子剂(诸如内-溶酶体破坏剂)之后在纳米粒中形成离子对。
在某些实施方案中，在25℃下测得的疏水性抗衡离子剂(诸如内-溶酶体破坏剂)的溶解度可小于约2g/100mL水，在一些实施方案中小于约1g/100mL水，在一些实施方案中小于约100mg/100mL水，在一些实施方案中小于约10mg/100mL水，以及在一些实施方案中小于约1mg/100mL水。在其他实施方案中，在25℃下测得的酸的溶解度可为约1mg/100mL水至约2g/100mL水，在一些实施方案中为约1mg/100mL水至约1g/100mL水，在一些实施方案中为约1mg/100mL水至约500mg/100mL水，以及在一些实施方案中为约1mg/100mL水至约100mg/100mL水。在一些实施方案中，疏水性抗衡离子剂(诸如内-溶酶体破坏剂)在25℃下可基本上不溶于水。
在一些实施方案中，所公开的纳米粒可基本上不含在制备纳米粒期间使用的疏水性抗衡离子剂(诸如内-溶酶体破坏剂)。在其他实施方案中，所公开的纳米粒可包含疏水性抗衡离子剂(诸如内-溶酶体破坏剂)。例如，在一些实施方案中，所公开的纳米粒中的疏水性抗衡离子剂(诸如内-溶酶体破坏剂)的含量可为约0.05重量％至约35重量％，在一些实施方案中为约0.05重量％至约30重量％，在一些实施方案中为约0.5重量％至约30重量％，在一些实施方案中为约1重量％至约30重量％，在一些实施方案中为约2重量％至约30重量％，在一些实施方案中为约3重量％至约30重量％，在一些实施方案中为约5重量％至约30重量％，在一些实施方案中为约7重量％至约30重量％，在一些实施方案中为约10重量％至约30重量％，在一些实施方案中为约15重量％至约30重量％，在一些实施方案中为约20重量％至约30重量％，在一些实施方案中为约0.05重量％至约0.5重量％，在一些实施方案中为约0.05重量％至约5重量％，在一些实施方案中为约1重量％至约5重量％，在一些实施方案中为约3重量％至约10重量％，在一些实施方案中为约5重量％至约15重量％，以及在一些实施方案中为约10重量％至约20重量％。
在一些实施方案中，例如，当在室温(例如，25℃)和/或在37℃下置于磷酸盐缓冲液中时，所公开的纳米粒基本上释放(例如，经约1分钟至约30分钟、约1分钟至约25分钟、约5分钟至约30分钟、约5分钟至约1小时、约1小时或约24小时)少于约2％、少于约5％、少于约10％、少于约15％、少于约20％、少于约25％、少于约30％、或少于约40％的核酸或核酸-疏水性抗衡离子剂(诸如内-溶酶体破坏剂)。在某些实施方案中，当在例如25℃和/或在37℃下置于水溶液(例如，磷酸盐缓冲液)中时，包含核酸的纳米粒可以以基本上对应于以下的速度释放核酸或核酸-疏水性抗衡离子：约0.01％至约50％，在一些实施方案中约0.01％至约25％，在一些实施方案中约0.01％至约15％，在一些实施方案中约0.01％至约10％，在一些实施方案中约1％至约40％，在一些实施方案中约5％至约40％，以及在一些实施方案中约10％至约40％的含可质子化的氮的治疗剂经约1小时释放。在一些实施方案中，当在例如25℃和/或在37℃下置于水溶液(例如，磷酸盐缓冲液)中时，包含含可质子化的氮的治疗剂的纳米粒可以以基本上对应于以下的速度释放含可质子化的氮的治疗剂：约10％至约70％，在一些实施方案中约10％至约45％，在一些实施方案中约10％至约35％，或在一些实施方案中约10％至约25％的含可质子化的氮的治疗剂经约4小时释放。
在一些实施方案中，当在37℃下置于磷酸盐缓冲液中时，所公开的纳米粒可基本上保留核酸，例如，至少约1分钟，至少约1小时或更长。
在一些实施方案中，所公开的治疗性纳米粒可包含靶向配体，例如，低分子量配体。在某些实施方案中，低分子量配体缀合至聚合物，并且纳米粒包含一定比率的配体缀合聚合物(例如，PLA-PEG-配体)与非官能化聚合物(例如，PLA-PEG或PLGA-PEG)。纳米粒可具有优化比率的这两种聚合物，从而有效量的配体与纳米粒缔合用于治疗疾病或紊乱，诸如癌症。例如，增加的配体密度可增加靶点结合(细胞结合/靶点摄取)，使纳米粒“靶点特异”。或者，纳米粒中一定浓度的非官能化聚合物(例如，非官能化PLGA-PEG共聚物)可控制炎症和/或免疫原性(即，激发免疫反应的能力)，并且使得纳米粒具有适于治疗疾病或紊乱的循环半衰期。此外，在一些实施方案中，非官能化聚合物可降低通过网状内皮系统(RES)从循环系统的清除率。因此，非官能化聚合物可向纳米粒提供可使颗粒在给药后穿过身体的特征。在一些实施方案中，非官能化聚合物可平衡否则会较高的配体浓度，较高的配体浓度可加速个体的清除，导致向靶细胞的递送减少。
在一些实施方案中，本文公开的纳米粒可包含缀合至配体的官能化聚合物，其组成纳米粒整个聚合物组合物(即，官能化+非官能化聚合物)的约0.1-50摩尔％，例如，0.1-30摩尔％，例如，0.1-20摩尔％，例如，0.1-10摩尔％。还如本文所公开的，在另一实施方案中，包含与一种或多种低分子量配体缀合(例如，共价缀合(例如，通过连接基(例如，亚烷基连接基))或键)的聚合物的纳米粒，其中低分子量配体相对于总聚合物的重量％为约0.001至5，例如，为约0.001至2，例如，为约0.001至1。
在一些实施方案中，所公开的纳米粒可能能够有效地结合至生物实体或者与生物实体缔合，所述生物实体例如，特定的膜组分或细胞表面受体。应该理解，肽、配体、蛋白、抗体或纳米抗体也可用于靶向纳米粒。治疗剂或核酸的靶向(例如，靶向特定组织或细胞类型，靶向具体疾病组织但不靶向正常组织等)对于治疗组织特异性疾病(如实体癌(例如，前列腺癌))是期望的。例如，与全身递送细胞毒性抗癌剂相反，本文公开的纳米粒可基本上防止剂杀死健康细胞。另外，所公开的纳米粒可使得给药较低剂量的剂(与没有用公开的纳米粒或制剂给药的有效量的剂相比)，其可以减少通常与传统化疗有关的不期望的副作用。
一般而言，“纳米粒”指直径小于1000nm(例如，约10nm至约200nm)的任何颗粒。所公开的治疗性纳米粒可包括具有以下直径的纳米粒：约60至约120nm，或约70至约120nm，或约80至约120nm，或约90至约120nm，或约100至约120nm，或约60至约130nm，或约70至约130nm，或约80至约130nm，或约90至约130nm，或约100至约130nm，或约110至约130nm，或约60至约140nm，或约70至约140nm，或约80至约140nm，或约90至约140nm，或约100至约140nm，或约110至约140nm，或约60至约150nm，或约70至约150nm，或约80至约150nm，或约90至约150nm，或约100至约150nm，或约110至约150nm，或约120至约150nm。应该理解，所公开的纳米粒可以形成特定大小，其可决定摄取途径、循环时间、靶向、内化和/或清除。
聚合物
在一些实施方案中，纳米粒可包含聚合物基质和治疗剂，诸如上述的核酸，任选地与疏水性抗衡离子剂(诸如内-溶酶体破坏剂)一起。在一些实施方案中，治疗剂和/或靶向部分(例如，低分子量配体)可与聚合物基质的至少一部分缔合。例如，在一些实施方案中，靶向部分(例如，配体)可与聚合物基质的表面共价缔合。在一些实施方案中，通过连接基介导共价缔合。治疗剂可与聚合物基质的表面缔合，封装于聚合物基质内、被聚合物基质包围和/或分散遍及聚合物基质。
药物递送技术领域中已知广泛多种聚合物和由其形成颗粒的方法。在一些实施方案中，本公开涉及具有至少两种大分子的纳米粒，其中第一大分子包含结合至低分子量配体(例如，靶向部分)的第一聚合物；以及第二大分子包含不结合至靶向部分的第二聚合物。纳米粒可任选地包含一种或多种另外的非官能化聚合物。
可在所公开的纳米粒中使用任何合适的聚合物。聚合物可以是天然的或非天然的(合成的)聚合物。聚合物可以是均聚物或包含两种或更多种单体的共聚物。就序列而言，共聚物可以是随机的、嵌段或包含随机及嵌段序列的组合。通常，聚合物是有机聚合物。
本文所使用的术语“聚合物”具有其在如本领域中所使用的通常含义，即包含一个或多个通过共价键连接的重复单元(单体)的分子结构。重复单元可全部相同，或在一些情形下可在聚合物中存在多于一种类型的重复单元。在一些情况下，聚合物可以是生物来源的，例如，生物聚合物。非限制性实例包括肽或蛋白质。在一些情况下，另外的部分也可存在于聚合物中，例如，生物部分，诸如下文中描述的那些。若多于一种类型的重复单元存在于聚合物中，则聚合物称为“共聚物”。应理解，在使用聚合物的任何实施方案中，在一些情况下所使用的聚合物可以是共聚物。形成共聚物的重复单元可以任何方式排列。例如，重复单元可以随机顺序、以交替顺序或作为嵌段共聚物(即，包含一个或多个各包含第一重复单元(例如，第一嵌段)的区域，以及一个或多个各包含第二重复单元(例如，第二嵌段)的区域)等排列。嵌段共聚物可具有两个(二嵌段共聚物)、三个(三嵌段共聚物)或更多数量的不同嵌段。
所公开的颗粒可包含共聚物，在一些实施方案中其描述彼此缔合的两种或更多种聚合物(诸如本文所描述的那些)，通常通过将两种或更多种聚合物共价键合。因此，共聚物可包含缀合在一起以形成嵌段共聚物的第一聚合物和第二聚合物，其中第一聚合物可以是嵌段共聚物的第一嵌段，第二聚合物可以是嵌段共聚物的第二嵌段。当然，本领域普通技术人员会理解，在一些情况下，嵌段共聚物可含有多个聚合物嵌段，并且本文所使用的“嵌段共聚物”并不仅限于仅具有单一第一嵌段及单一第二嵌段的嵌段共聚物。例如，嵌段共聚物可包含包含第一聚合物的第一嵌段、包含第二聚合物的第二嵌段以及包含第三聚合物或第一聚合物的第三嵌段等。在一些情况下，嵌段共聚物可含有任何数量的第一聚合物的第一嵌段以及第二聚合物的第二嵌段(以及在某些情况下，第三嵌段、第四嵌段等)。此外，应注意，在一些情形下，嵌段共聚物也可由其他嵌段共聚物形成。例如，第一嵌段共聚物可缀合至另一聚合物(其可以是均聚物、生物聚合物、另一嵌段共聚物等)以形成含有多个类型嵌段的新嵌段共聚物，和/或缀合至其他部分(例如，至非聚合部分)。
在一些实施方案中，聚合物(例如，共聚物，例如，嵌段共聚物)可以是两亲性的，即具有亲水性部分及疏水性部分，或相对亲水性部分及相对疏水性部分。亲水性聚合物可以是一般吸引水的聚合物，疏水性聚合物可以是一般排斥水的聚合物。例如，可以通过制备聚合物样品并且测量其与水的接触角来鉴别亲水性或疏水性聚合物(通常，亲水性聚合物会具有小于60°的接触角，疏水性聚合物会具有大于约60°的接触角)。在一些情况下，两种或更多种聚合物的亲水性可以相对于彼此来测量，即，第一聚合物可以比第二聚合物更加亲水。例如，第一聚合物可具有小于第二聚合物的接触角。
在一组实施方案中，本文所涵盖的聚合物(例如，共聚物，例如，嵌段共聚物)包括生物相容性聚合物，即，当插入或注射入活体个体时通常不诱导不良反应的聚合物，例如，无显著炎症和/或免疫系统对聚合物的急性排斥(例如通过T细胞应答)。因此，本文所涵盖的治疗性颗粒可以是非免疫原性的。本文所使用的术语非免疫原性指处于天然状态的内源性生长因子，其通常不引发或仅引发最低水平的循环抗体、T细胞或反应性免疫细胞，且其通常不在个体中引发针对自身的免疫应答。
生物相容性通常指至少部分免疫系统对物质的急性排斥，即植入个体中的非生物相容性物质在个体中激发免疫应答，其可足够严重使得免疫系统对物质的排斥不能被充分控制，且通常其程度使得必须从个体中去除所述物质。一种测定生物相容性的简单试验可以是体外将聚合物暴露于细胞；生物相容性聚合物是在中等浓度下(例如，在50微克/106个细胞的浓度下)通常不会导致显著细胞死亡的聚合物。例如，当暴露于细胞(诸如成纤维细胞或上皮细胞)时，即使被这样的细胞吞噬或摄取，生物相容性聚合物可引起小于约20％的细胞死亡。可用于各个实施方案中的生物相容性聚合物的非限制性实例包括聚二噁烷酮(PDO)、聚羟基链烷酸酯、聚羟基丁酸酯、聚(甘油癸二酸酯)、聚乙交酯(即聚(乙醇)酸)(PGA)、聚丙交酯(即聚(乳)酸)(PLA)、聚(乳)酸-共-聚(乙醇)酸(PLGA)、聚己酸内酯或包括这些和/或其它聚合物的共聚物或衍生物。
在某些实施方案中，所涵盖的生物相容性聚合物可以是生物降解的，即，聚合物能够在生理环境内(诸如在体内)化学地和/或生物地降解。如本文所使用的，“生物降解的”聚合物是当引入细胞中时通过细胞机制(生物学降解)和/或通过化学过程(诸如水解)(化学降解)分解成细胞可再利用或处置而对细胞无显著毒性作用的组分的那些聚合物。在一个实施方案中，生物降解的聚合物及其降解副产物可以是生物相容性的。
本文所公开的颗粒可含或可不含PEG。此外，某些实施方案可涉及含有聚(酯-醚)的共聚物(例如，具有通过酯键(例如，R-C(O)-O-R'键)及醚键(例如，R-O-R'键)连接的重复单元的聚合物)。在一些实施方案中，含有羧酸基团的生物降解的聚合物(如可水解的聚合物)可与聚(乙二醇)重复单元缀合以形成聚(酯-醚)。含有聚(乙二醇)重复单元的聚合物(例如，共聚物，例如，嵌段共聚物)也可称为“PEG化”的聚合物。
例如，所涵盖的聚合物可以是在暴露于水时(例如，在个体内)自发水解的聚合物，或聚合物可以在暴露于热时(例如，在约37℃温度下)降解。聚合物的降解可以以不同速率发生，其取决于所使用的聚合物或共聚物。例如，聚合物的半衰期(50％的聚合物可以被降解成单体和/或其他非聚合物部分的时间)可以大约是数天、数周、数月或数年，其取决于聚合物。聚合物可以是生物学降解的，例如，通过酶活性或细胞机制，在一些情况下，例如，通过暴露于溶菌酶(例如，具有相对低的pH)。在一些情况下，聚合物可以分解成细胞可再利用或处置而对细胞无显著毒性作用的单体和/或其他非聚合物部分(例如，聚丙交酯可水解形成乳酸，聚乙交酯可水解形成乙醇酸等)。
在一些实施方案中，聚合物可以是聚酯，其包括包含乳酸和乙醇酸单元的共聚物，诸如聚(乳酸-共-乙醇酸)和聚(丙交酯-共-乙交酯)(在本文中统称为“PLGA”)；以及包含乙醇酸单元的均聚物，本文称为“PGA”，和包含乳酸单元的均聚物，诸如聚-L-乳酸、聚-D-乳酸、聚-D,L-乳酸、聚-L-丙交酯、聚-D-丙交酯和聚-D,L-丙交酯，在本文统称为“PLA”。在一些实施方案中，示例性聚酯包括，例如，聚羟基酸；丙交酯和乙交酯的PEG化聚合物及共聚物(例如，PEG化PLA、PEG化PGA、PEG化PLGA及其衍生物)。在一些实施方案中，聚酯包括，例如，聚酐、聚(原酸酯)、PEG化聚(原酸酯)、聚(己内酯)、PEG化聚(己内酯)、聚赖氨酸、PEG化聚赖氨酸、聚(乙烯亚胺)、PEG化聚(乙烯亚胺)、聚(L-丙交酯-共-L-赖氨酸)、聚(丝氨酸酯)、聚(4-羟基-L-脯氨酸酯)、聚[α-(4-氨基丁基)-L-乙醇酸]及其衍生物。
在一些实施方案中，聚合物可以是PLGA。PLGA是乳酸和乙醇酸的生物相容性和生物降解的共聚物，并且可通过乳酸:乙醇酸的比率表征各种形式的PLGA。乳酸可以是L-乳酸、D-乳酸或D,L-乳酸。可通过改变乳酸-乙醇酸比率来调节PLGA的降解速率。在一些实施方案中，PLGA可通过大约85:15、大约75:25、大约60:40、大约50:50、大约40:60、大约25:75或大约15:85的乳酸:乙醇酸的比率表征。在一些实施方案中，可以选择颗粒聚合物(例如，PLGA嵌段共聚物或PLGA-PEG嵌段共聚物)中的乳酸与乙醇酸单体的比率以优化各种参数，诸如可以优化水摄取、治疗剂释放和/或聚合物降解动力学。
在一些实施方案中，聚合物可以是一种或多种丙烯酸聚合物。在某些实施方案中，丙烯酸聚合物包括，例如，丙烯酸和甲基丙烯酸共聚物、甲基丙烯酸甲酯共聚物、甲基丙烯酸乙氧基乙基酯、甲基丙烯酸氰基乙基酯、氨基烷基甲基丙烯酸酯共聚物、聚(丙烯酸)、聚(甲基丙烯酸)、甲基丙烯酸烷基酰胺共聚物、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(甲基丙烯酸聚丙烯酰胺、氨基烷基甲基丙烯酸酯共聚物、甲基丙烯酸缩水甘油基酯共聚物、聚氰基丙烯酸酯、以及包含一种或多种前述聚合物的组合。丙烯酸聚合物可包含具有低含量季铵基团的丙烯酸和甲基丙烯酸酯的完全聚合共聚物。
在一些实施方案中，聚合物可以是阳离子聚合物。通常，阳离子聚合物能够缩合和/或保护带负电荷的核酸链(例如，DNA、RNA或其衍生物)。在一些实施方案中，在所公开的颗粒中涵盖使用含胺聚合物，诸如聚(赖氨酸)、聚乙烯亚胺(PEI)和聚(酰胺-胺)树枝状大分子。
在一些实施方案中，聚合物可以是带有阳离子侧链的可降解聚酯。这些聚酯的实例包括聚(L-丙交酯-共-L-赖氨酸)、聚(丝氨酸酯)、聚(4-羟基-L-脯氨酸酯)。
涵盖例如，当PEG未缀合至配体时，PEG可被封端并且包括末端基团。例如，PEG可封端于羟基、甲氧基或其他烷氧基、甲基或其他烷基、芳基、羧酸、胺、酰胺、乙酰基、胍基或咪唑。其他所涵盖的末端基团包括叠氮化物、炔烃、马来酰亚胺、醛、酰肼、羟胺、烷氧基胺或硫醇部分。
本领域普通技术人员会知晓使聚合物PEG化的方法和技术，例如，通过使用EDC(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐)和NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)使聚合物与以胺封端的PEG基团反应、通过开环聚合技术(ROMP)等等。
在一个实施方案中，可优化聚合物的分子量(或例如，例如共聚物的不同嵌段的分子量的比率)以用于如本文公开的有效治疗。例如，聚合物的分子量可影响颗粒降解速率(诸如，当可调整生物降解的聚合物的分子量时)、溶解度、水摄取和药物释放动力学。例如，可调整聚合物的分子量(或例如，例如共聚物的不同嵌段的分子量的比率)从而使颗粒在合理的时间段内(从数小时至1-2周、3-4周、5-6周、7-8周等)在所治疗的个体中生物降解。
所公开的颗粒，例如，可包含PEG和PL(G)A的二嵌段共聚物，其中例如，PEG部分可具有约1,000-20,000，例如，约2,000-20,000、例如，约2至约10,000的数均分子量，PL(G)A部分可具有约5,000至约20,000、或约5,000-100,000，例如，约20,000-70,000、例如，约15,000-50,000的数均分子量。
例如，本文所公开的是示例性治疗性纳米粒，其包含约10重量％至约99重量％的聚(乳)酸-聚(乙)二醇共聚物或聚(乳)酸-共-聚(乙醇)酸-聚(乙)二醇共聚物，或约20重量％至约80重量％、约40重量％至约80重量％、或约30重量％至约50重量％、或约70重量％至约90重量％的聚(乳)酸-聚(乙)二醇共聚物或聚(乳)酸-共-聚(乙醇)酸-聚(乙)二醇共聚物。示例性聚(乳)酸-聚(乙)二醇共聚物可包括约10至约20kDa、约15至约20kDa、或约10至约25kDa数均分子量的聚(乳)酸和约4至约6或约2kDa至约10kDa数均分子量的聚(乙)二醇。
在一些实施方案中，聚(乳)酸-聚(乙)二醇共聚物可以具有约0.6至约0.95数均分子量分数的聚(乳)酸，在一些实施方案中为约0.7至约0.9、在一些实施方案中为约0.6至约0.8、在一些实施方案中为约0.7至约0.8、在一些实施方案中为约0.75至约0.85、在一些实施方案中为约0.8至约0.9以及在一些实施方案中为约0.85至约0.95。应当理解的是，聚(乳)酸数均分子量分数可通过共聚物的聚(乳)酸组分的数均分子量除以聚(乳)酸组分的数均分子量和聚(乙)二醇组分的数均分子量的和。
所公开的纳米粒可任选地包含约1重量％至约50重量％的聚(乳)酸或聚(乳)酸-共-聚(乙醇)酸(其不包括PEG)，或可任选地包含约1重量％至约50重量％、或约10重量％至约50重量％或约30重量％至约50重量％的聚(乳)酸或聚(乳)酸-共-聚(乙醇)酸。例如，聚(乳)酸或聚(乳)酸-共-聚(乙醇)酸可具有约5至约15kDa或约5至约12kDa的数均分子量。示例性PLA可具有约5至约10kDa的数均分子量。示例性PLGA可具有约8至约12kDa的数均分子量。
在一些实施方案中，治疗性纳米粒可含有约10重量％至约30重量％、在一些实施方案中约10重量％至约25重量％、在一些实施方案中约10重量％至约20重量％、在一些实施方案中约10重量％至约15重量％、在一些实施方案中约15重量％至约20重量％、在一些实施方案中约15重量％至约25重量％、在一些实施方案中约20重量％至约25重量％、在一些实施方案中约20重量％至30重量％、或在一些实施方案中约25重量％至约30重量％的聚(乙)二醇，其中聚(乙)二醇可以以聚(乳)酸-聚(乙)二醇共聚物、聚(乳)酸-共-聚(乙醇)酸-聚(乙)二醇共聚物或聚(乙)二醇均聚物存在。在某些实施方案中，纳米粒的聚合物可以缀合至脂质。例如，聚合物可以是脂质封端的PEG。
靶向部分
在一些实施方案中，本文提供的是可包括任选靶向部分(即，能够结合至生物实体或与生物实体缔合的部分的纳米粒，所述生物实体例如，膜组分、细胞表面受体、抗原等。存在于颗粒表面的靶向部分可使颗粒定位于特定靶向位点，例如，肿瘤、疾病位点、组织、器官、某类细胞等。因此，纳米粒然后可以是“靶点特异性的”。在一些情况下，药物或其他有效负载(payload)然后可从颗粒释放并使得与特定靶向位点局部相互作用。
所公开的纳米粒可包含在跨细胞/转胞作用、胞吞作用、内吞作用或生物合成转运功能中有效的疏水性离子对。在一些实施方案中，靶向部分可将纳米粒靶向用于转胞作用或内吞作用的受体位点。例如，靶向部分可以通过蛋白质小窝蛋白将纳米粒靶向细胞膜穴样凹陷(其能够进行内吞作用)。在其他实施方案中，靶向网格蛋白包被的小窝和囊泡(其是已知的用于摄取大分子的有效通路)。在这个过程中，被称为受体介导的内吞作用，大分子结合至互补的跨膜受体蛋白，在包被的小窝中积聚，然后作为受体大分子复合物在网格蛋白包被的囊泡中进入细胞。已知超过25种不同的受体参与受体介导的不同类型分子的内吞作用，并且可以使用相同的网格蛋白-包被-小窝通路(例如，LDL受体、转铁蛋白受体、结合EGF(表皮生长因子)的受体)。因此，应该理解，所涵盖的靶向部分可以靶向已知参与受体介导的内吞作用的不同受体。
应该理解，受体-配体键可解离并且可以遵循来自内体小室(endosomalcompartment)的通路。例如，包括内-溶酶体逃脱剂可以将核酸-疏水性抗衡离子复合物释放至不同质膜区中。
在一些实施方案中，所公开的纳米粒包含为低分子量配体的靶向部分。本文所使用的术语“结合”(“bind”或“binding”)指相关的一对分子或其部分之间的相互作用，其通常因特异性或非特异性结合或相互作用(包括但不限于生物化学、生理学和/或化学相互作用)而展现相互亲和力或结合能力。“生物学结合”定义发生于分子(包括蛋白质、核酸、糖蛋白、碳水化合物、激素等)对之间的一类相互作用。术语“结合配偶体”指可与特定分子进行结合的分子。“特异性结合”指分子(诸如聚核苷酸)能够以基本上高于其他类似生物实体的程度结合至或识别结合配偶体(或有限数量的结合配偶体)。在一组实施方案中，靶向部分具有小于约1微摩尔、至少约10微摩尔或至少约100微摩尔的亲和力(通过解离常数测量)。
例如，靶向部分可使得颗粒定位于个体身体内的肿瘤(例如，实体瘤)、疾病位点、组织、器官、某类细胞等，其取决于所使用的靶向部分。例如，低分子量配体可定位于实体瘤，例如，乳房或前列腺肿瘤或癌细胞。个体可以是人类或非人类动物。个体的实例包括但不限于，哺乳动物，诸如狗、猫、马、猴、兔、牛、猪、绵羊、山羊、大鼠、小鼠、豚鼠、仓鼠、灵长类动物、人类等。
所涵盖的靶向部分可以包括小分子。在某些实施方案中，术语“小分子”指具有相对低分子量并且不是蛋白质、多肽或核酸的有机化合物(不论是天然存在或人工产生(例如，通过化学合成)的)。小分子通常具有多个碳-碳键。在某些实施方案中，小分子的大小小于约2000g/mol。在一些实施方案中，小分子小于约1500g/mol或小于约1000g/mol。在一些实施方案中，小分子小于约800g/mol或小于约500g/mol，例如约100g/mol至约600g/mol、或约200g/mol至约500g/mol。
在一些实施方案中，低分子量配体是式I、II、III或IV：
及其对映异构体、立体异构体、旋转异构体、互变异构体、非对映异构体或外消旋物；
其中m和n各自独立地是0、1、2或3；p是0或1；
R1、R2、R4和R5各自独立地选自被取代或未被取代的烷基(例如，C1-10-烷基、C1-6-烷基或C1-4-烷基)、被取代或未被取代的芳基(例如，苯基或吡啶基)和其任意组合；并且R3是H或C1-6-烷基(例如，CH3)。
对于式I、II、III和IV的化合物而言，R1、R2、R4或R5包含与纳米粒的连接点，例如，与形成所公开的纳米粒的部分的聚合物(例如，PEG)的连接点。连接点可以通过共价键、离子键、氢键、通过吸附(包括化学吸附和物理吸附)形成的键、来自范德华键形成的键或分散力形成。例如，如果R1、R2、R4或R5定义为苯胺或C1-6-烷基-NH2基团，则可去除这些官能化基团的任意氢(例如，氨基氢)，从而低分子量配体共价结合至纳米粒的聚合物基质(例如，聚合物基质的PEG嵌段)。如本文所使用的，术语“共价键”指两个原子之间通过共享至少一对电子所形成的键。
在式I、II、III或IV的特定实施方案中，R1、R2、R3、R4和R5各自独立地是C1-6-烷基或苯基，或者C1-6-烷基或苯基的任意组合，其独立地被OH、SH、NH2或CO2H取代一次或多次，并且其中烷基可插入N(H)、S或O。在另一个实施方案中，R1、R2、R4和R5各自独立地是CH2-Ph、(CH2)2-SH、CH2-SH、(CH2)2C(H)(NH2)CO2H、CH2C(H)(NH2)CO2H、CH(NH2)CH2CO2H、(CH2)2C(H)(SH)CO2H、CH2-N(H)-Ph、O-CH2-Ph或O-(CH2)2-Ph，其中各Ph可以独立地被OH、NH2、CO2H或SH取代一次或多次。对于这些式而言，NH2、OH或SH基团用作与纳米粒的共价连接点(例如，-N(H)-PEG、-O-PEG或-S-PEG)。
示例性配体包括：
及其对映异构体、立体异构体、旋转异构体、互变异构体、非对映异构体或外消旋物，其中NH2、OH或SH基团用作与纳米粒的共价连接点(例如，-N(H)-PEG、-O-PEG或-S-PEG)或表示与纳米粒的连接点，其中n是1、2、3、4、5或6，并且其中R独立地选自NH2、SH、OH、CO2H、被NH2、SH、OH或CO2H取代的C1-C6-烷基、和被NH2、SH、OH或CO2H取代的苯基，其中R用作与纳米粒的共价连接点(例如，-N(H)-PEG、-S-PEG、-O-PEG或CO2-PEG)。这些化合物可进一步被NH2、SH、OH、CO2H、被NH2、SH、OH或CO2H取代的C1-C6-烷基、被NH2、SH、OH或CO2H取代的苯基取代，其中这些官能团也可用作与纳米粒的共价连接点。
在一些实施方案中，可用于靶向与实体瘤(诸如前列腺或乳腺癌肿瘤)有关的细胞的小分子靶向部分包括PSMA肽酶抑制剂，诸如2-PMPA、GPI5232、VA-033、苯基烷基膦酰胺和/或其类似物及衍生物。在一些实施方案中，可用于靶向与前列腺癌肿瘤有关的细胞的小分子靶向部分包括硫醇和吲哚硫醇衍生物，诸如，2-MPPA及3-(2-巯乙基)-1H-吲哚-2-甲酸衍生物。在一些实施方案中，可用于靶向与前列腺癌肿瘤有关的细胞的小分子靶向部分包括氧肟酸酯衍生物。在一些实施方案中，可用于靶向与前列腺癌肿瘤有关的细胞的小分子靶向部分包括基于PBDA和基于脲的抑制剂(诸如，ZJ 43、ZJ 11、ZJ 17、ZJ 38和/或其类似物及衍生物)、雄激素受体靶向剂(ARTA)、多胺(诸如，腐胺、精胺和亚精胺)、谷氨酸羧化酶II(GCPII)(也称为NAAG肽酶或NAALADase)的抑制剂。
在一些实施方案中，所涵盖的配体可以是小分子DPPIV抑制剂，其可以靶向成纤维细胞活化蛋白(FAP)用于治疗实体瘤。磺胺(乙酰唑胺和其他)配体可靶向G250抗原用于治疗ccRCC(肾透明细胞癌)和其他实体瘤。配体可以包括靶向氯毒素受体的氯毒素用于治疗胶质母细胞瘤和实体瘤。小分子可以靶向CXCR4和基质金属蛋白酶(MMP)用于治疗白血病、淋巴瘤和血管生成中的上调。
在另一个实施方案中，靶向部分可以是靶向叶酸受体或toll受体的配体。在另一个实施方案中，靶向部分是叶酸(folate)、叶酸(folic acid)、小分子、抗体和纳米抗体。
靶向部分可以包括靶向抗体。所涵盖的抗体靶向EpCAM(CD326)、IGF-R、间皮素、Lewis-Y抗原(CD174)、CanAg(MUC1、PEM、CA242、CD205)、NCAM(CD56)、Cripto、黑素转铁蛋白(P97)、糖蛋白NMB(CG56972)、CD70(CD27配体)、5T4(滋养层细胞糖蛋白)、CD57、CD44、癌胚抗原(CEA)、GD2、CD40、纤连蛋白ED-B、内皮糖蛋白(CD105)、生腱蛋白C、磷脂酰丝氨酸(PS)、HER3、CD30、CD33、CD40、CD52、CD74、CD138、CS1(CD319、CRACC)、TAG-72、CD2、CD64、ROBO4、DLL4、Tie2和/或B7-H3。例如，生腱蛋白C可以被生腱蛋白C靶向抗体靶向以治疗神经胶质瘤和癌。HER3可以被调蛋白或HER3靶向抗体靶向以治疗实体瘤。CD33抗体可以靶向CD33用于治疗AML。例如，可以用靶向EpCAM(CD326)、IGF-R、间皮素、Lewis-Y抗原(CD174)、CanAg(MUC1、PEM、CA242、CD205)、NCAM(CD56)和Cripto的抗体治疗实体瘤。可以用靶向黑素转铁蛋白(P97)的抗体治疗原发性和转移性黑色素瘤。CD30可以被抗体靶向用于治疗霍奇金病和ALC淋巴瘤。CD74可以被抗体靶向用于治疗多发性骨髓瘤、NHL或CLL。Affymax肽可以靶向TRAIL R2用于治疗实体瘤。肽(诸如Dyax Litt)可以靶向c-Met用于治疗实体瘤。其他肽和小分子配体可以靶向EphA2和EphB2用于治疗实体瘤。
例如，所涵盖的靶向部分可以包括核酸、适体、多肽、糖蛋白、碳水化合物或脂质。例如，靶向部分可以是结合至细胞类型特异性标记物的核酸靶向部分(例如，适体，例如，A10适体)。通常，适体是结合至特定靶点(诸如多肽)的寡核苷酸(例如，DNA、RNA或其类似物或衍生物)。在一些实施方案中，靶向部分可以是用于细胞表面受体的天然存在的或合成的配体，例如，生长因子、激素、LDL、转铁蛋白等。靶向部分可以是抗体，该术语意指包括抗体片段。例如，可使用诸如噬菌体展示等过程来鉴别抗体、单链靶向部分的特征部分。
靶向部分可以是具有长度长达约50个残基的靶向多肽或靶向肽模拟物。例如，靶向部分可以包括氨基酸序列AKERC、CREKA、ARYLQKLN或AXYLZZLN，其中X和Z是可变氨基酸，或其保守性变体或肽模拟物。在特定实施方案中，靶向部分是肽，其包括氨基酸序列AKERC、CREKA、ARYLQKLN或AXYLZZLN，其中X和Z是可变氨基酸并且具有长度少于20、50或100个残基。也涵盖CREKA(Cys Arg Glu Lys Ala)肽或其肽模拟物或八肽AXYLZZLN作为靶向部分，以及肽、或其保守性变体或肽模拟物，其与胶原蛋白IV结合或形成复合物，或靶向组织基底膜(例如，血管的基底膜)。示例性靶向部分包括靶向ICAM(细胞间黏附分子，例如，ICAM-1)的肽。其他基于肽的靶向部分可以是Affymax、Dyax Litt、YSA/SWL、NGR肽和具有乌苯美司的类似物、奥曲肽、CCK和胃泌素类似物、亮丙瑞林和类似物、GLP1/艾塞那肽、凝集素和Mercator。应该理解，靶向配体可以靶向TRAIL R2、c-Met、EphA2、EphB2、氨肽酶N(CD13)、VLA-4(α4β1整合素)、CXCR4、黑素皮质素受体(MC1R)、生长抑素受体、胆囊收缩素受体、GnRH受体、GLP1-受体、E-选择素、IL-11受体、血小板应答蛋白-1受体、内皮细胞抑制素、CD79和CD74。
在一些实施方案中，本文所公开的靶向部分可以缀合至所公开的聚合物或共聚物(例如，PLA-PEG)，并且这样的聚合物缀合物可以形成所公开的纳米粒的部分。
在一些实施方案中，治疗性纳米粒可以包括聚合物-药物缀合物。例如，药物可以缀合至所公开的聚合物或共聚物(例如，PLA-PEG)，并且这样的聚合物-药物缀合物可以形成所公开的纳米粒的部分。例如，所公开的治疗性纳米粒可以任选地包括约0.2重量％至约30重量％的PLA-PEG或PLGA-PEG，其中PEG被药物官能化(例如，PLA-PEG-药物)。
可以使用任意合适的缀合技术形成所公开的聚合物缀合物(例如，聚合物-配体缀合物)。例如，可以使用诸如以下技术使两种化合物(诸如靶向部分或药物和生物相容性聚合物(例如，生物相容性聚合物和聚(乙二醇)))缀合在一起：EDC-NHS化学(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺)或涉及马来酰亚胺或羧酸(其可缀合至硫醇、胺或类似官能化聚醚的一端)的反应。靶向部分或药物和聚合物形成聚合物-靶向部分缀合物或聚合物-药物缀合物的缀合可在有机溶剂(诸如但不限于，二氯甲烷、乙腈、氯仿、二甲基甲酰胺、四氢呋喃、丙酮等)中进行。本领域普通技术人员仅使用常规实验即可确定具体反应条件。
在另一组实施方案中，可通过使包含羧酸官能团的聚合物(例如，聚(酯-醚)化合物)与包含胺的聚合物或其他部分(诸如靶向部分或药物)反应来进行缀合反应。例如，靶向部分(诸如低分子量配体)或药物(诸如达沙替尼)可与胺反应形成含胺部分，其然后可缀合至聚合物的羧酸。这样的反应可以以单一步骤反应发生，即，在不使用中间体(例如，N-羟基琥珀酰亚胺或马来酰亚胺)下进行缀合。在一些实施方案中，可使药物与含胺连接基反应形成含胺药物，其然后可缀合至如上文所述的聚合物的羧酸。在一组实施方案中，可通过以下方式来实现含胺部分与羧酸封端的聚合物(诸如聚(酯-醚)化合物)之间的缀合反应：将溶于有机溶剂(诸如(但不限于)二氯甲烷、乙腈、氯仿、四氢呋喃、丙酮、甲酰胺、二甲基甲酰胺、吡啶、二恶烷或二甲基亚砜)中的含胺部分添加至含有羧酸封端的聚合物的溶液中。羧酸封端的聚合物可含于有机溶剂(诸如，但不限于，二氯甲烷、乙腈、氯仿、二甲基甲酰胺、四氢呋喃或丙酮)中。在一些情况下，含胺部分与羧酸封端的聚合物之间的反应可自发发生。可以在这样的反应之后洗涤掉未缀合反应物，并且可使聚合物沉淀于溶剂(诸如，例如，乙醚、己烷、甲醇或乙醇)中。在某些实施方案中，可在含醇部分和聚合物的羧酸官能团之间形成缀合物，其可如上述用于胺和羧酸的缀合物类似地来实现。
应该理解，在一些实施方案中，纳米粒可包含两种不同类型的配体。例如，纳米粒可包含小分子配体和核酸类型配体。在一些实施方案中，纳米粒可包含三种不同类型的配体。在一些实施方案中，纳米粒可包含多种不同类型的配体。应该理解，所公开的纳米粒可包括任意数量的不同配体。
纳米粒的制备
本公开的另一方面涉及制备所公开的纳米粒的系统和方法。在一些实施方案中，使用不同比率的两种或更多种不同的聚合物(例如，共聚物，例如，嵌段共聚物)并从聚合物(例如，共聚物，例如，嵌段共聚物)产生颗粒，颗粒的性质被控制。例如，一种聚合物(例如，共聚物，例如，嵌段共聚物)可以包括低分子量配体，而另一种聚合物(例如，共聚物，例如，嵌段共聚物)可以针对其生物相容性和/或其控制所得颗粒的免疫原性的能力来选择。
在一些实施方案中，用于纳米粒制备方法(例如，如下文所讨论的纳米沉淀方法或纳米乳化方法)的溶剂可以包括疏水性抗衡离子剂(诸如，内-溶酶体破坏剂)，其可赋予使用该方法制备的纳米粒有利的性质。如上文所讨论的，在一些情况下，疏水性抗衡离子剂(诸如内-溶酶体破坏剂)可改善药物负载，保护核酸的完整性和实现所公开纳米粒的转染。另外，在一些情形下，可通过使用疏水性抗衡离子剂(诸如内-溶酶体破坏剂)改善所公开的纳米粒的控制释放性质。在一些情况下，疏水性抗衡离子剂(诸如内-溶酶体破坏剂)可包含于，例如，在该方法中使用的有机溶液或水溶液中。在一个实施方案中，药物与有机溶液和疏水性抗衡离子剂(诸如内-溶酶体破坏剂)以及任选地一种或多种聚合物组合。疏水性抗衡离子剂(诸如内-溶酶体破坏剂)在用于溶解药物的溶液中的浓度在上文讨论了，例如，可以是约1重量％至约30重量％等。
在一组实施方案中，通过提供包含一种或多种聚合物的溶液，并使该溶液与聚合物非溶剂接触以产生颗粒来形成颗粒。溶液可与聚合物非溶剂混溶或不混溶。例如，水混溶性液体(诸如，乙腈)可含有聚合物，并且，例如，通过以受控速率将乙腈倾倒至水中来使乙腈与水、聚合物非溶剂接触，形成颗粒。含于溶液中的聚合物在与聚合物非溶剂接触时，然后可沉淀以形成颗粒，诸如纳米粒。当在环境温度和压力下一种液体不溶于另一种液体至少10重量％的水平时，这两种液体可称为彼此“不混溶(immiscible)”或不混溶(notmiscible)。通常，有机溶液(例如，二氯甲烷、乙腈、氯仿、四氢呋喃、丙酮、甲酰胺、二甲基甲酰胺、吡啶、二恶烷、二甲基亚砜等)和含水液体(例如，水，或含有溶解盐或其它种类、细胞或生物介质、乙醇等的水)彼此不混溶。例如，可将第一溶液倾倒至第二溶液中(以适宜速率或速度)。在一些情况下，当第一溶液与不混溶的第二液体接触时，可形成颗粒，诸如纳米粒，例如，在将第一溶液倾倒至第二液体中时，聚合物在接触时发生沉淀使得聚合物形成纳米粒，在一些情况下，例如，当小心控制引入速率并且保持在相对缓慢速率时，可形成纳米粒。本领域普通技术人员仅使用常规实验即可容易地优化这样的颗粒形成的控制。
可使用所公开的方法高度控制性质，诸如，表面官能性、表面电荷、大小、zeta(ζ)电位、疏水性、控制免疫原性的能力等。例如，可合成颗粒文库，并且筛选以鉴别具有使得颗粒具有特定密度的存在于颗粒表面上的部分(例如，低分子量配体)的特定聚合物比率的颗粒。这使得能制备具有一种或多种特定性质(例如，部分的特定大小和特定表面密度)的颗粒，而无需过多努力。因此，某些实施方案涉及使用这样的文库的筛选技术，以及使用这样的文库鉴别任何颗粒。此外，可通过任意合适方法来进行鉴别。例如，鉴别可以是直接或间接，或定量或定性进行。
在一些实施方案中，使用类似于那些记载的用于产生配体官能化聚合物缀合物的程序用靶向部分对已形成的纳米粒官能化。例如，将第一共聚物(PLGA-PEG、聚(丙交酯-共-乙交酯)和聚(乙二醇))与核酸混合以形成颗粒。然后使颗粒与低分子量配体缔合以形成纳米粒，其可用于治疗癌症或其他紊乱。颗粒可与不同量的低分子量配体缔合以控制纳米粒的配体表面密度，由此改变纳米粒的治疗性特征。另外，例如，通过控制参数(诸如分子量、PEG分子量和纳米粒表面电荷)可获得极精确控制的颗粒。
在另一个实施方案中，提供纳米乳化方法，诸如图1、2A和/或2B中所表示的方法。例如，可将核酸、疏水性抗衡离子剂(诸如内-溶酶体破坏剂)、第一聚合物(例如，二嵌段共聚物(诸如PLA-PEG或PLGA-PEG，其中的任一个可任选地结合至配体))和任选的第二聚合物(例如，(PL(G)A-PEG或PLA)与有机溶液组合以形成第一有机相。在其他方法中，将核酸和/或疏水性抗衡离子剂加入含水相中。这样的第一相可包括约1重量％至约50重量％固体、约5重量％至约50重量％固体、约5重量％至约40重量％固体、约1重量％至约15重量％固体、或约10重量％至约30重量％固体。该第一有机相可与第一含水溶液组合以形成第二相。有机溶液可包括，例如，甲苯、甲基乙基酮、乙腈、四氢呋喃、乙酸乙酯、异丙醇、乙酸异丙酯、二甲基甲酰胺、二氯甲烷(methylene chloride)、二氯甲烷(dichloromethane)、氯仿、丙酮、苯甲醇、Tween 80、Span 80等。在实施方案中，有机相可包括苯甲醇、乙酸乙酯及其组合。第二相可以是约0.1重量％至50重量％、约1重量％至50重量％、约5重量％至40重量％、或约1重量％至15重量％的固体。含水溶液可以是任选地与胆酸钠、乙酸乙酯、聚乙酸乙烯酯及苯甲醇中的一种或多种组合的水。在一些方法中，将核酸和/或疏水性抗衡离子剂加入含水相。在一些实施方案中，含水相的pH可基于核酸的pKa和/或疏水性抗衡离子剂(诸如内-溶酶体破坏剂)的pKa选择。例如，在某些实施方案中，核酸可以具有第一pKa，疏水性抗衡离子剂(诸如内-溶酶体破坏剂)可以具有第二pKa，并且含水相可以具有等于第一pKa和第二pKa之间的pKa单位的pH。在特定实施方案中，含水相的pH可以是等于在第一pKa和第二pKa之间约等距离的pKa单位。
例如，油或有机相可使用仅部分地与非溶剂(水)混溶的溶剂。因此，在以足够低比率混合时和/或在使用经有机溶剂预饱和的水时，油相仍为液体。油相可乳化至含水溶液中并且作为液滴，例如，使用高能量分散系统(诸如，均化器或超声处理器)剪切成纳米粒。乳液的含水部分(另外称为“水相”)可以是由胆酸钠组成并且经乙酸乙酯和苯甲醇预饱和的表面活性剂溶液。在某些情形下，有机相(例如，第一有机相)可以包括核酸。另外，在某些实施方案中，含水溶液(例如，第一含水溶液)可包括基本上疏水性抗衡离子剂(诸如内-溶酶体破坏剂)。在其他实施方案中，核酸和基本上疏水性抗衡离子剂(诸如内-溶酶体破坏剂)两者都可溶于有机相中。在其他实施方案中，核酸和基本上疏水性抗衡离子剂(诸如内-溶酶体破坏剂)两者都可溶于含水相中。
例如，可以在一个或两个乳化步骤中进行乳化第二相以形成乳液相。例如，可制备初级乳液，然后乳化以形成细乳液。例如，可使用简单混合、高压均化器、探针超声处理器、搅拌棒或转子定子均化器来形成初级乳液。可通过使用，例如，探针超声处理器或高压均化器(例如，通过穿过均化器1、2、3或更多次)来使初级乳液形成细乳液。例如，当使用高压均化器时，所用压力可以是约30至约60psi、约40至约50psi、约1000至约8000psi、约2000至约4000psi、约4000至约8000psi或约4000至约5000psi，例如，约2000、2500、4000或5000psi。
在一些情况下，可选择细乳液条件(其特征可在于乳液中的滴液的非常高的表面体积比率)以最大化核酸剂和疏水性抗衡离子剂(诸如内-溶酶体破坏剂)的溶解度。在某些实施方案中，在细乳液条件下，所溶解组分可快速地发生平衡，即快于纳米粒的固化。因此，基于，例如，核酸剂和疏水性抗衡离子剂(诸如内-溶酶体破坏剂)之间的pKa差别来选择疏水性抗衡离子剂(诸如内-溶酶体破坏剂)，或调节其他参数(诸如，细乳液的pH和/或骤冷溶液的pH)，可对纳米粒的药物负载和释放性质具有显著影响，例如，通过控制核酸-疏水性抗衡离子复合物在纳米粒中的形成而不是核酸剂和/或疏水性抗衡离子剂(诸如内-溶酶体破坏剂)从纳米粒中扩散出来。
在一些实施方案中，可在乳化第二相之前将核酸和基本上疏水性抗衡离子剂(诸如内-溶酶体破坏剂)于第二相中组合。在一些情况下，核酸和基本上疏水性抗衡离子剂(诸如内-溶酶体破坏剂)可在乳化第二相之前形成核酸-疏水性抗衡离子复合物。在其他实施方案中，核酸和基本上疏水性抗衡离子剂(诸如内-溶酶体破坏剂)可在第二相的乳化期间形成核酸-疏水性抗衡离子复合物。例如，核酸剂和基本上疏水性抗衡离子剂(诸如内-溶酶体破坏剂)可在基本上与乳化第二相的同时于第二相中组合，例如，核酸剂和基本上疏水性抗衡离子剂(诸如内-溶酶体破坏剂)可溶于分开的溶液(例如，两种基本上不混溶的溶液)中，然后在乳化期间组合。在另一个实例中，核酸和基本上疏水性抗衡离子剂(诸如内-溶酶体破坏剂)可溶于分开的混溶的溶液中，然后在乳化期间将其加入至第二相。
可能需要容剂蒸发或稀释以完成溶剂萃取和固化颗粒。为更好地控制提取动力学和更加可放大的(scalable)方法，可使用通过含水骤冷液(aqueous quench)的溶剂稀释。例如，可将乳液在冷水中稀释至足以溶解所有有机溶剂以形成骤冷相的浓度。在一些实施方案中，可至少部分地在约5℃或更低的温度下进行骤冷。例如，用于骤冷的水可在低于室温的温度下(例如，约0至约10℃、或约0至约5℃)。在某些实施方案中，可选择具有有利于将乳液相骤冷的pH的骤冷液，例如，通过改善纳米粒的性质(诸如释放特征)或改善纳米粒参数(诸如药物负载)。可通过酸或碱滴定，例如或者通过适当选择缓冲液来调节骤冷液的pH。在一些实施方案中，骤冷液的pH的选择可基于核酸的pKa和/或疏水性抗衡离子剂(诸如内-溶酶体破坏剂)的pKa。例如，在某些实施方案中，核酸可具有第一pKa，疏水性抗衡离子剂(诸如内-溶酶体破坏剂)可具有第二pKa，乳液相可以被具有等于第一pKa和第二pKa之间的pKa单位的pH的含水溶液骤冷。在一些实施方案中，所得骤冷相也可具有等于第一pKa与第二pKa之间的pKa单位的pH。在特定实施方案中，pH可等于在第一pKa和第二pKa之间约等距离的pKa单位。
在某些实施方案中，核酸-疏水性抗衡离子复合物可发生于乳化期间或之后，例如，因细乳液中的平衡条件。不期望受限于任何理论，应相信有机可溶性抗衡离子(即，疏水性抗衡离子剂(诸如内-溶酶体破坏剂))可因核酸-疏水性抗衡离子复合物而促进亲水性治疗剂(核酸)扩散至乳液的纳米粒、有机相或液滴。不期望受限于任何理论，核酸-疏水性抗衡离子复合物可在纳米粒固化前保留于纳米粒、有机相或液滴中，因为核酸-疏水性抗衡离子复合物在纳米粒中的溶解度高于核酸-疏水性抗衡离子复合物在乳液和/或骤冷液中的溶解度。例如，通过选择骤冷液的pH在核酸的pKa和疏水性抗衡离子剂(诸如内-溶酶体破坏剂)的pKa之间，可优化核酸-疏水性抗衡离子复合物的形成。然而，选择过高的pH可倾向于导致疏水性抗衡离子剂(诸如内-溶酶体破坏剂)扩散出纳米粒，而选择过低的pH可倾向于导致治疗剂(核酸)扩散出纳米粒。
在某些实施方案中，用于纳米粒制剂方法(例如，包括但不限于含水相、乳液相、骤冷液和骤冷相)的含水溶液的pH可独立地选择并且可为约1至约3，在一些实施方案中为约2至约4，在一些实施方案中为约3至约5，在一些实施方案中为约4至约6，在一些实施方案中为约5至约7，在一些实施方案中为约6至约8，在一些实施方案中为约7至约9，以及在一些实施方案中为约8至约10。在某些实施方案中，用于纳米粒制剂方法的含水溶液的pH可为约3至约4，在一些实施方案中为约4至约5，在一些实施方案中为约5至约6，在一些实施方案中为约6至约7，在一些实施方案中为约7至约8，以及在一些实施方案中为约8至约9。
在一些实施方案中，不是所有核酸在此阶段都封装于颗粒中，将药物增溶剂加入至骤冷相中以形成溶解相。药物增溶剂可以是，例如，Tween 80、Tween 20、聚乙烯吡咯烷酮、环糊精、十二烷基硫酸钠、胆酸钠、二乙基亚硝胺、乙酸钠、脲、甘油、丙二醇、四氢呋喃聚乙二醇醚(glycofurol)、聚(乙)二醇、双(聚氧乙烯乙二醇十二烷基醚(bris(polyoxyethyleneglycolddodecyl ether)、苯甲酸钠、水杨酸钠、或其组合。例如，可将Tween-80添加至骤冷纳米粒悬浮液中以溶解游离药物并防止形成药物晶体。在一些实施方案中，药物增溶剂与核酸的比率是约200:1至约10:1，或在一些实施方案中约100:1至约10:1。
可过滤溶解相以回收纳米粒。例如，可使用超滤膜浓缩纳米粒悬浮液，基本上消除有机溶剂、游离药物(即，未封装的核酸)、药物增溶剂和其他处理助剂(表面活性剂)。可使用切向流过滤系统进行示例性过滤。例如，通过使用孔径适于保留纳米粒而允许溶质、胶束和有机溶剂通过的膜，可选择性分离纳米粒。可使用具有300-500kDa(～5-25nm)的分子量截留的示例性膜。
可使用恒定体积方式来进行渗滤，其意在可以与从悬浮液中去除滤液相同的速率向进料悬浮液中添加渗滤液(冷去离子水，例如，约0至约5℃，或0至约10℃)。在一些实施方案中，过滤可包括使用约0至约5℃或0至约10℃的第一温度和约20至约30℃或15至约35℃的第二温度的第一滤液。在一些实施方案中，过滤可包括处理约1至约30、在一些情况下约1至约15、或在一些情况下1至约6的渗滤体积(diavolume)。例如，过滤可包括在约0至约5℃下处理约1至约30、或在一些情况下约1至约6的渗滤体积，以及在约20至约30℃下处理至少一渗滤体积(例如，约1至约15、约1至约3、或约1至约2的渗滤体积)。在一些实施方案中，过滤包括在不同区别温度下处理不同的渗滤体积。
在纯化和浓缩纳米粒悬浮液后，纳米粒可通过一个、两个或更多个除菌和/或深度过滤器(例如，使用～0.2μm深度预过滤器)。例如，除菌过滤步骤可涉及使用过滤组(filtration train)以受控速率过滤治疗性纳米粒。在一些实施方案中，过滤组可包括深度过滤器和除菌过滤器。
在制备纳米粒的另一实施方案中，有机相由核酸和聚合物(例如，共聚物和任选地具有配体的共聚物)的混合物构成。将有机物与含水相以大约1:5比率(油相:含水相)混合，其中含水相由表面活性剂和一些溶解溶剂构成。通过在简单混合下或通过使用转子定子均化器组合两种相以形成初级乳液。然后通过使用高压均化器使初级乳液形成细乳液。然后通过在混合下添加至去离子水中将细乳液骤冷。在一些实施方案中，骤冷液:乳液的比率可以是约2:1至约40:1、或在一些实施方案中约5:1至约15:1。在一些实施方案中，骤冷液:乳液的比率大约是8.5:1。然后将Tween(例如Tween 80)的溶液加入至骤冷液中以获得总共大约2％的Tween。这用于溶解游离、未封装的核酸。然后通过离心或超滤/渗滤分离纳米粒。
会理解，用于制备制剂的聚合物、核酸和疏水性抗衡离子剂(诸如内-溶酶体破坏剂)的量可不同于最终制剂。例如，一些核酸可不完全引入纳米粒中，例如，这样的游离核酸可以被过滤掉。例如，在实施方案中，可使用第一有机溶液(含有约11重量％理论负载的核酸，在第一有机溶液中含有约9％的第一疏水性抗衡离子剂(诸如内-溶酶体破坏剂))，第二有机溶液(含有约89重量％的聚合物(例如，聚合物可包括约2.5mol％的缀合至聚合物的靶向部分和约97.5mol％的PLA-PEG))，和含水溶液(含约0.12％的第二疏水性抗衡离子剂(诸如内-溶酶体破坏剂))来制备制剂，其得到，例如，包含约2重量％的核酸、约97.5重量％的聚合物(其中聚合物可包括约1.25mol％的缀合至聚合物的靶向部分和约98.75mol％的PLA-PEG)、和约0.5％至约3％的总内-溶酶体逃脱剂得最终纳米粒。这样的方法可提供适于给患者给药的最终纳米粒，其包括约1重量％至约20重量％的治疗剂，例如，约1重量％、约2重量％、约3重量％、约4重量％、约5重量％、约8重量％、约10重量％或约15重量％的核酸。
药物制剂
根据另一方面，本文所公开的纳米粒可与药学上可接受的载体组合形成药物组合物。本领域技术人员会理解，可基于下文所述的给药途径、靶组织位置、所递送的药物、递送药物的时间过程等来选择载体。
可通过本领域已知的任意方式(包括口服和肠胃外途径)将药物组合物给药于患者。本文所使用的术语“患者”指人类以及非人类，包括，例如，哺乳动物、鸟、爬行动物、两栖动物和鱼。例如，非人类可以是哺乳动物(例如，啮齿动物、小鼠、大鼠、兔、猴、狗、猫、灵长类动物或猪)。在某些实施方案中，期望肠胃外途径，因为其避免与消化管中所发现的消化酶接触。根据这样的实施方案，组合物可通过注射(例如，静脉、皮下或肌内、腹膜内注射)、经直肠、经阴道、局部(通过粉剂、乳霜、软膏或滴剂)、或通过吸入(通过喷雾剂)给药。
在特定实施方案中，纳米粒全身性地向有此需要的个体给药，例如，通过IV输注或注射。
可根据已知现有技术使用合适分散或湿润剂以及悬浮剂来配制可注射制剂，例如，无菌可注射含水混悬剂或含油混悬剂。无菌可注射制剂也可以是无毒肠胃外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌可注射溶液、悬浮液或乳液，例如，为1,3-丁二醇中的溶液。可采用的可接受的载体和溶剂是水、Ringer’s溶液、U.S.P.和等渗氯化钠溶液。此外，常规地采用无菌不挥发性油作为溶剂或悬浮介质。出于这个目的，可采用包括合成甘油单酸酯或甘油二酸酯的任何温和的不挥发性油。此外，脂肪酸诸如油酸被用于制备注射剂。在一个实施方案中，将缀合物悬浮于包含1％(w/v)羧甲基纤维素钠和0.1％(v/v)TWEENTM 80的载体液中。注射剂可例如通过经细菌截留过滤器过滤、或通过掺入无菌固体组合物形式的灭菌剂(其可在使用前溶解或分散于无菌水或其他无菌可注射介质中)除菌。
用于口服给药的固体剂型包括胶囊、片剂、丸剂、粉剂和颗粒剂。在这样的固体剂型中，封装或未封装的缀合物与至少一种惰性的、药学上可接受的赋形剂或载体(例如，柠檬酸钠或磷酸二钙)和/或以下混合：(a)填充剂或增量剂，诸如，淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和硅酸，(b)黏合剂，如，羧甲基纤维素、海藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯胶，(c)保湿剂，诸如，甘油，(d)崩解剂，诸如，琼脂-琼脂、碳酸钙、马铃薯或木薯淀粉、海藻酸、某些硅酸盐和碳酸钠，(e)溶液阻滞剂，诸如，石蜡，(f)吸收促进剂，诸如，季铵化合物，(g)润湿剂，如，鲸蜡醇和甘油单硬脂酸酯，(h)吸收剂，诸如，高岭土和膨润土，以及(i)润滑剂，诸如，滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、月桂基硫酸钠及其混合物。在胶囊、片剂和丸剂的情况下，剂型还可以包含缓冲剂。
会理解，个体医生根据被治疗的患者来选择含有核酸剂的纳米粒的确切剂量，一般而言，调节剂量和给药以提供有效量的核酸剂纳米粒至所治疗的患者。如本文所使用的，含有核酸剂的纳米粒的“有效量”指引发期望的生物学应答所必需的量。本领域普通技术人员会理解，含有核酸剂的纳米粒的有效量可根据这样的因素而变化：所期望的生物学终点、待递送药物、靶组织、给药途径等。例如，含有核酸剂的纳米粒的有效量可以是导致肿瘤大小经所期望的时间段减小期望量的量。可考虑的其他因素包括疾病状况的严重程度；所治疗患者的年龄、体重和性别；饮食、给药时间和频率、药物组合；反应敏感性；以及对疗法的耐受性/反应。
可以以剂量单位形式配制纳米粒以便给药和剂量均一。本文所使用的表达“剂量单位形式”指适于被治疗的患者的纳米粒的物理上分离单位。然而，会理解，组合物的总日用量应由主治医师在合理医疗判断的范围内决定。对于任何纳米粒而言，可最初在细胞培养试验中或动物模型(通常为小鼠、兔、狗或猪)中估计治疗有效剂量。也使用动物模型来实现期望给药的浓度范围和途径。然后可使用这样的信息来确定人类给药的有用剂量和途径。可以通过在细胞培养或实验动物中的标准药物程序来确定纳米粒的治疗效力和毒性，例如，ED50(在50％的群体中治疗有效的剂量)和LD50(对50％群体致死的剂量)。毒性与治疗效应的剂量比率是治疗指数，其可以表示为比率LD50/ED50。展现大的治疗指数的药物组合物可用于一些实施方案中。从细胞培养试验和动物研究中获得的数据可用于配制用于人类使用的剂量范围。
在实施方案中，本文所公开的组合物可包括少于约10ppm的钯、或少于约8ppm、或少于约6ppm的钯。例如，本文提供的是包括具有聚合物缀合物的纳米粒的组合物，其中组合物具有少于10ppm的钯。
在一些实施方案中，涵盖适于冷冻的组合物，其包括本文所公开的纳米粒和适于冷冻的溶液，例如，将糖(如，单糖、二糖或多糖，例如，蔗糖和/或海藻糖)，和/或盐和/或环糊精溶液添加至纳米粒悬浮液中。糖(例如，蔗糖或海藻糖)可作为，例如，冷冻保护剂来防止颗粒在冷冻时聚集。例如，本文提供的是纳米粒制剂，其包含多种所公开的纳米粒、蔗糖、离子卤化物和水；其中纳米粒/蔗糖/水/离子卤化物是约3-40％/10-40％/20-95％/0.1-10％(w/w/w/w)或约5-10％/10-15％/80-90％/1-10％(w/w/w/w)。例如，这样的溶液可包括本文所公开的纳米粒，约5重量％至约20重量％蔗糖和浓度为约10-100nM的离子卤化物(诸如，氯化钠)。在另一实中，本文提供的是纳米粒制剂，其包含多种所公开的纳米粒、海藻糖、环糊精和水；其中纳米粒/海藻糖/水/环糊精是约3-40％/1-25％/20-95％/1-25％(w/w/w/w)或约5-10％/1-25％/80-90％/10-15％(w/w/w/w)。
例如，所涵盖的溶液可包括本文所公开的纳米粒，约1重量％至约25重量％二糖(诸如，海藻糖或蔗糖(例如，约5重量％至约25重量％海藻糖或蔗糖，例如，约10重量％海藻糖或蔗糖或约15重量％海藻糖或蔗糖，例如，约5重量％蔗糖))和环糊精(诸如，β-环糊精，其浓度为约1重量％至约25重量％(例如，约5重量％至约20重量％，例如，10重量％或约20重量％或约15重量％至约20重量％)环糊精)。所涵盖的制剂可包括多种所公开的纳米粒(例如，具有PLA-PEG和活性剂的纳米粒)，和约2wt％至约15wt％(或约4wt％至约6wt％，例如，约5wt％)蔗糖及约5wt％至约20％(例如，约7wt％至约12wt％，例如，约10wt％)环糊精(例如，HPbCD)。
本公开部分地涉及冻干的药物组合物，其在复溶时具有最小量的大聚集物。这样的大聚集物的大小可大于约0.5μm、大于约1μm、或大于约10μm，并且在复溶溶液中可以是不期望的。聚集物大小可使用多种技术来测量，包括美国药典在32<788>中所显示的那些，在此援引加入。USP 32<788>中所概述的测试包括遮光颗粒计数测试、微观颗粒计数测试、激光衍射和单颗粒光学传感。在一个实施方案中，使用激光衍射和/或单颗粒光学传感来测量给定样品中的粒径。
USP 32<788>通过遮光颗粒计数测试描述了用于取样悬浮液中的粒径的指南。对于小于或等于100mL的溶液，如果存在的颗粒的平均数量不超过6000个/容器(其≥10μm)以及600个/容器(其≥25μm)，则制剂与测试相符合。
如USP 32<788>中所概述，微观颗粒计数测试描述用于使用调节至100±10倍放大倍数且具有目镜测微计的双目显微镜来测定颗粒量的指南。目镜测微计是圆直径计数线，其由分成象限的圆组成且具有在以100倍放大倍数观测时指示10μm和25μm的黑色参考圆。在计数线下方提供线性标度。目测计算参照10μm和25μm的颗粒数。对于小于或等于100mL的溶液，如果所存在颗粒的平均数量不超过3000个/容器(其≥10μm)以及300个/容器(其≥25μm)，则制剂与测试相符合。
在一些实施方案中，所公开的组合物的10mL含水样品在复溶后包含少于600个颗粒/mL(其大小大于或等于10微米)；和/或少于60个颗粒/mL(其大小大于或等于25微米)。
可使用动态光散射(DLS)来测量粒径，但其依赖于布朗运动从而该技术可能检测不到一些较大的颗粒。激光衍射依赖于颗粒与悬浮介质之间的折射率差。该技术能够检测亚微米至毫米范围的颗粒。相对小(例如，约1-5重量％)量的较大颗粒可以在纳米粒悬浮液中测定。单颗粒光学传感(SPOS)使用稀悬浮液的遮光来计数约0.5μm的个体颗粒。通过知晓所测量样品的颗粒浓度，可计算聚集物的重量百分比或聚集物浓度(颗粒/mL)。
在冻干期间由于颗粒表面脱水可发生聚集物的形成。该脱水可通过在冻干之前在悬浮液中使用冻干保护剂(例如，二糖)来避免。合适的二糖包括蔗糖、乳果糖、乳糖、麦芽糖、海藻糖或纤维二糖和/或其混合物。其他所涵盖的二糖包括曲二糖、黑曲霉糖、异麦芽糖、β,β-海藻糖、α,β-海藻糖、槐糖、昆布二糖、龙胆二糖、松二糖、麦芽酮糖、帕拉金糖、龙胆二酮糖(gentiobiulose)、甘露二糖、蜜二糖、车前二糖、芸香糖、芦丁酮糖和木二糖。当与起始悬浮液相比时，复溶显示等同的DLS大小分布。然而，激光衍射可检测一些复溶溶液中>10μm大小的颗粒。另外，SPOS也可以检测>10μm大小颗粒(高于FDA指南的浓度(对于>10μm颗粒，104-105个颗粒/mL))。
在一些实施方案中，可使用一种或多种离子卤化物盐作为除糖(如，蔗糖、海藻糖或其混合物)外的另外的冻干保护剂。糖可包括二糖、单糖、三糖和/或多糖，并且可包括其他赋形剂，例如，甘油和/或表面活性剂。任选地，可包括环糊精作为另外的冻干保护剂。可添加环糊精以代替离子卤化物盐。或者，除离子卤化物盐外可添加环糊精。
合适的离子卤化物盐可包括氯化钠、氯化钙、氯化锌或其混合物。其他合适的离子卤化物盐包括氯化钾、氯化镁、氯化铵、溴化钠、溴化钙、溴化锌、溴化钾、溴化镁、溴化铵、碘化钠、碘化钙、碘化锌、碘化钾、碘化镁或碘化铵和/或其混合物。在一个实施方案中，约1重量％至15重量％的蔗糖可与离子卤化物盐一起使用。在一个实施方案中，冻干的药物组合物可包含约10mM至约100mM的氯化钠。在另一个实施方案中，冻干的药物组合物可包含约100mM至约500mM的二价离子氯化物盐，诸如，氯化钙或氯化锌。在又一实施方案中，待冻干的悬浮液可进一步包含环糊精，例如，可使用约1重量％至约25重量％的环糊精。
合适的环糊精可包括α-环糊精、β-环糊精、γ-环糊精或其混合物。本文所公开的组合物中使用的所涵盖的示例性环糊精包括羟丙基-β-环糊精(HPbCD)、羟乙基-β-环糊精、磺丁基醚-β-环糊精、甲基-β-环糊精、二甲基-β-环糊精、羧甲基-β-环糊精、羧甲基乙基-β-环糊精、二乙基-β-环糊精、三-O-烷基-β-环糊精、葡萄糖基-β-环糊精和麦芽糖基-β-环糊精。在一些实施方案中，约1重量％至约25重量％的海藻糖(例如，约10％至约15％，例如，5重量％至约20重量％)可与环糊精一起使用。在一个实施方案中，冻干的药物组合物可包含约1重量％至约25重量％的β-环糊精。示例性组合物可包含含PLA-PEG、活性剂/治疗剂、约4％至约6％(例如，5wt％)蔗糖和约8重量％至约12重量％(例如，约10wt％)HPbCD的纳米粒。
一方面，提供冻干的药物组合物，其包含所公开的纳米粒，其中以约50mg/mL的纳米粒浓度在小于或约100mL的含水介质中复溶冻干的药物组合物时，适用于肠胃外给药的复溶的组合物包含少于6000个(诸如少于3000个)大于或等于10微米的微粒；和/或少于600个(诸如，少于300个)大于或等于25微米的微粒。
微粒数可通过诸如USP 32<788>中的通过遮光颗粒计数测试、USP 32<788>中的通过微观颗粒计数测试、激光衍射和单颗粒光学传感的方式测定。
一方面，提供在复溶后适用于肠胃外使用的药物组合物，其包含多种治疗性颗粒，各治疗性颗粒包含具有疏水性聚合物部分(segment)和亲水性聚合物部分的共聚物；活性剂；糖；和环糊精。
例如，共聚物可以是聚(乳)酸-嵌段-聚(乙)二醇共聚物。在复溶后，100mL含水样品可包含少于6000个具有大小大于或等于10微米的颗粒；和少于600个具有大小大于或等于25微米的颗粒。
添加二糖和离子卤化物盐的步骤可包括添加约5重量％至约15重量％蔗糖或约5重量％至约20重量％海藻糖(例如，约10重量％至约20重量％海藻糖)，和约10至约500mM离子卤化物盐。离子卤化物盐可选自氯化钠、氯化钙和氯化锌或其混合物。在一个实施方案中，还添加约1重量％至约25重量％的环糊精。
在另一实施方案中，添加二糖和环糊精的步骤可包括添加约5重量％至约15重量％的蔗糖或约5重量％至约20重量％的海藻糖(例如，约10重量％至约20重量％海藻糖)，和约1重量％至约25重量％的环糊精。在实施方案中，添加约10重量％至约15重量％的环糊精。环糊精可选自α-环糊精、β-环糊精、γ-环糊精或其混合物。
另一方面，提供防止药物纳米粒组合物中颗粒大量聚集的方法，其包括向冻干的制剂中添加糖和盐以防止纳米粒在复溶时的聚集。在实施方案中，还添加环糊精至冻干制剂中。又一方面，提供防止药物纳米粒组合物中颗粒大量聚集的方法，其包括向冻干的制剂中添加糖和环糊精以防止纳米粒在复溶时的聚集。
所涵盖的冻干的组合物可具有大于约40mg/mL的治疗性颗粒浓度。适合于肠胃外给药的制剂可在10mL剂量中具有少于约600个具有大小大于10微米的颗粒。冻干可包括在大于-40℃或例如小于约-30℃的温度下冷冻组合物，形成冷冻组合物；和干燥冷冻组合物以形成冻干的组合物。干燥步骤可在约50毫托下在约-25℃至约-34℃、或约-30℃至约-34℃的温度下发生。
治疗方法
在一些实施方案中，所公开的纳米粒可用于治疗、缓解、改善、减轻疾病、紊乱和/或病况的一种或多种症状或特征、延迟其发作、抑制其进展、降低其严重程度和/或减少其发生率。在一些实施方案中，所公开的纳米粒可用于治疗实体瘤，例如，癌症和/或癌细胞。在一些实施方案中，治疗EGFR表达的细胞。在一些实施方案中，治疗表达EGFR的其他癌细胞的实体瘤。在某些实施方案中，所公开的纳米粒可用于在有此需要的受试者中治疗任何的癌症，其中PSMA表达在癌细胞表面或在肿瘤新生血管(包括前列腺或非前列腺实体瘤的新生血管)中。PSMA相关适应症的实例包括但不限于，前列腺癌、乳腺癌、非小细胞肺癌、结肠直肠癌和胶质母细胞瘤。例如，所公开的纳米粒可用于治疗肾细胞癌。在另一实施方案中，所公开的纳米粒可用于治疗肾癌、多形性胶质母细胞瘤、套细胞淋巴瘤或真皮Kaposi's肉瘤。
所公开的纳米粒可用于治疗癌症。术语“癌症”包括恶化前和恶性癌症。癌症包括但不限于，血癌(例如，慢性髓性白血病、慢性髓单核细胞性白血病、费城染色体阳性的急性淋巴细胞白血病、套细胞淋巴瘤)、前列腺癌、胃癌、口咽癌、宫颈癌、肛门癌、胆囊癌、胆管癌、肠癌、结肠直肠癌、皮肤癌(例如，黑色素瘤或基底细胞癌)、肺癌(例如，小细胞肺癌或非小细胞肺癌(例如，腺癌、鳞状细胞癌))、乳腺癌、头颈癌、支气管癌、胰腺癌、膀胱癌、脑癌或中枢神经系统癌、扁桃体癌、周围神经系统癌、食管癌、口腔癌或咽癌、肝癌(例如，肝细胞癌)、肾癌(例如，肾细胞癌)、睪丸癌、胆道癌、小肠癌或阑尾癌、胃肠道间质瘤、唾液腺癌、甲状腺癌(例如，滤泡状甲状腺癌和未分化的甲状腺癌)、肾上腺癌、骨肉瘤、软骨肉瘤、血液组织癌、治疗具有KRas突变的癌症、治疗难治性癌症等。“癌细胞”可以是肿瘤的形式(即实体瘤)，单独存在于个体内(例如，白血病细胞)，或是源自癌症的细胞系。
癌症可与多种身体症状有关。癌症症状通常取决于肿瘤的类型和位置。例如，肺癌可引起咳嗽、呼吸短促和胸痛，而结肠癌通常引起腹泻、便秘和便血。然而，仅举几个实例，以下症状通常与许多癌症有关：发烧、寒冷、盗汗、咳嗽、呼吸困难、重量减轻、食欲不振、厌食、恶心、呕吐、腹泻、贫血、黄疸、肝大、咯血、疲劳、全身乏力、认知功能障碍、抑郁、内分泌失调、中性粒细胞减少、疼痛、不愈合的疮、淋巴结肿大、周围神经病变和性功能障碍。所公开的纳米粒可用于治疗癌症的身体症状。
在一方面，提供治疗癌症(例如，白血病)的方法。应该理解，治疗诸如感染、炎症、遗传疾病等方法可以如本文所公开的完成。在一些实施方案中，癌症的治疗包括以实现期望的结果所必需的量和时间，向有此需要的个体给药治疗有效量的所公开的纳米粒。在某些实施方案中，所公开的纳米粒的“治疗有效量”是有效治疗、缓解、改善、减轻癌症的一种或多种症状或特征、延迟其发作、抑制其进展、降低其严重程度和/或减少其发生率的量。
在一方面，提供向患有癌症(例如，白血病)的个体给药组合物的方法。在一些实施方案中，可以实现期望的结果(即，治疗癌症)所必需的量和时间向个体给药颗粒。在某些实施方案中，所公开的纳米粒的“治疗有效量”是有效治疗、缓解、改善、减轻癌症的一种或多种症状或特征、延迟其发作、抑制其进展、降低其严重程度和/或减少其发生率的量。
本文也涵盖通过给药所公开的纳米粒治疗经器官移植的患者的方法。本文所涵盖的其他方法包括通过给药有效量的所公开的纳米粒治疗患有结节性硬化症复合症和/或孤独症的患者。
公开本文所涵盖的方法包括，例如，预防或阻止患者(例如，在血管病变中接受裸金属支架的患者)的血管中的新生血管内膜增生的方法，其包括给药包含所公开纳米粒的组合物。本文也涵盖治疗或预防再狭窄(例如，在接受支架的患者中)的方法，其包括给药所公开的纳米粒。
所涵盖的方法包括治疗炎性疾病，其可以是炎性肠病，诸如克罗恩氏病、溃疡性结肠炎、胶原性结肠炎、淋巴细胞性结肠炎、缺血性结肠炎、转流性结肠炎、白塞病或未确定型结肠炎。在其他实施方案中，提供治疗有此需要的患者的肠易激综合征的方法。该方法包括向患者给药治疗有效量的纳米粒。在一些实施方案中，纳米粒可含有治疗剂。例如，在某些实施方案中，治疗剂可以是抗炎剂，诸如上面所述。
治疗方案涉及向健康个体(即，不展现任何癌症症状和/或未被诊断患有癌症的个体)给药治疗有效量的所公开的纳米粒。例如，可以在癌症发生和/或癌症症状发作之前用所公开的纳米粒对健康个体进行“免疫”；处于风险的个体(例如，具有家族癌症史的患者；携带与癌症发生有关的一种或多种基因突变的患者；具有与癌症发生有关的遗传多态性的患者；被与癌症发生有关的病毒感染的患者；具有与癌症发生有关的习惯和/或生活方式的患者等)可以基本上与癌症症状发作同时(例如，48小时内、24小时内或12小时内)治疗。当然，已知患有癌症的个体可在任何时间接受治疗。
在其他实施方案中，所公开的纳米粒可用于抑制癌细胞(例如，髓性白血病癌细胞)的生长。如本文所使用的，术语“抑制癌细胞的生长”或“癌细胞生长的抑制”指癌细胞增殖和/或迁移的速率的任何减缓、癌细胞增殖和/或迁移的阻止、或杀死癌细胞，从而使得与所观测或预测的未治疗的对照癌细胞的生长速率相比，癌细胞生长的速率降低。术语“抑制生长”也可指癌细胞或肿瘤的大小减小或消失，以及指其转移可能性的降低。优选地，在细胞水平的这样的抑制可在患者中减小癌症的大小、阻止癌症生长、降低癌症侵袭性或预防或抑制癌症转移。本领域技术人员可以通过多种合适指标中的任何指标容易地确定癌细胞生长是否被抑制。
例如，癌细胞生长的抑制可例如通过以下得到证实：癌细胞停滞在细胞周期的特定阶段，例如，停滞在细胞周期的G2/M阶段。癌细胞生长的抑制也可通过直接或间接测量癌细胞或肿瘤大小来证实。在人类癌症患者中，这样的测量通常使用公知的成像方法来进行，诸如磁共振成像、计算机化的轴向层析成像和X射线。癌细胞生长也可间接的测定，诸如通过测定循环癌胚抗原、前列腺特异性抗原或与癌细胞生长相关的其他癌症特异性抗原的水平。癌症生长的抑制通常也与个体的存活期延长和/或健康和康乐增加相关。
本文还提供向患者给药本文所公开的纳米粒(包括活性剂)的方法，其中，在向患者给药时，与给药单独的剂(即不是作为所公开的纳米粒)相比，这样的纳米粒大大降低分布体积和/或大大降低游离Cmax。
美国专利号8,206,747，于2012年6月26日授权，标题为“Drug Loaded PolymericNanoparticles and Methods of Making and Using Same”在此整体援引加入。
实施例
所公开的纳米粒现已被一般性地描述，通过参考下列实施例会更容易理解，其仅用于说明所公开的纳米粒的某些方面和实施方案的目的，不意在以任何方式限制所公开的纳米粒。
实施例1：PLA-PEG的制备
合成通过d,l-丙交酯与作为高分子-引发剂的α-羟基-ω-甲氧基聚(乙二醇)的开环聚合来完成，并且在升高的温度使用作为催化剂的2-乙基己酸锡(II)来进行，如下所示(PEG Mn≈5,000Da；PLA Mn≈16,000Da；PEG-PLA Mn≈21,000Da)
聚合物通过将其溶解于二氯甲烷中，并在己烷和乙醚的混合物中沉淀来纯化。从该步骤中回收的聚合物会在干燥箱中干燥。
实施例2：乳化方法
该方法的一般流程图在图4中描述。通过降低乳化油相的溶剂含量，当纳米粒硬化时，较少的药物损失到骤冷液中。选择溶剂体系具有合适溶剂化能力以使药物在溶液中保持高浓度。使用共溶剂体系(通常是79:21的乙酸乙酯:苯甲醇)允许连续溶液高达50％的固体(通常20-30％，或20-25％)和80:20的聚合物:抗衡离子混合物。
有机相由抗衡离子和聚合物(共聚物，任选地具有配体的共聚物)的混合物构成形成。将有机相与含水相以大约1:5比率(油相:含水相)混合，其中含水相由核酸、表面活性剂和一些溶解溶剂构成。为了实现高药物负载，在有机相中使用约30％的固体。
将有机相与含水相以大约1:5比率(油相:含水相)混合，其中含水相包括核酸、任选的表面活性剂和一些溶解溶剂。通过经简单混合或通过使用转子定子均化器将两种相组合形成初级乳液。然后通过使用高压均化器使初级乳液形成细乳液。然后在给定温度下(在表中列出)在搅拌下通过加入至去离子水或缓冲液或盐溶液，骤冷细乳液。骤冷液:乳液的比率大约是8:1。然后将25％(wt％)的Tween 80加入至骤冷液以实现大约2％的全部Tween80。这用于溶解游离的、未封装的药物，并使得纳米粒的分离过程可行。然后通过离心或超滤/渗滤分离纳米粒。
实施例3：纳米粒制备—乳化方法2
有机相由抗衡离子(在一些实施方案中，通过阳离子抗衡离子与寡核苷酸的电荷缔合形成核酸的疏水性盐)和聚合物(共聚物，和任选地具有配体的共聚物)构成形成。将有机相与含水相以大约1:5比率(油相:含水相)混合，其中含水相由核酸、表面活性剂和一些溶解溶剂构成。为了实现高核酸和抗衡离子负载，在有机相中使用约30％的固体。
初级粗乳液通过经简单混合或通过使用转子定子均化器将两种相组合形成。
然后通过使用高压均化器使初级乳液形成细乳液。
然后通过在给定温度下在搅拌下加入至去离子水骤冷细乳液。在骤冷单元操作中，在搅拌下将乳液加入至冷含水骤冷液中。这用于提取大部分的油相溶剂，有效硬化纳米粒用于下游过滤。骤冷液:乳液的比率大约是5:1。
将35％(wt％)的Tween 80溶液加入至骤冷液以实现大约2％的全部Tween 80。乳液骤冷后，可加入Tween-80溶液。
使用如上所述的标准程序制备纳米粒，聚合物分子量不同，具有100％封装效率，如下所示。核酸是ssDNA:5’CGG CAA GCT GAC CCT GAA GTT。
PLA/PEG 大小(nm) ZP(mV) 负载(UV) EE
13.1/5 105 10.7 10.2％ 100％
16/5 99 10.4 10.6％ 100％
19.2/5 94 11.1 10.4％ 100％
实施例4：纳米粒制备—乳化方法3
有机相由抗衡离子和聚合物(共聚物，和任选地具有配体的共聚物)的混合物构成形成。将有机相与含水相以大约1:5比率(油相:含水相)混合，其中含水相由表面活性剂和一些溶解溶剂构成。为了实现高核酸和抗衡离子负载，在有机相中使用约30％的固体。
初级粗乳液通过经简单混合或通过使用转子定子均化器将两种相组合形成。
然后通过使用高压均化器使初级乳液形成细乳液。
然后将寡核苷酸的含水溶液加入至细乳液中并保持一段时间以使寡核苷酸分散在整个乳液中。
然后通过在给定温度下在搅拌下加入至去离子水骤冷细乳液。在骤冷单元操作中，在搅拌下将乳液加入至冷含水骤冷液中。这用于提取大部分的油相溶剂，有效硬化纳米粒用于下游过滤。骤冷液:乳液的比率大约是5:1。
可将35％(wt％)的Tween 80溶液加入至骤冷液以实现大约2％的全部Tween 80。乳液骤冷后，可加入Tween-80溶液。
实施例5：纳米粒制备—细乳液后(加入CI，然后加入寡核苷酸)
有机相由溶解于有机溶剂中的聚合物(共聚物，和任选地具有配体的共聚物)构成形成。将有机相与含水相以大约1:5比率(油相:含水相)混合，其中含水相由表面活性剂和一些溶解溶剂构成。在有机相中使用约15％的固体。
初级粗乳液通过经简单混合或通过使用转子定子均化器将两种相组合形成。
然后通过使用高压均化器使初级乳液形成细乳液。
抗衡离子作为粉末加入至细乳液中。将溶液搅拌约10分钟。然后将寡核苷酸(粉末)加入至搅拌的细乳液中并再搅拌约10分钟。
然后通过在给定温度下在搅拌下加入至去离子水骤冷细乳液。在骤冷单元操作中，在搅拌下将乳液加入至冷含水骤冷液中。这用于提取大部分的油相溶剂，有效硬化纳米粒用于下游过滤。骤冷液:乳液的比率大约是5:1。
将35％(wt％)的Tween 80溶液加入至骤冷液以实现大约2％的全部Tween 80。乳液骤冷后，加入Tween-80溶液。
使用如上所述的标准程序制备纳米粒。以下是用该方法制备批次的NP大小、药物负载和IVR数据。也可参见图11。核酸是ssDNA:5’CGG CAA GCT GAC CCT GAA GTT。
PLA/PEG 大小(nm) 负载 EE
16/5 122 4.3 43％
实施例6：体外释放
体外释放的方法用于测定在环境温度和37℃条件下从纳米粒的初始爆发(burst)阶段释放。为了保持漏槽状态(sink condition)并且防止纳米粒进入释放样品，设计了透析系统。在获得能够制粒100nm颗粒的超速离心后，将透析膜去除并使用离心将释放的药物从封装的药物中分离。
透析系统如下：通过移液将DI-水中的3 mL寡核苷酸纳米粒(约250μg/mL核酸/PLA纳米粒，相当于2.5 mg/mL固体浓度)的浆放入300 kDa MWCO透析器的内管中。除了DI-水，可使用盐溶液(诸如NaCl)或缓冲液。在一些实施方案中使用0.5 M NaCl的盐溶液。纳米粒在该介质中悬浮。将透析器放入含有130 mL释放介质(PBS中的2.5％羟基β环糊精)的玻璃瓶中，其使用摇床在150 rpm下连续摇动以防止在膜/外部溶液界面处形成未摇动的水层。
在预定时间点，从外部溶液(透析液)中取出等分的样品(1 mL)，并使用基于染料的方法(Oligreen)分析寡核苷酸的浓度。基于染料的定量通过HPLC确认。图5描述了用于体外释放的基于染料和基于HPLC的定量方法的比较。
在没有透析袋的情况下，以较低悬浮体积使用类似条件运行离心系统。将样品以60,000 g离心30分钟并测定上清液的药物含量以测量释放的药物。
实施例7：抗衡离子筛选
所有含核酸的纳米粒均包含抗衡离子以增强递送。所测试的抗衡离子包括氯丙嗪、双十二烷基甲基铵、十六烷基吡啶盐和海巴明，其是基于封装和控制的潜力以及作为离子对的能力而选择的。用不同抗衡离子:核酸比率制备的纳米粒基于以下被筛选：粒径、zeta电位、负载、封装效率和体外释放。
以下描述了含有核酸的纳米粒的完整特征，所述纳米粒包含不同比率的双十二烷基溴化铵和氯丙嗪(结构上非常类似于许多内体和溶酶体破坏分子)。
双十二烷基溴化铵
CI:寡核苷酸进料 大小(nm) ZP(mV) 负载(UV) EE
10 92 5.5 3.3％ 32％
20 92 14.5 6.5％ 66％
40 102 11.5 8.4％ 95％
盐酸氯丙嗪
CI:寡核苷酸进料 Size(nm) ZP(mV) 负载(UV) EE
10 92 5.5 3.3％ 32％
20 92 14.5 6.5％ 66％
40 102 11.5 8.4％ 95％
图6和7分别显示包含不同比率的双十二烷基溴化铵和氯丙嗪的含核酸纳米粒的体外释放结果。
图8描述具有指定抗衡离子的含核酸颗粒的zeta电位。所有的颗粒特性都符合所期望的中性至微负电荷。如图3中所示，用脱氧核糖核酸酶I(Dnase I)处理游离ssDNA(例如，不在纳米粒中的任何类型的DNA)和负载在纳米粒中的ssDNA，接着使脱氧核糖核酸酶I失活。纳米粒内的DNA被保护免于降解，而游离的纳米粒被降解(如图9中所示)。
实施例8：封装材料的核酸酶稳定性
封装的核酸对核酸酶降解的稳定性通过保护免受脱氧核糖核酸酶I切割来测定。用脱氧核糖核酸酶I处理裸露的ssDNA或被纳米粒负载的ssDNA，脱氧核糖核酸酶失活和DNA提取后用HPLC定量DNA。图9描述当引入指定纳米粒时对ssDNA的完全保护使其免于蛋白水解切割。
实施例9：体外释放和负载或理论的负载
使用替代的ssDNA研究含寡核苷酸和抗衡离子(以2:1的抗衡离子:寡核苷酸比率)的纳米粒以测定的释放曲线。方法参见上述的实施例6。可以使用任何的替代DNA或ssDNA(例如，黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD))。颗粒的大小为95-100nm。两种抗衡离子，月桂酰精氨酸乙酯和脱氢松香胺的释放曲线在37℃进行了研究。
图12描述不同理论负载的含有月桂酰精氨酸乙酯作为抗衡离子的纳米粒的寡核苷酸随时间的体外释放曲线。
图13描述不同理论负载的含有脱氢松香胺(内体逃脱剂)作为抗衡离子的纳米粒的寡核苷酸随时间的体外释放。
如图12和13中所示，观察到负载(或理论负载)影响IVR而不对其他属性产生负面影响。
实施例10：反义寡核苷酸(ASO)
研究含反义寡核苷酸(10个核苷酸核糖核酸酶H(Rnase H)结构域侧接5个核苷酸2’O-Me修饰区域)和抗衡离子(氯丙嗪)的纳米粒以测定释放曲线。制剂与先前评估ssDNA的相同。
图14描述包含ASO和抗衡离子(氯丙嗪)的纳米粒在指定抗衡离子:寡核苷酸比率下的释放曲线。
实施例11：反义寡核苷酸(ASO)和
在细胞内研究含有与内体逃脱剂配对的STAT3(信号转导及转录激活因子3)反义寡核苷酸(本文中称为STAT3 ASO)的纳米粒以测定STAT3的表达。STAT3是由STAT3基因编码的转录因子。没有任何递送剂下孵育STAT3 ASO导致STAT3表达没有可测量的减少。相反，加入基于脂质的递送剂促进ASO摄取和随后的STAT3的敲低。这与本领域已知的这种类型的ASO不能穿过细胞膜并抑制蛋白质的表达是一致的。
在第0天以1.5x 105个细胞/孔接种C4-2细胞(PSMA表达阳性)。应该理解，C4-2细胞是市售的并且其孵育、生长和维持细胞是本领域公知的技术。类似地，蛋白质印迹分析是公知的分析技术。在第1天，细胞或置于未处理状态，或在生长介质中用2.5μM的STAT3 ASO(游离)、200nM的STAT3 ASO(Oligofectamine(脂质))或含有2.5μM的STAT3 ASO和内体逃脱剂(例如，氯丙嗪、氟西汀、异丙嗪或脱氢松香胺)的纳米粒处理。将细胞在37℃孵育72小时，此时将它们收集于裂解缓冲液中并通过蛋白质印迹分析STAT3表达。应该理解，在裂解缓冲液中裂解细胞是本领域公知的技术。在实验中，肌动蛋白用作对照。结果显示在图15A中。重复相同的实验，不同之处在于细胞用含有2.5μM或10μM的STAT3 ASO和氯丙嗪、月桂酰精氨酸乙酯或脱氢松香胺之一的纳米粒处理72小时。结果显示在图15B中(UTC(未处理的细胞)、ASO(反义寡核苷酸)、CPZ(氯丙嗪)、ELA(月桂酰精氨酸乙酯)、脂质(oligofectamine))。
如图15A的蛋白质印迹图中所示，当细胞用含有STAT3 ASO和抗衡离子脱氢松香胺(2.5μM)处理时，存在STAT3表达的可测量的敲低。如图15B中所示，更高浓度的脱氢松香胺(10mM)和CPZ也可促进ASO的递送。
图15A和15B证明脱氢松香胺和STAT3反义ASO在PSMA靶向的纳米粒中的共封装促进ASO在2.5和10μM浓度下的递送，导致STAT3蛋白质表达的敲低。使用氯丙嗪-ASO在10μM浓度的ASO下看到类似的效果。
实施例12：体外细胞试验
在体外细胞试验中研究纳米粒的不同制剂以测定从纳米粒中释放并在细胞中检测的治疗剂的量。
体外细胞试验(细胞IVR)由铺板于96孔板上的A431细胞(表皮样癌细胞)组成。将细胞接种并在CO2控制培养箱中用细胞培养基孵育过夜。为了建立标准曲线，将游离的ASO在细胞培养基中连续3倍稀释并与细胞孵育24小时。随后裂解细胞并进行cDNA合成，接着通过qPCR测定mRNA水平。进行以下步骤以评估封装的ASO从纳米粒的释放。纳米粒封装的ASO的含量通过HPLC分析测定。具有已知ASO含量的颗粒在96孔板上在细胞培养基中连续3倍稀释并在37℃孵育24小时、48小时或72小时。在每个时间点，将细胞培养基中的颗粒与3倍连续稀释的游离ASO(标准曲线)转移至含有A431细胞的96孔板中。在37℃再孵育24小时后，裂解细胞并进行cDNA合成，并qPCR读出mRNA水平。为了建立从纳米粒中ASO的总百分比释放，计算每个纳米粒处理组的IC50水平并与游离ASO的进行比较。
图16A-16C描述在ASO从纳米粒中释放24、48或72小时后游离ASO对比纳米粒制剂1、2、3和4的剂量-反应曲线。含有非活性寡核苷酸有效负载的ssDNA制剂作为阴性对照。制剂#1是含有10％w/w ASO有效负载的表皮生长因子受体(EGFR)靶向制剂。制剂#2是含有5％w/w ASO有效负载的非靶向制剂。制剂#3是含有10％w/w ASO有效负载的非靶向制剂。制剂#4是含有10％w/w ASO有效负载以及疏水性赋形剂(HEPTAKIS 2,3,6-TRIOBENZOYL环糊精)的非靶向制剂。图16D描述相对于游离ASO处理组计算的各纳米粒制剂的IC50值来用于计算在37℃孵育24、48和72小时后从纳米粒中释放的ASO的相对百分比。
图17A描述KB细胞(表皮样癌)的荧光显微照片，显示荧光标记的叶酸靶向的纳米粒(红色箭头表示)、溶酶体(绿色箭头表示)和细胞核(蓝色箭头表示)的内化及相对亚细胞定位。实验前三天，用表达GFP标记的溶酶体标记物的杆状病毒感染细胞。两天后，将感染的KB细胞涂布在玻璃盖玻片上并使其在无叶酸培养基中粘附过夜。次日，将细胞培养基更换为含有叶酸靶向的纳米粒的新的无叶酸培养基，使其在37℃下孵育细胞60分钟。将细胞洗涤、固定和透化，用DAPI DNA染色剂染色，并安装在盖玻片上。图像以100倍放大倍数拍摄。图17B描述在0分钟子、15分钟和60分钟时结合的叶酸靶向的纳米粒的内化百分比。收集KB细胞，悬浮在含有叶酸靶向的荧光纳米粒的无叶酸培养基中，并在4℃孵育30分钟。然后洗涤细胞以去除未结合的纳米粒，重新放置于无叶酸培养基中，并在37℃孵育0、15或60分钟。在每个时间点，收集细胞并分成两个池(pool)。第一个池悬浮在PBS中并通过流式细胞术评估纳米粒荧光—这代表总纳米粒含量(内化和表面结合两者)。第二个池重悬于酸洗(0.2M乙酸，0.5M NaCl)中，在室温孵育5分钟，在PBS中洗涤并通过流式细胞术评估。当酸洗去掉表面结合的纳米粒时，这种荧光读数仅仅是内化纳米粒的测量。内化百分比通过酸洗荧光除以总荧光来确定。
实施例13：siRNA-GFP敲除体外细胞试验
细胞内研究含有与内体逃脱剂配对的siRNA的纳米粒以确定对eGFP表达的影响。在A431细胞试验中多种靶向eGFP的siRNA的制剂封装在纳米粒中。为了测试siRNA有效负载的成功递送，在处理前一天，稳定表达含有C-末端PEST结构域(eGFP-PEST)的短期形式的eGFP的A431细胞以5000个细胞/孔铺板于96孔组织培养板中，并且在37℃和5％湿度下孵育。次日，去除培养基，用含有多种siRNA制剂siRNA浓度为2.5、0.63或0.16μM的100μl新鲜培养基替换，单独或在溶液中假定内体逃脱剂的存在下，以先前确定的亚毒性剂量(6.7μM胺碘酮；16.7μM阿米替林；50μM多塞平；0.5μM UNC-7938；75μM ELA)。所有测试组都设置一式两份。然后在IncuCyte活细胞成像系统中孵育细胞，其中它们每3个小时以10倍放大倍数成像数天。平均每视野中的完整的eGFP荧光，除以细胞融合百分比以归一化细胞密度的变化。然后将这个值对未处理细胞的值(其被设定为100％)归一化。
图18A和图18B描述细胞试验的结果，特别是相对荧光。图18A描述通过活细胞分析系统测量的相对eGFP荧光结果。图18B报告实时PCR转录结果。如图18A和18B中所示，荧光和转录水平通常是一致的。在结果中也可以看出，与未处理的细胞相比，暴露于siRNA-B890纳米粒的细胞中的荧光降低。类似地，具有多塞平和阿米替林的siRNA-B890纳米粒产生最低的相对荧光。
图19A、19B和19C描述用游离siRNA(图19A)、PTNP-siRNA(图19B)和B890-siRNA(图19C)如上述进行的细胞试验的结果。PTNP表示非官能化纳米粒。从图19A、19B和19C中可见，B890-siRNA纳米粒提供最低相对荧光，特别是在2.5uM浓度下。
图20A、20B、20C和20D描绘在78小时多种siRNA制剂的细胞试验结果。图20A描述在78小时PTNP-siRNA的相对GFP荧光。图20B描述在78小时5％B890-siRNA的相对GFP荧光。图20C描述在78小时10％B890-siRNA的相对GFP荧光。图20C描述在78小时20％B890-siRNA的相对GFP荧光。
图21A-21C描述细胞试验的结果，特别是未处理细胞在0和88小时的细胞试验中的荧光，而图22A-22C描述B890-siRNA纳米粒和多塞平在0和88小时的细胞试验中的荧光。
等同
本领域技术人员仅使用常规实验即会识别或能够确定本文所述的所公开的纳米粒的具体实施方案的许多等同。这些等同意在被以下权利要求涵盖。
援引加入
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Claims (35)

1.药学上可接受的纳米粒，其包含：
核酸和疏水性抗衡离子剂；和
约50重量％至约99.75重量％的二嵌段聚(乳)酸-聚(乙)二醇共聚物或二嵌段聚(乳酸-共-乙醇酸)-聚(乙)二醇共聚物。
2.如权利要求1所述的药学上可接受的纳米粒，其中所述疏水性抗衡离子剂是内体和/或溶酶体破坏剂。
3.如权利要求1或2所述的药学上可接受的纳米粒，其中所述核酸分子选自反义化合物、mRNA、短干扰核酸(siNA)、短干扰RNA(siRNA)、双链RNA(dsRNA)、微-RNA(miRNA)、核仁小RNA(sno-RNA)、Piwi-相互作用RNA(piRNA)和短发夹RNA(shRNA)分子。
4.如权利要求1-2中任一项所述的药学上可接受的纳米粒，其中所述核酸分子选自寡核苷酸、适体、载体、苏糖核酸、二醇核酸(GNA)和锁核酸(LNA)。
5.如权利要求1-4中任一项所述的药学上可接受的纳米粒，其中所述核酸包含修饰。
6.如权利要求5所述的药学上可接受的纳米粒，其中所述修饰至少是以下之一：2’O-甲基(2’OMe)修饰、2’氟(2’F)修饰、2’甲氧基乙基(2’-O-MOE)修饰、2’氟阿糖基(FANA)修饰、2’-H修饰、2’-硫脲嘧啶修饰、锁核酸(LNA)修饰、桥接核酸(BNA)修饰、乙烯桥接核酸(ENA)修饰、己糖醇核酸(HNA)修饰、阿卓糖醇核酸(ANA)修饰、环己烯核酸(CeNA)修饰、未锁核酸(UNA)修饰、4’硫(4’-S)修饰、巯基连接修饰和3’反转脱碱基端帽修饰。
7.如权利要求1-5中任一项所述的药学上可接受的纳米粒，其中所述疏水性抗衡离子剂是内-溶酶体破坏剂。
8.如权利要求1-5中任一项所述的药学上可接受的纳米粒，其进一步包含用配体官能化的聚(乳)酸-聚(乙)二醇共聚物。
9.如权利要求8所述的药学上可接受的纳米粒，其中至少一种配体是靶向配体。
10.如权利要求9所述的药学上可接受的纳米粒，其中所述至少一种靶向配体选自核酸、抗体、小分子、适体、多肽、蛋白质、碳水化合物、脂质和寡核苷酸。
11.如权利要求10所述的药学上可接受的纳米粒，其中所述抗体靶向选自以下的靶点：EpCAM(CD326)、IGF-R、间皮素、Lewis-Y抗原(CD174)、CanAg(MUC1、PEM、CA242、CD205)、NCAM(CD56)、Cripto、黑素转铁蛋白(P97)、糖蛋白NMB(CG56972)、CD70(CD27配体)、5T4(滋养层细胞糖蛋白)、CD57、CD44、癌胚抗原(CEA)、GD2、CD40、纤连蛋白ED-B、内皮糖蛋白(CD105)、生腱蛋白C、磷脂酰丝氨酸(PS)、HER3、CD30、CD33、CD40、CD52、CD74、CD138、CS1(CD319、CRACC)、TAG-72、CD2、CD64、ROBO4、DLL4、Tie2和B7-H3。
12.如权利要求10所述的药学上可接受的纳米粒，其中所述多肽靶向选自以下的靶点：TRAIL R2、c-Met、EphA2、EphB2、氨肽酶N(CD13)、VLA-4(α4β1整合素)、CXCR4、黑素皮质素受体(MC1R)、生长抑素受体、胆囊收缩素受体、GnRH受体、GLP1-受体、E-选择素、IL-11受体、血小板应答蛋白-1受体、内皮细胞抑制素、CD79和CD74。
13.如权利要求9所述的药学上可接受的纳米粒，其中所述靶向配体靶向用于内吞作用的受体位点。
14.如权利要求1-13中任一项所述的药学上可接受的纳米粒，其中所述疏水性抗衡离子选自氯丙嗪、他莫昔芬、氯米酚、雷洛昔芬、枸橼酸他莫昔芬、托瑞米芬、枸橼酸氯米酚、枸橼酸托瑞米芬、维拉帕米、地尔硫卓、氨氯地平、硝苯地平、盐酸维拉帕米、尼莫地平、非洛地平、尼卡地平、尼索地平、氯维地平、伊拉地平、群多普利/维拉帕米、地昔帕明、丙咪嗪、阿米替林、去甲替林、氯丙咪嗪、多塞平、阿莫沙平、曲米帕明、普罗替林、胺碘酮、利多卡因、索他洛尔、决奈达隆、氟卡胺、普鲁卡因胺、普罗帕酮、奎尼丁、多非力特、美西律、伊布利特、丙吡胺、帕罗西汀、氟西汀、舍曲林、依他普仑、西酞普兰、氟伏沙明、盐酸帕罗西汀、奈法唑酮、氢溴酸西酞普兰、草酸依他普仑、奥氮平/氟西汀、氯环嗪、阿莫地喹、甲硫达嗪、氯喹、奎宁、阿托伐醌/氯胍、阿托伐醌、氟西汀、甲氟喹、伯氨喹、奎纳克林、奎尼丁、卤泛群、氯喹、莫能菌素、氯环嗪、安曲非宁、阿立哌唑、比氟诺西、依匹唑派、卡比米嗪、环丙沙星、达哌唑、羟丙哌嗪、依吡哌唑、依托哌酮、伊曲康唑、酮康唑、左羟丙哌嗪、美吡哌唑、米安色林、萘哌地尔、奈法唑酮、烟胺哌嗪、奥苷哌汀、泊沙康唑、曲唑酮、乌美螺酮、乌拉地尔、维司力农、鲁巴唑酮、阿卡嗪、巴托拉嗪、比氟诺西、沃替西汀、维拉佐酮、托吡哌唑、索奈哌唑、帕多芦诺、萘基哌嗪、Naluzotan、洛吡哌唑、氟辛克生、氟普拉嗪、氟班色林、恩沙库林、恩吡哌唑、依托拉嗪、依吡哌唑、UNC 7938、鞘氨醇、十二烷基咪唑、巴弗洛霉素A1、喹诺酮、奥美拉唑、埃索美拉唑、泮托拉唑、兰索拉唑、雷贝拉唑、右兰索拉唑、布雷菲德菌素A、Golgicide、Dyasore、Pitstop、阿莫地喹、EGA(4-溴苯甲醛N-(2,6-二甲基苯基)缩氨基脲)、氟西汀、帕罗西汀、舍曲林、甲硫达嗪、吩噻嗪、异丙嗪、丙氯拉嗪、三氟拉嗪、氟奋乃静、甲哌氯丙嗪、癸氟奋乃静、盐酸异丙嗪、奎宁、卡西霉素、甲氟喹、阿普林定、丙吡胺、氟卡胺、利多卡因、美西律、喷替索胺、普罗帕酮、赛庚啶阿扎他定、酮替芬、氯雷他定、苯噻啶、阿米替林、普萘洛尔、卢帕他定、地普托品、氨磺必利、去甲替林、环苯扎林、奥克替林、布替林、伊普吲哚、三甲丙咪嗪、黄酮哌酯、桂利嗪氯米帕明、氟西汀、丙嗪、丙咪嗪、舍曲林、卡马西平、ay9944、氯丙咪嗪、氯氮平、氟卡胺、氟哌啶醇、酮康唑、氧氟沙星、哌克昔林、索他洛尔、他莫昔芬、齐美利定、赛庚啶、托瑞米芬、氟奋乃静、三氟拉嗪、苯噻啶、CGS 12066B、普鲁氯嗪、多塞平、酮替芬、拉西地平、sb 205607、洛非帕明、米非司酮、clobenpropit、沙美特罗、氮卓斯汀、氮卓斯汀、依匹斯汀、地氯雷他定、am-251、吲达曲林、奈非那韦、氟哌啶醇、苯丙哌林、M-帕罗西汀、卡维地洛、钙泊三醇、奋乃静、吩噻嗪、氯普噻吨、地昔帕明、丁卡因、艾芬地尔、U18666A和苯海拉明。
15.如权利要求1-14中任一项所述的药学上可接受的纳米粒，其中所述疏水性抗衡离子剂的logP是约2或更大。
16.如权利要求1-15中任一项所述的药学上可接受的纳米粒，其中所述疏水性抗衡离子剂的logP为约2至约3。
17.如权利要求1-16中任一项所述的药学上可接受的纳米粒，其包含约5重量％至约20重量％的所述核酸。
18.如权利要求1-17中任一项所述的药学上可接受的纳米粒，其包含约5重量％至约20重量％的所述疏水性抗衡离子剂。
19.如权利要求1-18中任一项所述的药学上可接受的纳米粒，其中所述纳米粒的zeta电位是约-10mV至约10mV。
20.如权利要求1-19中任一项所述的药学上可接受的纳米粒，其中所述核酸在脱氧核糖核酸酶试验中是基本上稳定的。
21.如权利要求1-20中任一项所述的药学上可接受的纳米粒，其中所述聚(乳)酸-聚(乙)二醇共聚物具有约10kDa至约35kDa数均分子量的聚(乳酸)和约4kDa至约6kDa数均分子量的聚(乙)二醇。
22.药学上可接受的纳米粒，其包含：
核酸和内-溶酶体破坏剂，其中所述内溶酶体破坏剂的存在量至少足以形成所述核酸的疏水性抗衡离子；和
约50重量％至约99.75重量％的二嵌段聚(乳)酸-聚(乙)二醇共聚物或二嵌段聚(乳酸-共-乙醇酸)-聚(乙)二醇共聚物。
23.如权利要求22所述的药学上可接受的纳米粒，其中所述核酸分子选自反义化合物、mRNA、短干扰核酸(siNA)、短干扰RNA(siRNA)、双链RNA(dsRNA)、微-RNA(miRNA)、核仁小RNA(sno-RNA)、Piwi-相互作用RNA(piRNA)和短发夹RNA(shRNA)分子。
24.如权利要求22-23中任一项所述的药学上可接受的纳米粒，其中所述核酸分子选自寡核苷酸、适体、载体、苏糖核酸、二醇核酸(GNA)和锁核酸(LNA)。
25.如权利要求22-24中任一项所述的药学上可接受的纳米粒，其中所述核酸包含修饰。
26.如权利要求25所述的药学上可接受的纳米粒，其中所述修饰至少是以下之一：2’O-甲基(2’OMe)修饰、2’氟(2’F)修饰、2’甲氧基乙基(2’-O-MOE)修饰、2’氟阿糖基(FANA)修饰、2’-H修饰、2’-硫脲嘧啶修饰、锁核酸(LNA)修饰、桥接核酸(BNA)修饰、乙烯桥接核酸(ENA)修饰、己糖醇核酸(HNA)修饰、阿卓糖醇核酸(ANA)修饰、环己烯核酸(CeNA)修饰、未锁核酸(UNA)修饰、4’硫(4’-S)修饰、巯基连接修饰和3’反转脱碱基端帽修饰。
27.如权利要求22-26中任一项所述的药学上可接受的纳米粒，其进一步包含用配体官能化的聚(乳)酸-聚(乙)二醇共聚物。
28.如权利要求27所述的药学上可接受的纳米粒，其中至少一种配体是靶向配体。
29.如权利要求28所述的药学上可接受的纳米粒，其中所述至少一种靶向配体选自核酸、抗体、小分子、适体、多肽、蛋白质、碳水化合物、脂质和寡核苷酸。
30.如权利要求29所述的药学上可接受的纳米粒，其中所述抗体靶向选自以下的靶点：EpCAM(CD326)、IGF-R、间皮素、Lewis-Y抗原(CD174)、CanAg(MUC1、PEM、CA242、CD205)、NCAM(CD56)、Cripto、黑素转铁蛋白(P97)、糖蛋白NMB(CG56972)、CD70(CD27配体)、5T4(滋养层细胞糖蛋白)、CD57、CD44、癌胚抗原(CEA)、GD2、CD40、纤连蛋白ED-B、内皮糖蛋白(CD105)、生腱蛋白C、磷脂酰丝氨酸(PS)、HER3、CD30、CD33、CD40、CD52、CD74、CD138、CS1(CD319、CRACC)、TAG-72、CD2、CD64、ROBO4、DLL4、Tie2和B7-H3。
31.如权利要求29所述的药学上可接受的纳米粒，其中所述多肽靶向选自以下的靶点：TRAIL R2、c-Met、EphA2、EphB2、氨肽酶N(CD13)、VLA-4(α4β1整合素)、CXCR4、黑素皮质素受体(MC1R)、生长抑素受体、胆囊收缩素受体、GnRH受体、GLP1-受体、E-选择素、IL-11受体、血小板应答蛋白-1受体、内皮细胞抑制素、CD79和CD74。
32.如权利要求28所述的药学上可接受的纳米粒，其中所述靶向配体靶向用于内吞作用的受体位点。
33.如权利要求22-31中任一项所述的药学上可接受的纳米粒，其中所述纳米粒的zeta电位是约-10mV至约10mV。
34.如权利要求22-32中任一项所述的药学上可接受的纳米粒，其中所述核酸在脱氧核糖核酸酶试验中是基本上稳定的。
35.如权利要求22-33中任一项所述的药学上可接受的纳米粒，其中所述聚(乳)酸-聚(乙)二醇共聚物具有约10kDa至约35kDa数均分子量的聚(乳酸)和约4kDa至约6kDa数均分子量的聚(乙)二醇。
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