BR112020018573A2 - Composições e métodos de regulação gênica para imunoterapia aprimorada - Google Patents

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BR112020018573A2
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Jason Merkin
Gregory V. Kryukov
Solomon Martin Shenker
Michael Schlabach
Noah Tubo
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KSQ Therapeutics, Inc.
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Abstract

composições e métodos de regulação gênica para imunoterapia aprimorada . a presente descrição refere-se a métodos e composições relacionados à modificação de células efetoras imunes para aumentar a eficácia terapêutica. em algumas modalidades, são fornecidas células efetoras imunes modificadas para reduzir a expressão de um ou mais genes-alvo endógenos ou para reduzir uma ou mais funções de uma proteína endógena para aprimorar as funções efetoras das células imunes. em algumas modalidades, são fornecidas células efetoras imunes modificadas adicionalmente pela introdução de transgenes que conferem especificidade ao antígeno, como receptores de células t exógenos (tcrs) ou receptores de antígeno quiméricos (cars). métodos de tratamento de um distúrbio proliferativo celular, como um câncer, usando as células efetoras imunes modificadas descritas neste documento também são fornecidos.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "COM- POSIÇÕES E MÉTODOS DE REGULAÇÃO GÊNICA PARA IMUNO- TERAPIA APRIMORADA". Referência Cruzada a Pedidos Relacionados
[001] Este pedido reivindica o benefício de acordo com 35 USC §119 do Pedido Provisório US 62/643.578, depositado em 15 de mar- ço de 2018; Pedido Provisório US 62/692.010, depositado em 29 de junho de 2018; Pedido Provisório US 62/768.428, depositado em 16 de novembro de 2018; Pedido Provisório US 62/643.582, depositado em 15 de março de 2018; Pedido Provisório US 62/692.014, depositado em 29 de junho de 2018; Pedido Provisório US 62/768.430, depositado em 16 de novembro de 2018; Pedido Provisório US 62/804.259, depo- sitado em 12 de fevereiro de 2019; Pedido Provisório US 62/714.333, depositado em 3 de agosto de 2018; Pedido Provisório US 62/768.459, depositado em 16 de novembro de 2018; Pedido Provisório US 62/714.337, depositado em 3 de agosto de 2018, e Pedido Provisório US 62/768.462, depositado em 16 de novembro de 2018, que são in- corporados por referência em sua totalidade. Descrição do Arquivo de Texto Enviado Eletronicamente
[002] O conteúdo do arquivo de texto apresentado eletronicamen- te em anexo é incorporado neste documento por referência na sua to- talidade: uma cópia em formato legível por computador da Listagem de Sequência (nome do arquivo: KSQT_005_04WO_SeqList_ST25.txt, Data do registro: 14 de março de 2019, tamanho do arquivo: 279 kilo- bytes).
CAMPO DA INVENÇÃO
[003] A descrição refere-se a métodos, composições e compo- nentes para editar uma sequência de ácido nucleico alvo ou modular a expressão de uma sequência de ácido nucleico alvo e aplicações dos mesmos em conexão com imunoterapia, incluindo o uso de células efetoras imune-modificadas por receptor, no tratamento de doenças proliferativas celulares, doenças inflamatórias e/ou doenças infeccio- sas. Fundamentos
[004] A transferência de células adotivas utilizando células T ge- neticamente modificadas, em particular as células CAR-T, entrou em testes clínicos como terapêutica para malignidades sólidas e hemato- lógicas. Os resultados até o momento foram diversificados. Nas malig- nidades hematológicas (especialmente linfoma, CLL e ALL), a maioria dos pacientes em vários ensaios de Fase 1 e 2 exibiu pelo menos uma resposta parcial, com alguns exibindo respostas completas (Kochen- derfer et al., 2012 Blood 1 19, 2709-2720). Em 2017, o FDA aprovou duas terapias CAR-T, Kymriah™ e Yescarta™, ambas para o trata- mento de cânceres hematológicos. No entanto, na maioria dos tipos de tumores (incluindo melanoma, carcinoma de células renais e câncer colorretal), foram observadas menos respostas (Johnson et al., 2009 Blood 1 14, 535-546; Lamers et al., 2013 Mol. Ther. 21, 904-912; War- ren et al., 1998 Cancer Gene Ther. 5, S1-S2). Como tal, existe um es- paço considerável para melhorias com terapias adotivas de células T, uma vez que o sucesso tem sido amplamente limitado às abordagens de células CAR-T que visam malignidades hematológicas da linhagem de células B. Sumário
[005] Existe uma necessidade de melhorar a eficácia da transfe- rência adotiva de células imunes modificadas no tratamento do câncer, em particular aumentando a eficácia das terapias celulares adotivas contra malignidades sólidas, uma vez que foram observadas respostas reduzidas nesses tipos de tumor (melanoma, carcinoma da célula re- nal e câncer colorretal; Yong, 2017, Imm Cell Biol., 95:356-363). Além disso, mesmo nas malignidades hematológicas em que foi observado um benefício da transferência adotiva, nem todos os pacientes respem quem e ocorrem recidivas com uma frequência maior que a desejada, provavelmente como resultado da função diminuída das células T ado- tivamente transferidas.
[006] Os fatores que limitam a eficácia das células imunes gene- ticamente modificadas como terapêutica de câncer incluem (1) prolife- ração celular, por exemplo, proliferação limitada de células T após transferência adotiva; (2) sobrevivência de células, por exemplo, indu- ção de apoptose de células T por fatores no ambiente tumoral; e (3) função celular, por exemplo, inibição da função da célula T citotóxica por fatores inibidores secretados pelas células imunes do hospedeiro e células cancerígenas e exaustão das células imunes durante os pro- cessos de fabricação e/ou após a transferência.
[007] Considera-se que as características particulares que au- mentam os efeitos antitumorais de uma célula imune incluem a capa- cidade da célula de 1) proliferar no hospedeiro após a transferência adotiva; 2) infiltrar-se em um tumor; 3) persistir no hospedeiro e/ou exibir resistência à exaustão das células imunes; e 4) funcionar de modo que seja capaz matar células tumorais. A presente descrição fornece células imunes compreendendo diminuição da expressão e/ou função de um ou mais genes-alvo endógenos, em que as células imu- nes modificadas demonstram um aprimoramento de uma ou mais fun- ções efetoras, incluindo aumento da proliferação, aumento da infiltra- ção nos tumores, persistência das células imunes em um sujeito e/ou aumento da resistência à exaustão de células imunes. A presente des- crição também fornece métodos e composições para modificação de células efetoras imunes, a fim de provocar atividade celular imune aprimorada em direção a uma célula tumoral, bem como métodos e composições adequados para uso no contexto da terapia adotiva de transferência de células imunes.
[008] Em algumas modalidades, a presente descrição fornece uma célula efetora imune modificada compreendendo um sistema de regulação de genes capaz de reduzir a expressão e/ou função de um ou mais genes ou proteínas alvo endógenos selecionados a partir de: (a) o grupo que consiste em BCL2L11, FLI1, CALM2, DHODH, UMPS, RBM39, SEMA7A, CHIC2, PCBP1, PBRM1, WDR6, E2F8, SERPINA3, e GNAS; (b) o grupo consiste em PTPN1, PTPN2, PTPN22, SH2B3, SH2D1A, PIK3CD, e EGR2; (c) PELI1; ou (d) SETD5. Em algumas modalidades, a expressão e/ou função reduzida de um ou mais genes endógenos aprimora uma função efetora da célula efetora imune. Em algumas modalidades, a presente descrição fornece uma célula efeto- ra imune modificada compreendendo um sistema de regulação de ge- nes capaz de reduzir a expressão e/ou função de um ou mais genes- alvo endógenos selecionados do grupo que consiste emIkzf1, Ikzf3, GATA3, Bcl3, Tnip1, Tnfaip3, NFKBIA, SMAD2, Tgfbr1, Tgfbr2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6, IKZF2, Cblb, Ppp2r2d, Nrp1, Havcr2, Lag3, Tigit, Ctla4, Ptpn6, Pdcd1, e BCOR. Em algumas modalidades, a ex- pressão e/ou função reduzida de um ou mais genes endógenos apri- mora uma função efetora da célula efetora imune.
[009] Em algumas modalidades, o sistema de regulação de ge- nes é capaz de reduzir a expressão e/ou função de dois ou mais ge- nes-alvo endógenos selecionados do grupo que consiste em Ikzf1, Ikzf3, GATA3, Bcl3, Tnip1, Tnfaip3, NFKBIA, SMAD2, Tgfbr1, Tgfbr2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6, IKZF2, Cblb, Ppp2r2d, Nrp1, Havcr2, Lag3, Tigit, Ctla4, Ptpn6, Pdcd1, e BCOR. Em algumas modalidades, pelo menos um dos genes-alvo endógenos é selecionado a partir do grupo que consiste em Ikzf1, Ikzf3, GATA3, Bcl3, Tnip1, Tnfaip3, NFKBIA, SMAD2, Tgfbr1, Tgfbr2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6, e IKZF2 e pelo menos um dos genes-alvo endógenos é selecionado do grupo que consiste em Cblb, Ppp2r2d, Nrp1, Havcr2, Lag3, Tigit,
Ctla4, Ptpn6, Pdcd1, e BCOR.
[0010] Em algumas modalidades, a presente descrição fornece uma célula efetora imune modificada compreendendo um sistema de regulação de genes capaz de reduzir a expressão e/ou função de um ou mais genes-alvo endógenos selecionados dentre: (a) o grupo que consiste em BCL2L11, FLI1, CALM2, DHODH, UMPS, RBM39, SE- MA7A, CHIC2, PCBP1, PBRM1, WDR6, E2F8, SERPINA3, e GNAS; (b) o grupo consiste em PTPN1, PTPN2, PTPN22, SH2B3, SH2D1A, PIK3CD, e EGR2; (c) PELI1; ou (d) SETD5 e em que o sistema de re- gulação de genes é ainda capaz de reduzir a expressão e/ou função de um ou mais genes-alvo endógenos selecionados dentre Ikzf1, Ikzf3, GATA3, Bcl3, Tnip1, Tnfaip3, NFKBIA, SMAD2, Tgfbr1, Tgfbr2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6, IKZF2, Cblb, Ppp2r2d, Nrp1, Havcr2, Lag3, Tigit, Ctla4, Ptpn6, Pdcd1, e BCOR.
[0011] Em algumas modalidades, o sistema de regulação de ge- nes é capaz de reduzir a expressão e/ou função de pelo menos um gene-alvo endógeno selecionado do grupo que consiste emBCL2L11, FLI1, CALM2, DHODH, UMPS, RBM39, SEMA7A, CHIC2, PCBP1, PBRM1, WDR6, E2F8, SERPINA3, e GNAS e pelo menos um gene- alvo endógeno selecionado do grupo que consiste em Ikzf1, Ikzf3, GATA3, Bcl3, Tnip1, Tnfaip3, NFKBIA, SMAD2, Tgfbr1, Tgfbr2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6, IKZF2, Cblb, Ppp2r2d, Nrp1, Havcr2, Lag3, Tigit, Ctla4, Ptpn6, Pdcd1, e BCOR.
[0012] Em algumas modalidades, em que o sistema de regulação de genes é capaz de reduzir a expressão e/ou função de pelo menos um gene-alvo endógeno selecionado do grupo que consiste em PTPN1, PTPN2, PTPN22, SH2B3, SH2D1A, PIK3CD, e EGR2 e pelo menos um gene-alvo endógeno selecionado do grupo que consiste em Ikzf1, Ikzf3, GATA3, Bcl3, Tnip1, Tnfaip3, NFKBIA, SMAD2, Tgfbr1, Tgfbr2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6, IKZF2, Cblb, Ppp2r2d, Nrp1,
Havcr2, Lag3, Tigit, Ctla4, Ptpn6, Pdcd1, e BCOR. Em algumas moda- lidades, o sistema de regulação de genes é capaz de reduzir a expres- são e/ou função de PTPN2 e CBLB. Em algumas modalidades, em que o sistema de regulação de genes é capaz de reduzir a expressão e/ou função de PTPN2 e BCOR. Em algumas modalidades, o sistema de regulação de genes é capaz de reduzir a expressão e/ou função de PTPN2 e TNFAIP3.
[0013] Em algumas modalidades, o sistema de regulação de ge- nes é capaz de reduzir a expressão e/ou função de PELI1 e pelo me- nos um gene-alvo endógeno selecionado a partir do grupo que consis- te em Ikzf1, Ikzf3, GATA3, Bcl3, Tnip1, Tnfaip3, NFKBIA, SMAD2, Tgfbr1, Tgfbr2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6, IKZF2, Cblb, Ppp2r2d, Nrp1, Havcr2, Lag3, Tigit, Ctla4, Ptpn6, Pdcd1, e BCOR. Em algumas modalidades, o sistema de regulação de genes é capaz de reduzir a expressão e/ou função de PELI1 e CBLB. Em algumas modalidades, o sistema de regulação de genes é capaz de reduzir a expressão e/ou função de PELI1 e BCOR. Em algumas modalidades, o sistema de re- gulação de genes é capaz de reduzir a expressão e/ou função de PE- LI1 e TNFAIP3.
[0014] Em algumas modalidades, o sistema de regulação de ge- nes é capaz de reduzir a expressão e/ou função de SETD5 e pelo me- nos um gene-alvo endógeno selecionado a partir do grupo que consis- te em Ikzf1, Ikzf3, GATA3, Bcl3, Tnip1, Tnfaip3, NFKBIA, SMAD2, Tgfbr1, Tgfbr2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6, IKZF2, Cblb, Ppp2r2d, Nrp1, Havcr2, Lag3, Tigit, Ctla4, Ptpn6, Pdcd1, e BCOR. Em algumas modalidades, o sistema de regulação de genes é capaz de reduzir a expressão e/ou função de SETD5 e CBLB. Em algumas modalidades, o sistema de regulação de genes é capaz de reduzir a expressão e/ou função de SETD5 e BCOR. Em algumas modalidades, o sistema de regulação de genes é capaz de reduzir a expressão e/ou função de
SETD5 e TNFAIP3.
[0015] Em algumas modalidades, a presente descrição fornece uma célula efetora imune modificada compreendendo um sistema de regulação de genes capaz de reduzir a expressão e ou função de um ou mais genes-alvo endógenos, em que o sistema de regulação de genes compreende (i) um ou mais moléculas de ácidos nucleicos; (ii) uma ou mais proteínas enzimáticas; ou (iii) uma ou mais moléculas de ácido nucleico guia e uma proteína enzimática. Em algumas modalida- des, uma ou mais moléculas de ácido nucleico são selecionadas a par- tir de um siRNA, um shRNA, um microRNA (miR), um antagomiR ou um RNA antisense. Em algumas modalidades, o sistema de regulação de genes compreende um siRNA ou uma molécula de ácido nucleico shRNA.
[0016] Em algumas modalidades, a presente descrição fornece uma célula efetora imune modificada compreendendo um sistema de regulação de genes capaz de reduzir a expressão e/ou função de um ou mais genes-alvo endógenos, em que o sistema de regulação de genes compreende uma molécula de ácido nucleico siRNA ou shRNA e em que o um ou mais genes-alvo endógenos é selecionado a partir do grupo que consiste em Ikzf1, Ikzf3, GATA3, Bcl3, Tnip1, Tnfaip3, NFKBIA, SMAD2, Tgfbr1, Tgfbr2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6, IKZF2, Cblb, Ppp2r2d, Nrp1, Havcr2, Lag3, Tigit, Ctla4, Ptpn6, Pdcd1, e BCOR e em que as moléculas siRNA ou shRNA compreendem cer- ca de 19-30 nucleotídeos que ligam a uma sequência RNA codificada por uma sequência de DNA definida por um conjunto de coordenadas de genoma mostrado na Tabela 5A e Tabela 5B.
[0017] A célula efetora imune modificada, de acordo com a reivin- dicação 23, em que o siRNA ou shRNA compreende cerca de 19 – 30 nucleotídeos que se ligam a uma sequência de RNA codificada por uma sequência de DNA selecionada a partir do grupo que consiste em
SEQ ID NOs: 154-813.
[0018] Em algumas modalidades, a presente descrição fornece uma célula efetora imune modificada compreendendo um sistema de regulação de genes capaz de reduzir a expressão e/ou função de um ou mais genes-alvo endógenos, em que o sistema de regulação de genes compreende uma molécula de ácido nucleico siRNA ou shRNA e em que um ou mais genes-alvo endógenos é selecionado do grupo que consiste em BCL2L11, FLI1, CALM2, DHODH, UMPS, RBM39, SEMA7A, CHIC2, PCBP1, PBRM1, WDR6, E2F8, SERPINA3, e GNAS, e em que a molécula siRNA ou shRNA compreende cerca de 19-30 nucleotídeos que se ligam a uma sequência de RNA codificada por uma sequência de DNA definida por um conjunto de coordenadas do genoma mostradas na Tabela 6A e na Tabela 6B. Em algumas mo- dalidades, o siRNA ou shRNA compreende cerca de 19 – 30 nucleotí- deos que se ligam a uma sequência de RNA codificada por uma se- quência de DNA selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 814-1064.
[0019] Em algumas modalidades, a presente descrição fornece uma célula efetora imune modificada compreendendo um sistema de regulação de genes capaz de reduzir a expressão e/ou função de um ou mais genes-alvo endógenos, em que o sistema de regulação de genes compreende uma molécula de ácido nucleico siRNA ou shRNA e em que o um ou mais genes-alvo endógenos é selecionado a partir do grupo que consiste em PTPN1, PTPN2, PTPN22, SH2B3, SH2D1A, PIK3CD, e EGR2, e em que a molécula de siRNA ou shRNA compre- ende cerca de 19-30 nucleotídeos que se ligam a um RNA sequência codificada por uma sequência de DNA definida por um conjunto de co- ordenadas do genoma mostradas na Tabela 6C e na Tabela 6D. Em algumas modalidades, o siRNA ou shRNA compreende cerca de 19 – 30 nucleotídeos que se ligam a uma sequência de RNA codificada por uma sequência de DNA selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 1065-1329.
[0020] Em algumas modalidades, a presente descrição fornece uma célula efetora imune modificada compreendendo um sistema de regulação de genes capaz de reduzir a expressão e/ou função de um ou mais genes-alvo endógenos, em que o sistema de regulação de genes compreende uma molécula de ácido nucleico siRNA ou shRNA, e em que o um ou mais genes-alvo endógenos é PTPN2. Em algumas modalidades, o siRNA ou shRNA compreende cerca de 19 – 30 nucle- otídeos que se ligam a uma sequência de RNA codificada por uma se- quência de DNA selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs:1112-1227.
[0021] Em algumas modalidades, a presente descrição fornece uma célula efetora imune modificada compreendendo um sistema de regulação de genes capaz de reduzir a expressão e/ou função de um ou mais genes-alvo endógenos, em que o sistema de regulação de genes compreende uma molécula de ácido nucleico siRNA ou shRNA e em que o um ou mais genes-alvo endógenos é PELI1, e em que a molécula de siRNA ou shRNA compreende cerca de 19-30 nucleotí- deos que se ligam a uma sequência de RNA codificada por uma se- quência de DNA definida por um conjunto de coordenadas do genoma mostradas na Tabela 6E e na Tabela 6F. Em algumas modalidades, o siRNA ou shRNA compreende cerca de 19 – 30 nucleotídeos que se ligam a uma sequência de RNA codificada por uma sequência de DNA selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 1330-
1350.
[0022] Em algumas modalidades, a presente descrição fornece uma célula efetora imune modificada compreendendo um sistema de regulação de genes capaz de reduzir a expressão e/ou função de um ou mais genes-alvo endógenos, em que o sistema de regulação de genes compreende uma molécula de ácido nucleico siRNA ou shRNA e em que o um ou mais genes-alvo endógenos é SETD5, e em que a molécula de siRNA ou shRNA compreende cerca de 19-30 nucleotí- deos que se ligam a uma sequência RNA codificada por uma sequên- cia de DNA definida por um conjunto de coordenadas do genoma mos- tradas na Tabela 6G e na Tabela 6H. Em algumas modalidades, o siRNA ou shRNA compreende cerca de 19 – 30 nucleotídeos que se ligam a uma sequência de RNA codificada por uma sequência de DNA selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 1351-
1367.
[0023] Em algumas modalidades, a presente descrição fornece uma célula efetora imune modificada compreendendo um sistema de regulação de genes, em que o sistema de regulação de genes com- preende uma pluralidade de moléculas de siRNA ou shRNA e é capaz de reduzir a expressão e/ou função de dois ou mais genes-alvo endó- genos.
[0024] Em algumas modalidades, a presente descrição fornece uma célula efetora imune modificada compreendendo um sistema de regulação de genes, em que o sistema de regulação de genes com- preende uma pluralidade de moléculas de siRNA ou shRNA e é capaz de reduzir a expressão e/ou função de dois ou mais genes-alvo endó- genos, em que pelo menos um dos genes-alvo endógenos é selecio- nado do grupo que consiste em BCL2L11, FLI1, CALM2, DHODH, UMPS, RBM39, SEMA7A, CHIC2, PCBP1, PBRM1, WDR6, E2F8, SERPINA3, e GNAS e pelo menos um dos genes-alvo endógenos é selecionado a partir do grupo que consiste em Ikzf1, Ikzf3, GATA3, Bcl3, Tnip1, Tnfaip3, NFKBIA, SMAD2, Tgfbr1, Tgfbr2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6, IKZF2, Cblb, Ppp2r2d, Nrp1, Havcr2, Lag3, Tigit, Ctla4, Ptpn6, Pdcd1, e BCOR. Em algumas modalidades, pelo menos uma dentre a pluralidade de moléculas de siRNA ou shRNA compre-
ende cerca de 19-30 nucleotídeos que se ligam a uma sequência de RNA codificada por uma sequência de DNA definida por um conjunto de coordenadas de genoma mostradas na Tabela 6A e na Tabela 6B e pelo menos uma da pluralidade de moléculas de siRNA ou shRNA compreende cerca de 19-30 nucleotídeos que se ligam a uma sequên- cia de RNA codificada por uma sequência de DNA definida por um conjunto de coordenadas de genoma mostradas na Tabela 5A e na Tabela 5B. Em algumas modalidades, pelo menos uma dentre a plura- lidade de moléculas de siRNA ou shRNA compreende cerca de 19-30 nucleotídeos que se ligam a uma sequência de RNA codificada por uma sequência de DNA selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 814-1064 e pelo menos um de a pluralidade de moléculas de siRNA ou shRNA compreende cerca de 19-30 nucleotídeos que se li- gam a uma sequência de RNA codificada por uma sequência de DNA selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 154-813.
[0025] Em algumas modalidades, a presente descrição fornece uma célula efetora imune modificada compreendendo um sistema de regulação de genes, em que o sistema de regulação de genes com- preende uma pluralidade de moléculas de siRNA ou shRNA e é capaz de reduzir a expressão e/ou função de dois ou mais genes-alvo endó- genos, em que pelo menos um dos genes-alvo endógenos é selecio- nado do grupo que consiste em PTPN1, PTPN2, PTPN22, SH2B3, SH2D1A, PIK3CD, e EGR2 e pelo menos um dentre os genes-alvo endógenos é selecionado a partir do grupo que consiste em IKZF1, IKZF3, GATA3, BCL3, TNIP1, TNFAIP3, NFKBIA, SMAD2, TGFBR1, TGFBR2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6, IKZF2, CBLB, PPP2R2D, NRP1, HAVCR2, LAG3, TIGIT, CTLA4, PTPN6, PDCD1, e BCOR. Em algumas modalidades, pelo menos uma dentre a pluralidade de molé- culas de siRNA ou shRNA compreende cerca de 19-30 nucleotídeos que se ligam a uma sequência de RNA codificada por uma sequência de DNA definida por um conjunto de coordenadas de genoma mostra- das na Tabela 6C e na Tabela 6D e pelo menos um dentre a pluralida- de de moléculas de siRNA ou shRNA compreende cerca de 19-30 nu- cleotídeos que se ligam a uma sequência de RNA codificada por uma sequência de DNA definida por um conjunto de coordenadas de ge- noma mostradas na Tabela 5A e na Tabela 5B. Em algumas modali- dades, pelo menos uma dentre a pluralidade de moléculas de siRNA ou shRNA compreende cerca de 19-30 nucleotídeos que se ligam a uma sequência de RNA codificada por uma sequência de DNA seleci- onada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 1065-1329 e pelo me- nos uma dentre a pluralidade de moléculas de siRNA ou shRNA com- preende cerca de 19-30 nucleotídeos que se ligam a uma sequência de RNA codificada por uma sequência de DNA selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 154-813. Em algumas modalida- des, pelo menos uma dentre a pluralidade de moléculas de siRNA ou shRNA compreende cerca de 19-30 nucleotídeos que se ligam a uma sequência de RNA codificada por uma sequência de DNA selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 1112-1227 e pelo menos uma dentre a pluralidade de moléculas de siRNA ou shRNA compreende cerca de 19-30 nucleotídeos que se ligam a uma sequência de RNA codificada por uma sequência de DNA selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 499-524.
[0026] Em algumas modalidades, a presente descrição fornece uma célula efetora imune modificada compreendendo um sistema de regulação de genes, em que o sistema de regulação de genes com- preende uma pluralidade de moléculas de siRNA ou shRNA e é capaz de reduzir a expressão e/ou função de dois ou mais genes-alvo endó- genos, em que pelo menos um dos genes-alvo endógenos é PELI1 e pelo menos um dentre os genes-alvo endógenos é selecionado a partir do grupo que consiste em IKZF1, IKZF3, GATA3, BCL3, TNIP1,
TNFAIP3, NFKBIA, SMAD2, TGFBR1, TGFBR2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6, IKZF2, CBLB, PPP2R2D, NRP1, HAVCR2, LAG3, TIGIT, CTLA4, PTPN6, PDCD1, e BCOR.
[0027] A célula efetora imune da reivindicação 42, em que pelo menos uma dentre a pluralidade de moléculas de siRNA ou shRNA compreende cerca de 19-30 nucleotídeos que se ligam a uma sequên- cia de RNA codificada por uma sequência de DNA definida por um conjunto de coordenadas de genoma mostradas na Tabela 6E e na Tabela 6F e pelo menos uma dentre a pluralidade de moléculas de siRNA ou shRNA compreende cerca de 19-30 nucleotídeos que se li- gam a uma sequência de RNA codificada por uma sequência de DNA definida por um conjunto de coordenadas de genoma mostradas na Tabela 5A e na Tabela 5B. Em algumas modalidades, pelo menos uma dentre a pluralidade de moléculas de siRNA ou shRNA compre- ende cerca de 19-30 nucleotídeos que se ligam a uma sequência de RNA codificada por uma sequência de DNA selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 1330-1350 e pelo menos uma dentre a pluralidade de moléculas de siRNA ou shRNA compreende cerca de 19-30 nucleotídeos que se ligam a uma sequência de RNA codificada por uma sequência de DNA selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 154-813. Em algumas modalidades, pelo menos uma dentre a pluralidade de moléculas de siRNA ou shR- NA compreende cerca de 19-30 nucleotídeos que se ligam a uma se- quência de RNA codificada por uma sequência de DNA selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 1351-1367 e pelo menos uma dentre a pluralidade de moléculas de siRNA ou shRNA compreende cerca de 19-30 nucleotídeos que se ligam a uma sequência de RNA codificada por uma sequência de DNA selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 499-524.
[0028] Em algumas modalidades, a presente descrição fornece uma célula efetora imune modificada compreendendo um sistema de regulação de genes, em que o sistema de regulação de genes com- preende uma pluralidade de moléculas de siRNA ou shRNA e é capaz de reduzir a expressão e/ou função de dois ou mais genes-alvo endó- genos, em que pelo menos um dentre os genes-alvo endógenos é SETD5 e pelo menos um dentre os genes-alvo endógenos é selecio- nado a partir do grupo que consiste em IKZF1, IKZF3, GATA3, BCL3, TNIP1, TNFAIP3, NFKBIA, SMAD2, TGFBR1, TGFBR2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6, IKZF2, CBLB, PPP2R2D, NRP1, HAVCR2, LAG3, TIGIT, CTLA4, PTPN6, PDCD1, e BCOR.
Em algumas modali- dades, pelo menos uma dentre a pluralidade de moléculas de siRNA ou shRNA compreende cerca de 19-30 nucleotídeos que se ligam a uma sequência de RNA codificada por uma sequência de DNA defini- da por um conjunto de coordenadas de genoma mostradas na Tabela 6G e na Tabela 6H e pelo menos uma dentre a pluralidade de molécu- las de siRNA ou shRNA compreende cerca de 19-30 nucleotídeos que se ligam a uma sequência de RNA codificada por uma sequência de DNA definida por um conjunto de coordenadas de genoma mostradas na Tabela 5A e na Tabela 5B.
Em algumas modalidades, pelo menos uma dentre a pluralidade de moléculas de siRNA ou shRNA compre- ende cerca de 19-30 nucleotídeos que se ligam a uma sequência de RNA codificada por uma sequência de DNA selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 1351-1367 e pelo menos uma dentre a plu- ralidade de moléculas de siRNA ou shRNA compreende cerca de 19- 30 nucleotídeos que se ligam a uma sequência de RNA codificada por uma sequência de DNA selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 154-813. Em algumas modalidades, pelo menos uma dentre a pluralidade de moléculas de siRNA ou shRNA compreende cerca de 19-30 nucleotídeos que se ligam a uma sequência de RNA codificada por uma sequência de DNA selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 1351-1367 e pelo menos uma dentre a pluralidade de moléculas de siRNA ou shRNA compreende cerca de 19-30 nucleotídeos que se ligam a uma sequência de RNA codificada por uma sequência de DNA selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 499-524.
[0029] Em algumas modalidades, a presente descrição fornece uma célula efetora imune modificada compreendendo um sistema de regulação de genes, em que o sistema de regulação de genes com- preende uma proteína enzimática e em que a proteína enzimática foi manipulada para se ligar especificamente a uma sequência alvo em um ou mais dentre os genes endógenos. Em algumas modalidades, a proteína é uma nuclease com efetores do tipo ativador transcricional (TALEN), uma nuclease de dedo de zinco ou uma meganuclease.
[0030] Em algumas modalidades, a presente descrição fornece uma célula efetora imune modificada compreendendo um sistema de regulação de genes, em que o sistema de regulação de genes com- preende uma molécula de ácido nucleico guia e uma proteína enzimá- tica, em que a molécula de ácido nucleico é uma molécula de RNA guia (gRNA) e a proteína enzimática é uma proteína Cas ou um ortó- logo Cas.
[0031] Em algumas modalidades, a presente descrição fornece uma célula efetora imune modificada compreendendo um sistema de regulação de genes capaz de reduzir a expressão e/ou função de um ou mais genes-alvo endógenos, em que o sistema de regulação de genes compreende um gRNA e uma proteína Cas ou ortólogo Cas, e em que o um ou mais genes-alvo endógenos é selecionado a partir do grupo que consiste em;Ikzf1, Ikzf3, GATA3, Bcl3, Tnip1, Tnfaip3, NFKBIA, SMAD2, Tgfbr1, Tgfbr2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6, IKZF2, Cblb, Ppp2r2d, Nrp1, Havcr2, Lag3, Tigit, Ctla4, Ptpn6, Pdcd1, e BCOR, e em que a molécula de gRNA compreende uma sequência de domínio de direcionamento que se liga a uma sequência de ácido nucleico definida por um conjunto de coordenadas de genoma mostra- do na Tabela 5A e Tabela 5B. Em algumas modalidades, a molécula de gRNA compreende uma sequência de domínio de direcionamento que se liga a uma sequência de DNA alvo selecionada a partir do gru- po que consiste em SEQ ID NOs: 154-813. Em algumas modalidades, a molécula de gRNA compreende uma sequência de direcionamento codificada por uma sequência de ácido nucleico selecionada a partir do grupo que consiste na SEQ ID NOs: 154-813.
[0032] Em algumas modalidades, a presente descrição fornece uma célula efetora imune modificada compreendendo um sistema de regulação de genes capaz de reduzir a expressão e/ou função de um ou mais genes-alvo endógenos, em que o sistema de regulação de genes compreende um gRNA e uma proteína Cas ou Cas ortólogo, e em que o um ou mais genes-alvo endógenos selecionados do grupo que consiste em BCL2L11, FLI1, CALM2, DHODH, UMPS, RBM39, SEMA7A, CHIC2, PCBP1, PBRM1, WDR6, E2F8, SERPINA3, e GNAS, e em que o A molécula de gRNA compreende uma sequência de domínio de direcionamento que se liga a uma sequência de ácido nucleico definida por um conjunto de coordenadas de genoma mostra- das na Tabela 6A e na Tabela 6B. Em algumas modalidades, a molé- cula de gRNA compreende uma sequência de domínio de direciona- mento que se liga a uma sequência de DNA alvo selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 814-1064. Em algumas moda- lidades, a molécula de gRNA compreende uma sequência de domínio de direcionamento codificada por uma sequência de ácido nucleico selecionada a partir do grupo que consiste na SEQ ID NOs: 814-1064.
[0033] Em algumas modalidades, a presente descrição fornece uma célula efetora imune modificada compreendendo um sistema de regulação de genes capaz de reduzir a expressão e/ou função de um ou mais genes-alvo endógenos, em que o sistema de regulação de genes compreende um gRNA e uma proteína Cas ou Ortólogo Cas e em que o um ou mais genes-alvo endógenos selecionados do grupo que consiste em PTPN1, PTPN2, PTPN22, SH2B3, SH2D1A, PIK3CD e EGR2e em que a molécula de gRNA compreende uma sequência de domínio de direcionamento que se liga a uma sequência de ácidos nu- cleicos definido por um conjunto de coordenadas do genoma mostra- das na Tabela 6C e na Tabela 6D. Em algumas modalidades, a molé- cula de gRNA compreende uma sequência de domínio de direciona- mento que se liga a uma sequência de DNA alvo selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 1065-1329. Em algumas mo- dalidades, a molécula de gRNA compreende uma sequência de domí- nio de direcionamento codificada por uma sequência de ácido nucleico selecionada a partir do grupo que consiste na SEQ ID NOs: 1065-
1329.
[0034] Em algumas modalidades, a presente descrição fornece uma célula efetora imune modificada compreendendo um sistema de regulação de genes capaz de reduzir a expressão e/ou função de um ou mais genes-alvo endógenos, em que o sistema de regulação de genes compreende um gRNA e uma proteína Cas ou ortólogo Cas, e em que um ou mais genes-alvo endógenos é PELI1, e em que a molé- cula de gRNA compreende uma sequência de domínio de direciona- mento que se liga a uma sequência de ácido nucleico definida por um conjunto de coordenadas do genoma mostradas nas Tabelas 6E e 6F. Em algumas modalidades, a molécula de gRNA compreende uma se- quência de domínio de direcionamento que se liga a uma sequência de DNA alvo selecionada a partir do grupo que consiste na SEQ ID NOs: 1330-1350. Em algumas modalidades, a molécula de gRNA compreende uma sequência de domínio de direcionamento codificada por uma sequência de ácido nucleico selecionada a partir do grupo que consiste na SEQ ID NOs: 1330-1350.
[0035] Em algumas modalidades, a presente descrição fornece uma célula efetora imune modificada compreendendo um sistema de regulação de genes capaz de reduzir a expressão e/ou função de um ou mais genes-alvo endógenos, em que o sistema de regulação de genes compreende um gRNA e uma proteína Cas ou ortólogo Cas, e em que um ou mais genes-alvo endógenos é SETD5, e em que a mo- lécula de gRNA compreende uma sequência de domínio de direcio- namento que se liga a uma sequência de ácido nucleico definida por um conjunto de coordenadas do genoma mostradas nas Tabelas 6G e 6H. Em algumas modalidades, a molécula de gRNA compreende uma sequência de domínio de direcionamento que se liga a uma sequência de DNA alvo selecionada a partir do grupo que consiste na SEQ ID NOs: 1351-1367. Em algumas modalidades, a molécula de gRNA compreende uma sequência de domínio de direcionamento codificada por uma sequência de ácido nucleico selecionada a partir do grupo que consiste na SEQ ID NOs: 1351-1367.
[0036] Em algumas modalidades, a presente descrição fornece uma célula efetora imune modificada compreendendo um sistema de regulação de genes, em que o sistema de regulação de genes com- preende uma pluralidade de moléculas de gRNA e uma proteína Cas ou ortólogos e é capaz de reduzir a expressão e/ou função de dois ou mais genes-alvo endógenos.
[0037] Em algumas modalidades, a presente descrição fornece uma célula efetora imune modificada compreendendo um sistema de regulação de genes, em que o sistema de regulação de genes com- preende uma pluralidade de moléculas de gRNA e uma proteína ou ortólogo Cas e é capaz de reduzir a expressão e/ou função de dois ou mais genes-alvo endógenos, em que pelo menos um dos genes-alvo endógenos é selecionado do grupo que consiste em BCL2L11, FLI1,
CALM2, DHODH, UMPS, RBM39, SEMA7A, CHIC2, PCBP1, PBRM1, WDR6, E2F8, SERPINA3, e GNAS e pelo menos dos genes-alvo en- dógenos é selecionado a partir do grupo que consiste em Ikzf1, Ikzf3, GATA3, Bcl3, Tnip1, Tnfaip3, NFKBIA, SMAD2, Tgfbr1, Tgfbr2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6, IKZF2, Cblb, Ppp2r2d, Nrp1, Havcr2, Lag3, Tigit, Ctla4, Ptpn6, Pdcd1, e BCOR.
Em algumas modalidades, pelo menos uma dentre a pluralidade de moléculas de gRNA compreende uma sequência de domínio de direcionamento que se liga a uma se- quência de ácido nucleico definida por um conjunto de coordenadas de genoma mostradas na Tabela 6A e na Tabela 6B e pelo menos uma dentre a pluralidade de molécula de gRNA compreende uma sequên- cia de domínio de direcionamento que se liga a uma sequência de áci- do nucleico definida por um conjunto de coordenadas de genoma mos- tradas na Tabela 5A e na Tabela 5B.
Em algumas modalidades, pelo menos uma dentre a pluralidade de moléculas de gRNA compreende uma sequência de domínio de direcionamento que se liga a uma se- quência de DNA alvo selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 814-1064 e pelo menos uma da pluralidade de molécu- las de gRNA compreende uma sequência de domínio de direciona- mento que se liga a uma sequência de DNA alvo selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 154-813. Em algumas modali- dades, pelo menos uma dentre a pluralidade de moléculas de gRNA compreende uma sequência de domínio de direcionamento codificada por uma sequência de ácido nucleico selecionada do grupo que con- siste em SEQ ID NOs: 814-1064 e pelo menos uma dentre a pluralida- de de moléculas de gRNA compreende uma sequência de domínio de direcionamento codificada por uma sequência de ácido nucleico sele- cionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 154-813. Em algumas modalidades, pelo menos um dos genes-alvo endógenos selecionados do grupo que consiste emBCL2L11, FLI1, CALM2, DHODH, UMPS,
RBM39, SEMA7A, CHIC2, PCBP1, PBRM1, WDR6, E2F8, SERPINA3, e GNAS e pelo menos um dentre os genes-alvo endógenos é selecio- nado do grupo que consiste em Tnfaip3, Cblb, e BCOR.
[0038] Em algumas modalidades, a presente descrição fornece uma célula efetora imune modificada compreendendo um sistema de regulação de genes, em que o sistema de regulação de genes com- preende uma pluralidade de moléculas de gRNA e uma proteína ou ortólogo Cas e é capaz de reduzir a expressão e/ou função de dois ou mais genes-alvo endógenos, em que pelo menos um dos genes-alvo endógenos é selecionado do grupo que consiste em PTPN1, PTPN2, PTPN22, SH2B3, SH2D1A, PIK3CD, e EGR2 e pelo menos um dos genes-alvo endógenos é selecionado a partir do grupo que consiste em Ikzf1, Ikzf3, GATA3, Bcl3, Tnip1, Tnfaip3, NFKBIA, SMAD2, Tgfbr1, Tgfbr2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6, IKZF2, Cblb, Ppp2r2d, Nrp1, Havcr2, Lag3, Tigit, Ctla4, Ptpn6, Pdcd1, e BCOR. Em algumas modalidades, pelo menos uma dentre a pluralidade de moléculas de gRNA compreende uma sequência de domínio de direcionamento que se liga a uma sequência de ácido nucleico definida por um conjunto de coordenadas de genoma mostradas na Tabela 6C e na Tabela 6D e pelo menos uma dentre a pluralidade de molécula de gRNA compre- ende uma sequência de domínio de direcionamento que se liga a uma sequência de ácido nucleico definida por um conjunto de coordenadas de genoma mostradas na Tabela 5A e na Tabela 5B. Em algumas mo- dalidades, pelo menos uma dentre a pluralidade de moléculas de gRNA compreende uma sequência de domínio de direcionamento que se liga a uma sequência de DNA alvo selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 1065-1329 e pelo menos uma dentre a pluralidade de moléculas de gRNA compreende uma sequência de domínio de direcionamento que se liga a uma sequência de DNA alvo selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 154-813.
Em algumas modalidades, pelo menos um dos genes-alvo endógenos selecionados do grupo que consiste em PTPN1, PTPN2, PTPN22, SH2B3, SH2D1A, PIK3CD, e EGR2 e pelo menos um dos genes-alvo endógenos é selecionado a partir do grupo que consiste em Tnfaip3, Cblb, e BCOR.
[0039] Em algumas modalidades, pelo menos um dos genes-alvo endógenos é PTPN2 e pelo menos um dos genes-alvo endógenos é selecionado do grupo que consiste em Tnfaip3, Cblb e BCOR. Em al- gumas modalidades, pelo menos uma dentre a pluralidade de molécu- las de gRNA compreende uma sequência de domínio de direciona- mento que se liga a uma sequência de DNA alvo selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 1112-1227 e pelo menos uma dentre a pluralidade de moléculas de gRNA compreende uma sequên- cia de domínio de direcionamento que se liga a uma sequência de DNA alvo selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 499-524. Em algumas modalidades, pelo menos uma dentre a plurali- dade de moléculas de gRNA compreende uma sequência de domínio de direcionamento codificada por uma sequência de ácido nucleico selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 1065-1329 e pe- lo menos uma dentre a pluralidade de moléculas de gRNA compreen- de uma sequência de domínio de direcionamento codificada por uma sequência de ácido nucleico selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 154-813. Em algumas modalidades, pelo menos uma dentre a pluralidade de moléculas de gRNA compreende uma sequên- cia de domínio de direcionamento codificada por uma sequência de ácido nucleico selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 1112-1227 e pelo menos uma da pluralidade de moléculas de gRNA compreende uma sequência de domínio de direcionamento co- dificada por uma sequência de ácido nucleico selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 499-524.
[0040] Em algumas modalidades, a presente descrição fornece uma célula efetora imune modificada compreendendo um sistema de regulação de genes, em que o sistema de regulação de genes com- preende uma pluralidade de moléculas de gRNA e uma proteína ou ortólogo Cas e é capaz de reduzir a expressão e/ou função de dois ou mais genes-alvo endógenos, em que pelo menos um dos genes-alvo endógenos é selecionado do grupo que consiste em PELI1 e pelo me- nos um dos genes-alvo endógeno é selecionado do grupo que consis- te em Ikzf1, Ikzf3, GATA3, Bcl3, Tnip1, Tnfaip3, NFKBIA, SMAD2, Tgfbr1, Tgfbr2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6, IKZF2, Cblb, Ppp2r2d, Nrp1, Havcr2, Lag3, Tigit, Ctla4, Ptpn6, Pdcd1, e BCOR. Em algumas modalidades, pelo menos uma dentre a pluralidade de moléculas de gRNA compreende uma sequência de domínio de direcionamento que se liga a uma sequência de ácido nucleico definida por um conjunto de coordenadas de genoma mostradas na Tabela 6E e na Tabela 6F e pelo menos uma dentre a pluralidade de molécula de gRNA compre- ende uma sequência de domínio de direcionamento que se liga a uma sequência de ácido nucleico definida por um conjunto de coordenadas de genoma mostradas na Tabela 5A e na Tabela 5B. Em algumas mo- dalidades, pelo menos uma dentre a pluralidade de moléculas de gRNA compreende uma sequência de domínio de direcionamento que se liga a uma sequência de DNA alvo selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 1330-1350 e pelo menos uma dentre a pluralidade de moléculas de gRNA compreende uma sequência de domínio de direcionamento que se liga a uma sequência de DNA alvo selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 154-813.
[0041] Em algumas modalidades, pelo menos um dos genes-alvo endógenos é PELI1 e pelo menos um dos genes-alvo endógenos é selecionado do grupo que consiste em Tnfaip3, Cblb, e BCOR. Em al- gumas modalidades, pelo menos uma dentre a pluralidade de molécu-
las de gRNA compreende uma sequência de domínio de direciona- mento que se liga a uma sequência de DNA alvo selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 1351-1367 e pelo menos uma dentre a pluralidade de moléculas de gRNA compreende uma sequên- cia de domínio de direcionamento que se liga a uma sequência de DNA alvo selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 499-524. Em algumas modalidades, pelo menos uma dentre a plurali- dade de moléculas de gRNA compreende uma sequência de domínio de direcionamento que se liga a uma sequência de DNA alvo selecio- nada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 1330-1350 e pelo menos uma dentre a pluralidade de moléculas de gRNA compre- ende uma sequência de domínio de direcionamento que se liga a uma sequência de DNA alvo selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 154-813. Em algumas modalidades, pelo menos uma dentre a pluralidade de moléculas de gRNA compreende uma sequên- cia de domínio de direcionamento codificada por uma sequência de ácido nucleico selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 1351-1367 e pelo menos uma dentre a pluralidade de moléculas de gRNA compreende uma sequência de domínio de direcionamento que se liga a uma sequência de DNA alvo selecionada a partir do gru- po que consiste em SEQ ID NOs: 499-524.
[0042] Em algumas modalidades, a presente descrição fornece uma célula efetora imune modificada compreendendo um sistema de regulação de genes, em que o sistema de regulação de genes com- preende uma pluralidade de moléculas de gRNA e uma proteína ou ortólogo Cas e é capaz de reduzir a expressão e/ou função de dois ou mais genes-alvo endógenos, em que pelo menos um dos genes-alvo endógenos é selecionado do grupo que consiste em SETD5 e pelo menos um dos genes-alvo endógenos é selecionado a partir do grupo que consiste em Ikzf1, Ikzf3, GATA3, Bcl3, Tnip1, Tnfaip3, NFKBIA,
SMAD2, Tgfbr1, Tgfbr2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6, IKZF2, Cblb, Ppp2r2d, Nrp1, Havcr2, Lag3, Tigit, Ctla4, Ptpn6, Pdcd1, e BCOR. Em algumas modalidades, pelo menos uma dentre a pluralidade de molé- culas de gRNA compreende uma sequência de domínio de direciona- mento que se liga a uma sequência de ácido nucleico que se liga a uma sequência de ácido nucleico definida por um conjunto de coorde- nadas de genoma mostradas na Tabela 6G e na Tabela 6H e pelo menos uma dentre a pluralidade de molécula de gRNA compreende uma sequência de domínio de direcionamento que se liga a uma se- quência de ácido nucleico definida por um conjunto de coordenadas de genoma mostradas na Tabela 5A e na Tabela 5B. Em algumas moda- lidades, pelo menos uma dentre a pluralidade de moléculas de gRNA compreende uma sequência de domínio de direcionamento que se liga a uma sequência de DNA alvo selecionada a partir do grupo que con- siste nas SEQ ID NOs: 1351-1367 e pelo menos uma dentre a plurali- dade de moléculas de gRNA compreende uma sequência de domínio de direcionamento que se liga a uma sequência de DNA alvo selecio- nada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 154-813.
[0043] Em algumas modalidades, pelo menos um dos genes-alvo endógeno é SETD5 e pelo menos um dos genes-alvo endógenos é selecionado do grupo que consiste em Tnfaip3, Cblb, e BCOR. Em al- gumas modalidades, pelo menos uma dentre a pluralidade de molécu- las de gRNA compreende uma sequência de domínio de direciona- mento que se liga a uma sequência de DNA alvo selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 1351-1367 e pelo menos uma dentre a pluralidade de moléculas de gRNA compreende uma sequên- cia de domínio de direcionamento que se liga a uma sequência de DNA alvo selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 499-524. Em algumas modalidades, pelo menos uma dentre a plurali- dade de moléculas de gRNA compreende uma sequência de domínio de direcionamento codificada por uma sequência de ácido nucleico selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 1351-1367 e pe- lo menos uma dentre a pluralidade de moléculas de gRNA compreen- de uma sequência de domínio de direcionamento codificada por uma sequência de ácido nucleico selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 154-813. Em algumas modalidades, pelo menos uma dentre a pluralidade de moléculas de gRNA compreende uma sequên- cia de domínio de direcionamento codificada por uma sequência de ácido nucleico selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 1351-1367 e pelo menos uma da pluralidade de moléculas de gRNA compreende uma sequência de domínio de direcionamento co- dificada por uma sequência de ácido nucleico selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 499-524.
[0044] Em algumas modalidades, a célula efetora imune modifica- da compreende uma proteína Cas, em que: (a) a proteína Cas é uma proteína Cas do tipo selvagem compreendendo dois domínios enzima- ticamente ativos e capaz de induzir quebras de DNA em cadeia dupla; (b) a proteína Cas é um mutante de Nickase de Cas compreendendo um domínio enzimaticamente ativo e capaz de induzir quebras de DNA de fita simples; ou (c) a proteína Cas é uma proteína Cas desativada (dCas) e está associada a uma proteína heteróloga capaz de modular a expressão dentre um ou mais genes-alvo endógenos. Em algumas modalidades, a proteína Cas é uma proteína Cas9. Em algumas mo- dalidades, a proteína heteróloga é selecionada a partir do grupo que consiste no domínio de proteína 1 que interage com MAX (MXI1), do- mínio de caixa associada a Krüppel (KRAB), proteína de ligação a me- til-CpG 2 (MECP2) e quatro domínios mSin3 concatenados (SID4X).
[0045] Em algumas modalidades, o sistema de regulação de ge- nes introduz uma mutação inativadora em um ou mais genes-alvo en- dógenos. Em algumas modalidades, a mutação inativadora compreen-
de uma deleção, substituição ou inserção de um ou mais nucleotídeos nas sequências genômicas dentre dois ou mais genes endógenos. Em algumas modalidades, a deleção é uma deleção parcial ou completa dentre dois ou mais genes-alvo endógenos. Em algumas modalidades, a mutação inativadora é uma mutação de deslocamento de quadro. Em algumas modalidades, a mutação inativadora reduz a expressão e/ou função dos dois ou mais genes-alvo endógenos.
[0046] Em algumas modalidades, o sistema de regulação de ge- nes é introduzido na célula efetora imune por transfecção, transdução, eletroporação ou interrupção física da membrana celular por um dis- positivo microfluídico. Em algumas modalidades, o sistema de regula- ção de genes é introduzido como um polinucleotídeo que codifica um ou mais componentes do sistema, uma proteína ou um complexo de ribonucleoproteína (RNP).
[0047] Em algumas modalidades, a presente descrição fornece uma célula efetora imune modificada compreendendo expressão e/ou função reduzida de um ou mais genes endógenos selecionados do grupo que consiste em Ikzf1, Ikzf3, GATA3, Bcl3, Tnip1, Tnfaip3, NFKBIA, SMAD2, Tgfbr1, Tgfbr2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6, IKZF2, Cblb, Ppp2r2d, Nrp1, Havcr2, Lag3, Tigit, Ctla4, Ptpn6, Pdcd1, e BCOR, em que a função e/ou expressão reduzida dentre um ou mais genes endógenos aprimora uma função efetora da célula efetora imu- ne
[0048] Em algumas modalidades, a presente descrição fornece uma célula efetora imune modificada compreendendo a expressão e/ou função reduzida de um ou mais genes endógenos selecionados dentre: (a) o grupo que consiste em Ikzf1, Ikzf3, GATA3, Bcl3, Tnip1, Tnfaip3, NFKBIA, SMAD2, Tgfbr1, Tgfbr2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6 e IKZF2; ou (b) o grupo que consiste em Cblb, Ppp2r2d, Nrp1, Havcr2, Lag3, Tigit, Ctla4, Ptpn6, Pdcd1 e BCOR, em que a expressão e/ou função reduzidas dentre um ou mais genes endógenos aprimo- ram a função efetora da célula efetora imune.
[0049] Em algumas modalidades, a presente descrição fornece uma célula efetora imune modificada compreendendo expressão e/ou função reduzida dentre um ou mais genes endógenos selecionados a partir de: (a) o grupo que consiste em BCL2L11, FLI1, CALM2, DHODH, UMPS, RBM39, SEMA7A, CHIC2, PCBP1, PBRM1, WDR6, E2F8, SERPINA3, e GNAS; (b) o grupo que consiste emPTPN1, PTPN2, PTPN22, SH2B3, SH2D1A, PIK3CD, r EGR2; (c) PELI1; ou (d) SETD5, em que a expressão e/ou função reduzida dentre um ou mais genes endógenos aprimora uma função efetora da célula efetora imune modificada.
[0050] Em algumas modalidades, a presente descrição fornece uma célula efetora imune modificada compreendendo expressão e/ou função reduzida dentre um ou mais genes endógenos selecionados a partir de Ikzf1, Ikzf3, GATA3, Bcl3, Tnip1, Tnfaip3, NFKBIA, SMAD2, Tgfbr1, Tgfbr2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6, IKZF2, Cblb, Ppp2r2d, Nrp1, Havcr2, Lag3, Tigit, Ctla4, Ptpn6, Pdcd1, e BCOR, em que a função e/ou expressão reduzida dentre dois ou mais genes endógenos aprimora uma função efetora da célula efetora imune modificada. Em algumas modalidades, a célula efetora imune modificada compreende expressão e/ou função reduzida de CBLB e BCOR.
[0051] Em algumas modalidades, a presente descrição fornece uma célula efetora imune modificada que compreende expressão e/ou função reduzida de dois ou mais genes-alvo, em que pelo menos um gene-alvo é selecionado do grupo que consiste em BCL2L11, FLI1, CALM2, DHODH, UMPS, RBM39, SEMA7A, CHIC2, PCBP1, PBRM1, WDR6, E2F8, SERPINA3, e GNAS, e em que pelo menos um gene- alvo é selecionado do grupo que consiste em Ikzf1, Ikzf3, GATA3, Bcl3, Tnip1, Tnfaip3, NFKBIA, SMAD2, Tgfbr1, Tgfbr2, TANK, FOXP3,
RC3H1, TRAF6, IKZF2, Cblb, Ppp2r2d, Nrp1, Havcr2, Lag3, Tigit, Ctla4, Ptpn6, Pdcd1, e BCOR, em que a expressão e/ou função redu- zida dentre dois ou mais genes endógenos aprimora uma função efe- tora da célula efetora imune modificada.
[0052] Em algumas modalidades, a presente descrição fornece uma célula efetora imune modificada compreendendo expressão e/ou função reduzida de dois ou mais genes-alvo, em que pelo menos um gene-alvo é selecionado a partir do grupo que consiste em PTPN1, PTPN2, PTPN22, SH2B3, SH2D1A, PIK3CD, e EGR2, e em que pelo menos um gene-alvo é selecionado do grupo que consiste em Ikzf1, Ikzf3, GATA3, Bcl3, Tnip1, Tnfaip3, NFKBIA, SMAD2, Tgfbr1, Tgfbr2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6, IKZF2, Cblb, Ppp2r2d, Nrp1, Havcr2, Lag3, Tigit, Ctla4, Ptpn6, Pdcd1, e BCOR, em que a expressão e/ou função reduzida dentre dois ou mais genes endógenos aprimora uma função efetora da célula efetora imune modificada. Em algumas moda- lidades, a célula efetora imune modificada compreende expressão e/ou função reduzida de PTPN2 e CBLB. Em algumas modalidades, a célula efetora imune modificada compreende expressão e/ou função reduzida de PTPN2 e BCOR. Em algumas modalidades, a célula efe- tora imune modificada compreende expressão e/ou função reduzida de PTPN2 e Tnfaip3.
[0053] Em algumas modalidades, a presente descrição fornece uma célula efetora imune modificada compreendendo expressão e/ou função reduzida de dois ou mais genes-alvo, em que pelo menos um gene-alvo é PELI1, e em que pelo menos um gene-alvo é selecionado do grupo que consiste em Ikzf1, Ikzf3, GATA3, Bcl3, Tnip1, Tnfaip3, NFKBIA, SMAD2, Tgfbr1, Tgfbr2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6, IKZF2, Cblb, Ppp2r2d, Nrp1, Havcr2, Lag3, Tigit, Ctla4, Ptpn6, Pdcd1, e BCOR, em que a expressão e/ou função reduzida dentre dois ou mais genes endógenos aprimora uma função efetora da célula efetora imune modificada Em algumas modalidades, a célula efetora imune modificada compreende expressão e/ou função reduzida de PELI1 e CBLB. Em algumas modalidades, a célula efetora imune modificada compreende expressão e/ou função reduzida de PELI1 e BCOR. Em algumas modalidades, a célula efetora imune modificada compreende expressão e/ou função reduzida de PELI1 e Tnfaip3.
[0054] Em algumas modalidades, a presente descrição fornece uma célula efetora imune modificada compreendendo expressão e/ou função reduzida de dois ou mais genes-alvo, em que pelo menos um gene-alvo é SETD5, e em que pelo menos um gene-alvo é seleciona- do do grupo que consiste em Ikzf1, Ikzf3, GATA3, Bcl3, Tnip1, Tnfaip3, NFKBIA, SMAD2, Tgfbr1, Tgfbr2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6, IKZF2, Cblb, Ppp2r2d, Nrp1, Havcr2, Lag3, Tigit, Ctla4, Ptpn6, Pdcd1, e BCOR, em que a expressão e/ou função reduzida dentre dois ou mais genes endógenos aprimora uma função efetora da célula efetora imune modificada Em algumas modalidades, a célula efetora imune modificada compreende expressão e/ou função reduzida de SETD5 e CBLB. Em algumas modalidades, a célula efetora imune modificada compreende expressão e/ou função reduzida de SETD5 e BCOR. Em algumas modalidades, a célula efetora imune modificada compreende expressão e/ou função reduzida de SETD5 e Tnfaip3.
[0055] Em algumas modalidades, a presente descrição fornece uma célula efetora imune modificada compreendendo uma mutação inativadora em um ou mais genes endógenos selecionados do grupo que consiste em Ikzf1, Ikzf3, GATA3, Bcl3, Tnip1, Tnfaip3, NFKBIA, SMAD2, Tgfbr1, Tgfbr2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6, IKZF2, Cblb, Ppp2r2d, Nrp1, Havcr2, Lag3, Tigit, Ctla4, Ptpn6, Pdcd1 e BCOR.
[0056] Em algumas modalidades, a presente descrição fornece uma célula efetora imune modificada compreendendo uma mutação inativadora em um ou mais genes endógenos selecionados dentre: (a)
o grupo que consiste em Ikzf1, Ikzf3, GATA3, Bcl3, Tnip1, Tnfaip3, NFKBIA, SMAD2, Tgfbr1, Tgfbr2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6, e IKZF2; ou (b) o grupo consiste em Cblb, Ppp2r2d, Nrp1, Havcr2, Lag3, Tigit, Ctla4, Ptpn6, Pdcd1, e BCOR.
[0057] Em algumas modalidades, a presente descrição fornece uma célula efetora imune modificada compreendendo uma mutação inativadora em um ou mais genes endógenos selecionados dentre: (a) o grupo que consiste em BCL2L11, FLI1, CALM2, DHODH, UMPS, RBM39, SEMA7A, CHIC2, PCBP1, PBRM1, WDR6, E2F8, SERPINA3, e GNAS; (b) o grupo que consiste em PTPN1, PTPN2, PTPN22, SH2B3, SH2D1A, PIK3CD, e EGR2; (c) PELI1; ou (d) SETD5.
[0058] Em algumas modalidades, a presente descrição fornece uma célula efetora imune modificada compreendendo uma mutação inativadora em um ou mais genes-alvo selecionados de Ikzf1, Ikzf3, GATA3, Bcl3, Tnip1, Tnfaip3, NFKBIA, SMAD2, Tgfbr1, Tgfbr2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6, IKZF2, Cblb, Ppp2r2d, Nrp1, Havcr2, Lag3, Tigit, Ctla4, Ptpn6, Pdcd1, e BCOR. Em algumas modalidades, a célu- la efetora imune modificada compreende uma mutação inativadora nos genes CBLB e BCOR.
[0059] Em algumas modalidades, a presente descrição fornece uma célula efetora imune modificada compreendendo uma mutação inativadora em dois ou mais genes-alvo, em que pelo menos um gene- alvo é selecionado a partir do grupo que consiste em BCL2L11, FLI1, CALM2, DHODH, UMPS, RBM39, SEMA7A, CHIC2, PCBP1, PBRM1, WDR6, E2F8, SERPINA3, e GNAS, e pelo menos um gene-alvo é se- lecionado do grupo que consiste em Ikzf1, Ikzf3, GATA3, Bcl3, Tnip1, Tnfaip3, NFKBIA, SMAD2, Tgfbr1, Tgfbr2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6, IKZF2, Cblb, Ppp2r2d, Nrp1, Havcr2, Lag3, Tigit, Ctla4, Ptpn6, Pdcd1, e BCOR.
[0060] Em algumas modalidades, a presente descrição fornece uma célula efetora imune modificada compreendendo uma mutação inativadora em dois ou mais genes-alvo, em que pelo menos um gene- alvo é selecionado a partir do grupo que consiste em PTPN1, PTPN2, PTPN22, SH2B3, SH2D1A, PIK3CD, e EGR2 e pelo menos um gene- alvo é selecionado do grupo que consiste em Ikzf1, Ikzf3, GATA3, Bcl3, Tnip1, Tnfaip3, NFKBIA, SMAD2, Tgfbr1, Tgfbr2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6, IKZF2, Cblb, Ppp2r2d, Nrp1, Havcr2, Lag3, Tigit, Ctla4, Ptpn6, Pdcd1, e BCOR. Em algumas modalidades, a célula efe- tora imune modificada compreende uma mutação inativadora nos ge- nes PTPN2 e CBLB. Em algumas modalidades, a célula efetora imune modificada compreende uma mutação inativadora nos genes PTPN2 e BCOR. Em algumas modalidades, a célula efetora imune modificada compreende uma mutação inativadora nos genes PTPN2 e Tnfaip3.
[0061] Em algumas modalidades, a presente descrição fornece uma célula efetora imune modificada compreendendo uma mutação inativadora em dois ou mais genes-alvo, em que pelo menos um gene- alvo é PELI1 e pelo menos um gene-alvo é selecionado do gene-alvo que consiste em Ikzf1, Ikzf3, GATA3, Bcl3, Tnip1, Tnfaip3, NFKBIA, SMAD2, Tgfbr1, Tgfbr2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6, IKZF2, Cblb, Ppp2r2d, Nrp1, Havcr2, Lag3, Tigit, Ctla4, Ptpn6, Pdcd1, e BCOR. Em algumas modalidades, a célula efetora imune modificada compreende uma mutação inativadora nos genesPELI1 e CBLB. Em algumas mo- dalidades, a célula efetora imune modificada compreende uma muta- ção inativadora nos genes PELI1 e BCOR. Em algumas modalidades, a célula efetora imune modificada compreende uma mutação inativa- dora nos PELI1 e Tnfaip3.
[0062] Em algumas modalidades, a presente descrição fornece uma célula efetora imune modificada compreendendo uma mutação inativadora em dois ou mais genes-alvo, em que pelo menos um gene- alvo é SETD5 e pelo menos um gene-alvo é selecionado do grupo que consiste em Ikzf1, Ikzf3, GATA3, Bcl3, Tnip1, Tnfaip3, NFKBIA, SMAD2, Tgfbr1, Tgfbr2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6, IKZF2, Cblb, Ppp2r2d, Nrp1, Havcr2, Lag3, Tigit, Ctla4, Ptpn6, Pdcd1, e BCOR. Em algumas modalidades, a célula efetora imune modificada compreende uma mutação inativadora nos genes SETD5 e CBLB. Em algumas modalidades, a célula efetora imune modificada compreende uma mu- tação inativadora nos genes SETD5 e BCOR. Em algumas modalida- des, a célula efetora imune modificada compreende uma mutação ina- tivadora nos genes SETD5 e Tnfaip3.
[0063] Em algumas modalidades, a mutação inativadora compre- ende uma deleção, substituição ou inserção de um ou mais nucleotí- deos nas sequências genômicas dentre dois ou mais genes endóge- nos. Em algumas modalidades, a deleção é uma deleção parcial ou completa dentre dois ou mais genes-alvo endógenos. Em algumas modalidades, a mutação inativadora é uma mutação de deslocamento de quadro. Em algumas modalidades, a mutação inativadora reduz a expressão e/ou função dos dois ou mais genes-alvo endógenos.
[0064] Em algumas modalidades, a expressão dentre um ou mais genes-alvo endógenos é reduzida em pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80% ou pelo menos 90% em com- paração com uma célula efetora imune de controle ou não modificada. Em algumas modalidades, a função de um ou mais genes-alvo endó- genos é reduzida em pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80% ou pelo menos 90% em comparação com célu- la efetora imune de controle ou não modificada
[0065] Em algumas modalidades, a célula efetora imune modifica- da compreende adicionalmente um receptor imunológico manipulado exibido na superfície celular. Em algumas modalidades, o receptor imunológico manipulado é um CAR compreendendo um domínio de ligação ao antígeno, um domínio transmembranar e um domínio de sinalização intracelular. Em algumas modalidades, o receptor imunoló- gico manipulado é um TCR manipulado. Em algumas modalidades, o receptor imunológico manipulado se liga especificamente a um antíge- no expresso em uma célula-alvo, em que o antígeno é um antígeno associado ao tumor.
[0066] Em algumas modalidades, a célula efetora imune modifica- da compreende adicionalmente um transgene exógeno que expressa uma molécula de ativação imune. Em algumas modalidades, a molé- cula de ativação imune é selecionada do grupo que consiste em uma citocina, uma quimiocina, uma molécula coestimuladora, um peptídeo de ativação, um anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno. Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação do mesmo se liga e inibe especificamente a função da proteína codificada por NRP1, HAVCR2, LAG3, TIGIT, CTLA4 ou PDCD1.
[0067] Em algumas modalidades, a célula efetora imune é aquela em que a célula efetora imune é um linfócito selecionado a partir de uma célula T, uma célula exterminadora natural (NK), uma célula NKT. Em algumas modalidades, o linfócito é um linfócito infiltrante de tumor (TIL). Em algumas modalidades, a função efetora é selecionada a par- tir da proliferação celular, viabilidade celular, infiltração tumoral, citoto- xicidade, respostas imunes antitumorais e/ou resistência à exaustão.
[0068] Em algumas modalidades, a presente descrição fornece uma composição compreendendo uma célula efetora imune modifica- da descrita neste documento. Em algumas modalidades, a composi- ção compreende adicionalmente um carreador ou diluente farmaceuti- camente aceitável. Em algumas modalidades, a composição compre- ende pelo menos1 x 104, 1 x 105, 1 x 106, 1 x 107, 1 x 108, 1 x 109, 1 x 1010, ou 1 x 1011células efetoras imune modificas. Em algumas moda- lidades, a composição é adequada para administração a um sujeito em necessidade da mesma. Em algumas modalidades, a composição compreende células efetoras imunes autólogas derivadas a partir do sujeito em necessidade da mesma. Em algumas modalidades, a com- posição compreende células efetoras imunes alogênicas derivadas a partir de um sujeito doador.
[0069] Em algumas modalidades, a presente descrição fornece um sistema de regulação de genes capaz de reduzir a expressão e/ou função dentre um ou mais genes-alvo endógenos em uma célula sele- cionada a partir de: (a) o grupo que consiste em Ikzf1, Ikzf3, GATA3, Bcl3, Tnip1, Tnfaip3, NFKBIA, SMAD2, Tgfbr1, Tgfbr2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6, e IKZF2; ou (b) o grupo que consiste em Cblb, Ppp2r2d, Nrp1, Havcr2, Lag3, Tigit, Ctla4, Ptpn6, Pdcd1, e BCOR, em que o sistema compreende (i) uma molécula de ácido nucleico; (ii) uma enzimática; ou (iii) uma molécula de ácido nucleico guia e uma proteína enzimática
[0070] Em algumas modalidades, a presente descrição fornece um sistema de regulação de genes capaz de reduzir a expressão dentre um ou mais genes-alvo endógenos em uma célula selecionada de: (a) o grupo que consiste em BCL2L11, FLI1, CALM2, DHODH, UMPS, RBM39, SEMA7A, CHIC2, PCBP1, PBRM1, WDR6, E2F8, SERPINA3, e GNAS; (b) o grupo consiste em PTPN1, PTPN2, PTPN22, SH2B3, SH2D1A, PIK3CD, e EGR2; (c) PELI1; ou (d) SETD5, em que o siste- ma compreende (i) uma molécula de ácido nucleico; (ii) uma enzimáti- ca; ou (iii) uma molécula de ácido nucleico guia e uma proteína enzi- mática.
[0071] Em algumas modalidades, o sistema de regulação de ge- nes compreende uma molécula de ácido nucleico guia de RNA (gRNA) e uma endonuclease de Cas.
[0072] Em algumas modalidades, o sistema de regulação de ge- nes compreende uma molécula de gRNA e uma endonuclease de Cas e é capaz de reduzir a expressão de um ou mais genes-alvo endóge-
nos, em que um ou mais genes-alvo endógenos são selecionados dentre Ikzf1, Ikzf3, GATA3, Bcl3, Tnip1, Tnfaip3, NFKBIA, SMAD2, Tgfbr1, Tgfbr2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6, e IKZF2 ou é selecio- nado dentre Cblb, Ppp2r2d, Nrp1, Havcr2, Lag3, Tigit, Ctla4, Ptpn6, Pdcd1, e BCOR e em que a molécula de gRNA compreende uma se- quência de domínio de direcionamento que se liga a uma sequência de domínio de direcionamento que se liga a uma sequência de DNA alvo definida por um conjunto de coordenadas genômicas mostradas na Tabela 5A e Tabela 5B.
[0073] Em algumas modalidades, o sistema de regulação de ge- nes compreende uma molécula de gRNA e uma endonuclease de Cas e é capaz de reduzir a expressão de um ou mais genes-alvo endóge- nos, em que um ou mais genes-alvo endógenos são selecionados dentre Ikzf1, Ikzf3, GATA3, Bcl3, Tnip1, Tnfaip3, NFKBIA, SMAD2, Tgfbr1, Tgfbr2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6, e IKZF2 e em que a molécula de gRNA compreende uma sequência de domínio de direci- onamento que se liga a sequência de DNA alvo selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 154-498. Em algumas modalida- des, a molécula de gRNA compreende uma sequência de direciona- mento codificada por uma sequência de ácido nucleico selecionada a partir do grupo que consiste na SEQ ID NOs: 154-498.
[0074] Em algumas modalidades, o sistema de regulação de ge- nes compreende uma molécula de gRNA e uma endonuclease de Cas e é capaz de reduzir a expressão de um ou mais genes-alvo endóge- nos, em que um ou mais genes-alvo endógenos são selecionados dentre Cblb, Ppp2r2d, Nrp1, Havcr2, Lag3, Tigit, Ctla4, Ptpn6, Pdcd1, e BCOR e em que a molécula de gRNA compreende uma sequência de domínio alvo que se liga a uma sequência de DNA alvo selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 499-813. Em algumas modalidades, a molécula de gRNA compreende uma sequência de di-
recionamento codificada por uma sequência de ácido nucleico selecio- nada a partir do grupo que consiste na SEQ ID NOs: 499-813.
[0075] Em algumas modalidades, o sistema de regulação de ge- nes compreende uma molécula de gRNA e uma endonuclease de Cas e é capaz de reduzir a expressão de um ou mais genes-alvo endóge- nos, em que um ou mais genes-alvo endógenos são selecionados dentre BCL2L11, FLI1, CALM2, DHODH, UMPS, RBM39, SEMA7A, CHIC2, PCBP1, PBRM1, WDR6, E2F8, SERPINA3, e GNAS e em que a molécula de gRNA compreende uma sequência de domínio de dire- cionamento que se liga a uma sequência de DNA alvo definida por um conjunto de coordenadas genômicas mostradas na Tabela 6A e Tabe- la 6B. Em algumas modalidades, a molécula de gRNA compreende uma sequência de domínio de direcionamento que se liga a uma se- quência de DNA alvo selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 814-1064. Em algumas modalidades, a molécula de gRNA compreende uma sequência de domínio de direcionamento co- dificada por uma sequência de ácido nucleico selecionada a partir do grupo que consiste na SEQ ID NOs: 814-1064.
[0076] Em algumas modalidades, o sistema de regulação de ge- nes compreende uma molécula de gRNA e uma endonuclease de Cas e é capaz de reduzir a expressão de um ou mais genes-alvo endóge- nos, em que um ou mais genes-alvo endógenos são selecionados dentre PTPN1, PTPN2, PTPN22, SH2B3, SH2D1A, PIK3CD e EGR2 e em que a molécula de gRNA compreende uma sequência de domínio alvo que se liga a uma sequência de DNA alvo definida por um conjun- to de coordenadas genômicas mostradas na Tabela 6C e na Tabela 6D. Em algumas modalidades, a molécula de gRNA compreende uma sequência de domínio de direcionamento que se liga a uma sequência de DNA alvo selecionada a partir do grupo que consiste na SEQ ID NOs: 1065-1329. Em algumas modalidades, a molécula de gRNA compreende uma sequência de domínio de direcionamento que se liga a uma sequência de DNA alvo selecionada a partir do grupo que con- siste na SEQ ID NOs: 1112-1227. Em algumas modalidades, a molé- cula de gRNA compreende uma sequência de domínio de direciona- mento codificada por uma sequência de ácido nucleico selecionada a partir do grupo que consiste na SEQ ID NOs: 1065-1329. Em algumas modalidades, a molécula de gRNA compreende uma sequência de domínio de direcionamento codificada por uma sequência de ácido nu- cleico selecionada a partir do grupo que consiste na SEQ ID NOs:1112-1227.
[0077] Em algumas modalidades, o sistema de regulação de ge- nes compreende uma molécula de gRNA e uma endonuclease de Cas e é capaz de reduzir a expressão de um ou mais genes-alvo endóge- nos, em que o um ou mais genes-alvo endógenos compreende PELI1 e em que a molécula de gRNA compreende um domínio de direciona- mento sequência que se liga a uma sequência de DNA alvo definida por um conjunto de coordenadas genômicas mostradas na Tabela 6E e na Tabela 6F. Em algumas modalidades, a molécula de gRNA com- preende uma sequência de domínio de direcionamento que se liga a uma sequência de DNA alvo selecionada a partir do grupo que consis- te na SEQ ID NOs: 1330-1350. Em algumas modalidades, a molécula de gRNA compreende uma sequência de domínio de direcionamento codificada por uma sequência de ácido nucleico selecionada a partir do grupo que consiste na SEQ ID NOs: 1330-1350.
[0078] Em algumas modalidades, o sistema de regulação de ge- nes compreende uma molécula de gRNA e uma endonuclease de Cas e é capaz de reduzir a expressão de um ou mais genes-alvo endóge- nos, em que um ou mais genes-alvo endógenos compreende SETD5 e em que a molécula de gRNA compreende uma sequência de domínio de direcionamento que se liga a uma sequência de DNA alvo definida por um conjunto de coordenadas genômicas mostradas na Tabela 6G e na Tabela 6H. Em algumas modalidades, a molécula de gRNA com- preende uma sequência de domínio de direcionamento que se liga a uma sequência de DNA alvo selecionada a partir do grupo que consis- te na SEQ ID NOs: 1351-1367. Em algumas modalidades, a molécula de gRNA compreende uma sequência de domínio de direcionamento codificada por uma sequência de ácido nucleico selecionada a partir do grupo que consiste na SEQ ID NOs: 1351-1367.
[0079] Em algumas modalidades, o sistema de regulação de ge- nes compreende uma siRNA ou molécula de ácido nucleico shRNA e é capaz de reduzir a expressão dentre um ou mais genes-alvo endóge- nos, em que um ou mais genes-alvo endógenos são selecionados dentre Ikzf1, Ikzf3, GATA3, Bcl3, Tnip1, Tnfaip3, NFKBIA, SMAD2, Tgfbr1, Tgfbr2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6, e IKZF2 ou é selecio- nado Cblb, Ppp2r2d, Nrp1, Havcr2, Lag3, Tigit, Ctla4, Ptpn6, Pdcd1, e BCOR e em que a molécula de siRNA ou shRNA compreende cerca de 19-30 nucleotídeos que se ligam a uma sequência de RNA codifi- cada por uma sequência de DNA definida por um conjunto de coorde- nadas do genoma mostradas na Tabela 5A e na Tabela 5B. Em algu- mas modalidades, um ou mais genes-alvo endógenos são seleciona- dos dentre Ikzf1, Ikzf3, GATA3, Bcl3, Tnip1, Tnfaip3, NFKBIA, SMAD2, Tgfbr1, Tgfbr2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6, e IKZF2 e em que a molécula siRNA ou shRNA compreende cerca de 19-30 nucleotídeos que se ligam a uma sequência de RNA codificada por uma sequência de DNA selecionada de SEQ ID NOs: 154-498. Em algumas modali- dades, um ou mais genes-alvo endógenos são selecionados dentre Cblb, Ppp2r2d, Nrp1, Havcr2, Lag3, Tigit, Ctla4, Ptpn6, Pdcd1, e BCOR e em que a molécula siRNA ou shRNA compreende cerca de 19-30 nucleotídeos que se ligam a uma sequência de RNA codificada por uma sequência de DNA selecionada de SEQ ID NOs: 499-813.
[0080] Em algumas modalidades, o sistema de regulação de ge- nes compreende um siRNA ou uma molécula de ácido nucleico shRNA e é capaz de reduzir a expressão de um ou mais genes-alvo endóge- nos, em que um ou mais genes-alvo endógenos são selecionados dentre BCL2L11, FLI1, CALM2, DHODH, UMPS, RBM39, SEMA7A, CHIC2, PCBP1, PBRM1, WDR6, E2F8, SERPINA3, e GNAS e em que a molécula de siRNA ou shRNA compreende cerca de 19-30 nu- cleotídeos que se ligam a uma sequência de RNA codificada por uma sequência de DNA definida por um conjunto de coordenadas do ge- noma mostradas na Tabela 6A e na Tabela 6B. Em algumas modali- dades, a molécula de siRNA ou shRNA compreende cerca de 19-30 nucleotídeos que se ligam a uma sequência de RNA codificada por uma sequência de DNA selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 814-1064.
[0081] Em algumas modalidades, o sistema de regulação de ge- nes compreende um siRNA ou uma molécula de ácido nucleico shRNA e é capaz de reduzir a expressão de um ou mais genes-alvo endóge- nos, em que um ou mais genes-alvo endógenos são selecionados de PTPN1, PTPN2, PTPN22, SH2B3, SH2D1A, PIK3CD e EGR2 e em que a molécula de siRNA ou shRNA compreende cerca de 19-30 nu- cleotídeos que se ligam a uma sequência de RNA codificada por uma sequência de DNA definida por um conjunto de coordenadas de ge- noma mostradas na Tabela 6C e Tabela 6D. Em algumas modalida- des, o siRNA ou molécula de shRNA compreende cerca de 19-30 nu- cleotídeos que se ligam a uma sequência de RNA codificada por uma sequência de DNA selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 1065-1329. Em algumas modalidades, o siRNA ou molécula de shRNA compreende cerca de 19-30 nucleotídeos que se ligam a uma sequência de RNA codificada por uma sequência de DNA seleci- onada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs:1112-1227.
[0082] Em algumas modalidades, o sistema de regulação de ge- nes compreende um siRNA ou uma molécula de ácido nucleico shRNA e é capaz de reduzir a expressão de um ou mais genes-alvo endóge- nos, em que um ou mais genes-alvo endógenos é PELI1 e em que a molécula de siRNA ou shRNA compreende cerca de 19-30 nucleotí- deos que se ligam a uma sequência de RNA codificada por uma se- quência de DNA definida por um conjunto de coordenadas do genoma mostradas na Tabela 6E e na Tabela 6F. Em algumas modalidades, o siRNA ou molécula de shRNA compreende cerca de 19-30 nucleotí- deos que se ligam a uma sequência de RNA codificada por uma se- quência de DNA selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 1330-1350.
[0083] Em algumas modalidades, o sistema de regulação de ge- nes compreende um siRNA ou uma molécula de ácido nucleico shRNA e é capaz de reduzir a expressão de um ou mais genes-alvo endóge- nos, em que um ou mais genes-alvo endógenos é SETD5 e em que a molécula de siRNA ou shRNA compreende cerca de 19-30 nucleotí- deos que se ligam a uma sequência de RNA codificada por uma se- quência de DNA definida por um conjunto de coordenadas do genoma mostradas na Tabela 6G e na Tabela 6H. Em algumas modalidades, o siRNA ou molécula de shRNA compreende cerca de 19-30 nucleotí- deos que se ligam a uma sequência de RNA codificada por uma se- quência de DNA selecionada a partir de SEQ ID NOs: 1351-1367.
[0084] Em algumas modalidades, a presente descrição fornece um sistema de regulação de genes capaz de reduzir a expressão e/ou função de dois ou mais genes-alvo endógenos em uma célula, em que pelo menos um dos genes-alvo endógenos é selecionado dentre: (a) o grupo que consiste em BCL2L11, FLI1, CALM2, DHODH, UMPS, RBM39, SEMA7A, CHIC2, PCBP1, PBRM1, WDR6, E2F8, SERPINA3, e GNAS; (b) o grupo que consiste em PTPN1, PTPN2, PTPN22,
SH2B3, SH2D1A, PIK3CD, e EGR2; (c) PELI1; ou (d) SETD5, e em que pelo menos um ou mais genes-alvo endógenos é selecionado dentre: (e) o grupo que consiste em Ikzf1, Ikzf3, GATA3, Bcl3, Tnip1, Tnfaip3, NFKBIA, SMAD2, Tgfbr1, Tgfbr2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6, e IKZF2; ou (f) o grupo que consiste em Cblb, Ppp2r2d, Nrp1, Havcr2, Lag3, Tigit, Ctla4, Ptpn6, Pdcd1, e BCOR, em que o sistema compreende (i) uma molécula de ácido nucleico; (ii) uma enzimática; ou (iii) uma molécula de ácido nucleico guia e uma proteína enzimática
[0085] Em algumas modalidades, a presente descrição fornece um sistema de regulação de genes em que o sistema compreende uma pluralidade de moléculas de ácido nucleico de RNA guia (gRNA) e uma endonuclease de Cas e é capaz de reduzir a expressão e/ou fun- ção de dois ou mais genes-alvo endógenos.
[0086] Em algumas modalidades, a presente descrição fornece um sistema de regulação de genes, em que o sistema compreende uma pluralidade de moléculas de ácido nucleico de RNA guia (gRNA) e uma endonuclease de Cas e é capaz de reduzir a expressão e/ou fun- ção de dois ou mais genes-alvo endógenos, em que pelo menos um dos genes-alvo endógenos é selecionado do grupo que consiste em BCL2L11, FLI1, CALM2, DHODH, UMPS, RBM39, SEMA7A, CHIC2, PCBP1, PBRM1, WDR6, E2F8, SERPINA3 e GNAS e pelo menos um dos genes-alvo endógenos é selecionado dentre o grupo que consiste em Ikzf1, Ikzf3, GATA3, Bcl3, Tnip1, Tnfaip3, NFKBIA, SMAD2, Tgfbr1, Tgfbr2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6, IKZF2, Cblb, Ppp2r2d, Nrp1, Havcr2, Lag3, Tigit, Ctla4, Ptpn6, Pdcd1, e BCOR. Em algumas modalidades, pelo menos um dentre a pluralidade de gRNAs se liga a uma sequência de DNA alvo definida por um conjunto de coordenadas genômicas mostradas na Tabela 6A e Tabela 6B, e em que pelo me- nos uma dentre a pluralidade de gRNAs se liga a uma sequência de DNA alvo definida por um conjunto de coordenadas genômicas mos-
tradas na Tabela 5A e na Tabela 5B. Em algumas modalidades, pelo menos uma dentre a pluralidade de moléculas de gRNA compreende uma sequência de domínio de direcionamento que se liga a uma se- quência de DNA alvo selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 814-1064 e pelo menos uma da pluralidade de molécu- las de gRNA compreende uma sequência de domínio de direciona- mento que se liga a uma sequência de DNA alvo selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 154-498 ou SEQ ID NOs: 499-
813. Em algumas modalidades, pelo menos uma dentre a pluralidade de moléculas de gRNA compreende uma sequência de domínio de direcionamento codificada por uma sequência de ácido nucleico sele- cionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 814-1064 e em que pelo menos uma dentre a pluralidade de moléculas de gRNA compre- ende uma sequência de domínio de direcionamento codificada por uma sequência de ácido nucleico selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 154-498 ou SEQ ID NOs: 499-813.
[0087] Em algumas modalidades, a presente descrição fornece sistema de regulação de genes em que o sistema compreende uma pluralidade de moléculas de ácido nucleico de RNA guia (gRNA) e uma endonuclease de Cas e é capaz de reduzir a expressão e/ou fun- ção de dois ou mais genes-alvo endógenos, em que pelo menos um dos genes-alvo endógenos é selecionado do grupo que consiste em PTPN1, PTPN2, PTPN22, SH2B3, SH2D1A, PIK3CD, e EGR2 e pelo menos um dos genes-alvo endógenos é selecionado do grupo que consiste em Ikzf1, Ikzf3, GATA3, Bcl3, Tnip1, Tnfaip3, NFKBIA, SMAD2, Tgfbr1, Tgfbr2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6, IKZF2, Cblb, Ppp2r2d, Nrp1, Havcr2, Lag3, Tigit, Ctla4, Ptpn6, Pdcd1, e BCOR. Em algumas modalidades, pelo menos uma dentre a pluralidade de gRNAs se liga a uma sequência de DNA alvo definida por um conjunto de coordenadas genômicas mostradas na Tabela 6C e Tabela 6D, e em que pelo menos uma dentre a pluralidade de gRNAs se liga a uma sequência de DNA alvo definida por um conjunto de coordenadas ge- nômicas mostradas na Tabela 5A e na Tabela 5B.
Em algumas moda- lidades, pelo menos uma dentre a pluralidade de moléculas de gRNA compreende uma sequência de domínio de direcionamento que se liga a uma sequência de DNA alvo selecionada a partir do grupo que con- siste em SEQ ID NOs: 1065-1329 e em que pelo menos uma dentre a pluralidade de moléculas de gRNA compreende uma sequência de domínio de direcionamento que se liga a uma sequência de DNA alvo selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 154-498 ou SEQ ID NOs: 499-813. Em algumas modalidades, pelo menos uma dentre a pluralidade de moléculas de gRNA compreende uma sequên- cia de domínio de direcionamento que se liga a uma sequência de DNA alvo selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 1112-1227 e pelo menos uma dentre a pluralidade de moléculas de gRNA compreende uma sequência de domínio de direcionamento que se liga a uma sequência de DNA alvo selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 499-524. Em algumas modalidades, pelo menos uma dentre a pluralidade de moléculas de gRNA compre- ende uma sequência de domínio de direcionamento codificada por uma sequência de ácido nucleico selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 1065-1329 e em que pelo menos uma dentre a plu- ralidade de moléculas de gRNA compreende uma sequência de domí- nio de direcionamento codificada por uma sequência de ácido nucleico selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 154-498 ou SEQ ID NOs: 499-813. Em algumas modalidades, pelo menos uma dentre a pluralidade de moléculas de gRNA compreende uma sequência de domínio de direcionamento codificada por uma sequência de ácido nu- cleico selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 1112-1227 e pelo menos uma dentre a pluralidade de moléculas de gRNA compreende uma sequência de domínio de direcionamento co- dificada por uma sequência de ácido nucleico selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 499-524.
[0088] Em algumas modalidades, a presente descrição fornece sistema de regulação de genes em que o sistema compreende uma pluralidade de moléculas de ácido nucleico de RNA guia (gRNA) e uma endonuclease de Cas e é capaz de reduzir a expressão e/ou fun- ção de dois ou mais genes-alvo endógenos, em que pelo menos um dos genes-alvo endógenos é selecionado do grupo que consiste em PELI1 e pelo menos um dentre os genes-alvo endógenos é seleciona- do a partir do grupo que consiste em Ikzf1, Ikzf3, GATA3, Bcl3, Tnip1, Tnfaip3, NFKBIA, SMAD2, Tgfbr1, Tgfbr2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6, IKZF2, Cblb, Ppp2r2d, Nrp1, Havcr2, Lag3, Tigit, Ctla4, Ptpn6, Pdcd1, e BCOR. Em algumas modalidades, pelo menos uma dentre a pluralidade de gRNAs se liga a uma sequência de DNA alvo definida por um conjunto de coordenadas genômicas mostradas na Tabela 6E e Tabela 6F, e em que pelo menos uma dentre a pluralidade de gRNAs se liga a uma sequência de DNA alvo definida por um conjunto de coordenadas genômicas mostradas na Tabela 5A e na Tabela 5B. Em algumas modalidades, pelo menos uma dentre a pluralidade de moléculas de gRNA compreende uma sequência de domínio de direci- onamento que se liga a uma sequência de DNA alvo selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 1330-1350 e em que pelo menos uma dentre a pluralidade de moléculas de gRNA compre- ende uma sequência de domínio de direcionamento que se liga a uma sequência de DNA alvo selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 154-498 ou SEQ ID NOs: 499-813. Em algumas modali- dades, pelo menos uma dentre a pluralidade de moléculas de gRNA compreende uma sequência de domínio de direcionamento que se liga a uma sequência de DNA alvo selecionada a partir do grupo que con-
siste nas SEQ ID NOs: 1351-1367 e em que pelo menos uma dentre a pluralidade de moléculas de gRNA compreende uma sequência de domínio de direcionamento que se liga a uma sequência de DNA alvo selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 499-524. Em algumas modalidades, pelo menos uma dentre a pluralidade de moléculas de gRNA compreende uma sequência de domínio de direci- onamento codificada por uma sequência de ácido nucleico seleciona- da do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 1330-1350 e em que pelo menos uma dentre a pluralidade de moléculas de gRNA compreende uma sequência de domínio de direcionamento codificada por uma se- quência de ácido nucleico selecionada das SEQ ID NOs: 154-498 ou SEQ ID NOs: 499-813. Em algumas modalidades, pelo menos uma dentre a pluralidade de moléculas de gRNA compreende uma sequên- cia de domínio de direcionamento codificada por uma sequência de ácido nucleico selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 1351-1367 e em que pelo menos uma dentre a pluralidade de moléculas de gRNA compreende uma sequência de domínio de direci- onamento codificada por uma sequência de ácido nucleico seleciona- da do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 499-524.
[0089] Em algumas modalidades, a presente descrição fornece um sistema de regulação de genes em que o sistema compreende uma pluralidade de moléculas de ácido nucleico de RNA guia (gRNA) e uma endonuclease de Cas e é capaz de reduzir a expressão e/ou fun- ção de dois ou mais genes-alvo endógenos, em que pelo menos um dos genes-alvo endógenos é selecionado do grupo que consiste em SETD5 e pelo menos um dentre os genes-alvo endógenos é selecio- nado a partir do grupo que consiste em Ikzf1, Ikzf3, GATA3, Bcl3, Tnip1, Tnfaip3, NFKBIA, SMAD2, Tgfbr1, Tgfbr2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6, IKZF2, Cblb, Ppp2r2d, Nrp1, Havcr2, Lag3, Tigit, Ctla4, Ptpn6, Pdcd1, e BCOR. Em algumas modalidades, pelo menos uma dentre a pluralidade de gRNAs se liga a uma sequência de DNA alvo definida por um conjunto de coordenadas genômicas mostradas na Tabela 6G e Tabela 6H, e em que pelo menos uma dentre a plura- lidade de gRNAs se liga a uma sequência de DNA alvo definida por um conjunto de coordenadas genômicas mostradas na Tabela 5A e na Tabela 5B. Em algumas modalidades, pelo menos uma dentre a plura- lidade de moléculas de gRNA compreende uma sequência de domínio de direcionamento que se liga a uma sequência de DNA alvo selecio- nada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 1351-1367 e em que pelo menos uma dentre a pluralidade de moléculas de gRNA compreende uma sequência de domínio de direcionamento que se liga a uma sequência de DNA alvo selecionada a partir do grupo que con- siste nas SEQ ID NOs: 154-498 ou SEQ ID NOs: 499-813.
[0090] O sistema de regulação de genes da reivindicação 219 ou reinvindicação 220, em que pelo menos uma dentre a pluralidade de moléculas de gRNA compreende uma sequência de domínio de direci- onamento que se liga a uma sequência de DNA alvo selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 1351-1367 e em que pelo menos uma dentre a pluralidade de moléculas de gRNA compre- ende uma sequência de domínio de direcionamento que se liga a uma sequência de DNA alvo selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 499-524. Em algumas modalidades, pelo menos uma dentre a pluralidade de moléculas de gRNA compreende uma sequên- cia de domínio de direcionamento codificada por uma sequência de ácido nucleico selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 1351-1367 e em que pelo menos uma dentre a pluralidade de molécu- las de gRNA compreende uma sequência de domínio de direciona- mento codificada por uma sequência de ácido nucleico selecionada das SEQ ID NOs: 154-498 ou SEQ ID NOs: 499-813. Em algumas modalidades, pelo menos uma dentre a pluralidade de moléculas de gRNA compreende uma sequência de domínio de direcionamento co- dificada por uma sequência de ácido nucleico selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 1351-1367 e em que pelo menos uma dentre a pluralidade de moléculas de gRNA compreende uma se- quência de domínio de direcionamento codificada por uma sequência de ácido nucleico selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 499-524.
[0091] Em algumas modalidades, a célula efetora imune modifica- da compreende uma proteína Cas, em que a proteína Cas é: (a) uma proteína Cas do tipo selvagem compreendendo dois domínios enzima- ticamente ativos e capaz de induzir quebras de DNA de cadeia dupla; (b) a mutante de Nickase de Cas é um mutante de Nickase de Cas compreendendo um domínio enzimaticamente ativo e capaz de induzir quebras de DNA de fita simples; ou (c) a proteína Cas é uma proteína Cas desativada (dCas) e está associada a uma proteína heteróloga capaz de modular a expressão dentre um ou mais genes-alvo endóge- nos. Em algumas modalidades, a proteína heteróloga é selecionada a partir do grupo que consiste no domínio de proteína que interage com MAX 1 (MXI1), domínio de caixa associada a Krüppel (KRAB) e quatro domínios mSin3 concatenados (SID4X). Em algumas modalidades, a proteína Cas é uma proteína Cas9.
[0092] Em algumas modalidades, a presente descrição fornece uma célula efetora imune modificada compreendendo uma pluralidade de shRNA ou molécula de siRNA em que o sistema compreende uma pluralidade de moléculas de siRNA ou shRNA e é capaz de reduzir a expressão e/ou função de dois ou mais genes-alvo endógenos.
[0093] Em algumas modalidades, a presente descrição fornece uma célula efetora imune modificada compreendendo um sistema de regulação de genes, em que o sistema de regulação de genes com- preende uma pluralidade de moléculas de siRNA ou shRNA e é capaz de reduzir a expressão e/ou função de dois ou mais genes-alvo endó- genos, em que pelo menos um dos genes-alvo endógenos é selecio- nado do grupo que consiste em BCL2L11, FLI1, CALM2, DHODH, UMPS, RBM39, SEMA7A, CHIC2, PCBP1, PBRM1, WDR6, E2F8, SERPINA3 e GNAS e pelo menos um dos genes-alvo endógenos é selecionado a partir do grupo que consiste em Ikzf1, Ikzf3, GATA3, Bcl3, Tnip1, Tnfaip3, NFKBIA, SMAD2, Tgfbr1, Tgfbr2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6, IKZF2, Cblb, Ppp2r2d, Nrp1, Havcr2, Lag3, Tigit, Ctla4, Ptpn6, Pdcd1, e BCOR. Em algumas modalidades, pelo menos uma dentre a pluralidade de moléculas de siRNA ou shRNA compre- ende cerca de 19-30 nucleotídeos que se ligam a uma sequência de RNA codificada por uma sequência de DNA definida por um conjunto de coordenadas de genoma mostradas na Tabela 6A e na Tabela 6B e pelo menos uma da pluralidade de moléculas de siRNA ou shRNA compreende cerca de 19-30 nucleotídeos que se ligam a uma sequên- cia de RNA codificada por uma sequência de DNA definida por um conjunto de coordenadas de genoma mostradas na Tabela 5A e na Tabela 5B. Em algumas modalidades, pelo menos uma dentre a plura- lidade de moléculas de siRNA ou shRNA compreende cerca de 19-30 nucleotídeos que se ligam a uma sequência de RNA codificada por uma sequência de DNA selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 814-1064 e em que pelo menos um dentre a pluralidade de moléculas de siRNA ou shRNA compreende cerca de 19-30 nucleotí- deos que se ligam a uma sequência de RNA codificada por uma se- quência de DNA selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 154-498 ou SEQ ID NOs: 499-813.
[0094] Em algumas modalidades, a presente descrição fornece sistema de regulação de genes em que o sistema compreende uma pluralidade de moléculas de shRNA ou siRNA e é capaz de reduzir a expressão e/ou função de dois ou mais genes-alvo endógenos, em que pelo menos um dos genes-alvo endógenos é selecionado do gru- po que consiste em PTPN1, PTPN2, PTPN22, SH2B3, SH2D1A, PIK3CD, e EGR2 e pelo menos um dos genes-alvo endógenos é sele- cionado do grupo que consiste em Ikzf1, Ikzf3, GATA3, Bcl3, Tnip1, Tnfaip3, NFKBIA, SMAD2, Tgfbr1, Tgfbr2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6, IKZF2, Cblb, Ppp2r2d, Nrp1, Havcr2, Lag3, Tigit, Ctla4, Ptpn6, Pdcd1, e BCOR.
Em algumas modalidades, pelo menos uma dentre a pluralidade de moléculas de siRNA ou shRNA compreende cerca de 19-30 nucleotídeos que se ligam a uma sequência de RNA codificada por uma sequência de DNA definida por um conjunto de coordenadas de genoma mostradas na Tabela 6C e na Tabela 6D e pelo menos um dentre a pluralidade de moléculas de siRNA ou shRNA compreende cerca de 19-30 nucleotídeos que se ligam a uma sequência de RNA codificada por uma sequência de DNA definida por um conjunto de co- ordenadas de genoma mostradas na Tabela 5A e na Tabela 5B.
Em algumas modalidades, pelo menos uma dentre a pluralidade de molé- culas de siRNA ou shRNA compreende cerca de 19-30 nucleotídeos que se ligam a uma sequência de RNA codificada por uma sequência de DNA selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 1065- 1329 e pelo menos uma dentre a pluralidade de moléculas de siRNA ou shRNA compreende cerca de 19-30 nucleotídeos que se ligam a uma sequência de RNA codificada por uma sequência de DNA seleci- onada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 154-498 ou SEQ ID NOs: 499-813. Em algumas modalidades, pelo menos uma dentre a pluralidade de moléculas de siRNA ou shRNA compreende cerca de 19-30 nucleotídeos que se ligam a uma sequência de RNA codificada por uma sequência de DNA selecionada do grupo que con- siste nas SEQ ID NOs: 1112-1227 e pelo menos uma dentre a plurali- dade de moléculas de siRNA ou shRNA compreende cerca de 19-30 nucleotídeos que se ligam a uma sequência de RNA codificada por uma sequência de DNA selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 499-524.
[0095] Em algumas modalidades, a presente descrição fornece um sistema de regulação de genes em que o sistema compreende uma pluralidade de moléculas de shRNA ou siRNA e é capaz de reduzir a expressão e/ou função de dois ou mais genes-alvo endógenos, em que pelo menos um dos genes-alvo endógenos é PELI1 e pelo menos um dentre os genes-alvo endógenos é selecionado a partir do grupo que consiste emIkzf1, Ikzf3, GATA3, Bcl3, Tnip1, Tnfaip3, NFKBIA, SMAD2, Tgfbr1, Tgfbr2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6, IKZF2, Cblb, Ppp2r2d, Nrp1, Havcr2, Lag3, Tigit, Ctla4, Ptpn6, Pdcd1, e BCOR. Em algumas modalidades, pelo menos uma dentre a pluralidade de molé- culas de siRNA ou shRNA compreende cerca de 19-30 nucleotídeos que se ligam a uma sequência de RNA codificada por uma sequência de DNA definida por um conjunto de coordenadas de genoma mostra- das na Tabela 6E e na Tabela 6F e pelo menos uma dentre a plurali- dade de moléculas de siRNA ou shRNA compreende cerca de 19-30 nucleotídeos que se ligam a uma sequência de RNA codificada por uma sequência de DNA definida por um conjunto de coordenadas de genoma mostradas na Tabela 5A e na Tabela 5B. Em algumas moda- lidades, pelo menos uma dentre a pluralidade de moléculas de siRNA ou shRNA compreende cerca de 19-30 nucleotídeos que se ligam a uma sequência de RNA codificada por uma sequência de DNA seleci- onada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 1330-1350 e pelo menos uma dentre a pluralidade de moléculas de siRNA ou shR- NA compreende cerca de 19-30 nucleotídeos que se ligam a uma se- quência de RNA codificada por uma sequência de DNA selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 154-498 ou SEQ ID NOs: 499-813. Em algumas modalidades, pelo menos uma dentre a pluralidade de moléculas de siRNA ou shRNA compreende cerca de
19-30 nucleotídeos que se ligam a uma sequência de RNA codificada por uma sequência de DNA selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 1351-1367 e pelo menos uma dentre a pluralidade de moléculas de siRNA ou shRNA compreende cerca de 19-30 nucleotí- deos que se ligam a uma sequência de RNA codificada por uma se- quência de DNA selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 499-524.
[0096] Em algumas modalidades, a presente descrição fornece sistema de regulação de genes, em que o sistema de regulação de genes compreende uma pluralidade de moléculas de shRNA ou siRNA e é capaz de reduzir a expressão e/ou função de dois ou mais genes- alvo endógenos, em que pelo menos um dos genes-alvo endógenos é SETD5 e pelo menos dentre os genes-alvo endógenos é selecionado a partir do grupo que consiste em Ikzf1, Ikzf3, GATA3, Bcl3, Tnip1, Tnfaip3, NFKBIA, SMAD2, Tgfbr1, Tgfbr2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6, IKZF2, Cblb, Ppp2r2d, Nrp1, Havcr2, Lag3, Tigit, Ctla4, Ptpn6, Pdcd1, e BCOR. Em algumas modalidades, pelo menos uma dentre a pluralidade de moléculas de siRNA ou shRNA compreende cerca de 19-30 nucleotídeos que se ligam a uma sequência de RNA codificada por uma sequência de DNA definida por um conjunto de coordenadas de genoma mostradas na Tabela 6G e na Tabela 6H e pelo menos uma dentre a pluralidade de moléculas de siRNA ou shRNA compre- ende cerca de 19-30 nucleotídeos que se ligam a uma sequência de RNA codificada por uma sequência de DNA definida por um conjunto de coordenadas de genoma mostradas na Tabela 5A e na Tabela 5B. Em algumas modalidades, pelo menos uma dentre a pluralidade de moléculas de siRNA ou shRNA compreende cerca de 19-30 nucleotí- deos que se ligam a uma sequência de RNA codificada por uma se- quência de DNA selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 1351-1367 e pelo menos uma dentre a pluralidade de moléculas de siRNA ou shRNA compreende cerca de 19-30 nucleotídeos que se li- gam a uma sequência de RNA codificada por uma sequência de DNA selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 154-498 ou SEQ ID NOs: 499-813. Em algumas modalidades, pelo menos uma dentre a pluralidade de moléculas de siRNA ou shRNA compreende cerca de 19-30 nucleotídeos que se ligam a uma sequência de RNA codificada por uma sequência de DNA selecionada do grupo que con- siste nas SEQ ID NOs: 1351-1367 e pelo menos uma dentre a plurali- dade de moléculas de siRNA ou shRNA compreende cerca de 19-30 nucleotídeos que se ligam a uma sequência de RNA codificada por uma sequência de DNA selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 499-524.
[0097] Em algumas modalidades, em que o sistema de regulação de genes compreende uma proteína compreendendo um domínio de ligação ao DNA e um domínio enzimático e é selecionado a partir de uma nuclease de dedo de zinco e uma nuclease efetora do tipo ativa- dor de transcrição (TALEN).
[0098] Em algumas modalidades, a presente descrição fornece um sistema de regulação de genes compreendendo um vetor que codifica um ou mais gRNAs e um vetor que codifica uma proteína de endonu- clease de Cas, em que um ou mais gRNAs compreendem uma se- quência de domínio de direcionamento codificada por uma sequência de ácido nucleico selecionada dentre: SEQ ID NOs: 814-1064, SEQ ID NOs: 1065-1329, SEQ ID NOs: 1330-1350, SEQ ID NOs: 1351-1367, SEQ ID NOs: 154-498 ou SEQ ID NOs: 499-813.
[0099] Em algumas modalidades, a presente descrição fornece um sistema de regulação de genes compreendendo um vetor que codifica uma pluralidade de gRNAs e um vetor que codifica uma proteína de endonuclease de Cas, em que pelo menos uma dentre a pluralidade de gRNA compreende uma sequência de domínio de direcionamento codificada por uma sequência de ácido nucleico selecionado a partir de: SEQ ID NOs: 814-1064, SEQ ID NOs: 1065-1329, SEQ ID NOs: 1330-1350 ou SEQ ID NOs: 1351-1367 e em que pelo menos uma dentre a pluralidade de gRNA compreende um domínio de direciona- mento sequência codificada por uma sequência de ácido nucleico se- lecionada de: SEQ ID NOs: 154-498 ou SEQ ID NOs: 499-813.
[00100] Em algumas modalidades, a presente descrição fornece um sistema de regulação de genes compreendendo um vetor que codifica um ou mais gRNAs e uma molécula de mRNA que codifica uma prote- ína de endonuclease de Cas, em que um ou mais gRNAs compreen- dem uma sequência de domínio de direcionamento codificada por uma sequência de ácido nucleico selecionada dentre: SEQ ID NOs: 814- 1064, SEQ ID NOs: 1065-1329, SEQ ID NOs: 1330-1350, SEQ ID NOs: 1351-1367, SEQ ID NOs: 154-498, ou SEQ ID NOs: 499-813.
[00101] Em algumas modalidades, a presente descrição fornece um sistema de regulação de genes compreendendo um vetor que codifica uma pluralidade de gRNAs e uma molécula de mRNA que codifica uma proteína de endonuclease de Cas, em que pelo menos uma den- tre a pluralidade de gRNA compreende uma sequência de domínio de direcionamento codificada por uma sequência de ácido nucleico sele- cionado a partir de: SEQ ID NOs: 814-1064, SEQ ID NOs: 1065-1329, SEQ ID NOs: 1330-1350 ou SEQ ID NOs: 1351-1367 e em que pelo menos uma dentre a pluralidade de gRNA compreende uma sequência de domínio de direcionamento codificada por uma sequência de ácido nucleico selecionada de: SEQ ID NOs: 154-498 ou SEQ ID NOs: 499-
813.
[00102] Em algumas modalidades, a presente descrição fornece um sistema de regulação de genes compreendendo um ou mais gRNAs e uma proteína de endonuclease de Cas, em que um ou mais gRNAs compreendem uma sequência de domínio de direcionamento codifica-
da por uma sequência de ácido nucleico selecionada de: SEQ ID NOs: 814-1064, SEQ ID NOs: 1065-1329, SEQ ID NOs: 1330-1350, SEQ ID NOs: 1351-1367, SEQ ID NOs: 154-498, ou SEQ ID NOs: 499-813 e em que um ou mais gRNAs e a proteína endonuclease de Cas são complexadas para formar um complexo de ribonucleoproteína (RNP).
[00103] Em algumas modalidades, a presente descrição fornece um sistema de regulação de genes compreendendo uma pluralidade de gRNAs e uma proteína de endonuclease de Cas: em que pelo menos uma dentre a pluralidade de gRNA compreende uma sequência de domínio de direcionamento codificada por uma sequência de ácido nu- cleico selecionada de: SEQ ID NOs: 814-1064, SEQ ID NOs: 1065- 1329, SEQ ID NOs: 1330-1350 ou SEQ ID NOs: 1351-1367, em que pelo menos uma dentre a pluralidade de gRNA compreende uma se- quência de domínio de direcionamento codificada por uma sequência de ácido nucleico selecionado a partir de: SEQ ID NOs: 154-498 ou SEQ ID NOs: 499-813, e em que um ou mais gRNAs e a proteína da endonuclease de Cas são complexadas para formar um complexo de ribonucleoproteína (RNP).
[00104] Em algumas modalidades, a presente descrição fornece um kit que compreende um sistema de regulação de genes conforme des- crito neste documento.
[00105] Em algumas modalidades, a presente descrição fornece uma molécula de ácido nucleico de gRNA que compreende uma se- quência de ácido nucleico de domínio de direcionamento que se liga a uma sequência alvo em um gene-alvo endógeno selecionado a partir de: (a) o grupo que consiste em BCL2L11, FLI1, CALM2, DHODH, UMPS, RBM39, SEMA7A, CHIC2, PCBP1, PBRM1, WDR6, E2F8, SERPINA3, e GNAS; (b) o grupo que consiste em PTPN1, PTPN2, PTPN22, SH2B3, SH2D1A, PIK3CD, e EGR2; (c) PELI1; (d) SETD5;
(e) Ikzf1, Ikzf3, GATA3, Bcl3, Tnip1, Tnfaip3, NFKBIA, SMAD2, Tgfbr1, Tgfbr2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6, e IKZF2; ou (f) Cblb, Ppp2r2d, Nrp1, Havcr2, Lag3, Tigit, Ctla4, Ptpn6, Pdcd1, e BCOR.
Em algumas modalidades, (a) o gene endógeno é selecionado a partir do grupo que consiste em BCL2L11, FLI1, CALM2, DHODH, UMPS, RBM39, SE- MA7A, CHIC2, PCBP1, PBRM1, WDR6, E2F8, SERPINA3, e GNAS e o gRNA compreende uma sequência de domínio de direcionamento que se liga à sequência de DNA alvo localizado nas coordenadas ge- nômicas selecionadas a partir daquelas mostradas nas Tabelas 6A e 6B; (b) o gene endógeno é selecionado a partir do grupo que consiste em PTPN1, PTPN2, PTPN22, SH2B3, SH2D1A, PIK3CD, e EGR2 e o gRNA compreende uma sequência de domínio alvo que se liga à se- quência de DNA alvo localizado nas coordenadas genômica selecio- nadas a partir daquelas mostradas nas Tabela 6C e Tabela 6D; (c) o gene endógeno é PELI1 e o gRNA compreende uma sequência de domínio de direcionamento que se liga à sequência de DNA alvo loca- lizado nas coordenadas genômicas a partir daquelas mostradas na Tabela 6E e Tabela 6F; (d) o gene endógeno é SETD5 e o gRNA compreende uma sequência de domínio de direcionamento que se liga a uma sequência de DNA alvo localizada nas coordenadas genômicas selecionadas a partir daquelas mostradas na Tabela 6G e Tabela 6H; (e) o gene endógeno é selecionado a partir do grupo que consiste em Ikzf1, Ikzf3, GATA3, Bcl3, Tnip1, Tnfaip3, NFKBIA, SMAD2, Tgfbr1, Tgfbr2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6, e IKZF2 e o gRNA compreen- de uma sequência de domínio de direcionamento que se liga à se- quência de DNA alvo localizado nas coordenadas genômicas selecio- nadas a partir daquelas mostradas na Tabela 5A e Tabela 5B; ou (f) o gene endógeno é selecionado a partir do grupo que consiste em Cblb, Ppp2r2d, Nrp1, Havcr2, Lag3, Tigit, Ctla4, Ptpn6, Pdcd1, e BCOR e o gRNA compreende uma sequência de domínio de direcionamento que se liga a uma sequência de DNA alvo localizado nas coordenadas ge- nômicas selecionadas a partir daquelas mostradas na Tabela 5A e Ta- bela 5B.
[00106] Em algumas modalidades, o gRNA compreende uma se- quência de domínio de direcionamento que se liga a uma sequência de DNA alvo selecionada nas SEQ ID NOs: 814-1064, SEQ ID NOs: 1065-1329, SEQ ID NOs: 1330-1350, SEQ ID NOs: 1351-1367, SEQ ID NOs: 154-498, ou SEQ ID NOs: 499-813. Em algumas modalida- des, o gRNA compreende uma sequência de domínio de direciona- mento codificada por uma sequência selecionada nas SEQ ID NOs: 814-1064, SEQ ID NOs: 1065-1329, SEQ ID NOs: 1330-1350, SEQ ID NOs: 1351-1367, SEQ ID NOs: 154-498, ou SEQ ID NOs: 499-813.
[00107] Em algumas modalidades, a sequência alvo compreende uma sequência PAM. Em algumas modalidades, o gRNA é uma molé- cula de gRNA modular. Em algumas modalidades, o gRNA é uma mo- lécula de gRNA dual. Em algumas modalidades, o domínio de direcio- namento possui 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 ou mais nu- cleotídeos de comprimento. Em algumas modalidades, o gRNA com- preende uma modificação na extremidade 5' ou próximo a ela (por exemplo, dentro de 1-10, 1-5 ou 1-2 nucleotídeos da extremidade 5') e/ou uma modificação na extremidade 3' ou próximo a ela (por exem- plo, dentro de 1-10, 1-5 ou 1-2 nucleotídeos dessa extremidade 3'). Em algumas modalidades, o gRNA modificado exibe maior estabilidade em relação às nucleases quando introduzido em uma célula T. Em al- gumas modalidades, o gRNA modificado exibe uma resposta imune inata reduzida quando introduzida em uma célula T.
[00108] Em algumas modalidades, a presente descrição fornece uma molécula de polinucleotídeo que codifica uma molécula de gRNA descrita neste documento. Em algumas modalidades, a presente des- crição fornece uma composição compreendendo uma ou mais molécu-
las de gRNA descritas neste documento de polinucleotídeos que codi- ficam as mesmas. Em algumas modalidades, a presente descrição fornece um kit compreendendo uma molécula de gRNA descrita neste documento de polinucleotídeos que codificam a mesma.
[00109] Em algumas modalidades, a presente descrição fornece um método para produzir uma célula efetora imune modificada compreen- dendo: (a) obter uma célula efetora imune de um sujeito; (b) introduzir de um sistema de regulação de genes, descrito neste documento, na célula efetora imune; e (c) cultivar a célula efetora imune de modo que a expressão e/ou função de um ou mais genes-alvo endógenos seja reduzida em comparação com uma célula efetora imune que não foi modificada. Em algumas modalidades, a presente descrição fornece um método de produção de uma célula efetora imune modificada com- preendendo a introdução de um sistema de regulação de genes, des- crito neste documento, na célula efetora imune.
[00110] Em algumas modalidades, o método compreende adicio- nalmente a introdução de uma sequência polinucleotídica que codifica um receptor imune manipulado selecionado a partir de um CAR e um TCR. Em algumas modalidades, o sistema de regulação de genes e/ou o polinucleotídeo que codifica o receptor imune manipulado são introduzidos na célula efetora imune por transfecção, transdução, ele- troporação ou interrupção física da membrana celular por um dispositi- vo microfluídico. Em algumas modalidades, o sistema de regulação de genes é introduzido como uma sequência polinucleotídica que codifica um ou mais componentes do sistema, como uma proteína ou como um complexo de ribonucleoproteína (RNP).
[00111] Em algumas modalidades, a presente descrição fornece um método para produzir uma célula efetora imune modificada compreen- dendo: (a) expansão de uma população de células efetoras imunes em cultura; e (b) introdução de um sistema de regulação de genes, des-
crito neste documento, na população de células efetoras imunes. Em algumas modalidades, o método compreende adicionalmente obter a população de células efetoras imunes de um sujeito. Em algumas mo- dalidades, o sistema de regulação de genes é introduzido na popula- ção de células efetoras imunes antes, durante ou após a expansão. Em algumas modalidades, a expansão da população de células efeto- ras imunes compreende um primeiro ciclo de expansão e um segundo ciclo de expansão. Em algumas modalidades, o sistema de regulação de genes é introduzido na população de células efetoras imunes antes, durante ou após o primeiro ciclo de expansão. Em algumas modalida- des, o sistema de regulação de genes é introduzido na população de células efetoras imunes antes, durante ou após o segundo ciclo de ex- pansão. Em algumas modalidades, o sistema de regulação de genes é introduzido na população de células efetoras imunes antes do primeiro e segundo ciclo de expansão. Em algumas modalidades, o sistema de regulação de genes é introduzido na população de células efetoras imunes após uma primeira e um segundo ciclo de expansão. Em al- gumas modalidades, o sistema de regulação de genes é introduzido na população de células efetoras imunes após o primeiro ciclo de ex- pansão e antes do segundo ciclo de expansão.
[00112] Em algumas modalidades, a presente descrição fornece um método de tratamento de uma doença ou distúrbio em um sujeito em necessidade do mesmo, compreendendo a administração de uma quantidade eficaz de um efetor imunológico modificado conforme des- crito neste documento ou uma composição do mesmo. Em algumas modalidades, a doença ou distúrbio é um distúrbio proliferativo celular, um distúrbio inflamatório ou uma doença infecciosa. Em algumas mo- dalidades, a doença ou distúrbio é um câncer ou infecção viral. Em algumas modalidades, o câncer é selecionado a partir de uma leuce- mia, um linfoma ou um tumor sólido. Em algumas modalidades, o tu-
mor sólido é um melanoma, um tumor pancreático, um tumor da bexi- ga, um tumor ou metástase no pulmão, um câncer colorretal ou um câncer de cabeça e pescoço. Em algumas modalidades, o câncer é um câncer resistente a PD1 ou insensível. Em algumas modalidades, o sujeito foi tratado anteriormente com um inibidor de PD1 ou um inibi- dor de PDL1. Em algumas modalidades, o método compreende a ad- ministração ao sujeito de anticorpo ou fragmento de ligação do mesmo se liga e inibe especificamente a função da proteína codificada por NRP1, HAVCR2, LAG3, TIGIT, CTLA4, ou PDCD1. Em algumas mo- dalidades, as células efetoras imunes modificadas são autólogas ao sujeito. Em algumas modalidades, as células efetoras imunes modifi- cadas são alogênicas para o sujeito. Em algumas modalidades, o su- jeito não sofreu a linfodetecção antes da administração das células efetoras imunes modificadas ou composições das mesmas. Em algu- mas modalidades, o sujeito não recebe tratamento com alta dose de IL-2 com ou após a administração das células efetoras imunes modifi- cadas ou composições das mesmas. Em algumas modalidades, o su- jeito recebe tratamento com IL-2 em baixa dose com ou após a admi- nistração das células efetoras imunes modificadas ou composições das mesmas. Em algumas modalidades, o sujeito não recebe trata- mento com alta dose de IL-2 com ou após a administração das células efetoras imunes modificadas ou composições das mesmas.
[00113] Em algumas modalidades, a presente descrição fornece um método para matar uma célula cancerígena compreendendo a exposi- ção da célula cancerígena a uma célula efetora imune modificada des- crita neste documento ou uma composição da mesma. Em algumas modalidades, a exposição é in vitro, in vivo ou ex vivo.
[00114] Em algumas modalidades, a presente descrição fornece um método para aprimorar uma ou mais funções efetoras de uma célula efetora imune compreendendo a introdução de um sistema de regula-
ção de genes descrito neste documento na célula efetora imune. Em algumas modalidades, a presente descrição fornece um método para aprimorar uma ou mais funções efetoras de uma célula efetora imune, compreendendo a introdução de um sistema de regulação de genes descrito neste documento na célula efetora imune, em que a célula efetora imune modificada demonstra uma ou mais funções efetoras aprimoradas em comparação com a célula efetora imune que não foi modificada. Em algumas modalidades, uma ou mais funções efetoras são selecionadas a partir da proliferação celular, viabilidade celular, citotoxicidade, infiltração tumoral, aumento da produção de citocinas, respostas imune antitumorais e/ou resistência à exaustão. Breve Descrição das Figuras
[00115] A Figura 1A - Figura 1B ilustram combinações de genes- alvo endógenos que podem ser modificados pelos métodos descritos neste documento.
[00116] A Figura 2A - Figura 2B ilustram combinações de genes- alvo endógenos que podem ser modificados pelos métodos descritos neste documento.
[00117] A Figura 3A - Figura 3B ilustram combinações de genes- alvo endógenos que podem ser modificados pelos métodos descritos neste documento.
[00118] A Figura 4A - Figura 4D ilustra a edição dos genes TRAC e B2M usando métodos descritos neste documento.
[00119] A Figura 5A - Figura 5B ilustram dados de análise TIDE pa- ra edição de CBLB em células T humanas primárias.
[00120] A Figura 6 ilustra um Western blot para a proteína CBLB em células T humanas primárias editadas com um sgRNA de CBLB (D6551-CBLB) em comparação com controles não editados (D6551- WT).
[00121] A Figura 7A - A Figura 7E mostra o crescimento do tumor ao longo do tempo em um modelo de tumor singênico Ova/murino B16. A Figura 7A mostra o crescimento do tumor em camundongos tratados com células T OT1 editadas por CBLB em comparação com células T OT1 não editadas. A Figura 7B e a Figura 7C mostram o crescimento do tumor em camundongos tratados com células T OT1 editadas comPtpn2 em comparação com células T OT1 não editadas. A Figura 7D mostra o crescimento do tumor em camundongos tratados com células T OT1 editadas por Setd5em comparação com células T OT1 não editadas. A Figura 7E mostra o crescimento do tumor em camundongos tratados com células T OT1 editadas por Peli1 em com- paração com células T OT1 não editadas.
[00122] A Figura 8A - Figura 8B mostra o crescimento do tumor ao longo do tempo em um modelo de tumor singênico de murino PMEL/MC38. A Figura 8A mostra o crescimento do tumor ao longo do tempo em camundongos tratados com células T PMEL editadas por- Ptpn2 em comparação com células T PMEL não editadas. A Figura 8B mostra o crescimento do tumor em camundongos tratados com células T PMEL editadas por Peli1 em comparação com células T PMEL não editadas.
[00123] A Figura 9A - Figura 9B mostra o crescimento do tumor ao longo do tempo em um modelo de tumor singênico de óvulos Eg7 Ova de murino. A Figura 9A mostra o crescimento do tumor ao longo do tempo em camundongos tratados com células T PMEL editadas por- Peli1 em comparação com células T PMEL não editadas. A Figura 9B mostra o crescimento do tumor em camundongos tratados com células T PMEL editadas por Setd5 em comparação com células T não edita- das.
[00124] A Figura 10 mostra o crescimento do tumor ao longo do tempo em um modelo de xenoenxerto A375 de murino para camun- dongos tratados com células T específicas para NYESO editadas por
CBLB em comparação com células T específicas para NYESO não editadas.
[00125] A Figura 11 mostra o crescimento do tumor ao longo do tempo em camundongos tratados com BCOR editado, CBLB editada ou células T CAR anti-CD19 editado dual por BCOR/CBLB. O cresci- mento do tumor é comparado com camundongos tratados sem células T CAR ou células T anti-CD19 CAR não editadas.
[00126] A Figura 12 mostra o acúmulo de células T CD19 CAR edi- tadas por BCOR ou editadas por BCOR/CBLB num sistema de cultura in vitro.
[00127] A Figura 13 mostra a produção de IL-2 por células T CD19 CAR editadas por BCOR ou editadas por BCOR/CBLB em um sistema de cultura in vitro.
[00128] A Figura 14 mostra a produção de IFNγ por células T CD19 CAR editadas por BCOR ou editadas por BCOR/CBLB em um sistema de cultura in vitro.
[00129] A Figura 15 mostra o crescimento do tumor ao longo do tempo em camundongos tratados com células T OT1 edição dupla por Ptpn2OT1/Cblb em um modelo de tumor singênico/Ova B16 de muri- no.
[00130] A Figura 16 mostra a eficácia antitumoral de células T transgênicas de edição dupla por PD1/Lag3 em um modelo de tumor murino de Ova B16.
[00131] A Figura 17 mostra o aumento dos níveis de pSTAT1 nas células T Jurkat em resposta à estimulação por IFNγ após a derrubada genética de PTPN2.
[00132] A Figura 18 mostra o enriquecimento ou esgotamento de gRNAs em uma tela lado a lado de PTPN2.
[00133] A Figura 19 mostra o enriquecimento ou depleção de sgR- NAs em um ensaio fosfo-STAT5.
Descrição Detalhada
[00134] A presente descrição fornece métodos e composições rela- cionados à modificação de células efetoras imunes para aumentar sua eficácia terapêutica no contexto da imunoterapia. Em algumas modali- dades, as células efetoras imunes são modificadas pelos métodos da presente descrição para reduzir a expressão de um ou mais genes- alvo endógenos ou reduzir uma ou mais funções de uma proteína en- dógena, de modo que uma ou mais funções efetoras das células imu- nes sejam aprimoradas. Em algumas modalidades, as células efetoras imunes são adicionalmente modificadas pela introdução de transgenes que conferem especificidade ao antígeno, como a introdução de cons- trutos de expressão do receptor de células T (TCR) ou receptor de an- tígeno quimérico (CAR). Em algumas modalidades, a presente descri- ção fornece composições e métodos para modificar células efetoras imunes, como composições de sistemas de regulaçãoes de genes. Em algumas modalidades, a presente descrição fornece métodos de tra- tamento de um distúrbio proliferativo celular, como um câncer, com- preendendo a administração das células efetoras imunes modificadas descritas neste documento a um sujeito em necessidade. I. Definições
[00135] Conforme usado neste relatório descritivo e nas reivindica- ções anexas, as formas singulares "um", "uma" e "o(a)" incluem refe- rências plurais a menos que o contexto indique claramente de outra forma.
[00136] Conforme usado neste relatório descritivo, o termo "e/ou" é usado nesta descrição para significar "e" ou "ou", a menos que indica- do de outra forma.
[00137] Ao longo deste relatório descritivo, a menos que o contexto requeira o contrário, a palavra "compreender" ou variações, tais como "compreende" ou "compreendendo" será entendida como implicando na inclusão de um número inteiro de elementos relatado ou grupos de números inteiros de elementos, mas não a exclusão de qualquer outro número inteiro de elementos ou grupo de números inteiros de elemen- tos.
[00138] Conforme utilizado neste documento, os termos "cerca de" e "aproximadamente" são usados como equivalentes. Quaisquer nu- merais usados neste pedido com ou sem cerca de/aproximadamente destinam-se a abranger quaisquer flutuações normais apreciadas por alguém com habilidade comum na técnica relevante. Em determinadas modalidades, o termo "aproximadamente" ou "cerca de" refere-se a uma faixa de valores que se enquadram dentro de 25%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, ou menos em qualquer direção (maior ou menor que) do valor de referência indicado salvo indicação em contrário ou caso o contrário seja evidente no contexto (exceto em que tal número excede 100% de um valor possível).
[00139] "Diminuir" ou "reduzir" refere-se a uma diminuição ou redu- ção em um valor específico de pelo menos 5%, por exemplo, uma di- minuição de 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, ou 100% em comparação com um valor de referência. Uma di- minuição ou redução em um valor específico também pode ser repre- sentada como uma dobra de mudança no valor em comparação com um valor de referência, por exemplo, pelo menos 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 500, 1000 de vezes ou mais diminuem em comparação com um valor de referência.
[00140] "Aumento" refere-se a um aumento em um valor específico de pelo menos 5%, por exemplo, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%,
80%, 85%, 90%, 95%, 99%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% ou mais em comparação com um valor de referência. Um aumento em um va- lor específico também pode ser representado como uma dobra de mu- dança no valor comparado a um valor de referência, por exemplo, pelo menos 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 500, 1000 dobras ou mais, aumentam em comparação com o nível de um valor de referência.
[00141] Os termos "peptídeo", "polipeptídeo" e "proteína", são utili- zados neste documento alternadamente, e referem-se a uma forma polimérica de aminoácidos de qualquer comprimento, que pode incluir aminoácidos codificados e não codificados, aminoácidos quimicamen- te ou bioquimicamente modificados ou derivatizados, e polipeptídeos tendo estruturas principais de peptídeo modificadas.
[00142] Os termos "polinucleotídeo" e "ácido nucleico", usados neste documento de forma intercambiável, referem-se a uma forma polimérica de nucleotídeos de qualquer comprimento, sejam ribonu- cleotídeos ou desoxirribonucleotídeos. Assim, esse termo inclui, mas não se limita a, DNA ou RNA de fita simples, dupla ou múltiplas, DNA genômico, cDNA, híbridos de DNA-RNA ou um polímero compreen- dendo purina e bases de pirimidina ou outras bases nucleotídicas não naturais ou derivadas naturais ou quimicamente ou bioquimicamente modificadas. "Oligonucleotídeo" geralmente se refere a polinucleotí- deos entre cerca de 5 e cerca de 100 nucleotídeos de DNA de fita simples ou dupla. No entanto, para os fins desta descrição, não há li- mite superior para o comprimento de um oligonucleotídeo. Os oligonu- cleotídeos também são conhecidos como "oligômeros" ou "oligos" e podem ser isolados de genes ou sintetizados quimicamente por méto- dos conhecidos na técnica. Os termos "polinucleotídeo" e "ácido nu- cleico" devem ser entendidos como incluindo, conforme aplicável à modalidade sendo descrita, polinucleotídeos de fita simples (tais como sense ou antisense) e de fita dupla.
[00143] "Fragmento" refere-se a uma porção de uma molécula poli- peptídica ou polinucleotídica contendo menos do que toda a sequência polipeptídica ou polinucleotídica. Em algumas modalidades, um frag- mento de um polipeptídeo ou polinucleotídeo compreende pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de todo o comprimento do polipeptídeo ou polinucleotí- deo de referência. Em algumas modalidades, um polipeptídeo ou fra- gmento de polinucleotídeo pode conter 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000 ou mais nucleotídeos ou aminoácidos.
[00144] O termo "identidade de sequência" refere-se à porcentagem de bases ou aminoácidos entre duas sequências polinucleotídicas ou polipeptídicas que são iguais e na mesma posição relativa. Como tal, uma sequência polinucleotídica ou polipeptídica possui uma certa por- centagem de identidade de sequência em comparação com outra se- quência polinucleotídica ou polipeptídica. Para comparação de se- quências, tipicamente uma sequência atua como uma sequência de referência, com a qual as sequências de teste são comparadas. O termo "sequência de referência" refere-se a uma molécula à qual uma sequência de teste é comparada.
[00145] "Complementar" refere-se à capacidade de emparelhar, através do empilhamento de bases e ligação específica de hidrogênio, entre duas sequências que compreendem bases naturais ou não natu- rais ou análogos das mesmas. Por exemplo, se uma base em uma po- sição de um ácido nucleico é capaz de ligação de hidrogênio com uma base na posição correspem quente de um alvo, então as bases são consideradas complementares uma à outra nessa posição. Os ácidos nucléicos podem compreender bases universais ou espaçadores abá- sicos inertes que não fornecem contribuição positiva ou negativa para a ligação de hidrogênio. Os emparelhamentos de bases podem incluir tanto o emparelhamento de base Watson-Crick canônico quanto não- Watson-Crick (por exemplo, emparelhamento de base Wobble e em- parelhamento de base Hoogsteen). Entende-se que, para emparelha- mentos de bases complementares, bases do tipo de adenosina (A) são complementares às bases do tipo timidina (T) ou bases do tipo uracila (U), que as bases do tipo citosina (C) são complementares às bases do tipo guanosina (G), e que as bases universais, tais como, 3- nitropirrol ou 5-nitroindol podem hibridar e são consideradas comple- mentares a qualquer A, C, U, ou T. Nichols et al., Nature, 1994;369:492-493 e Loakes et al., Nucleic Acids Res., 1994;22:4039-
4043. A inosina (I) também foi considerada na técnica como uma base universal e é considerada complementar a qualquer A, C, U ou T. Ver Watkins e SantaLucia, Nucl. Acids Research, 2005; 33 (19): 6258-
6267.
[00146] Como referido neste documento, uma "sequência de ácido nucleico complementar" é uma sequência de ácido nucleico que com- preende uma sequência de nucleotídeos que permite a ligação não covalente a outro ácido nucleico de uma maneira antiparalela específi- ca de sequência (ou seja, um ácido nucleico especificamente liga-se a um ácido nucleico complementar) sob condições apropriadas in vitro e/ou in vivo de temperatura e resistência de solução iônica.
[00147] Os métodos de alinhamento de sequência para compara- ção e determinação da porcentagem de identidade de sequência e porcentagem de complementaridade são bem conhecidos na técnica. O alinhamento ideal de sequências para comparação pode ser condu- zido, por exemplo, pelo algoritmo de alinhamento de homologia de Needleman e Wunsch, (1970) J. Mol. Biol. 48:443, pela busca pelo método de similaridade de Pearson e Lipman (1988) Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85: 2444, por implementações computadorizadas desses al-
goritmos (GAP, BESTFIT, FASTA e TFASTA no Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madi- son, WI), por alinhamento manual e inspeção visual (consulte por exemplo, Brent et al., (2003) Current Protocols in Molecular Biology), pelo uso de algoritmos conhecidos na técnica, incluindo os algoritmos BLAST e BLAST 2.0, que são descritos em Altschul et al., (1977) Nuc. Acids Res. 25:3389-3402; e Altschul et al., (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410, respectivamente. O programa para a realização de aná- lises por BLAST está disponível publicamente através do Centro Naci- onal de Informações sobre Biotecnologia.
[00148] Aqui, o termo "hibridizar" refere-se ao emparelhamento en- tre bases nucleotídicas complementares (por exemplo, adenina (A) forma um par de bases com timina (T) em uma molécula de DNA e uracila (U) em uma molécula de RNA e guanina (G) forma um par de bases com citosina (C) nas moléculas de DNA e RNA) para formar uma molécula de ácido nucleico de fita dupla. (Ver, por exemplo, Wahl e Berger (1987) Methods Enzymol. 152: 399; Kimmel, (1987) Methods Enzymol. 152: 507). Além disso, também é conhecido na técnica que, para hibridação entre duas moléculas de RNA (por exemplo, dsRNA), pares de bases de guanina (G) com uracila (U). Por exemplo, o empa- relhamento de bases G/U é parcialmente responsável pela degeneres- cência (isto é, redundância) do código genético no contexto do empa- relhamento de bases anticódon de tRNA com códons no mRNA. No contexto desta descrição, uma guanina (G) de um segmento de liga- ção a proteínas (dsRNA duplex) de uma molécula de RNA guia é con- siderada complementar a um uracila (U) e vice-versa. Como tal, quan- do um par de bases G/U pode ser feito, em uma determinada posição nucleotídica, um segmento de ligação a proteínas (dsRNA duplex) de uma molécula de RNA guia, a posição não é considerada não com- plementar, mas é considerada seja complementar. É compreendido na técnica que a sequência do polinucleotídeos não precisa de ser 100% complementar a do seu ácido nucleico alvo para ser especificamente hibridizável. Além disso, um polinucleotídeo pode hibridar sobre um ou mais segmentos, de tal modo que os segmentos intervenientes ou ad- jacentes não estejam envolvidos no evento de hibridação (por exem- plo, uma estrutura de hairpin ou estrutura de loop). Um polinucleotí- deos pode compreender pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo me- nos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 99%, ou 100% de complemen- taridade de sequência com uma região alvo dentro da sequência de ácido nucleico alvo à qual eles são direcionados.
[00149] O termo "modificado" refere-se a uma substância ou com- posto (por exemplo, uma célula, uma sequência polinucleotídica e/ou uma sequência polipeptídica) que foi alterada ou alterou em compara- ção com a substância ou composto não modificado correspem quente.
[00150] O termo "ocorrência natural" tal como utilizado neste docu- mento aplicado a um ácido nucleico, um polipeptídeo, uma célula ou um organismo, refere-se a um ácido nucleico, polipeptídeo, célula ou organismo que é encontrado na natureza. Por exemplo, uma sequên- cia de polipeptídeo ou polinucleotídeo que está presente em um orga- nismo (incluindo vírus) que pode ser isolado de uma fonte na natureza e que não foi intencionalmente modificado pelo homem em laboratório ocorre naturalmente.
[00151] "Isolado" refere-se a um material que é livre em graus vari- ados de componentes que normalmente o acompanham como encon- trado em seu estado nativo.
[00152] Um "cassete de expressão" ou "construto de expressão" se refere a uma sequência de polinucleotídeos de DNA ligada de maneira funcional a um promotor. "Operacionalmente ligado" refere-se a uma justaposição em que os componentes funcionais assim descritos estão em uma relação que lhes permite funcionar da sua maneira pretendi-
da. Por exemplo, um promotor está operacionalmente conectado a uma sequência polinucleotídica se o promotor afeta a transcrição ou a expressão da sequência polinucleotídica.
[00153] O termo "vetor recombinante", conforme utilizado neste do- cumento, refere-se a uma molécula de polinucleotídeo capaz de trans- ferir ou transportar outro polinucleotídeo inserido no vetor. O polinucle- otídeo inserido pode ser um cassete de expressão. Em algumas mo- dalidades, um vetor recombinante pode ser um vetor viral ou um vetor não viral (por exemplo, um plasmídeo).
[00154] O termo "amostra" refere-se a uma composição biológica (por exemplo, uma célula ou uma porção de um tecido) que é subme- tida a análise e/ou modificação genética. Em algumas modalidades, uma amostra é uma "amostra primária", na medida em que é obtida diretamente de um sujeito; em algumas modalidades, uma "amostra" é o resultado do processamento de uma amostra primária, por exemplo, para remover certos componentes e/ou isolar ou purificar certos com- ponentes de interesse.
[00155] O termo "sujeito" inclui animais, como, por exemplo, mamí- feros. Em algumas modalidades, o mamífero é um primata. Em algu- mas modalidades, o mamífero é um humano. Em algumas modalida- des, os sujeitos são animais como gado, ovelhas, cabras, vacas, suí- nos e similares; ou animais domesticados, como cães e gatos. Em al- gumas modalidades (por exemplo, particularmente em contextos de pesquisa) os sujeitos são roedores (por exemplo, camundongos, ratos, hamsters), coelhos, primatas ou suínos, tais como porcos endocruza- dos e semelhantes. "Sujeito" e "paciente" são usados de forma inter- cambiável neste documento.
[00156] "Administração" se refere no presente documento a intro- duzir um agente ou composição num sujeito.
[00157] "Tratamento", conforme usado no presente documento, se refere a distribuir um agente ou composição a um sujeito para afetar um resultado fisiológico.
[00158] Conforme usado neste documento, o termo "quantidade eficaz" refere-se à quantidade mínima de um agente ou composição necessária para resultar em um efeito fisiológico específico. A quanti- dade eficaz de um agente específico pode ser representada de várias maneiras, com base na natureza do agente, como massa/volume, nú- mero de células/volume, partículas/volume (massa do agente)/(massa do sujeito), número de células/(massa do sujeito) ou partículas/(massa do sujeito). A quantidade eficaz de um determinado agente também pode ser expressa como a concentração eficaz semimáxima (EC50), que se refere à concentração de um agente que resulta na magnitude de uma resposta fisiológica específica que fica a meio caminho entre um nível de referência e um nível máximo de resposta.
[00159] "População" de células refere-se a qualquer número de cé- lulas maior que 1, mas é preferencialmente pelo menos 1x103 células, pelo menos 1x104 células, pelo menos 1x105 células, pelo menos 1x106 células, pelo menos 1x107 células, pelo menos 1x108 células, pelo menos 1x109 células, pelo menos 1x1010 células, pelo menos 1x1011 células ou mais células. Uma população de células pode se re- ferir a uma população in vitro (por exemplo, uma população de células em cultura) ou a uma população in vivo (por exemplo, uma população de células que residem em um tecido específico).
[00160] Métodos gerais em bioquímica molecular e celular podem ser encontrados em textos padrão, tais como Molecular Cloning: A La- boratory Manual, 3ª Ed. (Sambrook et al., HaRBor Laboratory Press 2001); Short Protocols in Molecular Biology, 4ª Ed. (Ausubel et al., eds., John Wiley et al. & Sons 1999); Protein Methods (Bollag et al., John Wiley & Sons 1996); Nonviral Vectors for Gene Therapy (Wagner et al. eds., Academic Press 1999); Viral Vectors (Kaplift & Loewy eds.,
Academic Press 1995); Immunology Methods Manual (I. Lefkovits ed., Academic Press 1997); e Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedu- res in Biotechnology (Doyle & Griffiths, John Wiley & Sons 1998), as divulgações das quais são incorporadas neste documento por referên- cia. II Células efetoras imunes modificadas
[00161] Em algumas modalidades, a presente descrição fornece métodos para a produção de células efetoras imunes modificadas. Neste documento, o termo "células efetoras imunes modificadas" abrange células efetoras imunes compreendendo uma ou mais modifi- cações genômicas, resultando na expressão e/ou função reduzida de um ou mais genes-alvo endógenos, bem como células efetoras imunes compreendendo um sistema de regulação de genes capaz de reduzir a expressão e/ou função de um ou mais genes-alvo endógenos. Neste documento, uma "célula efetora imune não modificada" ou "célula efe- tora imune de controle" refere-se a uma célula ou população de células em que os genomas não foram modificados e que não compreendem um sistema de regulação de genes ou compreendem um sistema de regulação de genes de controle (por exemplo, um controle vetorial va- zio, um gRNA não direcionado, um siRNA embaralhado etc.).
[00162] O termo "célula efetora imune" refere-se a células envolvi- das na montagem de respostas imunes inatas e adaptativas, incluindo, entre outros, linfócitos (como células T (incluindo timócitos) e células B), células exterminadoras naturais (NK), células NKT, macrófagos, monócitos, eosinófilos, basófilos, neutrófilos, células dendríticas e mastócitos. Em algumas modalidades, a célula efetora imune modifi- cada é uma célula T, como uma célula T CD4+, uma célula T CD8+ (também referida como célula T citotóxica ou CTL), uma célula T de regulaçãoa (Treg), uma célula Th1, uma célula Th2 ou uma célula Th17.
[00163] Em algumas modalidades, a célula efetora imune é uma célula T que foi isolada a partir de uma amostra de tumor (referida nes- te documento como "linfócitos infiltrantes de tumor" ou "TILs"). Sem desejar ser limitado pela teoria, acredita-se que os TILs aumentem a especificidade dos antígenos tumorais (Radvanyi et al., 2012 Clin Canc Res 18: 6758-6770) e, portanto, possam mediar a resposta imu- ne específica ao antígeno tumoral (por exemplo, ativação, proliferação e atividade citotóxica contra as células cancerígenas) levando à des- truição das células cancerígenas (Brudno et al., 2018 Nat Rev Clin Onc 15:31-46)) sem a introdução de um receptor manipulado exógeno. Portanto, em algumas modalidades, os TILs são isolados de um tumor em um sujeito, expandidos ex vivo e reinfundidos em um sujeito. Em algumas modalidades, os TILs são modificados para expressar um ou mais receptores exógenos específicos para um antígeno tumoral autó- logo, expandidos ex vivo e reinfundidos no sujeito. Tais modalidades podem ser modeladas usando modelos de camundongo in vivo em que os camundongos foram transplantados com uma linhagem de cé- lulas cancerígenas que expressam um antígeno do câncer (por exem- plo, CD19) e são tratados com células T modificadas que expressam um receptor exógeno que é específico para o antígeno do câncer (Ver, por exemplo, Exemplos 10 e 11).
[00164] Em algumas modalidades, a célula efetora imune é uma célula animal ou é derivada de uma célula animal, incluindo animais invertebrados e animais vertebrados (por exemplo, peixe, anfíbio, rép- til, pássaro ou mamífero). Em algumas modalidades, a célula efetora imune é uma célula de mamífero ou é derivada de uma célula de ma- mífero (por exemplo, um porco, uma vaca, uma cabra, uma ovelha, um roedor, um primata não humano, um humano, etc.). Em algumas mo- dalidades, a célula efetora imune é uma célula de roedor ou é derivada de uma célula de roedor (por exemplo, um rato ou um camundongo).
Em algumas modalidades, a célula efetora imune é uma célula huma- na ou é derivada de uma célula humana.
[00165] Em algumas modalidades, as células efetoras imunes modi- ficadas compreendem uma ou mais modificações (por exemplo, inser- ções, deleções ou mutações de um ou mais ácidos nucleicos) na se- quência de DNA genômico de um gene-alvo endógeno, resultando na expressão e/ou função reduzida do gene endógeno. Tais modificações são referidas neste documento como "mutações inativadoras" e os ge- nes endógenos que compreendem uma mutação inativadora são refe- ridos neste documento como "genes-alvo endógenos modificados". Em algumas modalidades, as mutações inativadoras reduzem ou inibem a transcrição do mRNA, reduzindo assim o nível de expressão do trans- crito e da proteína do mRNA codificado. Em algumas modalidades, as mutações inativadoras reduzem ou inibem a tradução de mRNA, redu- zindo assim o nível de expressão da proteína codificada. Em algumas modalidades, as mutações inativadoras codificam uma proteína endó- gena modificada com função reduzida ou alterada em comparação com a versão não modificada (isto é, do tipo selvagem) da proteína endógena (por exemplo, um mutante dominante negativo, descrito in- fra).
[00166] Em algumas modalidades, as células efetoras imunes modi- ficadas compreendem uma ou mais modificações genômicas em um local genômico que não seja um gene-alvo endógeno que resultam na expressão e/ou função reduzida do gene-alvo endógeno ou que resul- tam na expressão de uma versão modificada de uma proteína endó- gena. Por exemplo, em algumas modalidades, uma sequência polinu- cleotídica que codifica um sistema de regulação de genes é inserida em um ou mais locais no genoma, reduzindo assim a expressão e/ou função de um gene-alvo endógeno mediante a expressão do sistema de regulação de genes. Em algumas modalidades, uma sequência po-
linucleotídica que codifica uma versão modificada de uma proteína en- dógena é inserida em um ou mais locais no genoma, em que a função da versão modificada da proteína é reduzida em comparação com a versão não modificada ou do tipo selvagem da proteína (por exemplo, um mutante dominante negativo, descrito infra).
[00167] Em algumas modalidades, as células efetoras imunes modi- ficadas descritas neste documento compreendem um ou mais genes- alvo endógenos modificados, em que uma ou mais modificações resul- tam em uma expressão e/ou função reduzida de um produto gênico (ou seja, um transcrito de mRNA ou uma proteína) codificado pelo ge- ne-alvo endógeno comparado a uma célula efetora imune não modifi- cada. Por exemplo, em algumas modalidades, uma célula efetora imu- ne modificada demonstra expressão reduzida de um transcrito de mRNA e/ou expressão reduzida de uma proteína. Em algumas moda- lidades, a expressão do produto gênico em uma célula efetora imune modificada é reduzida em pelo menos 5% em comparação com a ex- pressão do produto do gene em uma célula efetora imune não modifi- cada. Em algumas modalidades, a expressão do produto gênico em uma célula efetora imune modificada é reduzida em pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou mais comparado com a expressão do produto gênico em uma célula efetora imune não mo- dificada. Em algumas modalidades, as células efetoras imunes modifi- cadas descritas neste documento demonstram expressão reduzida e/ou função de produtos gênicos codificados por uma pluralidade (por exemplo, dois ou mais) de genes-alvo endógenos em comparação com a expressão dos produtos gênicos em uma célula efetora imune não modificada. Por exemplo, em algumas modalidades, uma célula efetora imune modificada demonstra expressão e/ou função reduzida de produtos gênicos de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais genes-alvo en- dógenos em comparação com a expressão dos produtos gênicos em uma célula efetora imune não modificada.
[00168] Em algumas modalidades, a presente descrição fornece uma célula efetora imune modificada em que um ou mais genes-alvo endógenos, ou uma porção deles, são deletados (ou seja, "nocautea- dos") de modo que a célula efetora imune modificada não expresse o transcrito ou proteína de mRNA. Em algumas modalidades, uma célula efetora imune modificada compreende a deleção de uma pluralidade de genes-alvo endógenos, ou porções dos mesmos. Em algumas mo- dalidades, uma célula efetora imune modificada compreende a dele- ção de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais genes-alvo endógenos.
[00169] Em algumas modalidades, as células efetoras imunes modi- ficadas descritas neste documento compreendem um ou mais genes- alvo endógenos modificados, em que uma ou mais modificações na sequência de DNA alvo resultam na expressão de uma proteína com função reduzida ou alterada (por exemplo, uma "proteína endógena modificada") em comparação com a função da proteína correspem quente expressa em uma célula efetora imunológico não modificada (por exemplo, uma "proteína endógena não modificada"). Em algumas modalidades, as células efetoras imunes modificadas descritas neste documento compreendem 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais genes-alvo endógenos modificados que codificam 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais proteínas endógenas modificadas. Em algumas modalidades, a proteí- na endógena modificada demonstra uma afinidade de ligação reduzida ou alterada para com outra proteína expressa pela célula efetora imu- ne modificada ou expressa por outra célula; capacidade de sinalização reduzida ou alterada; atividade enzimática reduzida ou alterada; ativi- dade de ligação ao DNA reduzida ou alterada; ou capacidade reduzida ou alterada de funcionar como uma proteína de andaime.
[00170] Em algumas modalidades, o gene-alvo endógeno modifica- do compreende uma ou mais mutações negativas dominantes. Con-
forme utilizado neste documento, uma "mutação dominante negativa" refere-se a uma substituição, exclusão ou inserção de um ou mais nu- cleotídeos de um gene-alvo, de modo que a proteína codificada atue de maneira antagônica à proteína codificada pelo gene-alvo não modi- ficado. A mutação é dominante-negativa porque o fenótipo negativo confere dominância gênica sobre o fenótipo positivo do gene não mo- dificado correspem quente. Um gene compreendendo uma ou mais mutações dominantes negativas e a proteína codificada por isso é re- ferida como "mutantes dominantes negativos", por exemplo, genes dominantes negativos e proteínas dominantes negativas. Em algumas modalidades, a proteína mutante negativa dominante é codificada por um transgene exógeno inserido em um ou mais locais no genoma da célula efetora imune.
[00171] São conhecidos vários mecanismos para a negatividade dominante. Tipicamente, o produto genético de um mutante negativo dominante retém algumas funções do produto gênico não modificado, mas carece de uma ou mais outras funções cruciais do produto gênico não modificado. Isso faz com que o mutante dominante-negativo anta- gonize o produto gênico não modificado. Por exemplo, como uma mo- dalidade ilustrativa, um mutante dominante negativo de um fator de transcrição pode não ter um domínio de ativação funcional, mas reter um domínio de ligação ao DNA funcional. Neste exemplo, o fator de transcrição dominante-negativo não pode ativar a transcrição do DNA, como o fator de transcrição não modificado, mas o fator de transcrição dominante-negativo pode inibir indiretamente a expressão gênica, im- pedindo o fator de transcrição não modificado de ligar ao sítio de liga- ção do fator de transcrição. Como outra modalidade ilustrativa, são conhecidas mutações dominantes-negativos de proteínas que funcio- nam como dímeros. Mutantes dominantes negativos de tais proteínas diméricas podem reter a capacidade de dimerizar com proteína não modificada, mas não podem funcionar de outra maneira. Os monôme- ros dominantes negativos, por dimerização com monômeros não modi- ficados para formar heterodímeros, impedem a formação de homodí- meros funcionais dos monômeros não modificados.
[00172] Em algumas modalidades, as células efetoras imunes modi- ficadas compreendem um sistema de regulação de genes capaz de reduzir a expressão ou função de um ou mais genes-alvo endógenos. O sistema de regulação de gene pode reduzir a expressão e/ou função das modificações dos genes-alvo endógenos por uma variedade de mecanismos, incluindo a modificação da sequência de DNA genômico do gene-alvo endógeno (por exemplo, por inserção, deleção ou muta- ção de um ou mais ácidos nucleicos na sequência de DNA genômico); regulando a transcrição do gene-alvo endógeno (por exemplo, inibição ou repressão da transcrição de mRNA); e/ou regulando a tradução do gene-alvo endógeno (por exemplo, por degradação do mRNA).
[00173] Em algumas modalidades, as células efetoras imunes modi- ficadas descritas neste documento compreendem um sistema de regu- lação de genes (por exemplo, um sistema de regulação de genes à base de ácido nucleico, um sistema de regulação de genes à base de proteína ou um sistema de regulação de genes à base de ácido nu- cleico/combinação de proteína. Em tais modalidades, o sistema de re- gulação de genes compreendido na célula efetora imune modificada é capaz de modificar um ou mais genes-alvo endógenos. Em algumas modalidades, as células efetoras imunes modificadas descritas neste documento compreendem um sistema de regulação de genes com- preendendo: (a) uma ou mais moléculas de ácido nucleico capazes de reduzir a expressão ou modificar a função de um produto gênico codi- ficado por um ou mais genes-alvo endógenos; (b) um ou mais polinucleotídeos que codificam uma molécu-
la de ácido nucleico que é capaz de reduzir a expressão ou modificar a função de um produto gênico codificado por um ou mais genes-alvo endógenos; (c) uma ou mais proteínas de ácido nucleico capazes de reduzir a expressão ou modificar a função de um produto gênico codi- ficado por um ou mais genes endógenos alvo; (d) um ou mais polinucleotídeos que codificam uma proteí- na que é capaz de reduzir a expressão ou modificar a função de um produto gênico codificado por um ou mais genes-alvo endógenos; (e) um ou mais RNAs guias (gRNAs) capazes de se ligar a uma sequência de DNA alvo em um gene endógeno; (f) um ou mais polinucleotídeos que codificam um ou mais gRNAs capazes de se ligar a uma sequência de DNA alvo em um ge- ne endógeno; (g) um ou mais polipeptídeos modificadores direcionados ao sítio, capazes de interagir com um gRNA e modificar uma sequên- cia de DNA alvo em um gene endógeno; (h) um ou mais polinucleotídeos que codificam um polipep- tídeo de modificação direcionado ao sítio, capaz de interagir com um gRNA e modificar uma sequência de DNA alvo em um gene endóge- no; (i) um ou mais DNAs guia (gDNAs) capazes de se ligar a uma sequência de DNA alvo em um gene endógeno; (j) um ou mais polinucleotídeos que codificam um ou mais gDNAs capazes de se ligar a uma sequência de DNA alvo em um ge- ne endógeno; (k) um ou mais polipeptídeos modificadores direcionados ao sítio, capazes de interagir com um gDNA e modificar uma sequência de DNA alvo em um gene endógeno; (l) um ou mais polinucleotídeos que codificam um polipeptí-
deo de modificação direcionado ao sítio, capaz de interagir com um gDNA e modificar uma sequência de DNA alvo em um gene endóge- no; (m) um ou mais gRNAs capazes de se ligar a uma sequên- cia de mRNA codificada por gene endógeno; (n) um ou mais polinucleotídeos que codificam um ou mais gRNAs capazes de se ligar a uma sequência de mRNA codificada por um gene endógeno; (o) um ou mais polipeptídeos modificadores direcionados ao sítio, capazes de interagir com um gRNA e modificar uma sequên- cia de mRNA codificada por um gene endógeno; (p) um ou mais polinucleotídeos que codificam um polipep- tídeo de modificação direcionado ao sítio, capaz de interagir com um gRNA e modificar uma sequência de mRNA alvo codificado por um gene endógeno; ou (q) ou qualquer combinação dos grupos acima.
[00174] Em algumas modalidades, um ou mais polinucleotídeos que codificam o sistema de regulação de genes são inseridos no genoma da célula efetora imune. Em algumas modalidades, um ou mais poli- nucleotídeos que codificam o sistema de regulação de genes são ex- pressos de modo epissomal e não são inseridos no genoma da célula efetora imune.
[00175] Em algumas modalidades, as células efetoras imunes modi- ficadas descritas neste documento compreendem expressão e/ou fun- ção reduzida de um ou mais genes-alvo endógenos e adicionalmente compreendem um ou mais transgenes exógenos inseridos em um ou mais loci genômicos (por exemplo, um "knock-in" genético). Em algu- mas modalidades, um ou mais transgenes exógenos codificam tags detectáveis, sistemas de chave de segurança, receptores de chave quiméricos e/ou receptores específicos de antígeno manipulados.
[00176] Em algumas modalidades, as células efetoras imunes modi- ficadas descritas neste documento compreendem adicionalmente um transgene exógeno que codifica uma tag detectável.
Exemplos de tags detectáveis incluem, entre outros, tags FLAG, tags poli-histidina (por exemplo, 6xHis), tags SNAP, tags Halo, tags cMyc, tags glutationa-S- transferase, avidina, enzimas, proteínas fluorescentes, proteínas lumi- nescentes, quimioluminescentes proteínas, proteínas bioluminescen- tes e proteínas fosforescentes.
Em algumas modalidades, a proteína fluorescente é selecionada do grupo que consiste em proteínas azuis/UV (como BFP, TagBFP, mTagBFP2, Azurita, EBFP2, mKala- ma1, Sirius, Sapphire e T-Sapphire); proteínas cianas (como CFP, eCFP, Cerulean, SCFP3A, mTurquoise, mTurquoise2, monomérico Midoriishi-Cyan, TagCFP e mTFP1); proteínas verdes (como: GFP, eGFP, meGFP (mutação A208K), Emerald, Superfolder GFP, Mono- meric Azami Green, TagGFP2, mUKG, mWasabi, Clover e mNeon- Green); proteínas amarelas (como YFP, eYFP, Citrina, Venus, SYFP2 e TagYFP); proteínas alaranjadas (como Kusabira-Orange monoméri- ca, mKOκ, mKO2, mOrange e mOrange2); proteínas vermelhas (como RFP, mRaspberry, mCherry, mStrawberry, mTangerina, tdTomato, TagRFP, TagRFP-T, mApple, mRuby e mRuby2); proteínas distante do espectro vermelho (como mPlum, HcRed-Tandem, mKate2, mNep- tune e NirFP); proteínas próximas ao espectro infravermelho (como TagRFP657, IFP1.4 e iRFP); proteínas de mudança de longo curso (como mKeima Red, LSS-mKate1, LSS-mKate2 e mBeRFP); proteínas fotoativáveis (como PA-GFP, PAmCherry1 e PATagRFP); proteínas fotoconversíveis (como Kaede (verde), Kaede (vermelho), KikGR1 (verde), KikGR1 (vermelho), PS-CFP2, PS-CFP2, mEos2 (verde), mEos2 (vermelho), mEos3.2 (verde), mEos3.2 (vermelho), PSmOran- ge e PSmOrange); e proteínas selecionáveis em fotos (como Dronpa). Em algumas modalidades, a tag detectável pode ser selecionada de
AmCyan, AsRed, DsRed2, DsRed Express, E2-Crimson, HcRed, ZsGreen, ZsYellow, mCherry, mStrawberry, mOrange, mBanana, mPlum, mRasberry, tdTomato, DsRed Monomer e/ou AcGFP, todos disponíveis na Clontech.
[00177] Em algumas modalidades, as células efetoras imunes modi- ficadas descritas neste documento compreendem adicionalmente um transgene exógeno que codifica sistema de chave de segurança. Os sistemas de chave de segurança (também referidos na técnica como sistemas de genes suicidas) compreendem transgenes exógenos que codificam a uma ou mais proteínas que permitem a eliminação de uma célula efetora imune modificada após a célula ter sido administrada a um sujeito. Exemplos de sistemas de chave de segurança são conhe- cidos na técnica. Por exemplo, os sistemas de chave de segurança incluem genes que codificam para as proteínas que convertem pró- drogas não tóxicas em compostos tóxicos, como o sistema de timidina quinase de Herpes simplex (Hsv-tk) e sistema de ganciclovir (GCV) de Herpes simplex (Hsv-tk/GCV). O Hsv-tk converte o GCV não tóxico em um composto citotóxico que leva à apoptose celular. Como tal, a ad- ministração de GCV a um sujeito que foi tratado com células efetoras imunes modificadas compreendendo um transgene que codifica a pro- teína Hsv-tk pode eliminar seletivamente as células efetoras imunes modificadas enquanto poupa as células efetoras imunes endógenas. (Ver, por exemplo, Bonini et al., Science, 1997, 276 (5319): 1719- 1724; Ciceri et al., Blood, 2007, 109 (11): 1828-1836; Bondanza et al., Blood 2006, 107 (5): 1828-1836).
[00178] Os sistemas adicionais de chave de segurança incluem ge- nes que codificam marcadores de superfície celular, permitindo a eli- minação de células efetoras imunes modificadas pela administração de um anticorpo monoclonal específico para o marcador de superfície celular via ADCC. Em algumas modalidades, o marcador da superfície celular é CD20 e as células efetoras imunes modificadas podem ser eliminadas pela administração de um anticorpo monoclonal anti-CD20, como o Rituximabe (ver, por exemplo, Introna et al., Hum Gene Ther, 2000, 11 (4).): 611-620; Serafini et al., Hum Gene Ther, 2004, 14, 63- 76; van Meerten et al., Gene Ther, 2006, 13, 789-797). Sistemas simi- lares usando EGF-R e Cetuximabe ou Panitumumabe são descritos na Publicação Internacional PCT No. WO 2018006880. Sistemas de cha- ve de segurança adicionais incluem transgenes que codificam molécu- las pró-apoptóticas compreendendo um ou mais sítios de ligação para um indutor químico de dimerização (CID), permitindo a eliminação de células efetoras imunes modificadas pela administração de um CID que induz a oligomerização das moléculas pró-apoptóticas e ativação da via da apoptose. Em algumas modalidades, a molécula pró- apoptótica é Fas (também conhecida como CD95) (Thomis et al., Blo- od, 2001, 97 (5), 1249-1257). Em algumas modalidades, a molécula pró-apoptótica é a caspase-9 (Straathof et al., Blood, 2005, 105 (11), 4247-4254).
[00179] Em algumas modalidades, as células efetoras imunes modi- ficadas descritas neste documento compreendem adicionalmente um transgene exógeno que codifica sistema um de chave de quimérica. Receptores de chave quiméricas são receptores de superfície celular modificados que compreendem um domínio extracelular de um recep- tor endógeno da superfície celular e um domínio de sinalização intra- celular heterólogo, de modo que o reconhecimento de ligantes pelo domínio extracelular resulta na ativação de uma cascata de sinaliza- ção diferente daquela ativada pela forma de tipo selvagem do receptor da superfície celular. Em algumas modalidades, o receptor de chave quimérico compreende o domínio extracelular de um receptor inibidor da superfície celular fundido com um domínio intracelular que leva à transmissão de um sinal de ativação em vez do sinal inibitório normal-
mente transduzido pelo receptor inibidor da superfície celular. Em mo- dalidades particulares, os domínios extracelulares derivados de recep- tores de superfície celular conhecidos por inibir a ativação de células efetoras imunes podem ser fundidos à ativação de domínios intracelu- lares. O engajamento do ligante correspem quente ativará então as cascatas de sinalização que aumentam, em vez de inibir, a ativação da célula efetora imune. Por exemplo, em algumas modalidades, as célu- las efetoras imunes modificadas descritas neste documento compre- endem um transgene que codifica um receptor de chave PD1-CD28, em que o domínio extracelular de PD1 é fundido ao domínio de sinali- zação intracelular de CD28 (Ver, por exemplo, Liu et al., Cancer Res 76: 6 (2016), 1578-1590 e Moon et al., Molecular Therapy 22 (2014), S201). Em algumas modalidades, as células efetoras imunes modifi- cadas descritas neste documento compreendem um transgene que codifica o domínio extracelular de CD200R e o domínio de sinalização intracelular de CD28 (Ver Oda et al., Blood 130: 22 (2017), 2410- 2419).
[00180] Em algumas modalidades, as células efetoras imunes modi- ficadas descritas neste documento compreendem adicionalmente um receptor específico de antígeno modificado que reconhece um alvo proteico expresso por uma célula-alvo, como uma célula tumoral ou uma célula apresentadora de antígeno (APC), referida neste documen- to como "receptor modificado por células manipuladas" ou "células RE modificadas". O termo "receptor de antígeno manipulado" refere-se a um receptor específico de antígeno que não ocorre naturalmente, co- mo um receptor de antígeno quimérico (CAR) ou um receptor de célula T recombinante (TCR). Em algumas modalidades, o receptor de antí- geno manipulado é um CAR compreendendo um domínio de ligação ao antígeno extracelular fundido através de domínios de dobradiça e transmembranares a um domínio citoplasmático que compreende um domínio de sinalização. Em algumas modalidades, o domínio extrace- lular do CAR se liga a um antígeno expresso por uma célula-alvo de maneira independente do MHC, levando à ativação e proliferação da célula RE. Em algumas modalidades, o domínio extracelular de um CAR reconhece um marcador fundido com um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo. Em tais modalidades, a especifici- dade de antígeno do CAR é dependente da especificidade de antígeno do anticorpo marcado, de modo que um único construto de CAR possa ser usado para atingir vários antígenos diferentes, substituindo um an- ticorpo por outro (Ver, por exemplo, Patentes US 9.233.125 e
9.624.279; Publicações de Pedido de Patente US 20150238631 e 20180104354). Em algumas modalidades, o domínio extracelular de um CAR pode compreender um fragmento de ligação ao antígeno de- rivado de um anticorpo. Os domínios de ligação ao antígeno que são úteis na presente descrição incluem, por exemplo, scFvs; anticorpos; regiões de ligação ao antígeno de anticorpos; regiões variáveis das cadeias pesada/leve; e anticorpos de cadeia única.
[00181] Em algumas modalidades, o domínio de sinalização intrace- lular de um CAR pode ser derivado da cadeia zeta do complexo TCR (como domínios de sinalização de CD3ξ), FcγRIII, FcεRI ou o domínio de ativação de linfócitos T. Em algumas modalidades, o domínio de sinalização intracelular de um CAR compreende adicionalmente um domínio coestimulatório, por exemplo, um domínio 4-1BB, CD28, CD40, MyD88 ou CD70. Em algumas modalidades, o domínio de sina- lização intracelular de um CAR compreende dois domínios coestimula- tórios, por exemplo, quaisquer dois dos domínios dentre 4-1BB, CD28, CD40, MyD88 ou CD70. Estruturas de CAR exemplares e domínios de sinalização intracelular são conhecidos na técnica (ver, por exemplo, WO 2009/091826; US 20130287748; WO 2015/142675; WO 2014/055657; e WO 2015/090229, incorporado neste documento por referência).
[00182] Os CARs específicos para uma variedade de antígenos tu- morais são conhecidos na técnica, por exemplo, CARs específicos pa- ra CD171 (Park et al., Mol Ther (2007) 15 (4): 825-833), CARs especí- ficos para EGFRvIII (Morgan et al. Hum Gene Ther (2012) 23 (10): 1043-1053), CARs específicos de EGF-R (Kobold et al., J Natl Cancer Inst (2014) 107 (1): 364), CARs específicos de anidrase carbônica K (Lamers et al., Biochem Soc Trans (2016) 44 (3): 951-959), CARs es- pecíficos de FR-α (Kershaw et al., Clin Cancer Res (2006) 12 (20): 6106-6015), CARs específicos para HER2 (Ahmed et al., J Clin Oncol (2015) 33 (15) 1688-1696; Nakazawa et al., Mol Ther (2011) 19 (12): 2133-2143; Ahmed et al., Mol Ther (2009) 17 (10): 1779-1787; Luo et al., Cell Res (2016) 26 (7): 850-853; Morgan et al., Mol Ther (2010) 18 (4): 843-851; Grada et al., Mol Ther Nucleic Acids (2013) 9 (2): 32), CARs específicos para CEA (Katz et al., Clin Cancer Res (2015) 21 (14): 3149-3159), CARs específicos para IL13Rα2 (Brown et al., Clin Cacner Res (2015) 21 (18): 4062-4072), CARs específicos para GD2 (Louis et al., Blood (2011) 118 (23): 6050-6056; Caruana et al., Nat Med (2015) 21 (5): 524-529), CARs específicos para ErbB2 (Wilkie et al., J Clin Immunol (2012) 32 (5): 1059-1070), CARs específicos para VEGF-R-CARs (Chinnasamy et al., Cancer Res (2016) 22 (2): 436- 447), CARs específicos para FAP (Wang et al., Cancer Immunol Res (2014) 2 (2): 154-166), CARs específicos para MSLN (Moon et al., Clin Cancer Res (2011) 17 (14): 4719-30), CARs específicos para NKG2D (VanSeggelen et al., Mol Ther (2015) 23 (10): 1600-1610), CARs es- pecíficos para CD19 (Axicabtagene ciloleucel (Yescarta®) e Tisagen- lecleucel (Kymriah®). Ver também Li et al., J Hematol e Oncol (2018) 11 (22), revisando ensaios clínicos de CARs tumorais específicas.
[00183] Em algumas modalidades, o receptor de antígeno manipu- lado é um TCR manipulado. Os TCRs manipulados compreendem ca-
deias de TCRα e/ou TCRβ que foram isoladas e clonadas a partir de populações de células T que reconhecem um antígeno alvo específico. Por exemplo, os genes TCRα e/ou TCRβ (isto é, TRAC e TRBC) po- dem ser clonados a partir de populações de células T isoladas de indi- víduos com malignidades particulares ou populações de células T que foram isoladas de camundongos humanizados imunizados com antí- genos ou células tumorais específicas. Os TCRs manipulados reco- nhecem o antígeno através dos mesmos mecanismos que os seus homólogos endógenos (por exemplo, pelo reconhecimento de seu an- tígeno cognato apresentado no contexto das principais proteínas do complexo de histocompatibilidade (MHC) expressas na superfície da célula-alvo). Esse engajamento antigênico estimula as vias endógenas de transdução de sinal, levando à ativação e proliferação das células manipuladas pelo TCR.
[00184] TCRs manipulados específicos para antígenos tumorais são conhecidos na técnica, por exemplo, TCRs específicos para WT1 (JTCR016, Juno Therapeutics; WT1-TCRc4, descritos na publicação do pedido de patente US 20160083449), TCRs específicos para MART-1 (incluindo o clone DMF4T, descrito em Morgan et al., Science 314 (2006) 126-129); o clone DMF5T, descrito em Johnson et al., Blo- od 114 (2009) 535-546); e o clone ID3T, descrito em van den Berg et al., Mol. Ther. 23 (2015) 1541-1550), TCRs específicos de gp100 (Johnson et al., Blood 114 (2009) 535-546), TCRs específicos de CEA (Parkhurst et al., Mol Ther. 19 (2011) 620-626), TCRs específicos de NY-ESO e LAGE-1 (clone 1G4T, descritos em Robbins et al., J Clin Oncol 26 (2011) 917-924; Robbins et al., Clin Cancer Res 21 (2015) 1019-1027; e Rapoport et al., Nature Medicine 21 (2015) 914-921) e TCRs específicos para MAGE-A3 (Morgan et al., J Immunother 36 (2013) 133-151) e Linette et al., Blood 122 (2013) 227-242). (Ver tam- bém Debets et al., Seminars in Immunology 23 (2016) 10-21).
[00185] Em algumas modalidades, o receptor de antígeno manipu- lado é direcionado contra um antígeno alvo selecionado a partir de um cluster de molécula de diferenciação, como CD3, CD4, CD8, CD16, CD24, CD25, CD33, CD34, CD45, CD64, CD71, CD78, CD80 (tam- bém conhecido como B7-1), CD86 (também conhecido como B7-2), CD96, CD116, CD117, CD123, CD133 e CD138, CD371 (também co- nhecido como CLL1); um antígeno de superfície associado ao tumor, como 5T4, BCMA (também conhecido como CD269 e TNFRSF17, UniProt # Q02223), antígeno carcinoembrionário (CEA), anidrase car- bônica 9 (CAIX ou MN/CAIX), CD19, CD20, CD22, CD30, CD40, disia- logangliosídeos como GD2, ELF2M, mucina ducto-epitelial, efrina B2, molécula de adesão de células epiteliais (EpCAM), ErbB2 (HER2/neu), FCRL5 (UniProt# Q68SN8), FKBP11 (UniProt # Q9NYL4), FKBP11, glicosfingolipídeos, gp36, GPRC5D (UniProt # Q9NZD1), mut hsp70-2, carboxil esterase intestinal, receptor de IGF-I, ITGA8 (UniProt # P53708), KAMP3, LAGE-1a, MAGE, mesotelina, elastase de neutrófi- los, NKG2D, Nkp30, NY-ESO-1, PAP, prostase, antígeno-1 do tumor da próstata-carcinoma (PCTA-1), antígeno específico da próstata (PSA), PSMA, prosteína, RAGE-1, ROR1, RU1 (SFMBT1), RU2 (DCDC2), SLAMF7 (UniProt # Q9NQ25), survivina, TAG-72 e telome- rase; uma molécula do complexo principal de histocompatibilidade (MHC) que apresenta um epítopo peptídico específico de tumor; antí- genos estromais tumorais, como o domínio extra A (EDA) e o domínio extra B (EDB) da fibronectina; o domínio A1 da tenascina-C (TnC A1) e proteína associada a fibroblastos (FAP); receptores de citocinas, tais como receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR), variante III do EGFR (EGFRvIII), TFGβ-R ou componentes dos mesmos, como endoglina; uma molécula do complexo principal de histocompatibilida- de (MHC); um antígeno de superfície específico do vírus, como um antígeno específico do HIV (como o HIV gp120); um antígeno específi-
co de EBV, um antígeno específico de CMV, um antígeno específico de HPV, um antígeno específico de vírus Lassa, um antígeno específi- co de vírus Influenza, bem como qualquer derivado ou variante desses antígenos de superfície. A. Funções efetoras
[00186] Em algumas modalidades, as células efetoras imunes modi- ficadas descritas neste documento demonstram um aumento em uma ou mais funções efetoras de células imunes. Neste documento, o ter- mo "função efetora" se refere às funções de uma célula imune relacio- nadas à geração, manutenção e/ou aprimoramento de uma resposta imune contra uma célula-alvo ou antígeno alvo. Em algumas modali- dades, as células efetoras imunes modificadas descritas neste docu- mento demonstram uma ou mais das seguintes características em comparação com uma célula efetora imune não modificada: aumento da infiltração ou migração para um tumor, aumento da proliferação, viabilidade celular aumentada ou prolongada, aumento da resistência a fatores inibidores no microambiente circundante, de modo que o es- tado de ativação da célula seja prolongado ou aumentado, aumento da produção de fatores imunológicos pró-inflamatórios (por exemplo, cito- cinas pró-inflamatórias, quimiocinas e/ou enzimas), aumento da citoto- xicidade e/ou maior resistência à exaustão.
[00187] Em algumas modalidades, as células efetoras imunes modi- ficadas descritas neste documento demonstram aumento da infiltração em um tumor em comparação com uma célula efetora imune não mo- dificada. Em algumas modalidades, o aumento da infiltração tumoral por células efetoras imunes modificadas refere-se a um aumento do número de células efetoras imunes modificadas que se infiltram em um tumor durante um determinado período de tempo em comparação com o número de células efetoras imunes não modificadas que se infiltram em um tumor durante o mesmo período de tempo. Em algumas moda-
lidades, as células efetoras imunes modificadas demonstram 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100 ou mais vezes o aumen- to na filtração do tumor em comparação com uma célula imune não modificada. A infiltração tumoral pode ser medida isolando um ou mais tumores de um sujeito e avaliando o número de células imunes modifi- cadas na amostra por citometria de fluxo, imuno-histoquímica e/ou imunofluorescência.
[00188] Em algumas modalidades, as células efetoras imunes modi- ficadas descritas neste documento demonstram um aumento na proli- feração celular em comparação com uma célula efetora imune não modificada. Nestas modalidades, o resultado é um aumento no núme- ro de células efetoras imunes modificadas presentes em comparação com células efetoras imunes não modificadas após um determinado período de tempo. Por exemplo, em algumas modalidades, as células efetoras imunes modificadas demonstram taxas aumentadas de proli- feração em comparação com as células efetoras imunes não modifica- das, em que as células efetoras imunes modificadas se dividem em uma taxa mais rápida do que as células efetoras imunes não modifica- das. Em algumas modalidades, as células efetoras imunes modifica- das demonstram 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100 ou mais vezes o aumento na taxa de proliferação em comparação com uma célula imune não modificada. Em algumas modalidades, as células efetoras imunes modificadas demonstram períodos prolonga- dos de proliferação em comparação com as células efetoras imunes não modificadas, em que as células efetoras imunes modificadas e as células efetoras imunes não modificadas se dividem em taxas seme- lhantes, mas em que as células efetoras imunes modificadas mantêm o estado proliferativo por mais tempo período de tempo. Em algumas modalidades, as células efetoras imunes modificadas mantêm um es- tado proliferativo para 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20,25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100 ou mais vezes mais do que uma célula imune não modificada.
[00189] Em algumas modalidades, as células efetoras imunes modi- ficadas descritas neste documento demonstram viabilidade celular aumentada ou prolongada em comparação com uma célula efetora imune não modificada. Nestas modalidades, o resultado é um aumento no número de células efetoras imunes modificadas ou presentes em comparação com células efetoras imunes não modificadas após um determinado período de tempo. Em algumas modalidades, as células efetoras imunes modificadas mantêm descritas neste documento per- manecem viáveis e persistem por 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100 ou mais vezes mais do que uma célula imune não modificada.
[00190] Em algumas modalidades, as células efetoras imunes modi- ficadas descritas neste documento demonstram resistência aumentada a fatores inibidores em comparação com uma célula efetora imune não modificada. Fatores inibitórios exemplares incluem sinalização por mo- léculas de ponto de verificação imune (por exemplo, PD1, PDL1, CTLA4, LAG3, IDO) e/ou citocinas inibidoras (por exemplo, IL-10, TGFβ).
[00191] Em algumas modalidades, as células T modificadas descri- tas neste documento demonstram resistência aumentada à exaustão de células T em comparação com uma célula T não modificada. A exaustão das células T é um estado de disfunção das células T espe- cíficas do antígeno, caracterizada pela diminuição da função efetora e levando à deleção subsequente das células T específicas do antígeno. Em algumas modalidades, as células T exauridas carecem da capaci-
dade de proliferar em resposta ao antígeno, demonstrar diminuição da produção de citocinas e/ou demonstrar diminuição da citotoxicidade contra células-alvo, como células tumorais. Em algumas modalidades, as células T exauridas são identificadas pela expressão alterada de marcadores da superfície celular e fatores de transcrição, como ex- pressão diminuída da superfície celular de CD122 e CD127; expressão aumentada de marcadores inibidores da superfície celular, como PD1, LAG3, CD244, CD160, TIM3 e/ou CTLA4; e/ou aumento da expressão de fatores de transcrição, como Blimp1, NFAT e/ou BATF. Em algu- mas modalidades, as células T exauridas demonstram sinalização de citocina de sensibilidade alterada, como aumento da sensibilidade à sinalização de TGFβ e/ou sensibilidade reduzida à sinalização de IL-7 e IL-15. A exaustão das células T pode ser determinada, por exemplo, cocultivando as células T com uma população de células-alvo e me- dindo a proliferação de células T, produção de citocinas e/ou lise das células-alvo. Em algumas modalidades, as células efetoras imunes modificadas descritas neste documento são cocultivadas com uma po- pulação de células-alvo (por exemplo, células tumorais autólogas ou linhagens celulares que foram manipuladas para expressar um antíge- no tumoral alvo) e proliferação de células efetoras, produção de citoci- nas e/ou a lise da célula-alvo é medida. Estes resultados são então comparados com os resultados obtidos da cocultura de células-alvo com uma população de controle de células imunes (como células efe- toras imunes não modificadas ou células efetoras imunes que têm uma modificação de controle).
[00192] Em algumas modalidades, a resistência à exaustão de célu- las T é demonstrada pelo aumento da produção de uma ou mais cito- cinas (por exemplo, IFNγ, TNFα ou IL-2) a partir das células efetoras imunes modificadas em comparação com a produção de citocinas ob- servada a partir da população controle de células imunes. Em algumas modalidades, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100 ou mais vezes o aumento na produção de citocinas a partir das células efetoras imunes modificadas em comparação com a produção de cito- cinas da população de controle das células imunes é indicativo de um aumento de resistência à exaustão de células T. Em algumas modali- dades, a resistência à exaustão de células T é demonstrada pelo au- mento da proliferação das células efetoras imunes modificadas em comparação com a proliferação observada da população controle das células imunes. Em algumas modalidades, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100 ou mais vezes o aumento na prolifera- ção das células efetoras imunes modificadas em comparação com a proliferação da população de controle de células imunes é indicativo de um aumento da resistência à exaustão de células T. Em algumas modalidades, a resistência à exaustão das células T é demonstrada pelo aumento da lise das células-alvo pelas células efetoras imunes modificadas em comparação com a lise das células-alvo observada pela população de controle das células imunes. Em algumas modali- dades, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100 ou mais vezes o aumento na lise de célula-alvo pelas células efetoras imunes modificadas em comparação com a lise de célula-alvo pelo controle de população das células imunes é indicativo de um aumento de resistência à exaustão de células T.
[00193] Em algumas modalidades, a exaustão das células efetoras imunes modificadas em comparação com as populações de controle das células imunes é medida durante o processo de fabricação in vitro ou ex vivo. Por exemplo, em algumas modalidades, os TILs isolados de fragmentos de tumor são modificados de acordo com os métodos descritos neste documento e depois expandidos em um ou mais ciclos de expansão para produzir uma população de TILs modificados. Em tais modalidades, a exaustão dos TILs modificados pode ser determi- nada imediatamente após a colheita e antes de um primeiro ciclo de expansão, após o primeiro ciclo de expansão, mas antes de um se- gundo ciclo de expansão e/ou após o primeiro e o segundo ciclo de expansão. Em algumas modalidades, a exaustão das células efetoras imunes modificadas em comparação com as populações de controle de células imunes é medida em um ou mais momentos após a transfe- rência das células efetoras imunes modificadas para dentro do sujeito. Por exemplo, em algumas modalidades, as células modificadas são produzidas de acordo com os métodos descritos neste documento e administradas a um sujeito. Amostras podem então ser coletadas do sujeito em vários momentos após a transferência para determinar a exaustão das células efetoras imunes modificadas in vivo ao longo do tempo.
[00194] Em algumas modalidades, as células efetoras imunes modi- ficadas descritas neste documento demonstram aumento da expres- são ou produção de fatores imunes pró-inflamatórios em comparação com uma célula efetora imune não modificada. Exemplos de fatores imunes pró-inflamatórios incluem fatores citolíticos, como granzima B, perforina e granulisina; e citocinas pró-inflamatórias, tais como interfe- rons (IFNα, IFNβ, IFNγ), TNFα, IL-1β, IL-12, IL-2, IL-17, CXCL8 e/ou IL-6.
[00195] Em algumas modalidades, as células efetoras imunes modi- ficadas descritas neste documento demonstram citotoxicidade aumen- tada contra uma célula-alvo em comparação com uma célula efetora imune não modificada. Em algumas modalidades, as células efetoras imunes modificadas demonstram 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 ou mais vezes aumento na citotoxicidade em comparação a uma célula-alvo mais do que uma célula imune não modificada.
[00196] Os ensaios para medir a função efetora imune são conhe- cidos na técnica. Por exemplo, a infiltração tumoral pode ser medida isolando tumores de um sujeito e determinando o número total e/ou fenótipo dos linfócitos presentes no tumor por citometria de fluxo, imu- no-histoquímica e/ou imunofluorescência. A expressão do receptor da superfície celular pode ser determinada por citometria de fluxo, imuno- histoquímica, imunofluorescência, Western blot e/ou qPCR. A expres- são e produção de citocinas e quimiocinas podem ser medidas por ci- tometria de fluxo, imuno-histoquímica, imunofluorescência, Western blot, ELISA e/ou qPCR. A capacidade de resposta ou sensibilidade a estímulos extracelulares (por exemplo, citocinas, ligantes inibidores ou antígeno) pode ser medida avaliando a proliferação e/ou a ativação celular de caminhos de sinalização a jusante (por exemplo, fosforila- ção de intermediários de sinalização a jusante) em resposta aos estí- mulos. A citotoxicidade pode ser medida por ensaios de lise de célu- las-alvo conhecidos na técnica, incluindo a cocultura in vitro ou ex vivo das células efetoras imunes modificadas com células-alvo e modelos de tumores murinos in vivo, como os descritos nos Exemplos. B. Regulação de vias e genes endógenos
[00197] Em algumas modalidades, as células efetoras imunes modi- ficadas descritas neste documento demonstram uma expressão ou função reduzida de um ou mais genes-alvo endógenos e/ou compre- endem um sistema de regulação de genes capaz de reduzir a expres- são e/ou função de um ou mais genes-alvo endógenos (descrito infra). Em algumas modalidades, um ou mais genes-alvo endógenos estão presentes nas vias relacionadas à ativação e regulação das respostas das células efetoras. Em tais modalidades, a expressão ou função re- duzida de um ou mais genes-alvo endógenos aprimora uma ou mais funções efetoras da célula imune.
[00198] Vias exemplares adequadas para a regulação pelos méto- dos descritos neste documento são mostradas na Tabela 1. Em algu- mas modalidades, a expressão de um gene-alvo endógeno em uma via específica é reduzida nas células efetoras imunes modificadas. Em algumas modalidades, a expressão de uma pluralidade (por exemplo, duas ou mais) de genes-alvo endógenos em uma via específica são reduzidos nas células efetoras imunes modificadas. Por exemplo, a expressão de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais genes-alvo endógenos em uma via específica pode ser reduzida. Em algumas modalidades, a expressão de um gene-alvo endógeno em uma via e a expressão de um gene-alvo endógeno em outra via é reduzida nas células efetoras imunes modificadas. Em algumas modalidades, a expressão de ge- nes-alvo endógenos em uma via e a expressão de uma pluralidade de genes-alvo endógenos em outra via são reduzidas nas células efetoras imunes modificadas. Por exemplo, a expressão de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais genes-alvo endógenos em uma via pode ser reduzida e a expressão de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais genes-alvo endógenos em outra via específica podem ser reduzidas.
[00199] Em algumas modalidades, a expressão de uma pluralidade de genes-alvo endógenos em uma pluralidade de vias é reduzida. Por exemplo, um gene endógeno de cada uma de várias vias (por exem- plo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais vias) pode ser reduzido. Em as- pectos adicionais, uma pluralidade de genes endógenos (por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais genes) de cada uma de uma pluralida- de de vias (por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais vias) podem ser reduzidas.
Tabela 1: Vias endógenas exemplares Via Descrição Diferenciação linfocitá- Via de sinalização que controla a diferencia- ria ção de células-tronco de um progenitor lin- foide comum para o tipo distinto de linfócito (célula T, célula B ou célula NK) Sinalização NFκβ Via de sinalização que controla a transcrição do DNA, a produção de citocinas e a sobre- vivência celular geralmente em resposta a estímulos celulares prejudiciais.
Sinalização de TGF- β Via de sinalização que regula o crescimento celular, diferenciação celular, apoptose, ho- meostase celular e outras funções celulares.
Ativação de células T Via iniciada pela ligação do complexo recep- tor de células T (TCR) a uma molécula prin- cipal do complexo de histocompatibilidade que transporta um antígeno peptídico e pela ligação do receptor coestimulador CD28 a proteínas na superfície da célula apresenta- dora de antígeno.
A ativação de um TCR ini- cia uma via de sinalização que desencadeia a produção de anticorpos, a ativação de cé- lulas fagocíticas e a morte celular direta.
Crescimento de células Via de sinalização que controla a morte celu- T lar programada em resposta a sinais extrín- secos ou estresses celulares intrínsecos Biossíntese de pirimidi- Uma via de biossíntese nucleotídica de novo na para componentes de RNA e DNA Sinalização de citocinas As vias de sinalização a jusante dos recepto- res de citocinas geralmente envolvem sinali- zação JAK/STAT positiva Iniciação à apoptose Genes que iniciam a via apoptótica intrínseca ou extrínseca, que direciona a morte celular programada da célula
Via Descrição Início da transcrição Genes que se ligam diretamente aos promo- tores dos genes-alvo e agem como represso- res ou ativadores da transcrição da transcri- ção do gene-alvo Ligação Ca2++ O Ca2++ serve como um segundo mensa- geiro em resposta a estímulos e direciona a sinalização intracelular em vários processos, incluindo inflamação e resposta imune. Nas células T, a sinalização de Ca2++ é necessá- ria para a ativação das células T em resposta ao antígeno
[00200] Genes-alvo endógenos exemplares são mostrados abaixo nas Tabelas 2 e 3.
[00201] Em algumas modalidades, as células efetoras modificadas compreendem expressão e/ou função reduzida de um ou mais de Ikzf1, Ikzf3, GATA3, Bcl3, Tnip1, Tnfaip3, NFKBIA, SMAD2, Tgfbr1, Tgfbr2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6, IKZF2, Cblb, Ppp2r2d, Nrp1, Havcr2, Lag3, Tigit, Ctla4, Ptpn6, Pdcd1, ou BCOR (por exemplo, um ou mais genes-alvo endógenos selecionados na Tabela 2). Em algu- mas modalidades, as células efetoras modificadas compreendem ex- pressão e/ou função reduzida de um ou mais Tnfaip3, Cblb, ou BCOR.
[00202] Em algumas modalidades, as células efetoras imunes modi- ficadas compreendem expressão e/ou função reduzida de pelo menos dois genes selecionados dentre Ikzf1, Ikzf3, GATA3, Bcl3, Tnip1, Tnfaip3, NFKBIA, SMAD2, Tgfbr1, Tgfbr2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6, IKZF2, Cblb, Ppp2r2d, Nrp1, Havcr2, Lag3, Tigit, Ctla4, Ptpn6, Pdcd1, e BCOR (por exemplo, pelo menos dois genes selecionados da Tabela 2). Por exemplo, em algumas modalidades, as células efetoras imunes modificadas compreendem expressão e/ou função reduzida de pelo menos dois genes selecionados a partir das combinações 1-600, como ilustrado na Figura 1A - Figura 1B. Em algumas modalidades, as células efetoras imunes modificadas compreendem expressão e/ou função reduzida de BCOR e expressão e/ou função reduzida de CBLB. Enquanto métodos exemplares para modificar a expressão de Ikzf1, Ikzf3, GATA3, Bcl3, Tnip1, Tnfaip3, NFKBIA, SMAD2, Tgfbr1, Tgfbr2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6, IKZF2, Cblb, Ppp2r2d, Nrp1, Havcr2, Lag3, Tigit, Ctla4, Ptpn6, Pdcd1, e/ou BCOR são descritos neste do- cumento, a expressão desses genes-alvo endógenos também pode ser modificada por métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, os anticorpos inibitórios contra PD1 (codificados por PDCD1), NRP1, HACR2, LAG3, TIGIT e CTLA4 são conhecidos na técnica e alguns são aprovados pela FDA para indicações oncológicas (por exemplo, nivolumabe e pembrolizumabe para PD1).
[00203] Em algumas modalidades, as células efetoras imunes modi- ficadas compreendem expressão e/ou função reduzida de pelo menos dois genes selecionados de BCL2L11, FLI1, CALM2, DHODH, UMPS, RBM39, SEMA7A, CHIC2, PCBP1, PBRM1, WDR6, E2F8, SERPINA3, GNAS, PTPN1, PTPN2, PTPN22, SH2B3, SH2D1A, PIK3CD, ERG2, PELI1, e SETD5 (por exemplo, dois ou mais genes selecionados na Tabela 3).
[00204] Em algumas modalidades, as células efetoras modificadas descritas neste documento compreendem expressão e/ou função re- duzidas do gene Semaphorin 7A, (SEMA7A), também conhecido como CD108. Em algumas modalidades, as células efetoras modificadas descritas neste documento compreendem uma mutação inativadora no gene SEMA7A.
[00205] Em algumas modalidades, as células efetoras modificadas descritas neste documento compreendem expressão e/ou função re- duzidas do gene da proteína de ligação a RNA 39 (RBM39). A proteína RBM39 é encontrada no núcleo, em que se coloca com as proteínas spliceossomais do núcleo. Estudos de uma proteína de camundongo com alta similaridade de sequência com esta proteína sugerem que esta proteína pode atuar como um coativador de transcrição para os receptores JUN/AP-1 e estrogênio. Em algumas modalidades, as célu- las efetoras modificadas descritas neste documento compreendem uma mutação inativadora no gene RBM39.
[00206] Em algumas modalidades, as células efetoras modificadas descritas neste documento compreendem expressão e/ou função re- duzidas do gene da proteína 11 do tipo Bcl-2 (BCL2L11), também co- mumente chamado de BIM. Em algumas modalidades, as células efe- toras modificadas descritas neste documento compreendem uma mu- tação inativadora no gene BCL2L11
[00207] Em algumas modalidades, as células efetoras modificadas descritas neste documento compreendem expressão e/ou função re- duzidas do gene do fator de transcrição 1 de integração da leucemia de Friend (FLI1), também conhecido como fator de transcrição ERGB. Em algumas modalidades, as células efetoras modificadas descritas neste documento compreendem uma mutação inativadora no gene FLI1.
[00208] Em algumas modalidades, as células efetoras modificadas descritas neste documento compreendem expressão e/ou função re- duzidas do gene Calmodulin 2 (CALM2). Em algumas modalidades, as células efetoras modificadas descritas neste documento compreendem uma mutação inativadora no gene CALM2.
[00209] Em algumas modalidades, as células efetoras modificadas descritas neste documento compreendem expressão e/ou função re- duzidas do gene do gene da di-hidro-orotato desidrogenase (DHODH). A proteína DHODH é uma proteína mitocondrial localizada na superfí- cie externa da membrana mitocondrial interna e catalisa a oxidação do di-hidro-orotato mediada por ubiquinona para o orotato na biossíntese de novo de pirimidina. Em algumas modalidades, as células efetoras modificadas descritas neste documento compreendem uma mutação inativadora no gene DHODH.
[00210] Em algumas modalidades, as células efetoras modificadas descritas neste documento compreendem expressão e/ou função re- duzidas do gene da uridina monofosfato sintase (UMPS), também refe- rida como orotato fosforibosil transferase ou orotidina-5'- descarboxilase. A proteína UMPS catalisa a formação de uridina mo- nofosfato (UMP), uma molécula transportadora de carreadora em mui- tas vias biossintéticas importantes. Em algumas modalidades, as célu- las efetoras modificadas descritas neste documento compreendem uma mutação inativadora no gene UMPS.
[00211] Em algumas modalidades, as células efetoras modificadas descritas neste documento compreendem expressão e/ou função re- duzidas do gene do domínio hidrofóbico 2 rico em cisteína(CHIC2). A proteína CHIC2 codificada contém um motivo hidrofóbico rico em ciste- ína (CHIC) e está localizada nas estruturas vesiculares e na membra- na plasmática e está associada a alguns casos de leucemia mieloide aguda. Em algumas modalidades, as células efetoras modificadas descritas neste documento compreendem uma mutação inativadora no gene CHIC2.
[00212] Em algumas modalidades, as células efetoras modificadas descritas neste documento compreendem expressão e/ou função re- duzidas do gene da proteína 1(PCBP1) de ligação a Poly(rC). Em al- gumas modalidades, as células efetoras modificadas descritas neste documento compreendem uma mutação inativadora no gene PCBP1.
[00213] Em algumas modalidades, as células efetoras modificadas descritas neste documento compreendem expressão e/ou função re- duzidas do gene da proteína polibromo-1 (PBRM1), também conheci- do como fator 180 associado ao BRG1 (BAF180). O PBRM1 é um componente do complexo de remodelação da cromatina SWI/SNF-B e é um gene supressor de tumor em muitos subtipos de câncer. As mu- tações são especialmente prevalentes no carcinoma de células renais de células claras. Em algumas modalidades, as células efetoras modi- ficadas descritas neste documento compreendem uma mutação inati- vadora no gene PBRM1.
[00214] Em algumas modalidades, as células efetoras modificadas descritas neste documento compreendem expressão e/ou função re- duzidas do gene da proteína 6 contendo repetição WD (WDR6), um membro da família de proteínas repetidas WD expressa ubiquamente nos tecidos adulto e fetal. As repetições de WD são regiões minima- mente conservadas de aproximadamente 40 aminoácidos tipicamente entre colchetes por gly-his e trp-asp (GH-WD), que podem facilitar a formação de complexos heterotriméricos ou multiproteicos. Os mem- bros desta família estão envolvidos em uma variedade de processos celulares, incluindo progressão do ciclo celular, transdução de sinal, apoptose e regulação de genes. Em algumas modalidades, as células efetoras modificadas descritas neste documento compreendem uma mutação inativadora no gene WDR6.
[00215] Em algumas modalidades, as células efetoras modificadas descritas neste documento compreendem expressão e/ou função re- duzida do gene do fator de transcrição 8 (E2F8) E2F. A proteína E2F8 codificada regula a progressão da fase G1 para S, garantindo que o núcleo se divida no momento adequado. Em algumas modalidades, as células efetoras modificadas descritas neste documento compreendem uma mutação inativadora no gene E2F8.
[00216] Em algumas modalidades, as células efetoras modificadas descritas neste documento compreendem expressão e/ou função re- duzida do gene do membro 3 da família A da serpina (SERPINA3). SERPINA3 codifica a proteína alfa 1-anticrimotripsina (α1AC, A1AC ou a1ACT), que inibe a atividade de certas proteases, como catepsina G e quimioses. Em algumas modalidades, as células efetoras modifica- das descritas neste documento compreendem uma mutação inativado- ra no gene SERPINA3.
[00217] Em algumas modalidades, as células efetoras modificadas descritas neste documento compreendem expressão e/ou função re- duzidas do gene do locus complexo GNAS (GNAS). É a subunidade alfa da proteína G estimuladora (Gs-α), um componente essencial de muitas vias de transdução de sinal. Em algumas modalidades, as célu- las efetoras modificadas descritas neste documento compreendem uma mutação inativadora no gene GNAS.
[00218] Em algumas modalidades, as células efetoras modificadas aqui descritas compreendem expressão e/ou função reduzida do gene da proteína tirosina fosfatase não receptora tipo 1 (PTPN1). A proteína PTPN1 codificada por esse gene é o membro fundador da família da proteína tirosina fosfatase (PTP), que foi isolada e identificada com base em sua atividade enzimática e sequência de aminoácidos. PTPs catalisam a hidrólise dos monoésteres de fosfato especificamente em resíduos de tirosina. Os membros da família PTP compartilham um motivo catalítico altamente conservado, que é essencial para a ativi- dade catalítica. Sabe-se que os PTPs são moléculas sinalizadoras que regulam uma variedade de processos celulares, incluindo crescimento celular, diferenciação, ciclo mitótico e transformação oncogênica. De- monstrou-se que PTPN1 atua como um de regulação negativo da sina- lização de insulina, desfosforilando os resíduos de fosfotirosina do re- ceptor quinase de insulina e também foi relatado que desfosforila o receptor quinase do fator de crescimento epidérmico, bem como as quinases JAK2 e TYK2, que implicam o papel do PTPN1 na célula de controle de crescimento e resposta celular à estimulação por interfe- ron. Em algumas modalidades, as células efetoras modificadas descri- tas neste documento compreendem uma mutação inativadora no gene
PTPN1.
[00219] Em algumas modalidades, as células efetoras modificadas descritas neste documento compreendem expressão e/ou função re- duzida do gene da proteína tirosina fosfatase não receptora tipo 2 (PTPN2). PTPN2 também é um membro da família PTP. Foi relatado que o receptor do fator de crescimento epidérmico e a proteína adap- tadora Shc são substratos de PTPN2, o que sugeriu um papel para PTPN2 na sinalização celular mediada por fator de crescimento. Em algumas modalidades, as células efetoras modificadas descritas neste documento compreendem uma mutação inativadora no gene PTPN2.
[00220] Em algumas modalidades, as células efetoras modificadas descritas neste documento compreendem expressão e/ou função re- duzida do gene da proteína tirosina fosfatase não receptora tipo 22 (PTPN22). O gene PTPN22 codifica um membro da subfamília não receptora classe 4 da família proteína-tirosina fosfatase. A proteína PTPN22 codificada é uma fosfatase intracelular específica de linfoide que se associa à proteína adaptadora molecular CBL e pode estar en- volvida na regulação da função CBL na via de sinalização do receptor de célula T. Mutações nesse gene podem estar associadas a uma va- riedade de distúrbios autoimunes, incluindo Diabetes Tipo 1, artrite reumatoide, lúpus eritematosos sistêmicos e doença de Graves. Em algumas modalidades, as células efetoras modificadas descritas neste documento compreendem uma mutação inativadora no gene PTPN22.
[00221] Em algumas modalidades, as células efetoras modificadas descritas neste documento compreendem expressão e/ou função re- duzidas do gene da proteína adaptadora 3 SH2B(SH2B3), também conhecida como proteína adaptadora de linfócitos (LNK). SH2B3 é um membro da família de proteínas adaptadoras SH2B, envolvidas em uma série de atividades de sinalização por fator de crescimento e re- ceptores de citocinas. A proteína SH2B3 é um importante de regulação negativo da sinalização de citocinas e desempenha um papel crítico na hematopoiese. Mutações nesse gene têm sido associadas à suscetibi- lidade à doença celíaca tipo 13 e à diabetes mellitus dependente de insulina. Em algumas modalidades, as células efetoras modificadas descritas neste documento compreendem uma mutação inativadora no gene SH2B3.
[00222] Em algumas modalidades, as células efetoras modificadas descritas neste documento compreendem expressão e/ou função re- duzida do domínio SH2 contendo o gene 1A(SH2D1A). O gene SH2D1A codifica a proteína SH2D1A, que desempenha um papel im- portante na estimulação bidirecional das células T e B. SH2D1A asso- cia-se à molécula de ativação de linfócitos de sinalização, agindo as- sim como um inibidor dessa proteína transmembranar, bloqueando o recrutamento da molécula de transdução de sinal que contém o domí- nio SH2, SHP-2, ao seu sítio de ancoragem. SH2D1A também pode se ligar a outras moléculas de superfície relacionadas que são expressas em células T, B e NK ativadas, modificando assim as vias de transdu- ção de sinal nessas células. Mutações nesse gene causam síndrome linfoproliferativa ligada ao X tipo 1 ou doença de Duncan. Em algumas modalidades, as células efetoras modificadas descritas neste docu- mento compreendem uma mutação inativadora no gene SH2D1A.
[00223] Em algumas modalidades, as células efetoras modificadas descritas neste documento compreendem expressão e/ou função re- duzida do gene da subunidade catalítica da fosfatidilinositol-4,5- bifosfato 3-quinase (PIK3CD). A proteína PIK3CD é uma PI3K de clas- se I encontrada principalmente em leucócitos. Como outras PI3Ks de classe I (p110-alfa, p110-beta e p110-gama), o PIK3CD liga proteínas adaptadoras de p85 e RAS ligado a GTP. No entanto, ao contrário dos outros PI3Ks da classe I, o PIK3CD se fosforila, sem a proteína p85. Em algumas modalidades, as células efetoras modificadas descritas neste documento compreendem uma mutação inativadora no gene PIK3CD.
[00224] Em algumas modalidades, as células efetoras modificadas descritas neste documento compreendem expressão e/ou função re- duzida do gene homólogo da biossíntese de ergosterol 28 (ERG2). Em algumas modalidades, as células efetoras modificadas descritas neste documento compreendem uma mutação inativadora no gene ERG2.
[00225] Em algumas modalidades, as células efetoras modificadas descritas neste documento compreendem expressão e/ou função re- duzida do gene PELI1. O PELI1 é um membro da família Pellino das ligases de ubiquitina E3 que medeia a ubiquitinação e a degradação de componentes que controlam a ativação da célula imune. A família Pellino é composta por três membros, Peli1, Peli2 e Peli3, e comparti- lham alta homologia de sequência e estrutura de domínio. Nas células T, foi demonstrado que o PELI1 regula a via NF-kB, por exemplo, dire- cionando c-Rel para ubiquitinação. Em algumas modalidades, as célu- las efetoras modificadas descritas neste documento compreendem uma mutação inativadora no gene PELI1.
[00226] Em algumas modalidades, as células efetoras modificadas descritas neste documento compreendem expressão e/ou função re- duzida do gene SETD5 gene. SETD5 pertence à superfamília proteica do domínio SET das proteínas lisina metiltransferases. Os membros da família do domínio SET desempenham papéis importantes na regu- lação da expressão gênica ao longo do desenvolvimento, modificando a estrutura da cromatina. O SETD5 é provavelmente um de regulação da transcrição que atua formando grandes complexos multiproteicos que modificam e/ou remodelam a cromatina. Mutações de perda de função têm sido associadas a uma forma autossômica dominante de deficiência intelectual. SETD5 não possui um papel conhecido na bio- logia de células imunes. Em algumas modalidades, as células efetoras modificadas descritas neste documento compreendem uma mutação inativadora no gene SETD5.
[00227] Em algumas modalidades, as células efetoras imunes modi- ficadas compreendem expressão e/ou função reduzida de pelo menos dois genes selecionados de BCL2L11, FLI1, CALM2, DHODH, UMPS, RBM39, SEMA7A, CHIC2, PCBP1, PBRM1, WDR6, E2F8, SERPINA3, GNAS, PTPN1, PTPN2, PTPN22, SH2B3, SH2D1A, PIK3CD, ERG2, PELI1, e SETD5 (por exemplo, dois ou mais genes selecionados na Tabela 3). Por exemplo, em algumas modalidades, as células efetoras imunes modificadas compreendem expressão e/ou função reduzida de pelo menos dois genes selecionados a partir das combinações N°s 1176-1681, como ilustrado na Fig. 3A - Fig. 3B. Em algumas modali- dades, as células efetoras imunes modificadas compreendem expres- são e/ou função reduzida de pelo menos dois genes selecionados a partir das combinações N°s 1176-1483, conforme ilustrado na Fig. 3A. Em algumas modalidades, as células efetoras imunes modificadas compreendem expressão e/ou função reduzida de pelo menos dois genes selecionados a partir das Combinações N°s 1484-1637, con- forme ilustrado na Fig. 3B. Em algumas modalidades, as células efeto- ras imunes modificadas compreendem expressão e/ou função reduzi- da de pelo menos dois genes selecionados a partir das Combinações N°s 1638-1659, conforme ilustrado na Fig. 3B. Em algumas modalida- des, as células efetoras imunes modificadas compreendem expressão e/ou função reduzida de pelo menos dois genes selecionados a partir das Combinações N°s 1660-1681, conforme ilustrado na Fig. 3B.
[00228] Em algumas modalidades, as células efetoras modificadas compreendem expressão e/ou função reduzida de um ou mais de BCL2L11, FLI1, CALM2, DHODH, UMPS, RBM39, SEMA7A, CHIC2, PCBP1, PBRM1, WDR6, E2F8, SERPINA3, GNAS, PTPN1, PTPN2, PTPN22, SH2B3, SH2D1A, PIK3CD, ERG2, PELI1, e SETD5 (por exemplo, um ou mais genes selecionados na Tabela 3) e um ou mai- sIKZF1, IKZF3, GATA3, BCL3, TNIP1, TNFAIP3, NFKBIA, SMAD2, TGFBR1, TGFBR2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6, IKZF2, CBLB, PPP2R2D, NRP1, HAVCR2, LAG3, TIGIT, CTLA4, PTPN6, PDCD1, ou BCOR (por exemplo, um ou mais genes selecionados na Tabela 2). Por exemplo, as células efetoras imunes modificadas podem compre- ender expressão e/ou função reduzida de uma combinação de genes- alvo endógenos selecionados a partir das Combinações N°s 601-1175. Em algumas modalidades, as células efetoras imunes modificadas po- dem compreender expressão e/ou função reduzida de uma combina- ção de dois genes-alvo endógenos selecionados a partir das Combi- nações N°s 601-950 (como ilustrado na Fig. 2A). Em algumas modali- dades, as células efetoras imunes modificadas podem compreender expressão e/ou função reduzida de uma combinação de dois genes- alvo endógenos selecionados a partir das combinações N°s. 951-1125 (como ilustrado na Fig. 2B). Em algumas modalidades, as células efe- toras imunes modificadas podem compreender expressão e/ou função reduzida de uma combinação de dois genes-alvo endógenos selecio- nados a partir das Combinações N°s 1126-1150 (como ilustrado na Fig. 2B). Em algumas modalidades, as células efetoras imunes modifi- cadas podem compreender expressão e/ou função reduzida de uma combinação de dois genes-alvo endógenos selecionados a partir das Combinações N°s 1151-1175 (como ilustrado na Fig. 2B).
[00229] Em algumas modalidades, as células efetoras modificadas compreendem expressão e/ou função reduzida de um ou mais de BCL2L11, FLI1, CALM2, DHODH, UMPS, RBM39, SEMA7A, CHIC2, PCBP1, PBRM1, WDR6, E2F8, SERPINA3, e GNAS, e um ou mais de TNFAIP3, CBLB e BCOR. Em algumas modalidades, as células efeto- ras modificadas compreendem mutações inativadoras de uma ou mais de BCL2L11, FLI1, CALM2, DHODH, UMPS, RBM39, SEMA7A,
CHIC2, PCBP1, PBRM1, WDR6, E2F8, SERPINA3, e GNAS, e com- preendem mutações inativadoras de um ou mais TNFAIP3, CBLB e BCOR. Em algumas modalidades, as células efetoras modificadas compreendem expressão e/ou função reduzida de um ou mais de PTPN1, PTPN2, PTPN22, SH2B3, SH2D1A, PIK3CD e ERG2 e um ou mais de TNFAIP3, CBLB e BCOR. Em algumas modalidades, as célu- las efetoras modificadas compreendem mutações de inativação em um ou mais de PTPN1, PTPN2, PTPN22, SH2B3, SH2D1A, PIK3CD e ERG2, e compreendem mutações de inativação de um ou mais deTN- FAIP3, CBLB e BCOR. Em algumas modalidades, as células efetoras modificadas compreendem expressão e/ou função reduzida de um ou mais PELI1 e um ou mais de TNFAIP3, CBLB e BCOR. Em algumas modalidades, as células efetoras modificadas compreendem mutações de inativação em PELI1 e compreendem mutações de inativação de um ou mais DE TNFAIP3, CBLB e BCOR. Em algumas modalidades, as células efetoras modificadas compreendem expressão e/ou função reduzida de um ou mais de SETD5 e um ou mais de TNFAIP3, CBLB e BCOR. Em algumas modalidades, as células efetoras modificadas compreendem mutações de inativação em SETD5 e compreendem mutações de inativação de um ou mais de TNFAIP3, CBLB e BCOR.
[00230] Em algumas modalidades, as células efetoras modificadas compreendem expressão e/ou função reduzida de pelo menos um ge- ne selecionado dentreBCL2L11, FLI1, CALM2, DHODH, UMPS, RBM39, SEMA7A, CHIC2, PCBP1, PBRM1, WDR6, E2F8, SERPINA3, GNAS, PTPN1, PTPN2, PTPN22, SH2B3, SH2D1A, PIK3CD, ERG2, PELI1, e SETD5 e expressão e/ou função reduzidas de CBLB. Em al- gumas modalidades, as células efetoras modificadas compreendem expressão e/ou função reduzida de pelo menos um gene selecionado dentre BCL2L11, FLI1, CALM2, DHODH, UMPS, RBM39, SEMA7A, CHIC2, PCBP1, PBRM1, WDR6, E2F8, SERPINA3e GNAS e expres-
são e/ou função reduzida do CBLB.
Em algumas modalidades, as cé- lulas efetoras modificadas compreendem expressão e/ou função redu- zidas de pelo menos um gene selecionado entre PTPN1, PTPN2, PTPN22, SH2B3, SH2D1A, PIK3CD, ERG2 e expressão e/ou função reduzidas de CBLB.
Em algumas modalidades, as células efetoras modificadas compreendem expressão e/ou função reduzida de PTPN2 e um ou mais de TNFAIP3, CBLB e BCOR.
Em algumas modalidades, as células efetoras modificadas compreendem mutações inativadoras em PTPN2 e mutações inativadoras em TNFAIP3, CBLB e BCOR.
Em algumas modalidades, as células efetoras modificadas compreendem expressão e/ou função reduzida de PTPN2 e CBLB.
Em algumas mo- dalidades, as células efetoras modificadas compreendem mutações inativadoras em PTPN2 e CBLB.
Em algumas modalidades, as células efetoras modificadas compreendem expressão e/ou função reduzida de PELI1 e um ou mais de TNFAIP3, CBLB e BCOR.
Em algumas modalidades, as células efetoras modificadas compreendem mutações de inativação em PELI1 e mutações de inativação de um ou mais DE TNFAIP3, CBLB e BCOR.
Em algumas modalidades, as células efeto- ras modificadas compreendem expressão e/ou função reduzida de PELI1 e CBLB.
Em algumas modalidades, as células efetoras modifi- cadas compreendem mutações inativadoras em PELI1 e CBLB.
Em algumas modalidades, as células efetoras modificadas compreendem expressão e/ou função reduzida de SETD5 e um ou mais de TNFAIP3, CBLB e BCOR.
Em algumas modalidades, as células efetoras modifi- cadas compreendem mutações de inativação em SETD5 e mutações de inativação de um ou mais deTNFAIP3, CBLB e BCOR.
Em algumas modalidades, as células efetoras modificadas compreendem expres- são e/ou função reduzida de SETD5 e CBLB.
Em algumas modalida- des, as células efetoras modificadas compreendem mutações inativa- doras em SETD5 e CBLB.
[00231] Em algumas modalidades, as células efetoras imunes modi- ficadas compreendem expressão e/ou função reduzida de um gene selecionado dentre IKZF1, IKZF3, GATA3, BCL3, TNIP1, TNFAIP3, NFKBIA, SMAD2, TGFBR1, TGFBR2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6, IKZF2, CBLB, PPP2R2D, NRP1, HAVCR2, LAG3, TIGIT, CTLA4, PTPN6, PDCD1, ou BCOR (por exemplo, um ou mais genes selecio- nados da Tabela 2) e expressão e/ou função reduzida de dois genes selecionados dentre BCL2L11, FLI1, CALM2, DHODH, UMPS, RBM39, SEMA7A, CHIC2, PCBP1, PBRM1, WDR6, E2F8, SERPINA3, GNAS, PTPN1, PTPN2, PTPN22, SH2B3, SH2D1A, PIK3CD, ERG2, PELI1, e SETD5 (por exemplo, um ou mais genes selecionados da Tabela 3). Por exemplo, em algumas modalidades, as células efetoras imunes modificadas compreendem expressão e/ou função reduzida de um gene selecionado dentre IKZF1, IKZF3, GATA3, BCL3, TNIP1, TNFAIP3, NFKBIA, SMAD2, TGFBR1, TGFBR2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6, IKZF2, CBLB, PPP2R2D, NRP1, HAVCR2, LAG3, TIGIT, CTLA4, PTPN6, PDCD1,eBCOR além de expressão reduzida e/ou função de duas combinações de genes-alvo endógenos selecio- nadas nas combinações N°s 1176-1681 (como ilustrado na Fig. 3A - Fig. 3B).
[00232] Em algumas modalidades, as células efetoras imunes modi- ficadas compreendem expressão e/ou função reduzida de um gene selecionado dentre BCL2L11, FLI1, CALM2, DHODH, UMPS, RBM39, SEMA7A, CHIC2, PCBP1, PBRM1, WDR6, E2F8, SERPINA3, GNAS, PTPN1, PTPN2, PTPN22, SH2B3, SH2D1A, PIK3CD, ERG2,PELI1 e SETD5 (por exemplo, um gene selecionado na Tabela 3) e expressão e/ou função reduzidas de dois genes selecionados em IKZF1, IKZF3, GATA3, BCL3, TNIP1, TNFAIP3, NFKBIA, SMAD2, TGFBR1, TGFBR2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6, IKZF2, CBLB, PPP2R2D, NRP1, HAVCR2, LAG3, TIGIT, CTLA4, PTPN6, PDCD1, ou BCOR
(por exemplo, um ou mais genes selecionados da Tabela 2). Por exemplo, em algumas modalidades, as células efetoras imunes modifi- cadas compreendem expressão e/ou função reduzida de qualquer uma das BCL2L11, FLI1, CALM2, DHODH, UMPS, RBM39, SEMA7A, CHIC2, PCBP1, PBRM1, WDR6, E2F8, SERPINA3, GNAS, PTPN1, PTPN2, PTPN22, SH2B3, SH2D1A, PIK3CD, ERG2, PELI1, eSETD5 além da expressão e/ou função reduzidas de duas combinações de genes-alvo endógenos selecionadas a partir das combinações 1-600 ilustradas na Fig. 1A - Fig. 1B.
Em algumas modalidades, as células efetoras imunes modificadas compreendem expressão e/ou função reduzida de um gene selecionado dentre BCL2L11, FLI1, CALM2, DHODH, UMPS, RBM39, SEMA7A, CHIC2, PCBP1, PBRM1, WDR6, E2F8, SERPINA3e GNAS em adição à expressão e/ou função reduzi- da de duas combinações de genes-alvo endógenos selecionadas a partir das combinações N°s 1-600 ilustradas na Fig. 1A - Fig. 1B.
Em algumas modalidades, as células efetoras imunes modificadas com- preendem expressão e/ou função reduzidas de um gene selecionado dentre PTPN1, PTPN2, PTPN22, SH2B3, SH2D1A, PIK3CD, e ERG2 além de expressão reduzida e/ou função de duas combinações de ge- nes-alvo endógenos selecionado a partir da combinação N°s 1-600 ilustrada na Fig. 1A - Fig. 1B.
Em algumas modalidades, as células efetoras imunes modificadas compreendem expressão e/ou função reduzidas de PELI1, além de expressão e/ou função reduzidas de du- as combinações de genes-alvo endógenos selecionados a partir das Combinações N°s. 1-600 ilustradas na Fig. 1A - Fig. 1B.
Em algumas modalidades, as células efetoras imunes modificadas compreendem expressão e/ou função reduzidas de SETD5, além de expressão e/ou função reduzidas de duas combinações de genes-alvo endógenos se- lecionados a partir das Combinações N°s. 1-600 ilustradas na Fig. 1A - Fig. 1B.
[00233] Em algumas modalidades, as células efetoras imunes modi- ficadas compreendem expressão e/ou função reduzida de uma plurali- dade de genes selecionados na Tabela 2 e expressão e/ou função re- duzida de uma pluralidade de genes selecionados na Tabela 3. Em algumas modalidades, as células efetoras imunes modificadas com- preendem expressão e/ou função reduzida de dois genes seleciona- dos na Tabela 2 e expressão e/ou função reduzida de dois genes se- lecionados na Tabela 3. Por exemplo, em algumas modalidades, as células efetoras imunes modificadas compreendem expressão e/ou função reduzida de uma combinação de dois genes selecionados a partir da Combinação N°s. 1176-1681, como mostrado na Fig. 3A - Fig. 3B e uma combinação de dois genes selecionados das combina- ções 1-600, como mostrado na Fig. 1A - Fig. 1B.
Em algumas modali- dades, as células efetoras imunes modificadas podem compreender expressão e/ou função reduzida de três ou mais de IKZF1, IKZF3, GATA3, BCL3, TNIP1, TNFAIP3, NFKBIA, SMAD2, TGFBR1, TGFBR2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6, IKZF2, CBLB, PPP2R2D, NRP1, HAVCR2, LAG3, TIGIT, CTLA4, PTPN6, PDCD1, ou BCOR e expressão e/ou função reduzida de três ou maisBCL2L11, FLI1, CALM2, DHODH, UMPS, RBM39, SEMA7A, CHIC2, PCBP1, PBRM1, WDR6, E2F8, SERPINA3, GNAS, PTPN1, PTPN2, PTPN22, SH2B3, SH2D1A, PIK3CD, ERG2, PELI1, e SETD5. Tabela 2: Genes Endógenos Exemplares Símbolo Nome do gene Ref.
Hu- ID do Ref.
Mu- ID do do Gene mano NCBI rino Uni- NCBI UniProt humano Prot. murino IKZF1 Dedo de zinco da Q13422 10320 Q03267 22778 família IKAROS 1 IKZF2 Dedo de zinco da Q9UKS7 22807 P81183 22779 família IKAROS 2
Símbolo Nome do gene Ref. Hu- ID do Ref. Mu- ID do do Gene mano NCBI rino Uni- NCBI UniProt humano Prot. murino IKZF3 Dedo de zinco da Q9UKT9 22806 O08900 22780 família IKAROS 3 NFKBIA NFKB inibidor alfa P25963 4792 Q9Z1E3 18035 BCL3 CLL de células P20749 602 Q9Z2F6 12051 B/linfoma 3 TNIP1 Proteína de intera- Q15025 10318 Q9WUU8 57783 ção 1 com TNFAIP3 TNFAIP3 Proteína 3 induzida P21580 7128 Q60769 21929 por TNF alfa SMAD2 Membro da família Q15796 4087 Q919P9 17126 SMAD 2 TGFBR1 Receptor do fator P36897 7046 Q64729 21812 beta de crescimen- to de transforma- ção de tipo 1 TGFBR2 Receptor do fator P37173 7048 Q623212 21813 beta de crescimen- to de transforma- ção de tipo 2 TANK Ativador NFKB as- Q92844 10010 P70347 21353 sociado ao mem- bro da família
TRAF FOXP3 caixa para forquilha Q9BZS1 50943 Q99JB6 20371 P3 CBLB Proto-oncogene Q13191 868 Q3TTA7 208650 Cbl B PPP2R2 subunidade de re- Q66LE6 55844 Q7ZX64 52432 D gulaçãoa da prote- ína fosfatase 2 Bdelta NRP1 neuropilina-1 Q14786 8829 P97333 18186
Símbolo Nome do gene Ref. Hu- ID do Ref. Mu- ID do do Gene mano NCBI rino Uni- NCBI UniProt humano Prot. murino HAVCR2 receptor celular do Q8TDQ0 84868 Q8VIM0 171285 vírus 2 da hepatite
A LAG3 ativação de linfóci- P18627 3902 Q61790 16768 tos 3 TIGIT Imunorreceptor de Q495A1 201633 P86176 10004331 células T com do- 4 mínios Ig e ITIM CTLA4 proteína associada P16410 1493 P09793 12477 a linfócitos T cito- tóxicos 4 PTPN6 proteína tirosina P29350 5777 P29351 15170 fosfatase tipo não- receptor 6 BCOR Correpressor BCL6 Q6W2J9 54880 Q8CGN4 71458 GATA3 Proteína de ligação P23771 2625 P23772 14462 3 ao GATA PDCD1 Proteína progra- Q15116 5133 Q02242 18566 mada para morte celular 1 RC3H1 Domínios de dedo Q5TC82 149041 Q4VGL6 381305 anelar e tipo CCCH 1 TRAF6 Fator 6 associado Q9Y4K3 7186 P70196 22034 ao receptor de TNF
Tabela 3: Genes Exemplares para Regulamento Novo Símbolo Nome do gene Ref.
Hu- ID do Ref.
Mu- ID do do Gene mano NCBI rino Uni- NCBI UniProt humano Prot. murino SEMA7A Semaforina 7A O75326 8482 Q9QUR8 20361 RBM39 proteína RNA de Q14498 9584 Q8VH51 170791 motivo de ligação 39 BCL2L11 BCL2 do tipo 11 O43521 10018 O54918 12125 FLI1 Proto-oncogene Q01543 2313 P26323 14247 Fli-1, fator de transcrição ETS CALM2 calmodulina 2 P0P24 805 P0DP30 12314 DHODH di-hidro-orotato Q02127 1723 O35435 56749 desidrogenase (quinona) UMPS uridina monofos- P11172 7372 P13439 22247 fato sintetase CHIC2 domínio hidrofó- Q9UKJ5 26511 Q9D9G3 74277 bico rico em cis- teína 2 PCBP1 proteína de liga- Q15365 5093 P60335 23983 ção poli(rC) 1 PBRM1 polibromo 1 Q86U86 55193 Q8BSQ9 66923 WDR6 Domínio de repe- Q9NNW5 11180 Q99ME2 83669 tição WD 6 E2F8 Fator de transcri- A0AVK6 79733 Q58FA4 108961 ção E2F 8 SERPINA3 família serpina A P01011 12 membro 3 GNAS proteína de liga- Q5JWF2 2778 Q6R0H7 14683 ção ao nucleotí- deo guanina, es- timulante alfa
Símbolo Nome do gene Ref. Hu- ID do Ref. Mu- ID do do Gene mano NCBI rino Uni- NCBI UniProt humano Prot. murino PTPN22 proteína tirosina Q9Y2R2 26191 P29352 19260 fosfatase, tipo não-receptor 22 PTPN1 proteína tirosina P18031 5570 P35821 19246 fosfatase, tipo não-receptor 1 PTPN2 proteína tirosina P17706 5771 Q06180 19255 fosfatase, tipo não-receptor 2 SH2B3 Proteína adapta- Q9UQQ2 10019 O09039 16923 dora SH2B 3 SH2D1A Domínio SH2 O60880 4068 O88890 20400 contendo 1A PIK3CD delta da subuni- O00329 5293 O35904 18707 dade catalítica 3- quinase da fosfa- tidilinositol-4,5- bifosfato ERG2 resposta de cres- P11161 1959 P08152 13654 cimento precoce 2 PELI1 Homólogo da Q96FA3 57162 Q8C669 67245 proteína da ligase ubiquitina- proteína E3 1 SETD5 Proteína 5 con- Q9C0A6 55209 Q5XJV7 72895 tendo domínio
SET III. Sistemas de regulação de genes
[00234] Neste documento, o termo "sistema de regulação de genes" refere-se a uma proteína, ácido nucleico ou combinação dos mesmos que é capaz de modificar uma sequência de DNA alvo endógena quando introduzida em uma célula, regulando assim a expressão ou função do produto genético codificado. Numerosos sistemas de edição de genes adequados para uso nos métodos da presente descrição são conhecidos na técnica, incluindo, entre outros, shRNAs, siRNAs, sis- temas de nuclease de dedos de zinco, sistemas TALEN e sistemas CRISPR/Cas.
[00235] Como usado neste documento, "regular", quando usado em referência ao efeito de um sistema de regulação de genes em um ge- ne-alvo endógeno engloba qualquer alteração na sequência do gene- alvo endógeno, qualquer alteração no estado epigenético do gene-alvo endógeno, e/ou qualquer alteração na expressão ou função da proteí- na codificada pelo gene-alvo endógeno.
[00236] Em algumas modalidades, o sistema de regulação de ge- nes pode mediar uma mudança na sequência do gene-alvo endógeno, por exemplo, introduzindo uma ou mais mutações na sequência alvo endógena, como por inserção ou deleção de um ou mais ácidos nu- cleicos na sequência alvo endógena. Mecanismos exemplares que podem mediar alterações da sequência alvo endógena incluem, mas não estão limitados a junção de extremidade não homóloga (NHEJ) (por exemplo, clássica ou alternativa), junção de extremidade mediada por micro-homologia (MMEJ), reparo direcionado por homologia (por exemplo, mediada por modelo de doador endógeno), SDSA (recozi- mento de fita dependente da síntese), recozimento de fita simples ou invasão de fita simples.
[00237] Em algumas modalidades, o sistema de regulação de ge- nes pode mediar uma mudança no estado epigenético da sequência alvo endógena. Por exemplo, em algumas modalidades, o sistema de regulação de genes pode mediar modificações covalentes do DNA do gene-alvo endógeno (por exemplo, metilação e hidroximetilação de citosina) ou de proteínas histonas associadas (por exemplo, acetilação de lisina, metilação de lisina e arginina, fosforilação de serina e treoni- na, e ubiquitinação e sumoilação de lisina).
[00238] Em algumas modalidades, o sistema de regulação de ge- nes pode mediar uma mudança na expressão da proteína codificada pelo gene-alvo endógeno. Em tais modalidades, o sistema de regula- ção de genes pode regular a expressão da proteína codificada por modificações da sequência de DNA alvo endógena ou agindo no pro- duto de mRNA codificado pela sequência de DNA. Em algumas moda- lidades, o sistema de regulação de genes pode resultar na expressão de uma proteína endógena modificada. Em tais modalidades, as modi- ficações na sequência de DNA endógena mediada pelo sistema de regulação de genes resultam na expressão de uma proteína endógena demonstrando uma função reduzida em comparação com a proteína endógena correspem quente em uma célula efetora imune não modifi- cada. Em tais modalidades, o nível de expressão da proteína endóge- na modificada pode ser aumentado, diminuído ou pode ser o mesmo ou substancialmente semelhante ao nível de expressão da proteína endógena correspem quente em uma célula imune não modificada. A. Sistemas de regulação de genes baseados em ácido nucleico
[00239] Como utilizado neste documento, um sistema de regulação de genes baseado em ácido nucleico é um sistema que compreende uma ou mais moléculas de ácido nucleico que é capaz de regular a expressão de um gene-alvo endógeno sem a necessidade de uma proteína exógena. Em algumas modalidades, o sistema de regulação de genes baseado em ácido nucleico compreende uma molécula de interferência de RNA ou molécula de RNA antisense que é comple- mentar a uma sequência de ácido nucleico alvo.
[00240] Uma "molécula de RNA antisense" refere-se a uma molécu- la de RNA, independentemente do comprimento, que é complementar a um transcrito de mRNA. Moléculas de RNA antisense se referem a moléculas de RNA de fita simples que podem ser introduzidas em uma célula, tecido ou sujeito e resultam em diminuição da expressão de um produto de gene-alvo endógeno por meio de mecanismos que não de- pendem de vias endógenas de silenciamento de genes, mas sim con- fiar na degradação do transcrito de mRNA alvo mediada por RNaseH. Em algumas modalidades, um ácido nucleico antisense compreende uma estrutura principal modificada, por exemplo, fosforotioato, fosforo- ditioato ou outros conhecidos na técnica, ou pode compreender liga- ções internucleosídicas não naturais. Em algumas modalidades, um ácido nucleico antisense pode compreender ácidos nucleicos bloquea- dos (LNA).
[00241] "Molécula de interferência de RNA", conforme utilizado nes- te documento, refere-se a um polinucleotídeo de RNA que medeia a expressão diminuída de um produto de gene-alvo endógeno pela de- gradação de um mRNA alvo através de vias de silenciamento de ge- nes endógenos (por exemplo, Dicer e complexo de silenciamento in- duzido por RNA (RISC)). Agentes de interferência de RNA exemplifica- tivos incluem micro RNAs (também referidos neste documento como "miRNAs"), RNAs de hair-pin curto (shRNAs), pequenos RNAs interfe- rentes (siRNAs), aptâmeros de RNA e morfolinos.
[00242] Em algumas modalidades, o sistema de regulação de ge- nes baseado em ácido nucleico compreende um ou mais miRNAs. miRNAs referem-se a pequenas moléculas de RNA não codificantes de ocorrência natural com cerca de 21 a 25 nucleotídeos de compri- mento. Os miRNAs são pelo menos parcialmente complementares a uma ou mais moléculas de mRNA alvo. Os miRNAs podem regular negativamente (por exemplo, diminuir) a expressão de um produto de gene-alvo endógeno por meio de repressão translacional, clivagem do mRNA e/ou de adenilação.
[00243] Em algumas modalidades, o sistema de regulação de ge-
nes baseado em ácido nucleico compreende um ou mais shRNAs. Os shRNAs são moléculas de RNA de cadeia simples com cerca de 50-70 nucleotídeos de comprimento que formam estruturas de stem-loop e resultam na degradação de sequências complementares de mRNA. Os shRNAs podem ser clonados em plasmídeos ou em vetores virais recombinantes não replicantes a serem introduzidos intracelularmente e resultar na integração da sequência que codifica o shRNA no geno- ma. Como tal, um shRNA pode proporcionar uma repressão estável e consistente da tradução e expressão de genes-alvo endógenos.
[00244] Em algumas modalidades, o sistema de regulação de ge- nes baseado em ácido nucleico compreende um ou mais siRNAs. siRNAs referem-se a moléculas de RNA de fita dupla tipicamente com cerca de 21-23 nucleotídeos de comprimento. O siRNA se associa a um complexo multiproteico denominado complexo de silenciamento induzido por RNA (RISC), durante o qual a fita de sense do "passagei- ro" é clivada enzimaticamente. A fita "guia" antisense contida no RISC ativado, em seguida, guia o RISC para o mRNA correspem quente por causa da homologia da sequência e a mesma nuclease corta o mRNA alvo, resultando em silenciamento genético específico. Idealmente, um siRNA tem 18, 19, 20, 21, 22, 23 ou 24 nucleotídeos de comprimento e tem uma saliência de 2 bases na sua extremidade 3'. Os siRNAs po- dem ser introduzidos em uma célula individual e/ou sistema de cultura e resultar na degradação das sequências alvo de mRNA. siRNAs e shRNAs são descritos adicionalmente em Fire et al., Nature, 391: 19, 1998 e Patentes US N°s. 7.732.417; 8.202.846; e 8.383.599.
[00245] Em algumas modalidades, o sistema de regulação de ge- nes à base de ácido nucleico compreende um ou mais morfolinos. "Morfolino", como utilizado neste documento, refere-se a um oligômero de ácido nucleico modificado, em que as bases padrão de ácido nu- cleico estão ligadas aos anéis de morfolina e estão ligadas através de ligações de fosforodiamidato. Semelhante ao siRNA e shRNA, os mor- folinos se ligam a sequências complementares de mRNA. No entanto, os morfolinos funcionam através da inibição estérica da tradução de mRNA e da alteração do splicing de mRNA, em vez de direcionar se- quências complementares de mRNA para degradação.
[00246] Em algumas modalidades, o sistema de regulação de ge- nes baseado em ácido nucleico compreende uma molécula de ácido nucleico (por exemplo, um siRNA, um shRNA, um aptâmero de RNA ou um morfolino) que se liga a uma sequência de RNA alvo que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ou é 100% idênti- ca a um RNA codificado por uma sequência de DNA de um gene-alvo selecionado de Ikzf1, IKZF3, GATA3, BCL3, TNIP1, TNFAIP3, NFK- BIA, SMAD2, TGFBR1, TGFBR2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6, IKZF2, CBLB, PPP2R2D, NRP1, HAVCR2, LAG3, TIGIT, CTLA4, PTPN6, PDCD1 ou BCOR (ou seja, aqueles listados na Tabela 2). Em algumas modalidades, o sistema de regulação de genes baseado em ácido nucleico compreende uma molécula de ácido nucleico (por exemplo, um siRNA, um shRNA, um RNA aptâmero ou um morfolino) que se liga a uma sequência de RNA alvo que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica, ou é 100% idêntica a uma se- quência de RNA codificada por uma sequência de DNA definida por um conjunto de coordenadas genômicas mostradas na Tabela 5A ou na Tabela 5B. Em todo este pedido, as coordenadas genômicas refe- renciadas são baseadas em anotações genômicas no conjunto GRCh38 (também conhecido como hg38) do genoma humano do Ge- nome Reference Consortium, disponível no site do National Center for Biotechnology Information. Ferramentas e métodos para converter co- ordenadas genômicas entre um conjunto e outro são conhecidos na técnica e podem ser usados para converter as coordenadas genômi- cas fornecidas, neste documento, nas coordenadas correspem quen-
tes em outro conjunto do genoma humano, incluindo a conversão para um conjunto anterior gerado pelo mesmo instituição ou usando o mesmo algoritmo (por exemplo, de GRCh38 para GRCh37) e conver- ter um conjunto gerado por uma instituição ou algoritmo diferente (por exemplo, de GRCh38 para NCBI33, gerado pelo International Human Genome Sequencing Consortium). Os métodos e ferramentas disponí- veis conhecidos na técnica incluem, entre outros, o Serviço de Rema- peamento de Genoma da NCBI, disponível no site do National Center for Biotechnology Information, UCSC LiftOver, disponível no site da UCSC Genome Brower, e Assembly Converter, disponível no site En- sembl.org.
[00247] Em algumas modalidades, o sistema de regulação de ge- nes baseado em ácido nucleico compreende uma molécula de ácido nucleico (por exemplo, um siRNA, um shRNA, um RNA aptâmero ou um morfolino) que se liga a uma sequência de RNA alvo que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% são idênticos ou são 100% idênticas a uma sequência de RNA codificada por uma das SEQ ID NOs: 154-498 ou SEQ ID NOs: 499-813. Em algumas modalidades, o sistema de regulação de genes baseado em ácido nucleico é capaz de reduzir a expressão e/ou função de BCOR e compreende uma molécu- la de ácido nucleico (por exemplo, um siRNA, um shRNA, um RNA ap- tâmero ou um morfolino) que se liga a uma sequência de RNA alvo que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ou é 100% idêntica a uma sequência de RNA codificada por uma das SEQ ID NOs: 708-772 ou SEQ ID NOs: 708-764. Em algumas modalidades, o sistema de regulação de genes baseado em ácido nucleico é capaz de reduzir a expressão e/ou função de TNFAIP3 e compreende uma molécula de ácido nucleico (por exemplo, um siRNA, um shRNA, um RNA aptâmero ou um morfolino) que se liga a uma sequência de RNA alvo que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ou é 100% idêntica a uma sequência de RNA codificada por uma das SEQ ID NOs: 348-396 ou SEQ ID NOs: 348-386. Em algumas modali- dades, o sistema de regulação de genes baseado em ácido nucleico é capaz de reduzir a expressão e/ou função de CBLB e compreende uma molécula de ácido nucleico (por exemplo, um siRNA, um shRNA, um RNA aptâmero ou um morfolino) que se liga a uma sequência de RNA alvo que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idên- tica ou é 100% idêntica a uma sequência de RNA codificada por uma das SEQ ID NOS: 499-524. Em algumas modalidades, o sistema de regulação de genes baseado em ácido nucleico compreende uma mo- lécula de siRNA ou uma molécula shRNA selecionada dentre as co- nhecidas na técnica, como os construtos de siRNA e shRNA disponí- veis de fornecedores comerciais, como Sigma Aldrich, Dharmacon, ThermoFisher e similares.
[00248] Em algumas modalidades, o gene-alvo endógeno é CBLB e a molécula de ácido nucleico é um shRNA codificado por uma sequên- cia de ácido nucleico selecionada de SEQ ID NOs: 41-44 (Ver Publica- ção Internacional PCT N° 2018156886) ou selecionada de SEQ ID NOS: 45 -53 (Ver Publicação Internacional PCT N°. WO 2017120998). Em algumas modalidades, o gene-alvo endógeno é CBLB e a molécu- la de ácido nucleico é um siRNA compreendendo uma sequência de ácido nucleico selecionada de SEQ ID NOS: 54-63 (Veja a Publicação Internacional PCT N°. WO 2018006880) ou SEQ ID NOs: 64-73 (Ver as Publicações Internacionais PCT N°s WO 2018120998 e WO 2018137293).
[00249] Em algumas modalidades, o gene-alvo endógeno é TNFAIP3 e a molécula de ácido nucleico é um shRNA codificado por uma sequência de ácido nucleico selecionada a partir de SEQ ID NOS: 74-95 (Ver Patente US N°. 8.324.369). Em algumas modalidades, o gene-alvo endógeno é TNFAIP3 e a molécula de ácido nucleico é um siRNA compreendendo uma sequência de ácido nucleico selecionada de SEQ ID NOS: 96-105 (Veja a Publicação Internacional PCT N°. WO 2018006880).
[00250] Em algumas modalidades, o gene-alvo endógeno é CTLA4 e a molécula de ácido nucleico é um shRNA codificado por uma se- quência de ácido nucleico selecionada de SEQ ID NOS: 128-133 (Veja a Publicação Internacional PCT N°. N°s WO 2017120996). Em algu- mas modalidades, o gene-alvo endógeno é CTLA4 e a molécula de ácido nucleico é um siRNA compreendendo uma sequência de ácido nucleico selecionada de SEQ ID NOS: 134-143 (Veja a Publicação In- ternacional PCT N°. WO2017120996, WO 2017120998, WO 2018137295 e WO 2018137293) ou SEQ ID NOs: 144-153 (Ver a Pu- blicação Internacional PCT N°. WO 2018006880).
[00251] Em algumas modalidades, o gene-alvo endógeno é PDCD1 e a molécula de ácido nucleico é um shRNA codificado por uma se- quência de ácido nucleico selecionada da SEQ ID NOs: 106-107 (Ver a Publicação Internacional PCT N°. WO 2017120996). Em algumas modalidades, o gene-alvo endógeno é PDCD1 e a molécula de ácido nucleico é um siRNA compreendendo uma sequência de ácido nuclei- co selecionada de SEQ ID NOS: 108-117 (Veja a Publicação Interna- cional PCT N°s. WO2017120996, WO 201712998, WO 2018137295 e WO 2018137293) ou SEQ ID NOS: 118-127 (Ver a Publicação Inter- nacional PCT N°. WO 2018006880).
[00252] Em algumas modalidades, o sistema de regulação de ge- nes baseado em ácido nucleico compreende uma molécula de ácido nucleico (por exemplo, um siRNA, um shRNA, um RNA aptâmero ou um morfolino) que se liga a uma sequência de RNA alvo que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ou é 100% idênti- ca a uma sequência de RNA codificada por uma sequência de DNA de um gene-alvo selecionadoBCL2L11, FLI1, CALM2, DHODH, UMPS,
RBM39, SEMA7A, CHIC2, PCBP1, PBRM1, WDR6, E2F8, SERPINA3, GNAS, PTPN1, PTPN2, PTPN22, SH2B3, SH2D1A, PIK3CD, ERG2, PELI1, e SETD5 (isto é, aqueles listados na Tabela 3). Em algumas modalidades, o sistema de regulação de genes baseado em ácido nu- cleico compreende uma molécula de ácido nucleico (por exemplo, um siRNA, um shRNA, um RNA aptâmero ou um morfolino) que se liga a uma sequência de RNA alvo que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99%, ou é 100% idêntica a uma sequência de RNA idêntica codificada por uma sequência de DNA definida por um conjunto de co- ordenadas genômicas mostradas na Tabela 6A - Tabela 6H. Em algu- mas modalidades, o sistema de regulação de genes baseado em ácido nucleico compreende uma molécula de ácido nucleico (por exemplo, um siRNA, um shRNA, um RNA aptâmero ou um morfolino) que se liga a uma sequência de RNA alvo que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% ou 100% idênticas a uma sequência de RNA codifi- cada por uma das SEQ ID NOs: 814-1367.
[00253] Em algumas modalidades, o sistema de regulação de ge- nes baseado em ácido nucleico é capaz de reduzir a expressão e/ou função de um gene-alvo selecionado BCL2L11, FLI1, CALM2, DHODH, UMPS, RBM39, SEMA7A, CHIC2, PCBP1, PBRM1, WDR6, E2F8, SERPINA3 e GNAS. Em algumas modalidades, o sistema de regulação de genes baseado em ácido nucleico compreende uma mo- lécula de ácido nucleico (por exemplo, um siRNA, um shRNA, um RNA aptâmero ou um morfolino) que se liga a uma sequência de RNA alvo que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99%, ou é 100% idêntica a uma sequência de RNA idêntica codificada por uma se- quência de DNA definida por um conjunto de coordenadas genômicas mostradas em uma das Tabela 6A ou Tabela 6B. Em algumas modali- dades, o sistema de regulação de genes baseado em ácido nucleico compreende uma molécula de ácido nucleico (por exemplo, um siRNA,
um shRNA, um RNA aptâmero ou um morfolino) que se liga a uma se- quência de RNA alvo que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% ou 100% idênticas a uma sequência de RNA codificada por uma das SEQ ID NOs: 814-1064.
[00254] Em algumas modalidades, o sistema de regulação de ge- nes baseado em ácido nucleico é capaz de reduzir a expressão e/ou função de um gene-alvo selecionado entre PTPN1, PTPN2, PTPN22, SH2B3, SH2D1A, PIK3CD e ERG2. Em algumas modalidades, o sis- tema de regulação de genes baseado em ácido nucleico compreende uma molécula de ácido nucleico (por exemplo, um siRNA, um shRNA, um RNA aptâmero ou um morfolino) que se liga a uma sequência de RNA alvo que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99%, ou é 100% idêntica a uma sequência de RNA idêntica codificada por uma sequência de DNA definida por um conjunto de coordenadas genômi- cas mostradas em uma das Tabela 6C ou Tabela 6D. Em algumas modalidades, o sistema de regulação de genes baseado em ácido nu- cleico compreende uma molécula de ácido nucleico (por exemplo, um siRNA, um shRNA, um RNA aptâmero ou um morfolino) que se liga a uma sequência de RNA alvo que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% ou 100% idênticas a uma sequência de RNA codificada por uma das SEQ ID NOs: 1065-1329. Em algumas modalidades, o sistema de regulação de genes baseado em ácido nucleico é capaz de reduzir a expressão e/ou função dePTPN2 e compreende uma molé- cula de ácido nucleico (por exemplo, um siRNA, um shRNA, um RNA aptâmero ou um morfolino) que se liga a uma sequência de RNA alvo que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ou é 100% idêntica a uma sequência de RNA codificada por uma das SEQ ID NOS: 1112-1227. Em algumas modalidades, o sistema de regula- ção de genes baseado em ácido nucleico é capaz de reduzir a expres- são e/ou função de PTPN2 e compreende uma molécula de ácido nu-
cleico (por exemplo, um siRNA, um shRNA, um RNA aptâmero ou um morfolino) que se liga a uma sequência de RNA alvo que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ou é 100% idêntica a uma sequência de RNA codificada por uma das SEQ ID NOS: 1112-1148.
[00255] Em algumas modalidades, o sistema de regulação de ge- nes baseado em ácido nucleico é capaz de reduzir a expressão e/ou função de PELI1. Em algumas modalidades, o sistema de regulação de genes baseado em ácido nucleico compreende uma molécula de ácido nucleico (por exemplo, um siRNA, um shRNA, um RNA aptâme- ro ou um morfolino) que se liga a uma sequência de RNA alvo que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99%, ou é 100% idêntica a uma sequência de RNA codificada por uma sequência de DNA defini- da por um conjunto de coordenadas genômicas mostradas em uma das Tabela 6E ou Tabela 6F. Em algumas modalidades, o sistema de regulação de genes baseado em ácido nucleico compreende uma mo- lécula de ácido nucleico (por exemplo, um siRNA, um shRNA, um RNA aptâmero ou um morfolino) que se liga a uma sequência de RNA alvo que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% ou 100% idênti- cas a uma sequência de RNA codificada por uma das SEQ ID NOs: 1330-1350.
[00256] Em algumas modalidades, o sistema de regulação de ge- nes baseado em ácido nucleico é capaz de reduzir a expressão e/ou função de SETD5. Em algumas modalidades, o sistema de regulação de genes baseado em ácido nucleico compreende uma molécula de ácido nucleico (por exemplo, um siRNA, um shRNA, um RNA aptâme- ro ou um morfolino) que se liga a uma sequência de RNA alvo que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99%, ou é 100% idêntica a uma sequência de RNA codificada por uma sequência de DNA defini- da por um conjunto de coordenadas genômicas mostradas em uma das Tabela 6G ou Tabela 6H. Em algumas modalidades, o sistema de regulação de genes baseado em ácido nucleico compreende uma mo- lécula de ácido nucleico (por exemplo, um siRNA, um shRNA, um RNA aptâmero ou um morfolino) que se liga a uma sequência de RNA alvo que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% ou 100% idênti- cas a uma sequência de RNA codificada por uma das SEQ ID NOs: 1351-1367.
[00257] Em algumas modalidades, o sistema de regulação de ge- nes baseado em ácido nucleico compreende uma molécula de siRNA ou uma molécula shRNA selecionada dentre as conhecidas na técnica, como aqueles disponíveis de fornecedores comerciais como Sigma Aldrich, Dharmacon, ThermoFisher e similares. Construtos de siRNA e shRNA exemplificativas são descritas na Tabela 4A e na Tabela 4B abaixo. Em algumas modalidades, o sistema de regulação de genes baseado em ácido nucleico compreende duas ou mais moléculas de siRNA selecionadas dentre as conhecidas na técnica, como os cons- trutos de siRNA descritas na Tabela 4A. Em algumas modalidades, o sistema de regulação de genes baseado em ácido nucleico compreen- de duas ou mais moléculas de shRNA selecionadas dentre as conhe- cidas na técnica, como os construtos de shRNA descritas na Tabela 4B. Tabela 4A: Construtos exemplificativos de siRNA Gene-alvo Construto siRNA MISSION® esiRNA humano SEMA7A (esiR- NA1) (produto SigmaAldrich #EHU143161) MISSION® esiRNA direcionando o camun- dongo Sema7a (esiRNA1) (Produto SigmaAl- SEMA7A drich #EMU010311) Previsões de Rosetta para humano (produto SigmaAldrich #NM_003612) Previsões de Rosetta para murino (produto SigmaAldrich# NM_011352)
Gene-alvo Construto siRNA MISSION® esiRNA humano RBM39 (esiR- NA1) (produto SigmaAldrich# EHU070351) Previsões de Rosetta para humano (produto SigmaAldrich# NM_004902) Previsões de Rosetta para humano (produto SigmaAldrich# NM_184234) RBM39 Previsões de Rosetta para humano (produto SigmaAldrich# NM_184237) Previsões de Rosetta para humano (produto SigmaAldrich# NM_184241) Previsões de Rosetta para humano (produto SigmaAldrich# NM_184244) MISSION® esiRNA direcionando o camun- dongo Bcl2l11 (esiRNA1) (Produto SigmaAl- drich # Previsões de Rosetta para humano (produto SigmaAldrich# NM_006538) Previsões de Rosetta para humano (produto BCL2L11 SigmaAldrich# NM_138621) Previsões de Rosetta para humano (produto SigmaAldrich# NM_138622) Previsões de Rosetta para humano (produto SigmaAldrich# NM_138623) Previsões de Rosetta para humano (produto SigmaAldrich# NM_138624) MISSION® esiRNA humano FLI1 (esiRNA1) (produto SigmaAldrich# EHU091961) MISSION® esiRNA direcionando o camun- dongo Fli1 (esiRNA1) (Produto SigmaAldrich# FLI1 EMU090601) Previsões de Rosetta para humano (produto SigmaAldrich# NM_002017) Previsões de Rosetta para murino (produto SigmaAldrich# NM_008026)
Gene-alvo Construto siRNA MISSION® esiRNA humano CALM2 (esiR- NA1) (produto SigmaAldrich # EHU110161) MISSION® esiRNA direcionando o camun- dongo Calm2 (produto SigmaAldrich # CALM2 EMU176331) Previsões de Rosetta para humano (produto SigmaAldrich# NM_001743) Previsões de Rosetta para murino (produto SigmaAldrich# NM_007589) MISSION® esiRNA humano DHODH (esiR- NA1) (produto SigmaAldrich# EHU138421) MISSION® esiRNA direcionando o camun- dongo Dhodh (esiRNA1) (produto SigmaAl- DHODH drich # EMU072221) Previsões de Rosetta para humano (produto SigmaAldrich# NM_001025193) Previsões de Rosetta para humano (produto SigmaAldrich# NM_001361) DHODH Previsões de Rosetta para murino (produto SigmaAldrich# NM_020046) MISSION® esiRNA humano UMPS (esiRNA1) (produto SigmaAldrich # EHU093891) MISSION® esiRNA direcionando o camun- dongo Umps (esiRNA1) (Produto SigmaAl- UMPS drich # EMU023181) Previsões de Rosetta para humano (produto SigmaAldrich# NM_000373) Previsões de Rosetta para murino (produto SigmaAldrich# NM_009471) MISSION® esiRNA humano CHIC2 (esiR- NA1) (produto SigmaAldrich# EHU137501) CHIC2 MISSION® esiRNA direcionando o camun- dongo Chic2 (esiRNA1) (produto SigmaAldrich # EMU019221
Gene-alvo Construto siRNA Previsões de Rosetta para humano (produto SigmaAldrich# NM_012110) Previsões de Rosetta para murino (produto SigmaAldrich# NM_028850) MISSION® esiRNA direcionando o camun- dongo Pcbp1 (esiRNA1) (produto SigmaAl- drich # EMU011551) PCBP1 Previsões de Rosetta para humano (produto SigmaAldrich# NM_006196) Previsões de Rosetta para murino (produto SigmaAldrich# NM_011865) MISSION® esiRNA humano PBRM1 (esiR- NA1) (produto SigmaAldrich # EHU075001) Previsões de Rosetta para humano (produto SigmaAldrich# NM_018165) PBRM1 Previsões de Rosetta para humano (produto SigmaAldrich# NM_018313) Previsões de Rosetta para humano (produto SigmaAldrich# NM_181042) MISSION® esiRNA humano WDR6 (esiRNA1) (produto SigmaAldrich# EHU065441) MISSION® esiRNA direcionando o camun- dongo Wdr6 (esiRNA1) (Produto SigmaAldrich WDR6 # EMU038981) Previsões de Rosetta para humano (produto SigmaAldrich# NM_018031) Previsões de Rosetta para murino (produto SigmaAldrich# NM_031392) MISSION® esiRNA humano E2F8 (esiRNA1) (produto SigmaAldrich # EHU025641) E2F8 MISSION® esiRNA direcionando o camun- dongo E2f8 (produto SigmaAldrich # EMU206861)
Gene-alvo Construto siRNA Previsões de Rosetta para humano (produto SigmaAldrich# NM_024680) Previsões de Rosetta para murino (produto SigmaAldrich# NM_001013368) MISSION® esiRNA humano SERPINA3 (esiRNA1) (produto SigmaAldrich # SERPINA3 EHU150301) Previsões de Rosetta para humano (produto SigmaAldrich# NM_001085) MISSION® esiRNA humano GNAS (esiRNA1) (produto SigmaAldrich # EHU117321) MISSION® esiRNA direcionando o camun- dongo Gnas (esiRNA1) (Produto SigmaAldrich # EMU074141) GNAS Previsões de Rosetta para humano (produto SigmaAldrich# NM_000516) Previsões de Rosetta para humano (produto SigmaAldrich# NM_001077488) Previsões de Rosetta para humano (produto SigmaAldrich# NM_001077489) Previsões de Rosetta para humano (produto SigmaAldrich# NM_001077490)
GNAS Previsões de Rosetta para humano (produto SigmaAldrich# NM_016592) MISSION® esiRNA humano PTPN22 (esiR- NA1) (SigmaAldrich # EHU088211) MISSION® esiRNA direcionando o camun- dongo Ptpn22 (esiRNA1) (SigmaAldrich # PTPN22 EMU052181) MISSION® Fosfatase Humana PTPN22 siR- NA1, Nano Scale (SigmaAldrich # SIHP0754) Previsões de Rosetta para humano (Sigma- Aldrich # NM_012411)
Gene-alvo Construto siRNA Previsões de Rosetta para humano (Sigma- Aldrich # NM_015967) Previsões de Rosetta para murino (SigmaAl- PTPN22 drich # NM_008979) EsiRNA da MISSION® direcionando o PTPN1 humano (esiRNA1) (SigmaAldrich # EHU016451) MISSION® esiRNA direcionando o camun- PTPN1 dongo Ptpn1 (esiRNA1) (SigmaAldrich # EMU061791) Previsões de Rosetta para murino (SigmaAl- drich # NM_011201) MISSION® esiRNA humano PTPN2 (esiR- NA1) (SigmaAldrich # EHU113971) Previsões de Rosetta para humano (Sigma- Aldrich # NM_002828) Previsões de Rosetta para humano (Sigma- PTPN2 Aldrich # NM_080422) Previsões de Rosetta para humano (Sigma- Aldrich # NM_080423) Previsões de Rosetta para murino (SigmaAl- drich # NM_001127177) MISSION® esiRNA humano SH2B3 (esiR- NA1) (SigmaAldrich # EHU053031) MISSION® esiRNA direcionando o camundo- go Sh2b3 (esiRNA1) (SigmaAldrich # SH2B3 EMU029221) Previsões de Rosetta para humano (Sigma- Aldrich # NM_005475) Previsões de Rosetta para murino (SigmaAl- drich # NM_008507) MISSION® esiRNA humano SH2D1A (esiR- SH2D1A NA1) (SigmaAldrich # EHU088391)
Gene-alvo Construto siRNA MISSION® esiRNA humano SH2D1A (esiR- NA2) (SigmaAldrich # EHU097811) MISSION® esiRNA humano SH2D1A (esiR- NA3) (SigmaAldrich # EHU124931) Previsões de Rosetta para humano (Sigma- Aldrich # NM_001114937) Previsões de Rosetta para murino (SigmaAl- drich # NM_011364) EsiRNA MISSION® PIK3CD (esiRNA1) (Sig- maAldrich # EHU113461) MISSION® esiRNA direcionando o camun- dongo Pik3cd (esiRNA1) (SigmaAldrich # PIK3CD EMU089261) Previsões de Rosetta para humano (Sigma- Aldrich # NM_005026) Previsões de Rosetta para murino (SigmaAl- drich # NM_008840) MISSION® esiRNA humano EGR2 (esiRNA1) (SigmaAldrich # EHU124311) MISSION® esiRNA direcionando o camun- dongo Egr2 (SigmaAldrich # EMU152961) EGR2 Previsões Rosetta humana (SigmaAldrich # NM_000399) Previsões de Rosetta para murino (SigmaAl- drich # NM_010118) MISSION® esiRNA humano PELI1 (esiRNA1) (SigmaAldrich # EHU050891) MISSION® esiRNA direcionando o camun- dongo Peli1 (SigmaAldrich # EMU164651) PELI1 Previsões de Rosetta para humano (SigmaAl- drich # NM_020651) Previsões de Rosetta para camundogo (Sig- maAldrich # NM_023324)
Gene-alvo Construto siRNA Previsões de Rosetta para camundongo (SigmaAldrich # NM_030015) MISSION® esiRNA humano SETD5 (esiR- NA1) (SigmaAldrich # EHU058931) MISSION® esiRNA direcionando o camun- dongo Setd5 (esiRNA1) (SigmaAldrich # EMU004231) Previsões de Rosetta para humano (SigmaAl- drich # NM_001080517) SETD5 Previsões de Rosetta para humano (SigmaAl- drich # XM_371614) Previsões de Rosetta para humano (SigmaAl- drich # XM_926615) Previsões de Rosetta para humano (SigmaAl- drich # XM_931376) Previsões de Rosetta para humano (SigmaAl- drich # XM_931385) Tabela 4B: Construtos de shRNA exemplificativas Gene-alvo Construto shRNA DNA do plasmídeo murino MISSION® shRNA (produto SigmaAldrich # SHCLND- NM_011352) SEMA7A DNA do plasmídeo humano MISSION® shR- NA (produto SigmaAldrich # SHCLND- NM_003612) DNA do plasmídeo murino MISSION® shRNA (produto SigmaAldrich # SHCLND- NM_133242) RBM39 DNA do plasmídeo humano MISSION® shR- NA (produto SigmaAldrich # SHCLND- NM_004902) DNA do plasmídeo murino MISSION® shRNA BCL2L11 (produto SigmaAldrich # SHCLND- NM_009754)
Gene-alvo Construto shRNA DNA do plasmídeo humano MISSION® shR- NA (produto SigmaAldrich # SHCLND- NM_138621) DNA do plasmídeo humano MISSION® shR- NA (produto SigmaAldrich # SHCLND- NM_002017 FLI1 DNA do plasmídeo murino MISSION® shRNA (produto SigmaAldrich # SHCLND- NM_008026) DNA do plasmídeo murino MISSION® shRNA (produto SigmaAldrich # SHCLND- NM_007589) CALM2 DNA do plasmídeo humano MISSION® shR- NA (produto SigmaAldrich # SHCLND- NM_001743) DNA do plasmídeo murino MISSION® shRNA (produto SigmaAldrich # SHCLND- NM_020046)
DHODH DNA do plasmídeo humano MISSION® shR- NA (produto SigmaAldrich # SHCLND- NM_001361) DNA do plasmídeo murino MISSION® shRNA (produto SigmaAldrich # SHCLND- NM_009471)
UMPS DNA do plasmídeo humano MISSION® shR- NA (produto SigmaAldrich # SHCLND- NM_000373) DNA do plasmídeo murino MISSION® shRNA (produto SigmaAldrich # SHCLND- NM_028850) CHIC2 DNA do plasmídeo humano MISSION® shR- NA (produto SigmaAldrich # SHCLND- NM_012110)
Gene-alvo Construto shRNA DNA do plasmídeo murino MISSION® shRNA (produto SigmaAldrich # SHCLND- NM_011865) PCBP1 DNA do plasmídeo humano MISSION® shR- NA (produto SigmaAldrich # SHCLND- NM_006196) DNA do plasmídeo murino MISSION® shRNA PBRM1 (produto SigmaAldrich # SHCLND- NM_001081251) DNA do plasmídeo humano MISSION® shR- PBRM1 NA (produto SigmaAldrich # SHCLND- NM_018165) DNA do plasmídeo murino MISSION® shRNA (produto SigmaAldrich # SHCLND- NM_031392) WDR6 DNA do plasmídeo humano MISSION® shR- NA (produto SigmaAldrich # SHCLND- NM_018031) DNA do plasmídeo murino MISSION® shRNA (produto SigmaAldrich # SHCLND- NM_001013368) E2F8 DNA do plasmídeo humano MISSION® shR- NA (produto SigmaAldrich # SHCLND- NM_024680) DNA do plasmídeo humano MISSION® shR- SERPINA3 NA (produto SigmaAldrich # SHCLND- NM_001085) DNA do plasmídeo murino MISSION® shRNA (produto SigmaAldrich # SHCLND- NM_010309)
GNAS DNA do plasmídeo humano MISSION® shR- NA (produto SigmaAldrich # SHCLND- NM_000516) Plasmídeo humano MISSION® shRNA (Sig- PTPN22 maAldrich # SHCLND-NM_012411)
Gene-alvo Construto shRNA Plasmídeo murino MISSION® shRNA (Sig- maAldrich # SHCLND-NM_008979) Plasmídeo humano MISSION® shRNA (Sig- maAldrich # SHCLND-NM_002827) PTPN1 Plasmídeo murino MISSION® shRNA (Sig- maAldrich # SHCLND-NM_011201) Plasmídeo humano MISSION® shRNA (Sig- maAldrich # SHCLND-NM_002828) PTPN2 Plasmídeo murino MISSION® shRNA (Sig- maAldrich # SHCLND-NM_008977) Plasmídeo humano MISSION® shRNA (Sig- maAldrich # SHCLND-NM_005475) SH2B3 Plasmídeo murino MISSION® shRNA (Sig- maAldrich # SHCLND-NM_008507) Plasmídeo humano MISSION® shRNA (Sig- maAldrich # SHCLND-NM_002351) SH2D1A Plasmídeo murino MISSION® shRNA (Sig- maAldrich # SHCLND-NM_011364) Plasmídeo humano MISSION® shRNA (Sig- maAldrich # SHCLND-NM_005026) PIK3CD Plasmídeo murino MISSION® shRNA (Sig- maAldrich # SHCLND-NM_008840) Plasmídeo humano MISSION® shRNA (Sig- maAldrich # SHCLND-NM_000399) EGR2 Plasmídeo murino MISSION® shRNA (Sig- maAldrich # SHCLND-NM_010118) DNA do plasmídeo humano MISSION® shR- NA (SigmaAldrich # SHCLND-NM_020651) PELI1 DNA plasmídeo de camundongo MISSION® shRNA (SigmaAldrich # SHCLND- NM_023324) DNA do plasmídeo humano MISSION® shR- SETD5 NA (SigmaAldrich # SHCLND- NM_001080517)
Gene-alvo Construto shRNA DNA plasmídeo de camundongo MISSION® shRNA (SigmaAldrich # SHCLND- NM_028385)
[00258] Em algumas modalidades, o sistema de regulação de ge- nes compreende duas ou mais moléculas de ácido nucleico (por exemplo, dois ou mais siRNAs, dois ou mais shRNAs, dois ou mais aptâmeros de RNA ou dois ou mais morfolinos), em que pelo menos um dos ácidos nucleicos moléculas se ligam a uma sequência de RNA alvo que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ou é 100% idêntica a uma sequência de RNA codificada por uma sequên- cia de DNA de um gene-alvo selecionado de IKZF1, IKZF3, GATA3, BCL3, TNIP1, TNFAIP3, NFKBIA, SMAD2, TGFBR1, TGFBR2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6, IKZF2, CBLB, PPP2R2D, NRP1, HAVCR2, LAG3, TIGIT, CTLA4, PTPN6, PDCD1, ou BCOR (por exemplo, um gene selecionado da Tabela 2) e em que pelo menos uma das molécu- las de ácido nucleico se liga a uma sequência de RNA alvo que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica, ou é 100% idênti- ca a uma sequência de RNA codificada por uma sequência de DNA de um gene-alvo selecionadoBCL2L11, FLI1, CALM2, DHODH, UMPS, RBM39, SEMA7A, CHIC2, PCBP1, PBRM1, WDR6, E2F8, SERPINA3, GNAS, PTPN1, PTPN2, PTPN22, SH2B3, SH2D1A, PIK3CD, ERG2, PELI1, e SETD5 (por exemplo, um gene selecionado da Tabela 3).
[00259] Em algumas modalidades, pelo menos uma das duas ou mais moléculas de ácido nucleico de uma sequência de RNA alvo que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ou 100% idêntica a uma sequência de RNA codificada por uma sequência de DNA definida por um conjunto de coordenadas genômicas mostradas na Tabela 5A ou na Tabela 5B e pelo menos uma das duas ou mais moléculas de ácido nucleico se liga a uma sequência de RNA alvo que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ou é 100%
idêntica a uma sequência de RNA codificada por uma sequência de DNA definida por um conjunto de coordenadas genômicas mostradas na Tabela 6A - Tabela 6H. Em algumas modalidades, pelo menos uma das duas ou mais moléculas de ácido nucleico se liga a uma sequên- cia de RNA alvo que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ou 100% idêntica uma sequência de RNA codificada por uma das SEQ ID NOS: 814-1367 e pelo menos uma das duas ou mais mo- léculas de ácido nucleico se liga a uma sequência de RNA alvo que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% idêntica, ou é 100% idêntica, uma sequência de RNA codificada por uma das SEQ ID NOS: 154-498 ou SEQ ID NOS: 499-813.
[00260] Em algumas modalidades, o sistema de regulação de ge- nes compreende duas ou mais moléculas de ácido nucleico, em que pelo menos uma das moléculas de ácido nucleico se liga a uma se- quência de RNA alvo codificada por uma sequência de DNA de um gene-alvo selecionado de IKZF1, IKZF3, GATA3, BCL3, TNIP1, TNFAIP3, NFKBIA, SMAD2, TGFBR1, TGFBR2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6, IKZF2, CBLB, PPP2R2D, NRP1, HAVCR2, LAG3, TIGIT, CTLA4, PTPN6, PDCD1, ou BCOR e em que pelo menos uma das moléculas de ácido nucleico se ligam a uma sequência de RNA alvo codificada por uma sequência de DNA de um gene-alvo selecio- nado de BCL2L11, FLI1, CALM2, DHODH, UMPS, RBM39, SEMA7A, CHIC2, PCBP1, PBRM1, WDR6, E2F8, SERPINA3, e GNAS. Em al- gumas modalidades, pelo menos uma das duas ou mais moléculas de ácido nucleico de uma sequência de RNA alvo que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ou 100% idêntica a uma se- quência de RNA codificada por uma sequência de DNA definida por um conjunto de coordenadas genômicas mostradas na Tabela 5A ou na Tabela 5B e pelo menos uma das duas ou mais moléculas de ácido nucleico se liga a uma sequência de RNA alvo que é pelo menos 90%,
95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ou é 100% idêntica a uma se- quência de RNA codificada por uma sequência de DNA definida por um conjunto de coordenadas genômicas mostradas na Tabela 6A ou Tabela 6B. Em algumas modalidades, pelo menos uma das duas ou mais moléculas de ácido nucleico se liga a uma sequência de RNA alvo que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ou 100% idêntica uma sequência de RNA codificada por uma das SEQ ID NOS: 814-1064 e pelo menos uma das duas ou mais moléculas de ácido nucleico se liga a uma sequência de RNA alvo que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% idêntica, ou é 100% idêntica, uma sequência de RNA codificada por uma das SEQ ID NOS: 154-498 ou SEQ ID NOS: 499-813.
[00261] Em algumas modalidades, o sistema de regulação de ge- nes compreende duas ou mais moléculas de ácido nucleico, em que pelo menos uma das moléculas de ácido nucleico se liga a uma se- quência de RNA alvo codificada por uma sequência de DNA de CBLB e em que pelo menos uma das moléculas de ácido nucleico se liga a uma sequência de RNA alvo codificada por uma sequência de DNA de um gene-alvo selecionado de BCL2L11, FLI1, CALM2, DHODH, UMPS, RBM39, SEMA7A, CHIC2, PCBP1, PBRM1, WDR6, E2F8, SERPINA3 e GNAS. Em algumas modalidades, pelo menos uma das duas ou mais moléculas de ácido nucleico se liga a uma sequência de RNA alvo que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idên- tica ou 100% idêntica uma sequência de RNA codificada por uma das SEQ ID NOS: 814-1064 e pelo menos uma das duas ou mais molécu- las de ácido nucleico se liga a uma sequência de RNA alvo que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% idêntica, ou é 100% idên- tica, uma sequência de RNA codificada por uma das SEQ ID NOS: 499-524.
[00262] Em algumas modalidades, o sistema de regulação de ge-
nes compreende duas ou mais moléculas de ácido nucleico, em que pelo menos uma das moléculas de ácido nucleico se liga a uma se- quência de RNA alvo codificada por uma sequência de DNA de um gene-alvo selecionado de IKZF1, IKZF3, GATA3, BCL3, TNIP1, TNFAIP3, NFKBIA, SMAD2, TGFBR1, TGFBR2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6, IKZF2, CBLB, PPP2R2D, NRP1, HAVCR2, LAG3, TIGIT, CTLA4, PTPN6, PDCD1, ou BCOR e em que pelo menos uma das moléculas de ácido nucleico se ligam a uma sequência de RNA alvo codificada por uma sequência de DNA de um gene-alvo selecio- nado entre PTPN1, PTPN2, PTPN22, SH2B3, SH2D1A, PIK3CD, e ERG2. Em algumas modalidades, pelo menos uma das duas ou mais moléculas de ácido nucleico de uma sequência de RNA alvo que é pe- lo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ou 100% idênti- ca a uma sequência de RNA codificada por uma sequência de DNA definida por um conjunto de coordenadas genômicas mostradas na Tabela 5A ou na Tabela 5B e pelo menos uma das duas ou mais mo- léculas de ácido nucleico se liga a uma sequência de RNA alvo que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ou é 100% idêntica a uma sequência de RNA codificada por uma sequência de DNA definida por um conjunto de coordenadas genômicas mostradas na Tabela 6C ou Tabela 6D.
Em algumas modalidades, pelo menos uma das duas ou mais moléculas de ácido nucleico se liga a uma se- quência de RNA alvo que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ou 100% idêntica uma sequência de RNA codificada por uma das SEQ ID NOS: 1065-1329 e pelo menos uma das duas ou mais moléculas de ácido nucleico se liga a uma sequência de RNA alvo que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% idêntica, ou é 100% idêntica, uma sequência de RNA codificada por uma das SEQ ID NOS: 154-498 ou SEQ ID NOS: 499-813. Em algumas moda- lidades, pelo menos uma das duas ou mais moléculas de ácido nuclei-
co se liga a uma sequência de RNA alvo que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ou 100% idêntica uma sequência de RNA codificada por uma das SEQ ID NOS: 1112-1227 e pelo menos uma das duas ou mais moléculas de ácido nucleico se liga a uma se- quência de RNA alvo que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% idêntica, ou é 100% idêntica, uma sequência de RNA codifica- da por uma das SEQ ID NOS: 154-498 ou SEQ ID NOS: 499-813.
[00263] Em algumas modalidades, o sistema de regulação de ge- nes compreende duas ou mais moléculas de ácido nucleico, em que pelo menos uma das moléculas de ácido nucleico se liga a uma se- quência de RNA alvo codificada por uma sequência de DNA de um gene-alvo selecionado de IKZF1, IKZF3, GATA3, BCL3, TNIP1, TNFAIP3, NFKBIA, SMAD2, TGFBR1, TGFBR2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6, IKZF2, CBLB, PPP2R2D, NRP1, HAVCR2, LAG3, TIGIT, CTLA4, PTPN6, PDCD1, ou BCOR e em que pelo menos uma das moléculas de ácido nucleico se liga a uma sequência de RNA alvo codificada por uma sequência de DNA do gene PTPN2. Em algumas modalidades, o sistema de regulação de genes compreende duas ou mais moléculas de ácido nucleico, em que pelo menos uma das molé- culas de ácido nucleico se liga a uma sequência de RNA alvo codifica- da por uma sequência de DNA do gene CBLB e em que pelo menos um dos ácidos nucleicos moléculas se liga a uma sequência de RNA alvo codificada por uma sequência de DNA do gene PTPN2. Em al- gumas modalidades, pelo menos uma das duas ou mais moléculas de ácido nucleico se liga a uma sequência de RNA alvo que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ou 100% idêntica uma sequência de RNA codificada por uma das SEQ ID NOS: 1112-1227 e pelo menos uma das duas ou mais moléculas de ácido nucleico se liga a uma sequência de RNA alvo que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% idêntica, ou é 100% idêntica, uma sequência de
RNA codificada por uma das SEQ ID NOS: 499-524. Em algumas mo- dalidades, pelo menos uma das duas ou mais moléculas de ácido nu- cleico se liga a uma sequência de RNA alvo que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ou 100% idêntica uma sequên- cia de RNA codificada por uma das SEQ ID NOS: 1112-1148 e pelo menos uma das duas ou mais moléculas de ácido nucleico se liga a uma sequência de RNA alvo que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% idêntica, ou é 100% idêntica, uma sequência de RNA codificada por uma das SEQ ID NOS: 499-524.
[00264] Em algumas modalidades, o sistema de regulação de ge- nes compreende duas ou mais moléculas de ácido nucleico, em que pelo menos uma das moléculas de ácido nucleico se liga a uma se- quência de RNA alvo codificada por uma sequência de DNA de um gene-alvo selecionado de IKZF1, IKZF3, GATA3, BCL3, TNIP1, TNFAIP3, NFKBIA, SMAD2, TGFBR1, TGFBR2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6, IKZF2, CBLB, PPP2R2D, NRP1, HAVCR2, LAG3, TIGIT, CTLA4, PTPN6, PDCD1, ou BCOR e em que pelo menos uma das moléculas de ácido nucleico se liga a uma sequência de RNA alvo codificada por uma sequência de DNA do PELI1. Em algumas modali- dades, pelo menos uma das duas ou mais moléculas de ácido nucleico de uma sequência de RNA alvo que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ou 100% idêntica a uma sequência de RNA codificada por uma sequência de DNA definida por um conjunto de co- ordenadas genômicas mostradas na Tabela 5A ou na Tabela 5B e pe- lo menos uma das duas ou mais moléculas de ácido nucleico se liga a uma sequência de RNA alvo que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ou é 100% idêntica a uma sequência de RNA codificada por uma sequência de DNA definida por um conjunto de co- ordenadas genômicas mostradas na Tabela 6E ou Tabela 6F. Em al- gumas modalidades, pelo menos uma das duas ou mais moléculas de ácido nucleico se liga a uma sequência de RNA alvo que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ou 100% idêntica uma sequência de RNA codificada por uma das SEQ ID NOS: 1330-1350 e pelo menos uma das duas ou mais moléculas de ácido nucleico se liga a uma sequência de RNA alvo que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% idêntica, ou é 100% idêntica, uma sequência de RNA codificada por uma das SEQ ID NOS: 154-498 ou SEQ ID NOS: 499-813.
[00265] Em algumas modalidades, o sistema de regulação de ge- nes compreende duas ou mais moléculas de ácido nucleico, em que pelo menos uma das moléculas de ácido nucleico se liga a uma se- quência de RNA alvo codificada por uma sequência de DNA do gene CBLB e em que pelo menos um dos ácidos nucleicos moléculas se liga a uma sequência de RNA alvo codificada por uma sequência de DNA do gene PELI1. Em algumas modalidades, pelo menos uma das duas ou mais moléculas de ácido nucleico se liga a uma sequência de RNA alvo que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idên- tica ou 100% idêntica uma sequência de RNA codificada por uma das SEQ ID NOS: 1330-1350 e pelo menos uma das duas ou mais molé- culas de ácido nucleico se liga a uma sequência de RNA alvo que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% idêntica, ou é 100% idêntica, uma sequência de RNA codificada por uma das SEQ ID NOS: 499-524.
[00266] Em algumas modalidades, o sistema de regulação de ge- nes compreende duas ou mais moléculas de ácido nucleico, em que pelo menos uma das moléculas de ácido nucleico se liga a uma se- quência de RNA alvo codificada por uma sequência de DNA de um gene-alvo selecionado de IKZF1, IKZF3, GATA3, BCL3, TNIP1, TNFAIP3, NFKBIA, SMAD2, TGFBR1, TGFBR2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6, IKZF2, CBLB, PPP2R2D, NRP1, HAVCR2, LAG3,
TIGIT, CTLA4, PTPN6, PDCD1, ou BCOR e em que pelo menos uma das moléculas de ácido nucleico se liga a uma sequência de RNA alvo codificada por uma sequência de DNA do SETD5. Em algumas moda- lidades, pelo menos uma das duas ou mais moléculas de ácido nuclei- co de uma sequência de RNA alvo que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ou 100% idêntica a uma sequência de RNA codificada por uma sequência de DNA definida por um conjunto de co- ordenadas genômicas mostradas na Tabela 5A ou na Tabela 5B e pe- lo menos uma das duas ou mais moléculas de ácido nucleico se liga a uma sequência de RNA alvo que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ou é 100% idêntica a uma sequência de RNA codificada por uma sequência de DNA definida por um conjunto de co- ordenadas genômicas mostradas na Tabela 6G ou Tabela 6H. Em al- gumas modalidades, pelo menos uma das duas ou mais moléculas de ácido nucleico se liga a uma sequência de RNA alvo que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ou 100% idêntica uma sequência de RNA codificada por uma das SEQ ID NOS: 1351-1367 e pelo menos uma das duas ou mais moléculas de ácido nucleico se liga a uma sequência de RNA alvo que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% idêntica, ou é 100% idêntica, uma sequência de RNA codificada por uma das SEQ ID NOS: 154-498 ou SEQ ID NOS: 499-813.
[00267] Em algumas modalidades, o sistema de regulação de ge- nes compreende duas ou mais moléculas de ácido nucleico, em que pelo menos uma das moléculas de ácido nucleico se liga a uma se- quência de RNA alvo codificada por uma sequência de DNA do gene CBLB e em que pelo menos um dos ácidos nucleicos moléculas se liga a uma sequência de RNA alvo codificada por uma sequência de DNA do gene SETD5. Em algumas modalidades, pelo menos uma das duas ou mais moléculas de ácido nucleico se liga a uma sequência de
RNA alvo que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idên- tica ou 100% idêntica uma sequência de RNA codificada por uma das SEQ ID NOS: 1351-1367 e pelo menos uma das duas ou mais molé- culas de ácido nucleico se liga a uma sequência de RNA alvo que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% idêntica, ou é 100% idêntica, uma sequência de RNA codificada por uma das SEQ ID NOS: 499-524. B. Sistemas de regulação de genes baseados em proteínas
[00268] Em algumas modalidades, um sistema de regulação de ge- nes baseado em proteína é um sistema que compreende uma ou mais proteínas capazes de regular a expressão de um gene-alvo endógeno de uma maneira específica de sequência, sem a necessidade de uma molécula guia de ácido nucleico. Em algumas modalidades, o sistema de regulação de genes à base de proteína compreende uma proteína que compreende um ou mais domínios de ligação dedo de zinco e um domínio enzimático. Em algumas modalidades, o sistema de regulação de genes à base de proteína compreende uma proteína que compre- ende um domínio nuclease efetora do tipo ativador de transcrição (TA- LEN) e um domínio enzimático. Tais modalidades são referidas neste documento como "TALENs".
1. Sistemas de dedos de zinco
[00269] Os sistemas baseados em dedo de zinco compreendem uma proteína de fusão compreendendo dois domínios de proteína: um domínio de ligação ao DNA do dedo de zinco e um domínio enzimáti- co. Um "domínio de ligação ao DNA do dedo de zinco", "proteína do dedo de zinco" ou "ZFP" é uma proteína ou um domínio dentro de uma proteína maior que liga o DNA de uma maneira específica de sequên- cia através de um ou mais dedos de zinco, que são regiões da se- quência de aminoácidos dentro do domínio de ligação cuja estrutura é estabilizada através da coordenação de um íon de zinco. O domínio do dedo de zinco, ao se ligar a uma sequência de DNA alvo, direciona a atividade do domínio enzimático para a proximidade da sequência e, portanto, induz a modificação do gene-alvo endógeno na proximidade da sequência alvo. Um domínio de dedo de zinco pode ser manipulado para se ligar a praticamente qualquer sequência desejada. Conse- quentemente, após a identificação de um locus genético alvo contendo uma sequência de DNA alvo na qual a clivagem ou recombinação é desejada (por exemplo, um locus alvo em um gene-alvo referenciado nas Tabelas 2 ou 3), um ou mais domínios de ligação de dedos de zin- co podem ser manipulados para se ligar a uma ou mais sequências de DNA alvo no locus genético alvo. A expressão de uma proteína de fu- são compreendendo um domínio de ligação ao dedo de zinco e um domínio enzimático em uma célula, afeta a modificação no locus gené- tico alvo.
[00270] Em algumas modalidades, um domínio de ligação do dedo de zinco compreende um ou mais dedos de zinco. Miller et al. (1985) EMBO J. 4:1609-1614; Rhodes (1993) Scientific American Febuary:56- 65; Pat. U.S. N°. 6.453.242. Normalmente, um único domínio de dedo de zinco tem cerca de 30 aminoácidos de comprimento. Um dedo de zinco individual se liga a uma sequência de três nucleotídeos (isto é, tripleto) (ou uma sequência de quatro nucleotídeos que pode se so- brepor, por um nucleotídeo, ao sítio de ligação de quatro nucleotídeos de um dedo de zinco adjacente). Portanto, o comprimento de uma se- quência na qual um domínio de ligação de dedo de zinco é manipulado para se ligar (por exemplo, uma sequência alvo) determinará o número de dedos de zinco em um domínio de ligação de dedo de zinco mani- pulado. Por exemplo, para ZFPs em que os motivos dos dedos não se ligam a subsítios sobrepostos, uma sequência alvo de seis nucleotí- deos é ligada por um domínio de ligação com dois dedos; uma se- quência alvo de nove nucleotídeos é ligada por um domínio de ligação de três dedos, etc. Os sítios de ligação para dedos individuais de zinco (por exemplo, subsítios) em um sítio-alvo não precisam ser contíguos, mas podem ser separados por um ou vários nucleotídeos, dependen- do do comprimento e da natureza das sequências de aminoácidos en- tre os dedos de zinco (por exemplo, os ligadores com dedos) em um domínio de ligação com vários dedos. Em algumas modalidades, os domínios de ligação ao DNA de ZFNs individuais compreendem entre três e seis repetições individuais de dedo de zinco e podem reconhe- cer cada um entre 9 e 18 pares de bases.
[00271] Os domínios de ligação com o dedo de zinco podem ser manipulados para se ligar a uma sequência de escolha. Ver, por exemplo, Beerli et al. (2002) Nature Biotechnol. 20:135-141; Pabo et al. (2001) Ann. Rev. Biochem. 70:313-340; Isalan et al. (2001) Nature Biotechnol. 19:656-660; Segal et al. (2001) Curr. Opin. Biotechnol. 12:632-637; Choo et al. (2000) Curr. Opin. Struct. Biol. 10:411-416. Um domínio de ligação de dedo de zinco manipulado pode ter uma nova especificidade de ligação, em comparação a uma proteína dedo de zinco de ocorrência natural. Métodos de manipulação incluem, mas não estão limitados ao design racional e vários tipos de seleção.
[00272] A seleção de uma sequência de DNA alvo para ligação por um domínio de dedo de zinco pode ser realizada, por exemplo, de acordo com os métodos divulgados na Pat. U.S. N°. 6.453.242. Ficará claro para os versados na técnica que a inspeção visual simples de uma sequência nucleotídica também pode ser usada para a seleção de uma sequência de DNA alvo. Por conseguinte, quaisquer meios para a seleção da sequência de DNA alvo podem ser utilizados nos métodos descritos neste documento. Um sítio-alvo geralmente tem um comprimento de pelo menos 9 nucleotídeos e, consequentemente, é ligado por um domínio de ligação do dedo de zinco compreendendo pelo menos três dedos de zinco. No entanto, a ligação de, por exem-
plo, um domínio de ligação de 4 dedos a um sítio-alvo de 12 nucleotí- deos, um domínio de ligação de 5 dedos a um sítio-alvo de 15 nucleo- tídeos ou um domínio de ligação de 6 dedos a um sítio-alvo de 18 nu- cleotídeos é também é possível. Como será aparente, a ligação de domínios de ligação maiores (por exemplo, 7, 8, 9 dedos e mais) a sí- tio-alvo mais longos também é possível.
[00273] Em algumas modalidades, os domínios de ligação do dedo de zinco se ligam a uma sequência de DNA alvo que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ou é 100% idêntica a uma sequência de DNA alvo de um gene-alvo selecionado entre IKZF1, IKZF3, GATA3, BCL3, TNIP1, TNFAIP3, NFKBIA, SMAD2, TGFBR1, TGFBR2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6, IKZF2, CBLB, PPP2R2D, NRP1, HAVCR2, LAG3, TIGIT, CTLA4, PTPN6, PDCD1 ou BCOR (por exemplo, um gene selecionado na Tabela 2). Em algumas modalida- des, os domínios de ligação do dedo de zinco se ligam a uma sequên- cia de DNA alvo que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ou é 100% idêntica a uma sequência de DNA alvo definida por um conjunto de coordenadas genômicas mostradas na Tabela 5A ou na Tabela 5B. Em algumas modalidades, os domínios de ligação do dedo de zinco se ligam a uma sequência de DNA alvo que é pelo me- nos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ou é 100% idêntica a uma das SEQ ID NOS: 154-498 ou SEQ ID NOS: 499-813.
[00274] Em algumas modalidades, os domínios de ligação do dedo de zinco se ligam a uma sequência de DNA alvo que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ou é 100% idêntica a uma sequência de DNA alvo de CBLB. Em algumas modalidades, os domí- nios de ligação do dedo de zinco se ligam a uma sequência de DNA alvo que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ou é 100% idêntica a uma das SEQ ID NOS: 499-524. Em algumas mo- dalidades, os domínios de ligação do dedo de zinco se ligam a uma sequência de DNA alvo que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ou é 100% idêntica a uma sequência de DNA alvo de BCOR. Em algumas modalidades, os domínios de ligação do dedo de zinco se ligam a uma sequência de DNA alvo que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ou é 100% idêntica a uma das SEQ ID NOS: 708-772 ou SEQ ID NOS: 708-764. Em algumas moda- lidades, os domínios de ligação do dedo de zinco se ligam a uma se- quência de DNA alvo que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ou é 100% idêntica a uma sequência de DNA alvo de TNFAIP3. Em algumas modalidades, os domínios de ligação do dedo de zinco se ligam a uma sequência de DNA alvo que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ou é 100% idêntica a uma das SEQ ID NOS: 348-396 ou SEQ ID NOS: 348-386.
[00275] Em algumas modalidades, os domínios de ligação do dedo de zinco se ligam a uma sequência de DNA alvo que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ou é 100% idêntica a uma sequência de DNA alvo de um gene-alvo selecionadoBCL2L11, FLI1, CALM2, DHODH, UMPS, RBM39, SEMA7A, CHIC2, PCBP1, PBRM1, WDR6, E2F8, SERPINA3, GNAS, PTPN1, PTPN2, PTPN22, SH2B3, SH2D1A, PIK3CD, ERG2, PELI1, eSETD5 (por exemplo, um gene se- lecionado na Tabela 3). Em algumas modalidades, os domínios de li- gação do dedo de zinco se ligam a uma sequência de DNA alvo que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ou é 100% idêntica a uma sequência de DNA alvo definida por um conjunto de coordenadas genômicas mostradas em uma das Tabela 6A - Tabela 6H. Em algumas modalidades, os domínios de ligação do dedo de zin- co se ligam a uma sequência de DNA alvo que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ou é 100% idêntica a uma das SEQ ID NOS: 814-1367.
[00276] Em algumas modalidades, os domínios de ligação do dedo de zinco se ligam a uma sequência de DNA alvo que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ou é 100% idêntica a uma sequência de DNA alvo de um gene-alvo selecionado BCL2L11, FLI1, CALM2, DHODH, UMPS, RBM39, SEMA7A, CHIC2, PCBP1, PBRM1, WDR6, E2F8, SERPINA3, e GNAS. Em algumas modalidades, os do- mínios de ligação do dedo de zinco se ligam a uma sequência de DNA alvo que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ou é 100% idêntica a uma sequência de DNA alvo definida por um con- junto de coordenadas genômicas mostradas na Tabela 6A ou na Tabe- la 6B. Em algumas modalidades, os domínios de ligação do dedo de zinco se ligam a uma sequência de DNA alvo que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ou é 100% idêntica a uma das SEQ ID NOS: 814-1064.
[00277] Em algumas modalidades, os domínios de ligação do dedo de zinco se ligam a uma sequência de DNA alvo que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ou é 100% idêntica a uma sequência de DNA alvo de um gene-alvo selecionado PTPN1, PTPN2, PTPN22, SH2B3, SH2D1A, PIK3CD e ERG2. Em algumas modalida- des, os domínios de ligação do dedo de zinco se ligam a uma sequên- cia de DNA alvo que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ou é 100% idêntica a uma sequência de DNA alvo definida por um conjunto de coordenadas genômicas mostradas na Tabela 6C ou na Tabela 6D. Em algumas modalidades, os domínios de ligação do dedo de zinco se ligam a uma sequência de DNA alvo que é pelo me- nos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ou é 100% idêntica a uma das SEQ ID NOS: 1065-1329. Em algumas modalidades, os do- mínios de ligação do dedo de zinco se ligam a uma sequência de DNA alvo do gene PTPN2. Em algumas modalidades, os domínios de liga- ção do dedo de zinco se ligam a uma sequência de DNA alvo que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ou é 100%
idêntica a uma das SEQ ID NOS: 1112-1227. Em algumas modalida- des, os domínios de ligação do dedo de zinco se ligam a uma sequên- cia de DNA alvo que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ou é 100% idêntica a uma das SEQ ID NOS: 1112-1148.
[00278] Em algumas modalidades, os domínios de ligação do dedo de zinco se ligam a uma sequência de DNA alvo que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ou é 100% idêntica a uma sequência de DNA alvo de PELI1. Em algumas modalidades, os domí- nios de ligação do dedo de zinco se ligam a uma sequência de DNA alvo que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ou é 100% idêntica a uma sequência de DNA alvo definida por um con- junto de coordenadas genômicas mostradas na Tabela 6E ou na Tabe- la 6F. Em algumas modalidades, os domínios de ligação do dedo de zinco se ligam a uma sequência de DNA alvo que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ou é 100% idêntica a uma das SEQ ID NOS: 1330-1350. Em algumas modalidades, os domínios de ligação do dedo de zinco se ligam a uma sequência de DNA alvo que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ou é 100% idêntica a uma sequência de DNA alvo de SETD5. Em algumas moda- lidades, os domínios de ligação do dedo de zinco se ligam a uma se- quência de DNA alvo que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ou é 100% idêntica a uma sequência de DNA alvo defini- da por um conjunto de coordenadas genômicas mostradas na Tabela 6G ou na Tabela 6H. Em algumas modalidades, os domínios de liga- ção do dedo de zinco se ligam a uma sequência de DNA alvo que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ou é 100% idêntica a uma das SEQ ID NOS: 1351-1367.
[00279] Em algumas modalidades, o sistema de dedo de zinco é selecionado dentre aqueles versados na técnica, como aqueles dispo- níveis de fornecedores comerciais, como Sigma Aldrich. Por exemplo,
em algumas modalidades, o sistema de dedo de zinco é selecionado dentre os versados na técnica, como os descritos na Tabela 7 abaixo.
Tabela 7: Sistemas exemplares de dedo de zinco Gene-alvo Sistema de dedo de zinco CompoZr® nocaute ZFN humano SEMA7A NM_003612 (Produto SigmaAldrich # CKOZFND19082) SEMA7A Plasmídeo CompoZr® nocaute ZFN murino Se- ma7a NM_011352.2 (Produto SigmaAldrich # CKOZFND19082) Plasmídeo CompoZr® nocaute ZFN humano RBM39 (NM_004902) (produto SigmaAldrich # CKOZFND18044) RBM39 Plasmídeo CompoZr® nocaute ZFN do camun- dongo Rbm39 (NM_133242.2) (Produto SigmaAl- drich # CKOZFND39983) Plasmídeo CompoZr® nocaute ZFN humano BCL2L11 (NM_006538) (produto SigmaAldrich # CKOZFND3909) BCL2L11 Plasmídeo CompoZr® nocaute ZFN do camundo- go Bcl2l11 (NM_207680.2) (Produto SigmaAldrich # CKOZFND27562) Kit CompoZr® nocaute ZFN FLI1 humano FLI1 (NM_002017) (Produto SigmaAldrich # CKOZFN8731) Plasmídeo CompoZr® nocaute ZFN do camun- FLI1 dongo Fli1 (NM_008026.4) (Produto SigmaAldrich # CKOZFND31430) Kit CompoZr® nocaute ZFN Humano CALM2 (NM_001743) (Produto SigmaAldrich # CKOZFN5301) CALM2 Plasmídeo CompoZr® nocaute ZFN do camun- dongo Calm2 (NM_007589.5) (Produto SigmaAl- drich # CKOZFND27915)
Gene-alvo Sistema de dedo de zinco Plasmídeo CompoZr® nocaute ZFN humano DHODH (NM_001361) (produto SigmaAldrich # CKOZFND1982)
DHODH Plasmídeo CompoZr® nocaute ZFN do camun- dongo Dhodh (NM_020046.3) (Produto SigmaAl- drich # CKOZFND29960) Plasmídeo CompoZr® nocaute ZFN humano UMPS (NM_000373) (produto SigmaAldrich # CKOZFND1693)
UMPS Plasmídeo CompoZr® nocaute ZFN do camun- dongo Umps (NM_009471.2) (Produto SigmaAl- drich # CKOZFND43931) Kit de CompoZr® nocaute ZFN humano CHIC2 (NM_012110) (Produto SigmaAldrich # CKOZFN6059) CHIC2 Plasmídeo CompoZr® nocaute ZFN do camun- dongo Chic2 (NM_028850.4) (produto SigmaAl- drich # CKOZFND28691) Plasmídeo ZFN nocaute CompoZr® humano PCBP1 (NM_006196) (produto SigmaAldrich # CKOZFND16392) PCBP1 Plasmídeo CompoZr® nocaute ZFN do camun- dongo Pcbp1 (NM_011865.3) (Produto SigmaAl- drich # CKOZFND38313) Plasmídeo CompoZr® nocaute ZFN humano PBRM1 (NM_018165) (produto SigmaAldrich # CKOZFND2434) PBRM1 Plasmídeo CompoZr® nocaute ZFN camundongo Pbrm1 (NM_001081251.1) (Produto SigmaAldrich # CKOZFND38304) Plasmídeo ZFN nocaute CompoZr® humano WDR6 WDR6 (NM_018031) (produto SigmaAldrich # CKOZFND22841)
Gene-alvo Sistema de dedo de zinco Plasmídeo CompoZr® nocaute ZFN do camun- dongo Wdr6 (NM_031392.2) (Produto SigmaAl- drich # CKOZFND44594) Plasmídeo CompoZr® nocaute ZFN do humano E2F8 (NM_024680) (produto SigmaAldrich # CKOZFND7610) E2F8 Plasmídeo CompoZr® nocaute ZFN do camun- dongo E2f8 (NM_001013368.5) (Produto SigmaAl- drich # CKOZFND30371) Plasmídeo CompoZr® nocaute ZFN humano SERPINA3 SERPINA3 (NM_001085) (produto SigmaAldrich # CKOZFND1900) Plasmídeo CompoZr® nocaute ZFN humano GNAS (NM_000516) (produto SigmaAldrich # CKOZFND1354)
GNAS Plasmídeo CompoZr® nocaute ZFN do camun- dongo Gnas (NM_001077510.2) (Produto Sigma- Aldrich # CKOZFND32583) Plasmídeo CompoZr® nocaute ZFN humano PTPN22 (NM_015967) (SigmaAldrich # PTPN22 CKOZFND2410) Plasmídeo CompoZr® nocaute ZFN murino Ptpn22 (NM_008979.1) (SigmaAldrich # CKOZFND39635) Plasmídeo CompoZr® nocaute ZFN humano PTPN1 (NM_002827) (SigmaAldrich # PTPN1 CKOZFND2121) Plasmídeo CompoZr® nocaute ZFN murino Ptpn1 (NM_011201.3) (SigmaAldrich # CKOZFND39626) Plasmídeo CompoZr® nocaute ZFN humano PTPN2 (NM_002828) (SigmaAldrich # PTPN2 CKOZFND17697) Plasmídeo CompoZr® nocaute ZFN murino Ptpn2 (NM_008977.3) (SigmaAldrich # CKOZFND39632)
Gene-alvo Sistema de dedo de zinco Plasmídeo CompoZr® nocaute ZFN humano SH2B3 humano (NM_005475) (SigmaAldrich # SH2B3 CKOZFND19246) Plasmídeo CompoZr® nocaute ZFN murino Sh2b3 (NM_008507.3) (SigmaAldrich # CKOZFND41095) Plasmídeo CompoZr® nocaute ZFN humano Sh2d1a (NM_001114937) (SigmaAldrich # CKOZFND19247) SH2D1A Plasmídeo CompoZr® nocaute ZFN murino Sh2d1a (NM_011364.3) (SigmaAldrich # CKOZFND41096) Plasmídeo CompoZr® nocaute ZFN humano PIK3CD (NM_005026) (SigmaAldrich # CKOZFND1287) PIK3CD Plasmídeo CompoZr® nocaute ZFN murino Pik3cd (NM_001029837.2) (SigmaAldrich # CKOZFND38731) Kit humano CompoZr® nocaute ZFN humano EGR2 (NM_000399) (SigmaAldrich # EGR2 CKOZFN7717) Plasmídeo CompoZr® nocaute ZFN murino Egr2 (NM_010118.3) (SigmaAldrich # CKOZFND30496) Plasmídeo CompoZr® nocaute ZFN humano PE- LI1 (NM_020651) (SigmaAldrich # CKOZFND16614) PELI1 Plasmídeo CompoZr® nocaute ZFN do camun- dongo Peli1 (NM_023324.2) (SigmaAldrich # CKOZFND38539) Plasmídeo CompoZr® nocaute ZFN humano SETD5 (NM_001080517) (SigmaAldrich # CKOZFND19170) SETD5 Plasmídeo CompoZr® nocaute ZFN do camun- dongo Setd5 (NM_028385.1) (SigmaAldrich # CKOZFND41025)
[00280] Em algumas modalidades, o sistema de regulação de ge-
nes compreende duas ou mais proteínas de fusão ZFP, cada uma compreendendo um domínio de ligação ao dedo de zinco, em que pelo menos um dos domínios de ligação ao dedo de zinco se liga a uma sequência de DNA alvo que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ou 100% idêntica a uma sequência de DNA alvo de um gene-alvo selecionado de IKZF1, IKZF3, GATA3, BCL3, TNIP1, TNFAIP3, NFKBIA, SMAD2, TGFBR1, TGFBR2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6, IKZF2, CBLB, PPP2R2D, NRP1, HAVCR2, LAG3, TIGIT, CTLA4, PTPN6, PDCD1, ou BCOR e em que pelo menos um dos domínios de ligação do dedo de zinco se liga a uma sequência de DNA alvo que está em pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ou é 100% idêntica a uma sequência de DNA alvo de um gene-alvo selecionado BCL2L11, FLI1, CALM2, DHODH, UMPS, RBM39, SEMA7A, CHIC2, PCBP1, PBRM1, WDR6, E2F8, SERPINA3, GNAS, PTPN1, PTPN2, PTPN22, SH2B3, SH2D1A, PIK3CD, ERG2, PELI1, eSETD5. Em algumas modalidades, pelo menos um dos domí- nios de ligação do dedo de zinco se liga a uma sequência de DNA alvo que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ou é 100% idêntica a um sequência de DNA alvo definida por um conjunto de coordenadas genômicas mostradas na Tabela 5A ou Tabela 5B e pelo menos um dos domínios de ligação do dedo de zinco se liga a uma sequência de DNA alvo que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% idêntica, ou é 100% idêntica a uma sequência de DNA alvo definida por um conjunto de coordenadas genômicas mostradas em uma das Tabelas 6A - Tabela 6H.
Em algumas modalidades, pelo menos um dos domínios de ligação do dedo de zinco se liga a uma sequência de DNA alvo que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ou é 100% idêntica a uma das SEQ ID NOS: 154-498 ou SEQ ID NOS: 499-813 e pelo menos um dos domínios de ligação do dedo de zinco se ligam a uma sequência de DNA alvo que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ou é 100% idênti- ca a uma das SEQ ID NOS: 814-1367.
[00281] Em algumas modalidades, o sistema de regulação de ge- nes compreende duas ou mais proteínas de fusão ZFP, cada uma compreendendo um domínio de ligação de dedo de zinco, em que pelo menos um dos domínios de ligação de dedo de zinco se liga a uma sequência de DNA alvo de um gene-alvo selecionado de IKZF1, IKZF3, GATA3, BCL3, TNIP1, TNFAIP3, NFKBIA, SMAD2, TGFBR1, TGFBR2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6, IKZF2, CBLB, PPP2R2D, NRP1, HAVCR2, LAG3, TIGIT, CTLA4, PTPN6, PDCD1, ou BCOR dos domínios de ligação do dedo de zinco se liga a uma sequência de DNA alvo de um gene-alvo selecionado deBCL2L11, FLI1, CALM2, DHODH, UMPS, RBM39, SEMA7A, CHIC2, PCBP1, PBRM1, WDR6, E2F8, SERPINA3, e GNAS. Em algumas modalidades, pelo menos um dos dois ou mais domínios de ligação ao dedo de zinco se liga a uma sequência de DNA alvo que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ou é 100% idêntica a uma sequência de DNA alvo de- finida por um conjunto de coordenadas genômicas mostradas na Ta- bela 5A ou na Tabela 5B e pelo menos um dos dois ou mais domínios de ligação ao dedo de zinco se liga a uma sequência de DNA alvo que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ou é 100% idêntica a uma sequência de DNA alvo definida por um conjunto de coordenadas genômicas mostradas na Tabela 6A ou na Tabela 6B. Em algumas modalidades, pelo menos um dos dois ou mais domínios de ligação ao dedo de zinco se liga a uma sequência de DNA alvo que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ou é 100% idêntica a uma das SEQ ID NOS: 814-1064 e pelo menos um dos dois ou mais domínios de ligação dos dedos de zinco se liga a uma se- quência de DNA alvo que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ou é 100% idêntica a uma das SEQ ID NOS: 154-498 ou
SEQ ID NOS: 499-813.
[00282] Em algumas modalidades, o sistema de regulação de ge- nes compreende duas ou mais proteínas de fusão ZFP, cada uma compreendendo um domínio de ligação ao dedo de zinco, em que pelo menos um dos domínios de ligação ao dedo de zinco se liga a uma sequência de DNA alvo de CBLB e pelo menos um do zinco os domí- nios de ligação do dedo se ligam a uma sequência de DNA alvo de um gene-alvo selecionado deBCL2L11, FLI1, CALM2, DHODH, UMPS, RBM39, SEMA7A, CHIC2, PCBP1, PBRM1, WDR6, E2F8, SERPINA3, e GNAS. Em algumas modalidades, pelo menos um dos dois ou mais domínios de ligação ao dedo de zinco se liga a uma sequência de DNA alvo que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idên- tica ou é 100% idêntica a uma das SEQ ID NOS: 814-1064 e pelo me- nos um dos dois ou mais domínios de ligação dos dedos de zinco se liga a uma sequência de DNA alvo que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ou 100% idêntica a uma das SEQ ID NOS: 499-524.
[00283] Em algumas modalidades, o sistema de regulação de ge- nes compreende duas ou mais proteínas de fusão ZFP, cada uma compreendendo um domínio de ligação de dedo de zinco, em que pelo menos um dos domínios de ligação de dedo de zinco se liga a uma sequência de DNA alvo de um gene-alvo selecionado de IKZF1, IKZF3, GATA3, BCL3, TNIP1, TNFAIP3, NFKBIA, SMAD2, TGFBR1, TGFBR2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6, IKZF2, CBLB, PPP2R2D, NRP1, HAVCR2, LAG3, TIGIT, CTLA4, PTPN6, PDCD1, ou BCOR dos domínios de ligação do dedo de zinco se liga a uma sequência de DNA alvo de um gene-alvo selecionado entre PTPN1, PTPN2, PTPN22, SH2B3, SH2D1A, PIK3CD, e ERG2. Em algumas modalida- des, pelo menos um dos dois ou mais domínios de ligação ao dedo de zinco se liga a uma sequência de DNA alvo que é pelo menos 90%,
95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ou é 100% idêntica a uma se- quência de DNA alvo definida por um conjunto de coordenadas genô- micas mostradas na Tabela 5A ou na Tabela 5B e pelo menos um dos dois ou mais domínios de ligação ao dedo de zinco se liga a uma se- quência de DNA alvo que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ou é 100% idêntica a uma sequência de DNA alvo defini- da por um conjunto de coordenadas genômicas mostradas na Tabela 6C ou na Tabela 6D. Em algumas modalidades, pelo menos um dos dois ou mais domínios de ligação ao dedo de zinco se liga a uma se- quência de DNA alvo que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ou é 100% idêntica a uma das SEQ ID NOS: 1065-1329 e pelo menos um dos dois ou mais domínios de ligação do dedo de zinco se liga a uma sequência de DNA alvo que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ou é 100% idêntica a uma das SEQ ID NOS: 154-498 ou SEQ ID NOS: 499-813.
[00284] Em algumas modalidades, o sistema de regulação de ge- nes compreende duas ou mais proteínas de fusão ZFP, cada uma compreendendo um domínio de ligação de dedo de zinco, em que pelo menos um dos domínios de ligação de dedo de zinco se liga a uma sequência de DNA alvo de um gene-alvo selecionado deIKZF1, IKZF3, GATA3, BCL3, TNIP1, TNFAIP3, NFKBIA, SMAD2, TGFBR1, TGFBR2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6, IKZF2, CBLB, PPP2R2D, NRP1, HAVCR2, LAG3, TIGIT, CTLA4, PTPN6, PDCD1, ou BCOR dos domínios de ligação do dedo de zinco liga-se a uma sequência de DNA alvo do gene PTPN2. Em algumas modalidades, pelo menos um dos dois ou mais domínios de ligação ao dedo de zinco se liga a uma sequência de DNA alvo que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ou é 100% idêntica a uma das SEQ ID NOS: 1112- 1227 e pelo menos um dos dois ou mais domínios de ligação do dedo de zinco se liga a uma sequência de DNA alvo que é pelo menos 90%,
95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ou é 100% idêntica a uma das SEQ ID NOS: 154-498 ou SEQ ID NOS: 499-813.
[00285] Em algumas modalidades, o sistema de regulação de ge- nes compreende duas ou mais proteínas de fusão ZFP, cada uma compreendendo um domínio de ligação ao dedo de zinco, em que pelo menos um dos domínios de ligação ao dedo de zinco se liga a uma sequência de DNA alvo do gene CBLB e pelo menos um dos os domí- nios de ligação do dedo de zinco se ligam a uma sequência de DNA alvo do gene PTPN2. Em algumas modalidades, pelo menos um dos dois ou mais domínios de ligação ao dedo de zinco se liga a uma se- quência de DNA alvo que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ou é 100% idêntica a um dos SEQ ID NOS: 1112-1227 e pelo menos um dos dois ou mais domínios de ligação dos dedos de zinco se liga a uma sequência de DNA alvo que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ou 100% idêntica a uma das SEQ ID NOS: 499-524. Em algumas modalidades, pelo menos um dos dois ou mais domínios de ligação ao dedo de zinco se liga a uma se- quência de DNA alvo que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ou é 100% idêntica a um dos SEQ ID NOS: 1112-1148 e pelo menos um dos dois ou mais domínios de ligação dos dedos de zinco se liga a uma sequência de DNA alvo que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ou 100% idêntica a uma das SEQ ID NOS: 499-524.
[00286] Em algumas modalidades, o sistema de regulação de ge- nes compreende duas ou mais proteínas de fusão ZFP, cada uma compreendendo um domínio de ligação de dedo de zinco, em que pelo menos um dos domínios de ligação de dedo de zinco se liga a uma sequência de DNA alvo de um gene-alvo selecionado deIKZF1, IKZF3, GATA3, BCL3, TNIP1, TNFAIP3, NFKBIA, SMAD2, TGFBR1, TGFBR2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6, IKZF2, CBLB, PPP2R2D,
NRP1, HAVCR2, LAG3, TIGIT, CTLA4, PTPN6, PDCD1, ou BCOR dos domínios de ligação do dedo de zinco liga-se a uma sequência de DNA alvo do gene PELI1. Em algumas modalidades, pelo menos um dos dois ou mais domínios de ligação ao dedo de zinco se liga a uma sequência de DNA alvo que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ou é 100% idêntica a uma sequência de DNA alvo de- finida por um conjunto de coordenadas genômicas mostradas na Ta- bela 5A ou na Tabela 5B e pelo menos um dos dois ou mais domínios de ligação ao dedo de zinco se liga a uma sequência de DNA alvo que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ou é 100% idêntica a uma sequência de DNA alvo definida por um conjunto de coordenadas genômicas mostradas na Tabela 6D ou na Tabela 6E. Em algumas modalidades, pelo menos um dos dois ou mais domínios de ligação ao dedo de zinco se liga a uma sequência de DNA alvo que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ou é 100% idêntica a uma das SEQ ID NOS: 1330-1350 e pelo menos um dos dois ou mais domínios de ligação do dedo de zinco se liga a uma se- quência de DNA alvo que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ou é 100% idêntica a uma das SEQ ID NOS: 154-498 ou SEQ ID NOS: 499-813.
[00287] Em algumas modalidades, o sistema de regulação de ge- nes compreende duas ou mais proteínas de fusão ZFP, cada uma compreendendo um domínio de ligação ao dedo de zinco, em que pelo menos um dos domínios de ligação ao dedo de zinco se liga a uma sequência de DNA alvo do gene CBLB selecionado e pelo menos um dos os domínios de ligação do dedo de zinco se ligam a uma sequên- cia de DNA alvo do genePELI1. Em algumas modalidades, pelo menos um dos dois ou mais domínios de ligação ao dedo de zinco se liga a uma sequência de DNA alvo que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ou é 100% idêntica a um dos SEQ ID NOS:
1330-1350 e pelo menos um dos dois ou mais domínios de ligação dos dedos de zinco se liga a uma sequência de DNA alvo que é pelo me- nos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ou 100% idêntica a uma das SEQ ID NOS: 499-524.
[00288] Em algumas modalidades, o sistema de regulação de ge- nes compreende duas ou mais proteínas de fusão ZFP, cada uma compreendendo um domínio de ligação de dedo de zinco, em que pelo menos um dos domínios de ligação de dedo de zinco se liga a uma sequência de DNA alvo de um gene-alvo selecionado deIKZF1, IKZF3, GATA3, BCL3, TNIP1, TNFAIP3, NFKBIA, SMAD2, TGFBR1, TGFBR2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6, IKZF2, CBLB, PPP2R2D, NRP1, HAVCR2, LAG3, TIGIT, CTLA4, PTPN6, PDCD1, ou BCOR dos domínios de ligação do dedo de zinco liga-se a uma sequência de DNA alvo do gene SETD5. Em algumas modalidades, pelo menos um dos dois ou mais domínios de ligação ao dedo de zinco se liga a uma sequência de DNA alvo que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ou é 100% idêntica a uma sequência de DNA alvo de- finida por um conjunto de coordenadas genômicas mostradas na Ta- bela 5A ou na Tabela 5B e pelo menos um dos dois ou mais domínios de ligação ao dedo de zinco se liga a uma sequência de DNA alvo que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ou é 100% idêntica a uma sequência de DNA alvo definida por um conjunto de coordenadas genômicas mostradas na Tabela 6F ou na Tabela 6G. Em algumas modalidades, pelo menos um dos dois ou mais domínios de ligação ao dedo de zinco se liga a uma sequência de DNA alvo que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ou é 100% idêntica a uma das SEQ ID NOS: 1351-1367 e pelo menos um dos dois ou mais domínios de ligação do dedo de zinco se liga a uma se- quência de DNA alvo que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ou é 100% idêntica a uma das SEQ ID NOS: 154-498 ou
SEQ ID NOS: 499-813.
[00289] Em algumas modalidades, o sistema de regulação de ge- nes compreende duas ou mais proteínas de fusão ZFP, cada uma compreendendo um domínio de ligação ao dedo de zinco, em que pelo menos um dos domínios de ligação ao dedo de zinco se liga a uma sequência de DNA alvo do gene CBLB selecionado e pelo menos um dos os domínios de ligação do dedo de zinco se ligam a uma sequên- cia de DNA alvo do geneSETD5. Em algumas modalidades, pelo me- nos um dos dois ou mais domínios de ligação ao dedo de zinco se liga a uma sequência de DNA alvo que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ou é 100% idêntica a um dos SEQ ID NOS: 1351-1367 e pelo menos um dos dois ou mais domínios de ligação dos dedos de zinco se liga a uma sequência de DNA alvo que é pelo me- nos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ou 100% idêntica a uma das SEQ ID NOS: 499-524.
[00290] A porção do domínio enzimático das proteínas de fusão dos dedos de zinco pode ser obtida de qualquer endo- ou exonuclease. As endonucleases exemplificativas a partir das quais um domínio enzimá- tico pode ser derivado, incluem, mas não estão limitadas a endonu- cleases de restrição e endonucleases homing. Ver, por exemplo, 2002- 2003 Catalogue, New England Biolabs, Beverly, MA; e Belfort et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3379-3388. As enzimas adicionais que clivam DNA são conhecidas (por exemplo, Nuclease 51; nuclease de feijão-mungo; DNase I pancreática; nuclease microcócica; endonu- clease de levedura HO; ver também Linn et al. (eds.) Nucleases, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1993). Uma ou mais dessas enzimas (ou seus fragmentos funcionais) podem ser usadas como uma fonte de domínios de clivagem.
[00291] Endonucleases de restrição exemplares (enzimas de restri- ção) adequadas para uso como domínio enzimático dos ZFPs descri-
tos neste documento estão presentes em muitas espécies e são capa- zes de ligação específica a sequências ao DNA (em um sítio de reco- nhecimento) e clivagem de DNA no sítio ou próximo a ele. Determina- das enzimas de restrição (por exemplo, Tipo IIS) cliva o DNA em sítios removidos do sítio de reconhecimento e têm domínios de ligação e de clivagem separáveis. Por exemplo, a enzima do Tipo IIS Fok I catalisa a clivagem de fita dupla do DNA, em 9 nucleotídeos de seu sítio de reconhecimento em uma fita e em 13 nucleotídeos de seus sítios de reconhecimento na outra. Ver, por exemplo, Pat. U.S. N°s. 5.356.802;
5.436.150 e 5.487.994; assim como Li et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4275-4279; Li et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2764-2768; Kim et al. (1994a) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:883- 887; Kim et al. (1994b) J. Biol. Chem. 269:31.978-31.982. Assim, em uma modalidade, as proteínas de fusão compreendem o domínio en- zimático de pelo menos uma enzima de restrição Tipo IIS e um ou mais domínios de ligação ao dedo de zinco.
[00292] Uma enzima de restrição Tipo IIS exemplificativa, cujo do- mínio de clivagem é separável do domínio de ligação, é FokI. Esta en- zima particular é ativa como um dímero. Bitinaite et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 10,570-10,575. Assim, para a clivagem de DNA de fita dupla direcionada usando fusões de dedo de zinco-FokI, duas proteínas de fusão, cada uma compreendendo um domínio en- zimático de FokI, podem ser usadas para reconstituir um domínio de clivagem cataliticamente ativo. Alternativamente, uma única molécula polipeptídica contendo um domínio de ligação ao dedo de zinco e dois domínios enzimáticos de FokI também podem ser utilizados. ZFPs exemplares compreendendo domínios enzimáticos de FokI são descri- tos na Patente US N°. 9.782.437.
2. Sistemas TALEN
[00293] Os sistemas baseados em TALEN compreendem uma pro-
teína que compreende um domínio de ligação ao DNA efetor de TAL e um domínio enzimático. Eles são feitos pela fusão de um domínio de ligação ao DNA efetor de TAL a um domínio de clivagem de DNA (uma nuclease que corta as fitas de DNA). A enzima de restrição FokI des- crita acima é um domínio enzimático exemplar adequado para uso em sistemas de regulação de genes baseados em TALEN.
[00294] Os efetores TAL são proteínas secretadas pela bactéria Xanthomonas através do sistema de secreção tipo III quando infectam plantas. O domínio de ligação ao DNA contém uma sequência repetida e altamente conservada de 33 a 34 aminoácidos com 12 e 13 aminoá- cidos divergentes. Essas duas posições, referidas como Repeat Varia- ble Diresidue (RVD), são altamente variáveis e fortemente correlacio- nadas com o reconhecimento específico de nucleotídeos. Portanto, os domínios efetores de TAL podem ser manipulados para ligar sequên- cias de DNA alvo específicas selecionando uma combinação de seg- mentos de repetição contendo os RVDs apropriados. A especificidade do ácido nucleico para combinações de RVD é a seguinte: o HD tem como alvo a citosina, o NI tem como alvo a adenenina, o NG tem como alvo a timina e o NN tem como alvo a guanina (embora, em algumas modalidades, o NN também possa se ligar à adenenina com menor especificidade).
[00295] Em algumas modalidades, os domínios efetores de TAL se ligam a uma sequência de DNA alvo que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ou é 100% idêntica a uma sequência de DNA alvo de um gene-alvo selecionado entre IKZF1, IKZF3, GA- TA3, BCL3, TNIP1, TNFAIP3, NFKBIA, SMAD2, TGFBR1, TGFBR2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6, IKZF2, CBLB, PPP2R2D, NRP1, HAVCR2, LAG3, TIGIT, CTLA4, PTPN6, PDCD1 ou BCOR (por exem- plo, um gene selecionado na Tabela 2). Em algumas modalidades, os domínios efetores de TAL se ligam a uma sequência de DNA alvo que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ou é 100% idêntica a uma sequência de DNA alvo definida por um conjunto de coordenadas genômicas mostradas na Tabela 5A ou na Tabela 5B. Em algumas modalidades, os domínios efetores de TAL se ligam a uma sequência de DNA alvo que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ou é 100% idêntica a uma das SEQ ID NOS: 154-498 ou SEQ ID NOS: 499-813.
[00296] Em algumas modalidades, os domínios efetores de TAL se ligam a uma sequência de DNA alvo que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ou é 100% idêntica a uma sequência de DNA alvo do gene CBLB. Em algumas modalidades, os domínios efetores de TAL se ligam a uma sequência de DNA alvo que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ou é 100% idênti- ca a uma das SEQ ID NOS: 499-524. Em algumas modalidades, os domínios efetores de TAL se ligam a uma sequência de DNA alvo que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica, ou é 100% idêntica a uma sequência de DNA alvo do gene BCOR, e se ligam a uma sequência de DNA alvo que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ou é 100% idêntica a uma das SEQ ID NOS: 708-772 ou SEQ ID NOS: 708-764. Em algumas modalidades, os do- mínios efetores de TAL se ligam a uma sequência de DNA alvo que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ou é 100% idêntica a uma sequência de DNA alvo da TNFAIP3, liga-se a uma se- quência de DNA alvo que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ou é 100% idêntica a uma das SEQ ID NOS: 348-396 ou SEQ ID NOS: 348-386.
[00297] Em algumas modalidades, os domínios efetores de TAL se ligam a uma sequência de DNA alvo que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ou é 100% idêntica a uma sequência de DNA alvo de um gene-alvo selecionadoBCL2L11, FLI1, CALM2,
DHODH, UMPS, RBM39, SEMA7A, CHIC2, PCBP1, PBRM1, WDR6, E2F8, SERPINA3, GNAS, PTPN1, PTPN2, PTPN22, SH2B3, SH2D1A, PIK3CD, ERG2, PELI1, e SETD5 (por exemplo, um gene selecionado na Tabela 3). Em algumas modalidades, os domínios efe- tores de TAL se ligam a uma sequência de DNA alvo que é pelo me- nos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ou é 100% idêntica a uma sequência de DNA alvo definida por um conjunto de coordenadas genômicas mostradas em uma das Tabela 6A -Tabela 6H. Em algu- mas modalidades, os domínios efetores de TAL se ligam a uma se- quência de DNA alvo que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ou é 100% idêntica a uma das SEQ ID NOS: 814-1367.
[00298] Em algumas modalidades, os domínios efetores de TAL se ligam a uma sequência de DNA alvo que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ou é 100% idêntica a uma sequência de DNA alvo de um gene-alvo selecionado BCL2L11, FLI1, CALM2, DHODH, UMPS, RBM39, SEMA7A, CHIC2, PCBP1, PBRM1, WDR6, E2F8, SERPINA3, e GNAS. Em algumas modalidades, os domínios efetores de TAL se ligam a uma sequência de DNA alvo que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ou é 100% idênti- ca a uma sequência de DNA alvo definida por um conjunto de coorde- nadas genômicas mostradas na Tabela 6A ou Tabela 6B. Em algumas modalidades, os domínios efetores de TAL se ligam a uma sequência de DNA alvo que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ou é 100% idêntica a uma das SEQ ID NOS: 814-1064.
[00299] Em algumas modalidades, os domínios efetores de TAL se ligam a uma sequência de DNA alvo que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ou é 100% idêntica a uma sequência de DNA alvo de um gene-alvo selecionado PTPN1, PTPN2, PTPN22, SH2B3, SH2D1A, PIK3CD e ERG2. Em algumas modalidades, os do- mínios efetores de TAL se ligam a uma sequência de DNA alvo que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ou é 100% idêntica a uma sequência de DNA alvo definida por um conjunto de coordenadas genômicas mostradas na Tabela 6C ou Tabela 6D. Em algumas modalidades, os domínios efetores de TAL se ligam a uma sequência de DNA alvo que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ou é 100% idêntica a uma das SEQ ID NOS: 1065-
1329. Em algumas modalidades, os domínios efetores de TAL se li- gam a uma sequência de DNA alvo que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ou é 100% idêntica a uma sequência de DNA alvo do gene PTPN2. Em algumas modalidades, os domínios efetores de TAL se ligam a uma sequência de DNA alvo que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ou é 100% idênti- ca a uma das SEQ ID NOS: 1112-1227. Em algumas modalidades, os domínios efetores de TAL se ligam a uma sequência de DNA alvo que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ou é 100% idêntica a uma das SEQ ID NOS: 1112-1148.
[00300] Em algumas modalidades, os domínios efetores de TAL se ligam a uma sequência de DNA alvo que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ou é 100% idêntica a uma sequência de DNA alvo do gene PELI1. Em algumas modalidades, os domínios efetores de TAL se ligam a uma sequência de DNA alvo que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ou é 100% idênti- ca a uma sequência de DNA alvo definida por um conjunto de coorde- nadas genômicas mostradas na Tabela 6E ou Tabela 6F. Em algumas modalidades, os domínios efetores de TAL se ligam a uma sequência de DNA alvo que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ou é 100% idêntica a uma das SEQ ID NOS: 1330-1350.
[00301] Em algumas modalidades, os domínios efetores de TAL se ligam a uma sequência de DNA alvo que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ou é 100% idêntica a uma sequência de DNA alvo do gene SETD5. Em algumas modalidades, os domínios efetores de TAL se ligam a uma sequência de DNA alvo que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ou é 100% idênti- ca a uma sequência de DNA alvo definida por um conjunto de coorde- nadas genômicas mostradas na Tabela 6G ou Tabela 6H. Em algumas modalidades, os domínios efetores de TAL se ligam a uma sequência de DNA alvo que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ou é 100% idêntica a uma das SEQ ID NOS: 1351-1367.
[00302] Em algumas modalidades, o sistema de regulação de ge- nes compreende duas ou mais proteínas de fusão de efetores de TAL, cada uma compreendendo um domínio efetor de TAL, em que pelo menos um dos domínios efetores de TAL se liga a uma sequência de DNA alvo que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idên- tica ou 100% idêntica a uma sequência de DNA alvo de um gene-alvo selecionado de IKZF1, IKZF3, GATA3, BCL3, TNIP1, TNFAIP3, NFK- BIA, SMAD2, TGFBR1, TGFBR2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6, IKZF2, CBLB, PPP2R2D, NRP1, HAVCR2, LAG3, TIGIT, CTLA4, PTPN6, PDCD1, ou BCOR e a pelo menos um dos domínios efetores de TAL se liga a uma sequência de DNA alvo que está em pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ou é 100% idêntica a uma sequência de DNA alvo de um gene-alvo selecionado BCL2L11, FLI1, CALM2, DHODH, UMPS, RBM39, SEMA7A, CHIC2, PCBP1, PBRM1, WDR6, E2F8, SERPINA3, GNAS, PTPN1, PTPN2, PTPN22, SH2B3, SH2D1A, PIK3CD, ERG2, PELI1, eSETD5. Em algumas modalidades, pelo menos um dos domínios efetores de TAL se liga a uma sequência de DNA alvo que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ou é 100% idêntica a um sequência de DNA alvo definida por um conjunto de coordenadas genômicas mostradas na Tabela 5A ou Tabela 5B e pelo menos um dos domínios efetores de TAL se liga a uma sequência de DNA alvo que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%,
98%, ou 99% idêntico, ou é 100% idêntico a uma sequência de DNA alvo definida por um conjunto de coordenadas genômicas mostradas em uma das Tabelas 6A - Tabela 6H. Em algumas modalidades, pelo menos um dos domínios efetores TAL se liga a uma sequência de DNA alvo que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idên- tica ou é 100% idêntica a uma das SEQ ID NOS: 154-498 ou SEQ ID NOS: 499-813 e pelo menos um dos domínios efetores TAL se liga a uma sequência de DNA alvo que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ou 100% idêntica a uma das SEQ ID NOS: 814-
1367.
[00303] Em algumas modalidades, o sistema de regulação de ge- nes compreende duas ou mais proteínas efetoras de fusão TAL, cada uma compreendendo um domínio efetor de TAL, em que pelo menos um dos domínios efetores de TAL se liga a uma sequência de DNA alvo de um gene-alvo selecionado de IKZF1, IKZF3, GATA3, BCL3, TNIP1, TNFAIP3, NFKBIA, SMAD2, TGFBR1, TGFBR2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6, IKZF2, CBLB, PPP2R2D, NRP1, HAVCR2, LAG3, TIGIT, CTLA4, PTPN6, PDCD1, ou BCOR dos domínios de li- gação do dedo de zinco se liga a uma sequência de DNA alvo de um gene-alvo selecionado deBCL2L11, FLI1, CALM2, DHODH, UMPS, RBM39, SEMA7A, CHIC2, PCBP1, PBRM1, WDR6, E2F8, SERPINA3, e GNAS. Em algumas modalidades, pelo menos um dos dois ou mais domínios efetores de TAL se liga a uma sequência de DNA alvo que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ou é 100% idêntico a uma sequência de DNA alvo definida por um conjunto de coordenadas genômicas mostradas na Tabela 5A ou na Tabela 5B e pelo menos um dos dois ou mais domínios efetores de TAL se liga a uma sequência de DNA alvo que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntico ou é 100% idêntico a uma sequência de DNA alvo definida por um conjunto de coordenadas genômicas mostradas na Tabela 6A ou na Tabela 6B. Em algumas modalidades, pelo menos um dos dois ou mais domínios efetores de TAL se liga a uma sequên- cia de DNA alvo que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ou 100% idêntica a um dos SEQ ID NOS: 814-1064 e pelo menos um dos dois ou mais domínios efetores TAL se liga a uma se- quência de DNA alvo que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ou é 100% idêntica a uma das SEQ ID NOS: 154-498 ou SEQ ID NOS: 499-813.
[00304] Nas modalidades, o sistema de regulação de genes com- preende duas ou mais proteínas efetoras de fusão TAL, cada uma compreendendo um domínio efetor de TAL, em que pelo menos um dos domínios efetores de TAL se liga a uma sequência de DNA alvo de CBLB e pelo menos um dos domínios efetores de TAL liga-se a uma sequência de DNA alvo de um gene-alvo selecionado de BCL2L11, FLI1, CALM2, DHODH, UMPS, RBM39, SEMA7A, CHIC2, PCBP1, PBRM1, WDR6, E2F8, SERPINA3, e GNAS. Em algumas modalidades, pelo menos um dos dois ou mais domínios efetores de TAL se ligam a uma sequência de DNA alvo que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ou é 100% idêntica a uma das SEQ ID NOS: 814- 1064 e pelo menos um dos dois ou mais domínios efetores de TAL se liga a uma sequência de DNA alvo que é pelo me- nos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ou é 100% idêntica a uma das SEQ ID NOS: 499-524.
[00305] Em algumas modalidades, o sistema de regulação de ge- nes compreende duas ou mais proteínas efetoras de fusão TAL, cada uma compreendendo um domínio efetor de TAL, em que pelo menos um dos domínios efetores de TAL se liga a uma sequência de DNA alvo de um gene-alvo selecionado de IKZF1, IKZF3, GATA3, BCL3, TNIP1, TNFAIP3, NFKBIA, SMAD2, TGFBR1, TGFBR2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6, IKZF2, CBLB, PPP2R2D, NRP1, HAVCR2,
LAG3, TIGIT, CTLA4, PTPN6, PDCD1, ou BCOR pelo menos um dos domínios efetores de TAL se liga a uma sequência de DNA alvo de um gene-alvo selecionado entre PTPN1, PTPN2, PTPN22, SH2B3, SH2D1A, PIK3CD, e ERG2. Em algumas modalidades, pelo menos um dos dois ou mais domínios efetores de TAL se liga a uma sequên- cia de DNA alvo que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ou é 100% idêntico a uma sequência de DNA alvo definida por um conjunto de coordenadas genômicas mostradas na Tabela 5A ou na Tabela 5B e pelo menos um dos dois ou mais domínios efetores de TAL se liga a uma sequência de DNA alvo que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntico ou é 100% idêntico a uma se- quência de DNA alvo definida por um conjunto de coordenadas genô- micas mostradas na Tabela 6C ou na Tabela 6D. Em algumas modali- dades, pelo menos um dos dois ou mais domínios efetores de TAL se liga a uma sequência de DNA alvo que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ou é 100% idêntica a uma das SEQ ID NOS: 1065-1329 e pelo menos um dos dois ou mais domínios efetores de TAL se liga a uma sequência de DNA alvo que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ou é 100% idêntica a uma das SEQ ID NOS: 154-498 ou SEQ ID NOS: 499-813.
[00306] Em algumas modalidades, o sistema de regulação de ge- nes compreende duas ou mais proteínas efetoras de fusão TAL, cada uma compreendendo um domínio efetor de TAL, em que pelo menos um dos domínios efetores de TAL se liga a uma sequência de DNA alvo de um gene-alvo selecionado de IKZF1, IKZF3, GATA3, BCL3, TNIP1, TNFAIP3, NFKBIA, SMAD2, TGFBR1, TGFBR2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6, IKZF2, CBLB, PPP2R2D, NRP1, HAVCR2, LAG3, TIGIT, CTLA4, PTPN6, PDCD1, ou BCOR pelo menos um dos domínios efetores de TAL se liga a uma sequência de DNA do gene PTPN2. Em algumas modalidades, pelo menos um dos dois ou mais domínios efetores de TAL se liga a uma sequência de DNA alvo que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ou 100% idêntica a uma das SEQ ID NOS: 1112-1227 e pelo menos um dos dois ou mais domínios efetores de TAL se liga a uma sequência de DNA alvo que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idên- tica ou é 100% idêntica a uma das SEQ ID NOS: 154-498 ou SEQ ID NOS: 499-813.
[00307] Em algumas modalidades, o sistema de regulação de ge- nes compreende duas ou mais proteínas efetoras de fusão TAL, cada uma compreendendo um domínio efetor de TAL, em que pelo menos um dos domínios efetores de TAL se liga a uma sequência de DNA alvo do gene CBLB e pelo menos um dos TAL domínios efetores se liga a uma sequência de DNA alvo do gene PTPN2. Em algumas mo- dalidades, pelo menos um dos dois ou mais domínios efetores de TAL se liga a uma sequência de DNA alvo que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ou 100% idêntica a uma das SEQ ID NOS: 1112-1227 e pelo menos um dos dois ou mais domínios efetores de TAL se liga a uma sequência de DNA alvo que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ou é 100% idêntica a uma das SEQ ID NOS: 499-524. Em algumas modalidades, pelo menos um dos dois ou mais domínios efetores de TAL se liga a uma sequência de DNA alvo que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idên- tica ou 100% idêntica a um das SEQ ID NOS: 1112-1148 e pelo me- nos um dos dois ou mais domínios efetores TAL se liga a uma se- quência de DNA alvo que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ou é 100% idêntica a uma das SEQ ID NOS: 499-524.
[00308] Em algumas modalidades, o sistema de regulação de ge- nes compreende duas ou mais proteínas efetoras de fusão TAL, cada uma compreendendo um domínio efetor de TAL, em que pelo menos um dos domínios efetores de TAL se liga a uma sequência de DNA alvo de um gene-alvo selecionado de IKZF1, IKZF3, GATA3, BCL3, TNIP1, TNFAIP3, NFKBIA, SMAD2, TGFBR1, TGFBR2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6, IKZF2, CBLB, PPP2R2D, NRP1, HAVCR2, LAG3, TIGIT, CTLA4, PTPN6, PDCD1, ou BCOR pelo menos um dos domínios efetores de TAL se liga a uma sequência de DNA do gene PELI1. Em algumas modalidades, pelo menos um dos dois ou mais domínios efetores de TAL se liga a uma sequência de DNA alvo que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ou é 100% idêntico a uma sequência de DNA alvo definida por um conjunto de coordenadas genômicas mostradas na Tabela 5A ou na Tabela 5B e pelo menos um dos dois ou mais domínios efetores de TAL se liga a uma sequência de DNA alvo que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntico ou é 100% idêntico a uma sequência de DNA alvo definida por um conjunto de coordenadas genômicas mostradas na Tabela 6D ou na Tabela 6E. Em algumas modalidades, pelo menos um dos dois ou mais domínios efetores de TAL se liga a uma sequên- cia de DNA alvo que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ou 100% idêntica a uma das SEQ ID NOS: 1330-1350 e pelo menos um dos dois ou mais domínios efetores de TAL se liga a uma sequência de DNA alvo que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ou é 100% idêntica a uma das SEQ ID NOS: 154-498 ou SEQ ID NOS: 499-813.
[00309] Em algumas modalidades, o sistema de regulação de ge- nes compreende duas ou mais proteínas efetoras de fusão TAL, cada uma compreendendo um domínio efetor de TAL, em que pelo menos um dos domínios efetores de TAL se liga a uma sequência de DNA alvo do gene CBLB selecionado e pelo menos um dos domínios efeto- res de TAL se liga a uma sequência de DNA alvo do gene PELI1. Em algumas modalidades, pelo menos um dos dois ou mais domínios efe- tores de TAL se liga a uma sequência de DNA alvo que é pelo menos
90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ou 100% idêntica a uma das SEQ ID NOS: 1330-1350 e pelo menos um dos dois ou mais do- mínios efetores de TAL se liga a uma sequência de DNA alvo que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ou é 100% idêntica a uma das SEQ ID NOS: 499-524.
[00310] Em algumas modalidades, o sistema de regulação de ge- nes compreende duas ou mais proteínas efetoras de fusão TAL, cada uma compreendendo um domínio efetor de TAL, em que pelo menos um dos domínios efetores de TAL se liga a uma sequência de DNA alvo de um gene-alvo selecionado de IKZF1, IKZF3, GATA3, BCL3, TNIP1, TNFAIP3, NFKBIA, SMAD2, TGFBR1, TGFBR2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6, IKZF2, CBLB, PPP2R2D, NRP1, HAVCR2, LAG3, TIGIT, CTLA4, PTPN6, PDCD1, ou BCOR pelo menos um dos domínios efetores de TAL se liga a uma sequência de DNA do gene SETD5. Em algumas modalidades, pelo menos um dos dois ou mais domínios efetores de TAL se liga a uma sequência de DNA alvo que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ou é 100% idêntico a uma sequência de DNA alvo definida por um conjunto de coordenadas genômicas mostradas na Tabela 5A ou na Tabela 5B e pelo menos um dos dois ou mais domínios efetores de TAL se liga a uma sequência de DNA alvo que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntico ou é 100% idêntico a uma sequência de DNA alvo definida por um conjunto de coordenadas genômicas mostradas na Tabela 6F ou na Tabela 6G. Em algumas modalidades, pelo menos um dos dois ou mais domínios efetores de TAL se liga a uma sequên- cia de DNA alvo que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ou 100% idêntica a uma das SEQ ID NOS: 1351-1367 e pelo menos um dos dois ou mais domínios efetores de TAL se liga a uma sequência de DNA alvo que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ou é 100% idêntica uma das SEQ ID NOS: 154-498 ou SEQ ID NOS: 499-813.
[00311] Em algumas modalidades, o sistema de regulação de ge- nes compreende duas ou mais proteínas efetoras de fusão TAL, cada uma compreendendo um domínio efetor de TAL, em que pelo menos um dos domínios efetores de TAL se liga a uma sequência de DNA alvo do gene CBLB selecionado e pelo menos um dos domínios efeto- res de TAL se liga a uma sequência de DNA alvo do gene SETD5. Em algumas modalidades, pelo menos um dos dois ou mais domínios efe- tores de TAL se liga a uma sequência de DNA alvo que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ou 100% idêntica a uma das SEQ ID NOs: 1351-1367 e pelo menos um dos dois ou mais do- mínios efetores de TAL se liga a uma sequência de DNA alvo que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ou é 100% idêntica a uma das SEQ ID NOs: 499-524.
[00312] Os métodos e composições para a montagem das repeti- ções efetoras de TAL são conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, Cermak et al, Nucleic Acids Research, 39:12, 2011, e82. Os plasmí- deos para construtos das repetições efetoras de TAL estão disponíveis comercialmente na Addgene. C. Sistemas de regulação de genes de ácidos nucleicos/proteínas baseados em proteínas
[00313] Os sistemas de regulação de genes de combinação com- preendem um polipeptídeo modificador direcionado ao sítio e uma mo- lécula guia de ácido nucleico. Neste documento, um "polipeptídeo mo- dificador direcionado ao sítio" refere-se a um polipeptídeo que se liga a uma molécula guia de ácido nucleico, é direcionado a uma sequência alvo de ácido nucleico (por exemplo, uma sequência de DNA ou RNA alvo endógeno) pela molécula guia de ácido nucleico à qual está liga- da e modifica a sequência alvo de ácido nucleico (por exemplo, por clivagem, mutação ou metilação da sequência alvo de ácido nucleico).
[00314] Um polipeptídeo modificador direcionado ao sítio compre- ende duas porções, uma porção que liga o guia de ácido nucleico e uma porção de atividade.
Em algumas modalidades, um polipeptídeo modificador direcionado ao sítio compreende uma porção de atividade que exibe atividade enzimática direcionada ao sítio (por exemplo, meti- lação do DNA, clivagem de DNA ou RNA, acetilação da histona, meti- lação da histona, etc.), em que o sítio da atividade enzimática é deter- minado pelo ácido nucleico guia.
Em alguns casos, um polipeptídeo modificador direcionado ao sítio compreende uma porção de atividade que possui atividade enzimática que modifica a sequência de ácido nucleico alvo endógeno (por exemplo, atividade de nuclease, atividade de metiltransferase, atividade de desmetilase, atividade de reparo do DNA, atividade de dano ao DNA, atividade de desaminação, atividade de dismutase, atividade de alquilação, atividade de depurinação, ativi- dade de oxidação, atividade de formação de dímero de pirimidina, ati- vidade de integrase, atividade de transposase, atividade de recombi- nase, atividade de polimerase, atividade de ligase, atividade de helica- se, atividade de fotolase ou atividade de glicosilase). Em outros casos, um polipeptídeo modificador direcionado ao sítio compreende uma porção de atividade que possui atividade enzimática que modifica um polipeptídeo (por exemplo, uma histona) associado à sequência de ácido nucleico alvo endógeno (por exemplo, atividade metiltransferase, atividade desmetilase, atividade acetiltransferase, atividade desaceti- lase, atividade de quinase, atividade de fosfatase, atividade de ubiqui- tina ligase, atividade de desubiquitinação, atividade de adenilação, ati- vidade de deadenilação, atividade de sumoilação, atividade de dessu- moilação, atividade de ribosilação, atividade de desibosilação, ativida- de de miristoilação ou atividade de desiristoilação). Em algumas moda- lidades, um polipeptídeo modificador direcionado ao sítio compreende uma porção de atividade que modula a transcrição de uma sequência de DNA alvo (por exemplo, para aumentar ou diminuir a transcrição). Em algumas modalidades, um polipeptídeo modificador direcionado ao sítio compreende uma porção de atividade que modula a expressão ou tradução de uma sequência de RNA alvo (por exemplo, para aumentar ou diminuir a transcrição).
[00315] O guia de ácido nucleico compreende duas porções: uma primeira porção que é complementar e capaz de se ligar a uma se- quência nucleica alvo endógena (referida neste documento como um "segmento de ligação a ácidos nucleicos") e uma segunda porção que é capaz de interagir com o polipeptídeo modificador direcionado ao sítio (referido neste documento como um "segmento de ligação a pro- teínas"). Em algumas modalidades, o segmento de ligação ao ácido nucleico e o segmento de ligação à proteína de um guia de ácido nu- cleico estão compreendidos dentro de uma única molécula de polinu- cleotídeo. Em algumas modalidades, o segmento de ligação ao ácido nucleico e o segmento de ligação à proteína de um guia de ácido nu- cleico estão compreendidos dentro de moléculas de polinucleotídeo separadas, de modo que o guia de ácido nucleico compreende duas moléculas de polinucleotídeo que se associam para formar o guia fun- cional.
[00316] O guia de ácido nucleico medeia a especificidade alvo dos sistemas de regulaçãoes combinados de proteína/ácido nucleico, hi- bridando especificamente com uma sequência alvo de ácido nucleico. Em algumas modalidades, a sequência de ácido nucleico alvo é uma sequência de RNA, tal como uma sequência de RNA compreendida dentro de um transcrito de mRNA de um gene-alvo. Em algumas mo- dalidades, a sequência de ácido nucleico alvo é uma sequência de DNA compreendida dentro da sequência de DNA de um gene-alvo. A referência feita neste documento a um gene-alvo abrange a sequência de DNA completa para esse gene particular que compreende uma plu-
ralidade de loci genéticos alvo (isto é, partes de uma sequência de ge- ne-alvo específica (por exemplo, um éxon ou um íntron)). Dentro de cada loci genético alvo, há expansões mais curtas de sequências de DNA referidas neste documento como "sequências de DNA alvo" que podem ser modificadas pelos sistemas de regulação de genes descri- tos neste documento. Além disso, cada loci genético alvo compreende um "sítio de modificação alvo", que se refere à localização precisa da modificação induzida pelo sistema de regulação de genes (por exem- plo, a localização de uma inserção, uma deleção ou mutação, a locali- zação de um DNA ou a localização de uma modificação epigenética).
[00317] Os sistemas de regulação de genes descritos neste docu- mento podem compreender um único guia de ácido nucleico ou podem compreender uma pluralidade de guias de ácido nucleico (por exem- plo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais guias de ácido nucleico).
[00318] Em algumas modalidades, os sistemas de regulaçãoes combinados de proteína/ácido nucleico compreendem polipeptídeos modificadores direcionados ao sítio derivados de proteínas Argonaute (Ago) (por exemplo, T. thermophiles Ago ou TtAgo). Em tais modalida- des, o polipeptídeo modificador direcionado ao sítio é uma endonu- clease de DNA de T. thermophiles Ago e o guia de ácido nucleico é um DNA guia (gDNA) (Veja, Swarts et al., Nature 507 (2014), 258- 261). Em algumas modalidades, a presente descrição fornece um poli- nucleotídeo que codifica um gDNA. Em algumas modalidades, um áci- do nucleico que codifica o gDNA é compreendido em um vetor de ex- pressão, por exemplo, um vetor de expressão recombinante. Em al- gumas modalidades, a presente descrição fornece um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo modificador direcionado ao sítio de TtAgo ou uma variante do mesmo. Em algumas modalidades, o polinucleotí- deo que codifica um polipeptídeo modificador direcionado ao sítio de TtAgo está compreendido em um vetor de expressão, por exemplo, um vetor de expressão recombinante.
[00319] Em algumas modalidades, os sistemas de edição de genes descritos neste documento são sistemas de nuclease CRISPR (Repe- tições Palindrômicas Curtas com Intercalação Regular entre Cluste- res)/Cas (CRISPR Associados). Em algumas modalidades, o sistema CRISPR/Cas é um sistema de Classe 2. Os sistemas CRISPR/Cas de classe 2 são divididos em três tipos: sistemas Tipo II, Tipo V e Tipo VI. Em algumas modalidades, o sistema CRISPR/Cas é um sistema de Classe 2 Tipo II, utilizando a proteína Cas9. Em tais modalidades, o polipeptídeo modificador direcionado ao sítio é uma endonuclease de DNA Cas9 (ou sua variante) e a molécula guia de ácido nucleico é um RNA guia (gRNA). Em algumas modalidades, o sistema CRISPR/Cas é um sistema de Classe 2 Tipo V, utilizando as proteínas Cas12 (por exemplo, Cas12a (também conhecida como Cpf1), Cas12b (também conhecida como C2c1), Cas12c (também conhecida como C2c3), Cas12d (também conhecido como CasY) e Cas12e (também conheci- do como CasX)). Em tais modalidades, o polipeptídeo modificador di- recionado ao sítio é uma endonuclease de DNA Cas12 (ou sua varian- te) e a molécula guia de ácido nucleico é um gRNA. Em algumas mo- dalidades, o sistema CRISPR/Cas é um sistema de Classe 2 e Tipo VI, utilizando as proteínas Cas13 (por exemplo, Cas13a (também conhe- cida como C2c2), Cas13b e Cas13c). (Ver Pyzocha et al., ACS Che- mical Biology, 13 (2), 347-356). Em tais modalidades, o polipeptídeo modificador direcionado ao sítio é uma riboendonuclease de RNA Cas13 e a molécula guia de ácido nucleico é um gRNA.
[00320] Um polipeptídeo Cas refere-se a um polipeptídeo que pode interagir com uma molécula de gRNA e, em conjunto com a molécula de gRNA, hospedar ou localizar um DNA ou sequência de RNA alvo. Os polipeptídeos Cas incluem proteínas Cas que ocorrem naturalmen- te e proteínas Cas modificadas, alteradas ou modificadas que diferem por um ou mais resíduos de aminoácidos de uma sequência Cas que ocorre naturalmente.
[00321] Um RNA guia (gRNA) compreende dois segmentos, um segmento de ligação ao DNA e um segmento de ligação à proteína. Em algumas modalidades, o segmento de ligação a proteínas de um gRNA é compreendido em uma molécula de RNA e o segmento de ligação a DNA é compreendido em outra molécula de RNA separada. Tais modalidades são referidas neste documento como "gRNAs de molécula dupla" ou "gRNA de duas moléculas" ou "gRNAs duplos." Em algumas modalidades, o gRNA é uma molécula de RNA único e é refe- rido neste documento como um "RNA guia único" ou um "sgRNA." O termo "RNA guia" ou "gRNA" é inclusivo, referindo-se a RNAs guia de duas moléculas e sgRNAs.
[00322] O segmento de ligação a proteínas de um gRNA compre- ende, em parte, duas expansões complementares de nucleotídeos que hibridam entre si para formar um duplex de RNA de fita dupla (dsRNA duplex), que facilita a ligação à proteína Cas. O segmento de ligação ao ácido nucleico (ou "sequência de ligação ao ácido nucleico") de um gRNA compreende uma sequência nucleotídica que é complementar e capaz de se ligar a uma sequência alvo específica da sequência de ácido nucleico. O segmento de ligação a proteína do gRNA interage com um polipeptídeo Cas e a interação da molécula de gRNA e do po- lipeptídeo modificador direcionado ao sítio resulta na ligação de Cas à sequência endógena de ácido nucleico e produz uma ou mais modifi- cações dentro ou ao redor da sequência alvo de ácido nucleico. A lo- calização precisa do sítio de modificação alvo que é determinada por (i) complementaridade de emparelhamento de bases entre o gRNA e a sequência alvo de ácido nucleico; e (ii) a localização de um motivo cur- to, referido como motivo adjacente do protospacer (PAM), na sequên- cia de DNA alvo (referido como sequência de flanco protospacer (PFS)
nas sequências de RNA alvo). A sequência PAM/PFS é necessária para a ligação de Cas à sequência de ácido nucleico alvo. Uma varie- dade de sequências de PAM/PFS é conhecida na técnica e é adequa- da para uso com uma endonuclease específica de Cas (por exemplo, uma endonuclease de Cas9) (Veja, por exemplo, Nat Methods. 2013 Nov; 10(11): 1116–1121 e Sci Rep. 2014; 4: 5405). Em algumas mo- dalidades, a sequência do PAM está localizada dentro de 50 pares de bases do sítio de modificação alvo em uma sequência de DNA alvo. Em algumas modalidades, a sequência do PAM está localizada dentro de 10 pares de bases do sítio de modificação alvo em uma sequência de DNA alvo. As sequências de DNA que podem ser direcionadas por este método são limitadas apenas pela distância relativa da sequência PAM ao sítio de modificação alvo e pela presença de uma sequência exclusiva de 20 pares de bases para mediar a ligação de Cas mediada por gRNA específica da sequência. Em algumas modalidades, a se- quência de PFS está localizada na extremidade 3' da sequência de RNA alvo. Em algumas modalidades, o sítio de modificação alvo está localizado no terminal 5' do locus alvo. Em algumas modalidades, o sítio de modificação alvo está localizado na extremidade 3' do locus alvo. Em algumas modalidades, o sítio de modificação alvo está locali- zado dentro de um íntron ou um éxon do locus alvo.
[00323] Em algumas modalidades, a presente descrição fornece um polinucleotídeo que codifica um gRNA. Em algumas modalidades, um ácido nucleico que codifica o gRNA é compreendido em um vetor de expressão, por exemplo, um vetor de expressão recombinante. Em algumas modalidades, a presente descrição fornece um polinucleotí- deo que codifica um polipeptídeo modificador direcionado ao sítio. Em algumas modalidades, o polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo modificador direcionado ao sítio está compreendido em um vetor de expressão, por exemplo, um vetor de expressão recombinante.
1. Proteínas Cas
[00324] Em algumas modalidades, o polipeptídeo modificador dire- cionado ao sítio é uma proteína Cas. Moléculas Cas de várias espé- cies podem ser usadas nos métodos e composições descritos neste documento, incluindo moléculas Cas derivadas de S. pyogenes, S. au- reus, N. meningitidis, S. thermophiles, Acidovorax avenae, Actinobaci- llus pleuropneumoniae, Actinobacillus succinogenes, Actinobacillus suis, Actinomyces sp., Cycliphilusdenitrificans, Aminomonas paucivo- rans, Bacillus cereus, Bacillus smithii, Bacillus thuringiensis, Bacteroi- des sp., Blastopirellula marina, Bradyrhizobium sp., Brevibacillus late- rospoxus, Campylobacter coli, Campylobacter jejuni, Campylobacter lari, Candidatus puniceispirillum, Clostridium cellulolyticum, Clostridium perfringens, Corynebacterium accolens, Corynebacterium diphtheria, Corynebacterium matruchotii, Dinoroseobacter shibae, Eubacterium dolichum, Gammaproteobacterium, Gluconacetobacter diazotrophicus, Haemophilus parainfluenzae, Haemophilus sputomm, Helicobacter ca- nadensis, Helicobacter cinaedi, Helicobacter mustelae, Ilyobacter polytropus, Kingella kingae, Lactobacillus crispatus, Listeria ivanovii, Listeria monocytogenes, Listeriaceae bacterium, Methylocystis sp., Methylosinus trichosporium, Mobiluncus mulieris, Neisseria bacillifor- mis, Neisseria cinerea, Neisseria flavescens, Neisseria lactamica, Neisseria meningitidis, Neisseria sp., Neisseria wadsworthii, Nitroso- monas sp., Parvibaculum lavamentivorans, Pasteurella multocida, Phascolarctobacterium succinatutens, Ralstonia syzygii, Rhodopseu- domonas palustris, Rhodovulum sp., Simonsiella muelleri, Sphingomo- nas sp., Sporolactobacillus vineae, Staphylococcus aureus, Staphylo- coccus lugdunensis, Streptococcus sp., Subdoligranulum sp., Tistrella mobilis, Treponema sp., ou Verminephrobacter eiseniae.
[00325] Em algumas modalidades, a proteína Cas é uma proteína Cas que ocorre naturalmente. Em algumas modalidades, a endonu-
clease de Cas é selecionada a partir do grupo que consiste em C2C1, C2C3, Cpf1 (também conhecido como Cas12a), Cas12b, Cas12c, Cas12d, Cas12e, Cas13a, Cas13b, Cas13c, Cas13d, Casl, CaslB, Cas2, Cas3, Cas4, Cas5, Cas6, Cas7, Cas8, Cas9 (também conheci- da como Csnl e Csx12), Cas10, Csyl, Csy2, Csy3, Csel, Cse2, Cscl, Csc2, Csa5, Csn2, Csm2, Csm3, Csm4, Csm5, Csm6, Cmrl, Cmr3, Cmr4, Cmr5, Cmr6, Csbl, Csb2, Csb3, Csxl7, Csxl4, Csx10, Csx16, CsaX, Csx3, Csxl, Csxl5, Csfl, Csf2, Csf3, e Csf4.
[00326] Em algumas modalidades, a proteína Cas é uma endorri- bonuclease, como uma proteína Cas13. Em algumas modalidades, a proteína Cas13 é uma Cas13a (Abudayyeh et al., Nature 550 (2017), 280-284), Cas13b (Cox et al., Science (2017) 358:6336, 1019-1027), Cas13c (Cox et al., Science (2017) 358:6336, 1019-1027), ou proteína Cas13d (Zhang et al., Cell 175 (2018), 212-223).
[00327] Em algumas modalidades, a proteína Cas é uma proteína Cas9 de tipo selvagem ou de ocorrência natural ou um ortólogo Cas9. O Cas9 do tipo selvagem é uma enzima de vários domínios que usa um domínio de nuclease HNH para clivar a fita alvo do DNA e um do- mínio semelhante ao RuvC para clivar a fita não alvo. A ligação de WT Cas9 ao DNA com base na especificidade do gRNA resulta em que- bras de DNA de fita dupla que podem ser reparadas por junção de ex- tremidade não homóloga (NHEJ) ou reparo direcionado por homologia (HDR). Moléculas Cas9 de ocorrência natural exemplares são descri- tas em Chylinski et al., RNA Biology 2013 10:5, 727-737 e ortólogos Cas9 adicionais são descritos na Publicação Internacional PCT N°. WO 2015/071474. Essas moléculas Cas9 incluem moléculas Cas9 de uma família bacteriana do cluster 1, família bacteriana do cluster 2, família bacteriana do cluster 3, família bacteriana do cluster 4, família bacteriana do cluster 5, família bacteriana do cluster 6, família bacteri- ana do cluster 7, família bacteriana do cluster 8, família bacteriana do cluster 9, família bacteriana do cluster 10, família bacteriana do cluster 11, família bacteriana do cluster 12, família bacteriana do cluster 13, família bacteriana do cluster 14, família bacteriana do cluster 15, famí- lia bacteriana do cluster 16, família bacteriana do cluster 17, família bacteriana do cluster 18, família bacteriana do cluster 19, família bac- teriana do cluster 20, família bacteriana do cluster 21, família bacteria- na do cluster 22, família bacteriana do cluster 23, família bacteriana do cluster 24, família bacteriana do cluster 25, família bacteriana do clus- ter 26 família bacteriana do cluster 27 família bacteriana do cluster 28 família bacteriana do cluster 29 família bacteriana do cluster 30 família bacteriana do cluster 31 família bacteriana do cluster 32, família bacte- riana do cluster 33, família bacteriana do cluster 34, família bacteriana do cluster 35, família bacteriana do cluster 36, família bacteriana do cluster 37, família bacteriana do cluster 38, família bacteriana do clus- ter 39, família bacteriana do cluster 40 família, família bacteriana do cluster 41, família bacteriana do cluster 42, família bacteriana do clus- ter 43, família bacteriana do cluster 44, família bacteriana do cluster 45, família bacteriana do cluster 46, família bacteriana do cluster 47, família bacteriana do cluster 48, família bacteriana do cluster 49, famí- lia bacteriana do cluster 50, família bacteriana do cluster 51, família bacteriana do cluster 52, família bacteriana do cluster 53, família bac- teriana do cluster 54, família bacteriana do cluster 55, família bacteria- na do cluster 56, família bacteriana do cluster 57, família bacteriana do cluster 58, família bacteriana do cluster 59, família bacteriana do clus- ter 60, família bacteriana do cluster, 61 família bacteriana do cluster 62, família bacteriana do cluster 63, família bacteriana do cluster 64, família bacteriana do cluster 65, família bacteriana do cluster 66, famí- lia bacteriana do cluster 67, família bacteriana do cluster 68, família bacteriana do cluster 69, família bacteriana do cluster 70, família bac- teriana do cluster 71, família bacteriana do cluster 72, família bacteria-
na do cluster 73, família bacteriana do cluster 74, família bacteriana do cluster 75, família bacteriana do cluster 76, família bacteriana do clus- ter 77 ou família bacteriana do cluster 78.
[00328] Em algumas modalidades, o polipeptídeo Cas9 de ocorrên- cia natural é selecionado a partir do grupo que consiste em SpCas9, SpCas9-HF1, SpCas9-HF2, SpCas9-HF3, SpCas9-HF4, SaCas9, FnCpf, FnCas9, eSpCas9 e NmeCas9. Em algumas modalidades, a proteína Cas9 compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com uma sequência de aminoácidos Cas9 descrita em Chylinski et al., RNA Biology 2013 10: 5, 727-737; Hou et al., PNAS Early Edition 2013, 1-6).
[00329] Em algumas modalidades, o polipeptídeo Cas compreende uma ou mais das seguintes atividades: (a) uma atividade de nickase, isto é, a capacidade de clivar uma única fita, por exemplo, a fita não complementar ou a fita com- plementar de uma molécula de ácido nucleico; (b) uma atividade de nuclease de fita dupla, isto é, a capa- cidade de clivar ambas as fitas de um ácido nucleico de fita dupla e criar uma quebra de fita dupla, que em uma modalidade é a presença de duas atividades de nickase; (c) uma atividade de endonuclease; (d) uma atividade de exonuclease; e/ou (e) uma atividade de helicase, isto é, a capacidade de de- senrolar a estrutura helicoidal de um ácido nucleico de fita dupla.
[00330] Em algumas modalidades, o polipeptídeo Cas é fundido com proteínas heterólogas que recrutam proteínas sinalizadoras de dano ao DNA, exonucleases ou fosfatases para aumentar ainda mais a probabilidade ou a taxa de reparo da sequência alvo por um meca- nismo de reparo. Em algumas modalidades, um polipeptídeo WT Cas é coexpresso com um modelo de reparo de ácido nucleico para facili- tar a incorporação de uma sequência de ácido nucleico exógena por reparo direcionado à homologia.
[00331] Em algumas modalidades, diferentes proteínas Cas (ou se- ja, proteínas Cas9 de várias espécies) podem ser vantajosas para uso nos vários métodos fornecidos, a fim de capitalizar várias característi- cas enzimáticas das diferentes proteínas Cas (por exemplo, para dife- rentes preferências de sequência PAM; para maior ou atividade enzi- mática reduzida; para um nível aumentado ou diminuído de toxicidade celular; para alterar o equilíbrio entre NHEJ, reparo direcionado à ho- mologia, quebras de fita simples, quebras de fita dupla, etc.).
[00332] Em algumas modalidades, a proteína Cas é uma proteína Cas9 derivada de S. pyogenes e reconhece o motivo da sequência PAM NGG, NAG, NGA (Mali et al, Science 2013; 339 (6121): 823- 826). Em algumas modalidades, a proteína Cas é uma proteína Cas9 derivada de S. thermophiles e reconhece o motivo da sequência PAM NGGNG e/ou NNAGAAW (W = A ou T) (ver, por exemplo, Horvath et al, Science, 2010; 327 (5962): 167-170 e Deveau et al., J. Bacteriol 2008; 190 (4): 1390-1400). Em algumas modalidades, a proteína Cas é uma proteína Cas9 derivada de S. mutans e reconhece o motivo da sequência PAM NGG e/ou NAAR (R = A ou G) (ver, por exemplo, De- veau et al., J. BACTERIOL 2008; 190 (4): 1390-1400). Em algumas modalidades, a proteína Cas é uma proteína Cas9 derivada de S. au- reus e reconhece o motivo de sequência PAM NNGRR (R = A ou G). Em algumas modalidades, a proteína Cas é uma proteína Cas9 deri- vada de S. aureus e reconhece o motivo da sequência PAM N GRRT (R = A ou G). Em algumas modalidades, a proteína Cas é uma proteí- na Cas9 derivada de S. aureus e reconhece o motivo N de sequência PAM GRRV (R = A ou G). Em algumas modalidades, a proteína Cas é uma proteína Cas9 derivada de N. meningitidis e reconhece o motivo da sequência PAM N GATT ou N GCTT (R = A ou G, V = A, G ou C) (Veja, por exemplo, Hou et ah, PNAS 2013, 1-6). Nas modalidades mencionadas acima, N pode ser qualquer resíduo de nucleotídeo, por exemplo, qualquer um de A, G, C ou T. Em algumas modalidades, a proteína Cas é uma proteína Cas13a derivada de Leptotrichia shahii e reconhece o motivo de sequência PFS de um único 3' A, U ou C.
[00333] Em algumas modalidades, é fornecido um polinucleotídeo que codifica uma proteína Cas. Em algumas modalidades, o polinucle- otídeo codifica uma proteína Cas que é pelo menos 90% idêntica a uma proteína Cas descrita na Publicação Internacional PCT N°. WO 2015/071474 ou Chylinski et al., RNA Biology 2013 10: 5, 727-737. Em algumas modalidades, o polinucleotídeo codifica uma proteína Cas que é pelo menos 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica a uma prote- ína Cas descrita na Publicação Internacional PCT N°. WO 2015/071474 ou Chylinski et al., RNA Biology 2013 10: 5, 727-737. Em algumas modalidades, o polinucleotídeo codifica uma proteína Cas que é 100% idêntica a uma proteína Cas descrita na Publicação Inter- nacional PCT N°. WO 2015/071474 ou Chylinski et al., RNA Biology 2013 10: 5, 727-737.
2. Mutantes Cas
[00334] Em algumas modalidades, os polipeptídeos Cas são mani- pulados para alterar uma ou mais propriedades do polipeptídeo Cas. Por exemplo, em algumas modalidades, o polipeptídeo Cas compre- ende propriedades enzimáticas alteradas, por exemplo, atividade alte- rada de nuclease (em comparação com uma molécula Cas de ocor- rência natural ou outra referência) ou atividade alterada de helicase. Em algumas modalidades, um polipeptídeo Cas modificado pode ter uma alteração que altera seu tamanho, por exemplo, uma deleção da sequência de aminoácidos que reduz seu tamanho sem efeito signifi- cativo em outra propriedade do polipeptídeo Cas. Em algumas modali-
dades, um polipeptídeo Cas manipulado compreende uma alteração que afeta o reconhecimento de PAM. Por exemplo, um polipeptídeo Cas manipulado pode ser alterado para reconhecer uma sequência PAM diferente da sequência PAM reconhecida pela correspem quente proteína Cas do tipo selvagem.
[00335] Os polipeptídeos Cas com propriedades desejadas podem ser feitos de várias maneiras, incluindo alteração de um polipeptídeo Cas que ocorre naturalmente ou polipeptídeo Cas parental, para for- necer um polipeptídeo Cas mutante ou alterado com uma propriedade desejada. Por exemplo, uma ou mais mutações podem ser introduzi- das na sequência de um polipeptídeo Cas parental (por exemplo, um polipeptídeo Cas que ocorre naturalmente ou manipulado). Tais muta- ções e diferenças podem compreender substituições (por exemplo, substituições conservadoras ou substituições de aminoácidos não es- senciais); inserções; ou deleções. Em algumas modalidades, um poli- peptídeo Cas mutante compreende uma ou mais mutações (por exemplo, pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 30, 40 ou 50 mutações) em relação a um polipeptídeo Cas parental.
[00336] Em uma modalidade, um polipeptídeo Cas mutante com- preende uma propriedade de clivagem que difere de um polipeptídeo Cas que ocorre naturalmente. Em algumas modalidades, o Cas é um mutante de Cas (dCas) desativado. Em tais modalidades, o polipeptí- deo Cas não compreende nenhuma atividade enzimática intrínseca e é incapaz de mediar a clivagem de ácido nucleico alvo. Em tais modali- dades, o dCas pode ser fundido com uma proteína heteróloga que é capaz de modificar o ácido nucleico alvo de uma maneira não baseada em clivagem. Por exemplo, em algumas modalidades, uma proteína dCas é fundida aos domínios ativador ou repressor da transcrição (por exemplo, a caixa associada Kruppel (KRAB ou SKD); o domínio de interação Mad mSIN3 (SID ou SID4X); o domínio repressor ERF
(ERD); a proteína 1 de interação MAX (MXI1); proteína 2 de ligação ao metil-CpG (MECP2); etc.). Em alguns casos, a proteína de fusão dCas é direcionada pelo ggRNA para um sítio específico (isto é, sequência) no ácido nucleico alvo e exerce regulação específica do lócus, como o bloqueio da ligação da RNA polimerase a um promotor (que inibe sele- tivamente a função ativadora da transcrição) e/ou modificar o status da cromatina local (por exemplo, quando é usada uma sequência de fu- são que modifica o DNA alvo ou modifica um polipeptídeo associado ao DNA alvo). Em alguns casos, as mudanças são transitórias (por exemplo, repressão ou ativação de transcrição). Em alguns casos, as mudanças são hereditárias (por exemplo, quando são feitas modifica- ções epigenéticas ao DNA alvo ou às proteínas associadas ao DNA alvo, por exemplo, histonas nucleossômicas).
[00337] Em algumas modalidades, o dCas é um mutante de dCas13 (Konermann et al., Cell 173 (2018), 665-676). Esses mutantes dCas13 podem então ser fundidos com enzimas que modificam o RNA, incluindo adenosina desaminases (por exemplo, ADAR1 e ADAR2). As adenosina-desaminases convertem adenina em inosina, que a maquinaria de tradução trata como guanina, criando assim uma alteração funcional de AG na sequência de RNA. Em algumas mo- dalidades, o dCas é um mutante dCas9.
[00338] Em algumas modalidades, o mutante Cas9 é um mutante Cas9 nickase. Os mutantes Cas9 nickase compreendem apenas um domínio cataliticamente ativo (o domínio HNH ou o domínio RuvC). Os mutantes Cas9 nickase retêm a ligação do DNA com base na especifi- cidade do gRNA, mas são capazes de cortar apenas uma fita de DNA, resultando em uma quebra de fita única (por exemplo, um "nick"). Em algumas modalidades, dois mutantes Cas9 nickase complementares (por exemplo, um mutante Cas9 nickase com um domínio RuvC inati- vado e um mutante Cas9 nickase com um domínio HNH inativado) são expressos na mesma célula com dois gRNAs correspem quentes a duas respectivas sequências alvo; uma sequência alvo na fita de DNA sense e uma na fita de DNA antisense. Esse sistema de dupla nickase resulta em quebras de fita dupla escalonadas e pode aumentar a es- pecificidade do alvo, pois é improvável que dois cortes fora do alvo se- jam gerados perto o suficiente para gerar uma interrupção de fita du- pla. Em algumas modalidades, um mutante Cas9 nickase é coexpres- so com um modelo de reparo de ácido nucleico para facilitar a incorpo- ração de uma sequência de ácido nucleico exógena por reparo direci- onado à homologia.
[00339] Em algumas modalidades, os polipeptídeos Cas descritos neste documento podem ser manipulados para alterar a especificidade de PAM/PFS do polipeptídeo Cas. Em algumas modalidades, um poli- peptídeo Cas mutante tem uma especificidade de PAM/PFS que é di- ferente da especificidade de PAM/PFS do polipeptídeo Cas parental. Por exemplo, uma proteína Cas de ocorrência natural pode ser modifi- cada para alterar a sequência de PAM/PFS que o polipeptídeo mutan- te Cas reconhece para diminuir os sítios-alvo, melhorar a especificida- de ou eliminar um requisito de reconhecimento de PAM/PFS. Em al- gumas modalidades, uma proteína Cas pode ser modificada para au- mentar o comprimento da sequência de reconhecimento de PAM/PFS. Em algumas modalidades, o comprimento da sequência de reconhe- cimento de PAM tem pelo menos 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou 15 aminoácidos de comprimento. Polipeptídeos Cas que reconhecem diferentes se- quências de PAM/PFS e/ou têm atividade fora do alvo reduzida podem ser gerados usando evolução direcionada. Métodos e sistemas exem- plares que podem ser utilizados para evolução direcionada de polipep- tídeos Cas são descritos, por exemplo, em Esvelt et al. Nature 2011, 472 (7344): 499-503.
[00340] Exemplos de mutantes Cas são descritos na Publicação
Internacional PCT N°. WO 2015/161276 e Konermann et al., Cell 173 (2018), 665-676, que são incorporados neste documento por referên- cia na sua totalidade.
3. gRNAs
[00341] A presente descrição fornece RNAs guia (gRNAs) que dire- cionam um polipeptídeo modificador direcionado ao sítio para uma se- quência de ácido nucleico alvo específica. Um gRNA compreende um "domínio de direcionamento de ácido nucleico" ou "domínio de direcio- namento" e um segmento de ligação a proteínas. O domínio de direci- onamento também pode ser referido como uma sequência "espaçado- ra" e compreende uma sequência de nucleotídeos que é complemen- tar a uma sequência alvo de ácido nucleico. Como tal, o segmento do domínio de direcionamento de um gRNA interage com um ácido nu- cleico alvo de uma maneira específica da sequência por hibridação (isto é, emparelhamento de bases) e determina a localização no ácido nucleico alvo ao qual o gRNA se ligará. O segmento do domínio de direcionamento de um gRNA pode ser modificado (por exemplo, por manipulação genética) para hibridar com uma sequência desejada dentro de uma sequência alvo de ácido nucleico. Em algumas modali- dades, a sequência do domínio de direcionamento tem entre cerca de 13 e cerca de 22 nucleotídeos de comprimento. Em algumas modali- dades, a sequência do domínio de direcionamento tem cerca de 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 ou 22 nucleotídeos de comprimento. Em algumas modalidades, a sequência do domínio de direcionamento tem cerca de 20 nucleotídeos de comprimento.
[00342] O segmento de ligação às proteínas de um gRNA interage com um polipeptídeo modificador direcionado ao sítio (por exemplo, uma proteína Cas) para formar um complexo de ribonucleoproteína (RNP) compreendendo o gRNA e o polipeptídeo modificador direcio- nado ao sítio. O segmento do domínio de direcionamento do gRNA,
em seguida, guia o polipeptídeo modificador direcionado ao sítio ligado para uma sequência nucleotídica específica dentro do ácido nucleico alvo através da sequência espaçadora descrita acima. O segmento de ligação à proteína de um gRNA compreende pelo menos dois trechos de nucleotídeos que são complementares entre si e que formam um duplex de RNA de fita dupla. O segmento de ligação a proteínas de um gRNA também pode ser referido como um segmento de "estrutura em andaime" ou um "RNA tracr". Em algumas modalidades, a sequên- cia de RNA tracr tem entre cerca de 30 e cerca de 180 nucleotídeos de comprimento. Em algumas modalidades, a sequência de RNA tracr está entre cerca de 40 e cerca de 90 nucleotídeos, cerca de 50 e cerca de 90 nucleotídeos, cerca de 60 e cerca de 90 nucleotídeos, cerca de 65 e cerca de 85 nucleotídeos, cerca de 70 e cerca de 80 nucleotí- deos, cerca de 65 e cerca de 75 nucleotídeos, ou cerca de 75 e cerca de 85 nucleotídeos de comprimento. Em algumas modalidades, a se- quência de RNA tracr é de cerca de 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88 ou cerca de 90 nucleotídeos de comprimento. Em algumas modalidades, o RNA tracr compreende uma sequência de ácido nucleico codificada pela sequência de DNA da SEQ ID NO: 34 (Veja Mali et al., Science (2013) 339 (6121): 823- 826), SEQ ID NOs: 35- 36 (Consulte a publicação PCT N°. WO 2016/106236), SEQ ID NOs: 37-39 (Ver Deltcheva et al., Nature. 31 de março de 2011; 471 (7340): 602–607) ou SEQ ID NO: 40 (ver Chen et al., Cell. 2013; 155 (7); 1479-1491). Qualquer uma das sequências tracr anteriores é adequada para uso em combinação com qualquer uma das modalidades de domínio de direcionamento de gRNA descri- tas neste documento.
[00343] Em algumas modalidades, um gRNA compreende duas mo- léculas de RNA separadas (ou seja, um "gRNA duplo"). Em algumas modalidades, um gRNA compreende uma única molécula de RNA (ou seja, um "RNA de guia único" ou "sgRNA"). Neste documento, o uso do termo "RNA guia" ou "gRNA" inclui tanto os gRNAs duplos quanto os sgRNAs. Um gRNA duplo compreende duas moléculas de RNA se- paradas: um "RNA crispr" (ou "crRNA") e um "RNA tracr". Uma molé- cula de crRNA compreende uma sequência espaçadora covalente- mente ligada a uma sequência "tracr mate". A sequência tracer mate compreende um trecho de nucleotídeos que são complementares a uma sequência correspem quente na molécula de RNA tracr. A molé- cula de crRNA e a molécula de RNA tracr hibridam entre si através da complementaridade das sequências tracr e tracer mate.
[00344] Em algumas modalidades, o gRNA é um sgRNA. Em tais modalidades, a sequência de direcionamento de ácido nucleico e a sequência de ligação à proteína estão presentes em uma única molé- cula de RNA por fusão da sequência espaçadora com a sequência de RNA tracr. Em algumas modalidades, o sgRNA tem cerca de 50 a cer- ca de 200 nucleotídeos de comprimento. Em algumas modalidades, o sgRNA tem cerca de 75 a cerca de 150 ou cerca de 100 a cerca de 125 nucleotídeos de comprimento. Em algumas modalidades, o sgR- NA tem cerca de 100 nucleotídeos de comprimento.
[00345] Em algumas modalidades, os gRNAs da presente descrição compreendem uma sequência de domínio de direcionamento que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% complementar, ou é 100% complementar a uma sequência de ácido nucleico alvo dentro um lócus alvo. Em algumas modalidades, a sequência de ácido nuclei- co alvo é uma sequência alvo de RNA. Em algumas modalidades, a sequência de ácido nucleico alvo é uma sequência alvo de DNA.
[00346] Em algumas modalidades, os gRNAs fornecidos neste do- cumento compreendem uma sequência de domínio de direcionamento de DNA alvo que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ou é 100% idêntica a uma sequência de um gene-alvo seleci-
onado entre IKZF1, IKZF3, GATA3, BCL3, TNIP1, TNFAIP3, NFKBIA, SMAD2, TGFBR1, TGFBR2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6, IKZF2, CBLB, PPP2R2D, NRP1, HAVCR2, LAG3, TIGIT, CTLA4, PTPN6, PDCD1 ou BCOR (por exemplo, um gene selecionado na Tabela 2). Em algumas modalidades, a sequência do domínio de direcionamento se liga a uma sequência de DNA alvo que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ou é 100% idêntica a uma sequência de DNA alvo definida por um conjunto de coordenadas genômicas mostradas na Tabela 5A ou na Tabela 5B. Em algumas modalidades, a sequência do domínio de direcionamento se liga a uma sequência de DNA alvo que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idên- tica ou é 100% idêntica a uma das SEQ ID NOs: 154-498 ou SEQ ID NOs: 499-813.
[00347] Em algumas modalidades, os gRNAs fornecidos neste do- cumento compreendem uma sequência de domínio de direcionamento que se liga a uma sequência de DNA alvo que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ou 100% idêntica a uma se- quência de DNA alvo do gene CBLB. Em algumas modalidades, os segmentos de ligação de ácido nucleico das sequências de gRNA se ligam a uma sequência de DNA alvo que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ou 100% idêntica a uma das SEQ ID NOs: 499-524. Os gRNAs adicionais adequados para direcionar CBLB são descritos na Publicação do Pedido de Patente US N°. 2017/0175128. Em algumas modalidades, os gRNAs fornecidos neste documento compreendem uma sequência de domínio de direciona- mento que se liga a uma sequência de DNA alvo que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ou 100% idêntica a uma sequência de DNA alvo do geneTNFAIP3. Em algumas modalidades, os segmentos de ligação de ácido nucleico das sequências de gRNA se ligam a uma sequência de DNA alvo que é pelo menos 90%, 95%,
96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ou 100% idêntica a uma das SEQ ID NOs: 348-396 ou SEQ ID NOs: 348-386. Em algumas modalidades, os gRNAs fornecidos neste documento compreendem uma sequência de domínio de direcionamento que se liga a uma sequência de DNA alvo que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ou 100% idêntica a uma sequência de DNA alvo do gene BCOR. Em al- gumas modalidades, os segmentos de ligação de ácido nucleico das sequências de gRNA se ligam a uma sequência de DNA alvo que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ou 100% idêntica a uma das SEQ ID NOs:708-772 ou SEQ ID NOs: 708-764.
[00348] Em algumas modalidades, os gRNAs fornecidos neste do- cumento compreendem uma sequência de domínio de direcionamento que se liga a uma sequência de DNA alvo que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ou é 100% idêntica a uma se- quência de um gene-alvo selecionadoBCL2L11, FLI1, CALM2, DHODH, UMPS, RBM39, SEMA7A, CHIC2, PCBP1, PBRM1, WDR6, E2F8, SERPINA3, GNAS, PTPN1, PTPN2, PTPN22, SH2B3, SH2D1A, PIK3CD, ERG2, PELI1, eSETD5 (por exemplo, um gene se- lecionado na Tabela 3). Em algumas modalidades, a sequência do domínio de direcionamento se liga a uma sequência de DNA alvo que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ou é 100% idêntica a uma sequência de DNA alvo definida por um conjunto de coordenadas genômicas mostradas na Tabela 6A - Tabela 6H. Em al- gumas modalidades, a sequência do domínio de direcionamento se liga a uma sequência de DNA alvo que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ou é 100% idêntica a uma das SEQ ID NOs: 814-1367.
[00349] Em algumas modalidades, os gRNAs fornecidos neste do- cumento compreendem uma sequência de domínio de direcionamento que se liga a uma sequência de DNA alvo que é pelo menos 90%,
95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ou 100% idêntica a uma se- quência de um gene-alvo selecionado entre BCL2L11, FLI1, CALM2, DHODH, UMPS, RBM39, SEMA7A, CHIC2, PCBP1, PBRM1, WDR6, E2F8, SERPINA3 e GNAS. Em algumas modalidades, a sequência do domínio de direcionamento se liga a uma sequência de DNA alvo que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ou é 100% idêntica a uma sequência de DNA alvo definida por um conjunto de coordenadas genômicas mostradas na Tabela 6A ou na Tabela 6B. Em algumas modalidades, a sequência do domínio de direcionamento se liga a uma sequência de DNA alvo que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ou é 100% idêntica a uma das SEQ ID NOs: 814-1064.
[00350] Em algumas modalidades, os gRNAs fornecidos neste do- cumento compreendem uma sequência de domínio de direcionamento que se liga a uma sequência de DNA alvo que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ou 100% idêntica a uma se- quência de um gene-alvo selecionado entre PTPN1, PTPN2, PTPN22, SH2B3, SH2D1A, PIK3CD e ERG2. Em algumas modalidades, a se- quência do domínio de direcionamento se liga a uma sequência de DNA alvo que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idên- tica ou é 100% idêntica a uma sequência de DNA alvo definida por um conjunto de coordenadas genômicas mostradas na Tabela 6C ou Ta- bela 6D. Em algumas modalidades, a sequência do domínio de direci- onamento se liga a uma sequência de DNA alvo que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ou é 100% idêntica a uma das SEQ ID NOs: 1065-1329.
[00351] Em algumas modalidades, os gRNAs fornecidos neste do- cumento compreendem uma sequência de domínio de direcionamento que se liga a uma sequência de DNA alvo que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ou 100% idêntica a uma se-
quência do gene PTPN2. Em algumas modalidades, a sequência do domínio de direcionamento se liga a uma sequência de DNA alvo que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ou é 100% idêntica a uma das SEQ ID NOs: 1112-1227. Em algumas modalida- des, a sequência do domínio de direcionamento é codificada por uma sequência de DNA que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ou é 100% idêntica a uma das SEQ ID NOs: 1112-1227. Em algumas modalidades, a sequência do domínio de direcionamento se liga a uma sequência de DNA alvo que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ou é 100% idêntica a uma das SEQ ID NOs: 1112-1148. Em algumas modalidades, a sequência do domí- nio de direcionamento é codificada por uma sequência de DNA que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ou é 100% idêntica a uma das SEQ ID NOs: 1112-1148.
[00352] Em algumas modalidades, os gRNAs fornecidos neste do- cumento compreendem uma sequência de domínio de direcionamento que se liga a uma sequência de DNA alvo que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ou 100% idêntica a uma se- quência do gene PELI1. Em algumas modalidades, a sequência do domínio de direcionamento se liga a uma sequência de DNA alvo que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ou é 100% idêntica a uma sequência de DNA alvo definida por um conjunto de coordenadas genômicas mostradas na Tabela 6E ou Tabela 6F. Em algumas modalidades, a sequência do domínio de direcionamento se liga a uma sequência de DNA alvo que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ou é 100% idêntica a uma das SEQ ID NOs: 1330-1350. Em algumas modalidades, a sequência do domínio de direcionamento é codificada por uma sequência de DNA que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ou é 100% idênti- ca a uma das SEQ ID NOs: 1330-1350.
[00353] Em algumas modalidades, os gRNAs fornecidos neste do- cumento compreendem uma sequência de domínio de direcionamento que se liga a uma sequência de DNA alvo que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ou 100% idêntica a uma se- quência do gene SETD5. Em algumas modalidades, a sequência do domínio de direcionamento se liga a uma sequência de DNA alvo que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ou é 100% idêntica a uma sequência de DNA alvo definida por um conjunto de coordenadas genômicas mostradas na Tabela 6G ou Tabela 6H. Em algumas modalidades, a sequência do domínio de direcionamento se liga a uma sequência de DNA alvo que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ou é 100% idêntica a uma das SEQ ID NOs: 1351-1367. Em algumas modalidades, a sequência do domínio de direcionamento é codificada por uma sequência de DNA que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ou é 100% idênti- ca a uma das SEQ ID NOs: 1351-1367.
[00354] Em algumas modalidades, o sistema de regulação de ge- nes compreende duas ou mais moléculas de gRNA, em que pelo me- nos um dos gRNAs compreende um domínio de direcionamento que se liga a uma sequência de DNA alvo que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ou é 100% idêntica a uma sequência de DNA alvo de um gene-alvo selecionado entre IKZF1, IKZF3, GA- TA3, BCL3, TNIP1, TNFAIP3, NFKBIA, SMAD2, TGFBR1, TGFBR2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6, IKZF2, CBLB, PPP2R2D, NRP1, HAVCR2, LAG3, TIGIT, CTLA4, PTPN6, PDCD1, ou BCOR (por exemplo, um gene selecionado na Tabela 2) e em que pelo menos um dos gRNAs compreende um domínio de direcionamento que se liga a um sequência de DNA alvo que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ou é 100% idêntica a uma sequência de DNA alvo de um gene-alvo selecionado BCL2L11, FLI1, CALM2, DHODH,
UMPS, RBM39, SEMA7A, CHIC2, PCBP1, PBRM1, WDR6, E2F8, SERPINA3, GNAS, PTPN1, PTPN2, PTPN22, SH2B3, SH2D1A, PIK3CD, ERG2, PELI1, e SETD5 (por exemplo, um gene selecionado na Tabela 3).
[00355] Em algumas modalidades, pelo menos um dos gRNAs compreende um domínio de direcionamento que se liga a uma se- quência de DNA alvo que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ou 100% idêntica a uma sequência de DNA alvo definida por um conjunto de coordenadas genômicas mostradas na Tabela 5A ou na Tabela 5B e pelo menos um dos gRNAs compreende um domí- nio de direcionamento que se liga a uma sequência de DNA alvo que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ou é 100% idêntica a uma sequência de DNA alvo definida por um conjunto de coordenadas genômicas mostradas em uma das Tabelas 6A-6H. Em algumas modalidades, pelo menos um dos gRNAs compreende um domínio de direcionamento que se liga a uma sequência de DNA alvo que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica, ou é 100% idêntica a uma das SEQ ID NOs: 154-498 ou SEQ ID NOs: 499- 813 e pelo menos um dos gRNAs compreende um domínio de direcio- namento que se liga a uma sequência de DNA alvo que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ou é 100% idêntica a uma das SEQ ID NOs: 814-1367. Em algumas modalidades, pelo menos um dos gRNAs compreende um domínio de direcionamento codificado por uma sequência de ácido nucleico que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ou 100% idêntica a uma das SEQ ID NOs: 154-498 ou SEQ ID NOs: 499-813 e pelo menos um dos gRNAs compreende um domínio de direcionamento codificado por uma se- quência de ácido nucleico que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica, ou é 100% idêntica a uma das SEQ ID NOs: 814-1367.
[00356] Em algumas modalidades, o sistema de regulação de ge- nes compreende duas ou mais moléculas de gRNA, em que pelo me- nos um dos gRNAs compreende um domínio de direcionamento que se liga a uma sequência de DNA alvo que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ou é 100% idêntica a uma sequência de DNA alvo de um gene-alvo selecionado entre IKZF1, IKZF3, GA- TA3, BCL3, TNIP1, TNFAIP3, NFKBIA, SMAD2, TGFBR1, TGFBR2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6, IKZF2, CBLB, PPP2R2D, NRP1, HAVCR2, LAG3, TIGIT, CTLA4, PTPN6, PDCD1, ou BCOR e em que pelo menos um dos gRNAs compreende um domínio de direcionamen- to que se liga a uma sequência de DNA alvo que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ou é 100% idêntica a uma se- quência de DNA alvo de um gene-alvo selecionado BCL2L11, FLI1, CALM2, DHODH, UMPS, RBM39, SEMA7A, CHIC2, PCBP1, PBRM1, WDR6, E2F8, SERPINA3, e GNAS.
Em algumas modalidades, pelo menos um dos gRNAs compreende um domínio de direcionamento que se liga a uma sequência de DNA alvo que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ou 100% idêntica a uma se- quência de DNA alvo definida por um conjunto de coordenadas genô- micas mostradas na Tabela 5A ou na Tabela 5B e pelo menos um dos gRNAs compreende um domínio de direcionamento que se liga a uma sequência de DNA alvo que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ou é 100% idêntica a uma sequência de DNA alvo de- finida por um conjunto de coordenadas genômicas mostradas em uma das Tabelas 6A ou 6B.
Em algumas modalidades, pelo menos um dos gRNAs compreende um domínio de direcionamento que se liga a uma sequência de DNA alvo que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ou 100% idêntica a um dos SEQ ID NOs: 154-498 ou SEQ ID NOs: 499-813 e pelo menos um dos gRNAs compreende um domínio de direcionamento que se liga a uma sequência de DNA alvo que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ou é 100% idêntica a uma das SEQ ID NOs: 814-1064. Em algumas moda- lidades, pelo menos um dos gRNAs compreende um domínio de dire- cionamento codificado por uma sequência de ácido nucleico que é pe- lo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ou 100% idênti- ca a um dos SEQ ID NOs: 154-498 ou SEQ ID NOs: 499-813 e pelo menos um dos gRNAs compreende um domínio de direcionamento codificado por uma sequência de ácido nucleico que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ou é 100% idêntica a uma das SEQ ID NOs: 814-1064.
[00357] Em algumas modalidades, o sistema de regulação de ge- nes compreende duas ou mais moléculas de gRNA, em que pelo me- nos um dos gRNAs compreende um domínio de direcionamento que se liga a uma sequência de DNA alvo que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ou é 100% idêntica a uma sequência de DNA alvo do CBLB e em que pelo menos um dos gRNAs compre- ende um domínio de direcionamento que se liga a uma sequência de DNA alvo que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idên- tica ou é 100% idêntica a uma sequência de DNA alvo de um gene- alvo selecionado BCL2L11, FLI1, CALM2, DHODH, UMPS, RBM39, SEMA7A, CHIC2, PCBP1, PBRM1, WDR6, E2F8, SERPINA3, e GNAS. Em algumas modalidades, pelo menos um dos gRNAs com- preende um domínio de direcionamento que se liga a uma sequência de DNA alvo que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica, ou é 100% idêntica a uma das SEQ ID NOs: 499-524 e pelo menos um dos gRNAs compreende um domínio de direcionamento que se liga a uma sequência de DNA alvo que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ou é 100% idêntica a uma das SEQ ID NOs: 814-1064. Em algumas modalidades, pelo menos um dos gRNAs compreende um domínio de direcionamento codificado por uma sequência de ácido nucleico que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ou 100% idêntica a uma das SEQ ID NOs: 499-524 e pelo menos um dos gRNAs compreende um domínio de di- recionamento codificado por uma sequência de ácido nucleico que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica, ou é 100% idêntica a uma das SEQ ID NOs: 814-1064.
[00358] Em algumas modalidades, o sistema de regulação de ge- nes compreende duas ou mais moléculas de gRNA, em que pelo me- nos um dos gRNAs compreende um domínio de direcionamento que se liga a uma sequência de DNA alvo que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ou é 100% idêntica a uma sequência de DNA alvo de um gene-alvo selecionado de IKZF1, IKZF3, GATA3, BCL3, TNIP1, TNFAIP3, NFKBIA, SMAD2, TGFBR1, TGFBR2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6, IKZF2, CBLB, PPP2R2D, NRP1, HAVCR2, LAG3, TIGIT, CTLA4, PTPN6, PDCD1, ou BCOR e em que pelo me- nos um dos gRNAs compreende um domínio de direcionamento que se liga a uma sequência de DNA alvo que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% são idêntica ou é 100% idêntica a uma se- quência de DNA alvo de um gene-alvo selecionado dentre PTPN1, PTPN2, PTPN22, SH2B3, SH2D1A, PIK3CD, eERG2. Em algumas modalidades, pelo menos um dos gRNAs compreende um domínio de direcionamento que se liga a uma sequência de DNA alvo que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ou 100% idêntica a uma sequência de DNA alvo definida por um conjunto de coordena- das genômicas mostradas na Tabela 5A ou Tabela 5B e pelo menos um dos gRNAs compreende um domínio de direcionamento que se liga a uma sequência de DNA alvo que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ou é 100% idêntica a uma sequência de DNA alvo definida por um conjunto de coordenadas genômicas mos- tradas em uma das Tabelas 6C ou 6D. Em algumas modalidades, pelo menos um dos gRNAs compreende um domínio de direcionamento que se liga a uma sequência de DNA alvo que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ou 100% idêntica a uma das SEQ ID NOs: 154-498 ou SEQ ID NOs: 499-813 e pelo menos um dos gRNAs compreende um domínio de direcionamento que se liga a uma sequência de DNA alvo que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ou é 100% idêntica a uma das SEQ ID NOs: 1065-
1329. Em algumas modalidades, pelo menos um dos gRNAs compre- ende um domínio de direcionamento codificado por uma sequência de ácido nucleico que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ou 100% idêntica a uma das SEQ ID NOs: 154-498 ou SEQ ID NOs: 499-813 e pelo menos um dos gRNAs compreende um domínio de direcionamento codificado por uma sequência de ácido nucleico que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica, ou é 100% idêntica a uma das SEQ ID NOs: 1065-1329.
[00359] Em algumas modalidades, o sistema de regulação de ge- nes compreende duas ou mais moléculas de gRNA, em que pelo me- nos um dos gRNAs compreende um domínio de direcionamento que se liga a uma sequência de DNA alvo que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ou 100% idêntica a uma sequência de DNA alvo do gene CBLB em que pelo menos um dos gRNAs com- preende um domínio de direcionamento que se liga a uma sequência de DNA alvo que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ou é 100% idêntica a uma sequência de DNA alvo de um ge- ne-alvo selecionado entre PTPN1, PTPN2, PTPN22, SH2B3, SH2D1A, PIK3CD e ERG2. Em algumas modalidades, o sistema de regulação de genes compreende duas ou mais moléculas de gRNA, em que pelo menos um dos gRNAs compreende um domínio de direcionamento que se liga a uma sequência de DNA alvo que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ou 100% idêntica a uma se-
quência de DNA alvo do gene CBLB e em que pelo menos um dos gRNAs compreende um domínio de direcionamento que se liga a uma sequência de DNA alvo que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ou é 100% idêntica a uma sequência de DNA alvo do gene PTPN2. Em algumas modalidades, pelo menos um dos gRNAs compreende um domínio de direcionamento codificado por uma se- quência de ácido nucleico que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ou 100% idêntica a uma das SEQ ID NOs: 499- 524 e pelo menos um dos gRNAs compreende um domínio de direcio- namento codificado por uma sequência de ácido nucleico que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica, ou é 100% idênti- ca a uma das SEQ ID NOs: 1112-1227. Em algumas modalidades, pe- lo menos um dos gRNAs compreende um domínio de direcionamento que se liga a uma sequência de DNA alvo que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ou 100% idêntica a uma das SEQ ID NOs: 499-524 e pelo menos um dos gRNAs compreende um domínio de direcionamento que se liga a uma sequência de DNA alvo que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ou é 100% idêntica a uma das SEQ ID NOs: 1112-1148. Em algumas mo- dalidades, pelo menos um dos gRNAs compreende um domínio de direcionamento codificado por uma sequência de ácido nucleico que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ou 100% idêntica a uma das SEQ ID NOs: 499-524 e pelo menos um dos gRNAs compreende um domínio de direcionamento codificado por uma sequência de ácido nucleico que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica, ou é 100% idêntica a uma das SEQ ID NOs: 1112-1148.
[00360] Em algumas modalidades, o sistema de regulação de ge- nes compreende duas ou mais moléculas de gRNA, em que pelo me- nos um dos gRNAs compreende um domínio de direcionamento que se liga a uma sequência de DNA alvo que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ou é 100% idêntica a uma sequência de DNA alvo de um gene-alvo selecionado de IKZF1, IKZF3, GATA3, BCL3, TNIP1, TNFAIP3, NFKBIA, SMAD2, TGFBR1, TGFBR2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6, IKZF2, CBLB, PPP2R2D, NRP1, HAVCR2, LAG3, TIGIT, CTLA4, PTPN6, PDCD1, ou BCOR e em que pelo me- nos um dos gRNAs compreende um domínio de direcionamento que se liga a uma sequência de DNA alvo que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% são idêntica ou é 100% idêntica a uma se- quência de DNA alvo do gene PELI1. Em algumas modalidades, pelo menos um dos gRNAs compreende um domínio de direcionamento que se liga a uma sequência de DNA alvo que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ou 100% idêntica a uma se- quência de DNA alvo definida por um conjunto de coordenadas genô- micas mostradas na Tabela 5A ou Tabela 5B e pelo menos um dos gRNAs compreende um domínio de direcionamento que se liga a uma sequência de DNA alvo que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ou é 100% idêntica a uma sequência de DNA alvo de- finida por um conjunto de coordenadas genômicas mostradas em uma das Tabelas 6E ou 6F.
Em algumas modalidades, pelo menos um dos gRNAs compreende um domínio de direcionamento que se liga a uma sequência de DNA alvo que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ou 100% idêntica a uma das SEQ ID NOs: 154-498 ou SEQ ID NOs: 499-813 e pelo menos um dos gRNAs compreende um domínio de direcionamento que se liga a uma sequência de DNA alvo que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ou é 100% idêntica a uma das SEQ ID NOs: 1330-1350. Em algumas mo- dalidades, pelo menos um dos gRNAs compreende um domínio de direcionamento codificado por uma sequência de ácido nucleico que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ou 100%
idêntica a uma das SEQ ID NOs: 154-498 ou SEQ ID NOs: 499-813 e pelo menos um dos gRNAs compreende um domínio de direcionamen- to codificado por uma sequência de ácido nucleico que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica, ou é 100% idêntica a uma das SEQ ID NOs: 1330-1350.
[00361] Em algumas modalidades, o sistema de regulação de ge- nes compreende duas ou mais moléculas de gRNA, em que pelo me- nos um dos gRNAs compreende um domínio de direcionamento que se liga a uma sequência de DNA alvo que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ou 100% idêntica a uma sequência de DNA alvo do gene CBLB e em que pelo menos um dos gRNAs compreende um domínio de direcionamento que se liga a uma se- quência de DNA alvo que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ou é 100% idêntica a uma sequência de DNA alvo do gene PELI1. Em algumas modalidades, pelo menos um dos gRNAs compreende um domínio de direcionamento que se liga a uma se- quência de DNA alvo que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica a uma das SEQ ID NOs: 499-524 e pelo menos um dos gRNAs compreende um domínio de direcionamento que se liga a uma sequência de DNA alvo que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ou é 100% idêntica a uma das SEQ ID NOs: 1330-
1350. Em algumas modalidades, pelo menos um dos gRNAs compre- ende um domínio de direcionamento codificado por uma sequência de ácido nucleico que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ou 100% idêntica a uma das SEQ ID NOs: 499-524 e pelo menos um dos gRNAs compreende um domínio de direcionamento codificado por uma sequência de ácido nucleico que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica, ou é 100% idêntica a uma das SEQ ID NOs: 1330-1350.
[00362] Em algumas modalidades, o sistema de regulação de ge-
nes compreende duas ou mais moléculas de gRNA, em que pelo me- nos um dos gRNAs compreende um domínio de direcionamento que se liga a uma sequência de DNA alvo que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ou é 100% idêntica a uma sequência de DNA alvo de um gene-alvo selecionado de IKZF1, IKZF3, GATA3, BCL3, TNIP1, TNFAIP3, NFKBIA, SMAD2, TGFBR1, TGFBR2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6, IKZF2, CBLB, PPP2R2D, NRP1, HAVCR2, LAG3, TIGIT, CTLA4, PTPN6, PDCD1, ou BCOR e em que pelo me- nos um dos gRNAs compreende um domínio de direcionamento que se liga a uma sequência de DNA alvo que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ou é 100% idêntica a uma sequência de DNA alvo do gene SETD5. Em algumas modalidades, pelo menos um dos gRNAs compreende um domínio de direcionamento que se liga a uma sequência de DNA alvo que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ou 100% idêntica a uma sequência de DNA alvo definida por um conjunto de coordenadas genômicas mostradas na Tabela 5A ou Tabela 5B e pelo menos um dos gRNAs compreende um domínio de direcionamento que se liga a uma sequência de DNA alvo que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ou é 100% idêntica a uma sequência de DNA alvo definida por um con- junto de coordenadas genômicas mostradas em uma das Tabelas 6G ou 6H.
Em algumas modalidades, pelo menos um dos gRNAs com- preende um domínio de direcionamento que se liga a uma sequência de DNA alvo que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ou 100% idêntica a uma das SEQ ID NOs: 154-498 ou SEQ ID NOs: 499-813 e pelo menos um dos gRNAs compreende um domínio de direcionamento que se liga a uma sequência de DNA alvo que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ou é 100% idêntica a uma das SEQ ID NOs: 1351-1367. Em algumas modalida- des, pelo menos um dos gRNAs compreende um domínio de direcio-
namento codificado por uma sequência de ácido nucleico que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ou é 100% idênti- ca a uma das SEQ ID NOs: 154-498 ou SEQ ID NOs: 499-813 e pelo menos um dos gRNAs compreende um domínio de direcionamento codificado por uma sequência de ácido nucleico que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica, ou é 100% idêntica a uma das SEQ ID NOs: 1351-1367.
[00363] Em algumas modalidades, o sistema de regulação de ge- nes compreende duas ou mais moléculas de gRNA, em que pelo me- nos um dos gRNAs compreende um domínio de direcionamento que se liga a uma sequência de DNA alvo que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ou é 100% idêntica a uma sequência de DNA alvo do gene CBLB e em que pelo menos um dos gRNAs compreende um domínio de direcionamento que se liga a uma se- quência de DNA alvo que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ou é 100% idêntica a uma sequência de DNA alvo do gene SETD5. Em algumas modalidades, pelo menos um dos gRNAs compreende um domínio de direcionamento que se liga a uma se- quência de DNA alvo que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ou 100% idêntica a uma das SEQ ID NOs: 499-524 e pe- lo menos um dos gRNAs compreende um domínio de direcionamento que se liga a uma sequência de DNA alvo que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ou é 100% idêntica a uma das SEQ ID NOs: 1351-1367. Em algumas modalidades, pelo menos um dos gRNAs compreende um domínio de direcionamento codificado por uma sequência de ácido nucleico que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ou 100% idêntica a uma das SEQ ID NOs: 499-524 e pelo menos um dos gRNAs compreende um domínio de di- recionamento codificado por uma sequência de ácido nucleico que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica, ou é 100%
idêntica a uma das SEQ ID NOs: 1351-1367.
[00364] Em algumas modalidades, os segmentos de ligação de áci- do nucleico das sequências de gRNA descritas neste documento são projetados para minimizar a ligação fora do alvo usando algoritmos conhecidos na técnica (por exemplo, localizador Cas-OFF) para identi- ficar sequências alvo que são exclusivas para um lócus alvo específico ou gene-alvo.
[00365] Em algumas modalidades, os gRNAs descritos neste do- cumento podem compreender um ou mais nucleosídeos ou nucleotí- deos modificados que introduzem estabilidade em relação às nuclea- ses. Em tais modalidades, esses gRNAs modificados podem desenca- dear uma imunidade inata reduzida em comparação com um gRNA não modificado. O termo "resposta imune inata" inclui uma resposta celular a ácidos nucleicos exógenos, incluindo ácidos nucleicos de fita simples, geralmente de origem viral ou bacteriana, que envolvem a indução da expressão e liberação de citocinas, particularmente os in- terferons, e a morte celular.
[00366] Em algumas modalidades, os gRNAs descritos neste do- cumento são modificados na extremidade 5’ ou próximos a ela (por exemplo, dentro de 1-10, 1-5 ou 1-2 nucleotídeos da extremidade 5’). Em algumas modalidades, a extremidade 5’ de um gRNA é modificada pela inclusão de uma estrutura de tampa de mRNA eucariótica ou de um análogo de tampa (por exemplo, um análogo de tampa G(5’)ppp(5’)G, um análogo de tampa m7G(5’)ppp(5’)G ou um análogo anti tampa reversa 3’-0-Me-m7G(5’)ppp(5’)G (ARCA)). Em algumas modalidades, um gRNA transcrito in vitro é modificado por tratamento com uma fosfatase (por exemplo, fosfatase alcalina intestinal de bezer- ro) para remover o grupo trifosfato 5’. Em algumas modalidades, um gRNA compreende uma modificação na extremidade 3’ ou próximo a ela (por exemplo, dentro de 1-10, 1-5 ou 1-2 nucleotídeos da extremi-
dade 3’). Por exemplo, em algumas modalidades, a extremidade 3’ de um gRNA é modificada pela adição de um ou mais (por exemplo, 25- 200) resíduos de adenina (A).
[00367] Em algumas modalidades, nucleosídeos modificados e nu- cleotídeos modificados podem estar presentes em um gRNA, mas também podem estar presentes em outros sistemas de regulação de genes, por exemplo, sistemas baseados em mRNA, RNAi ou siRNA. Em algumas modalidades, nucleosídeos e nucleotídeos modificados podem incluir um ou mais de: (a) alteração, por exemplo, substituição, de um ou ambos os oxigênios de fosfato não-ligados e/ou de um ou mais dos oxigênios de fosfato de ligação na ligação da estrutura principal de fosfodiéster; (b) alteração, por exemplo, substituição, de um constituinte do açúcar ribose, por exemplo, da hidroxila 2’ no açúcar ribose; (c) substituição em massa da fração fosfato por ligantes "defosfo"; (d) modificação ou substituição de uma nucleobase de ocorrência natural; (e) substituição ou modificação da estrutura principal da ri- bose-fosfato; (f) modificação da extremidade 3’ ou da extremidade 5’ do oligonucleotídeo, por exemplo, remoção, modificação ou substituição de um grupo fosfato terminal ou conjugação de uma fração; e (g) modificação do açúcar.
[00368] Em algumas modalidades, as modificações listadas acima podem ser combinadas para fornecer nucleosídeos e nucleotídeos modificados que podem ter duas, três, quatro ou mais modificações. Por exemplo, em algumas modalidades, um nucleosídeo ou nucleotí- deo modificado pode ter um açúcar modificado e uma nucleobase mo- dificada. Em algumas modalidades, toda base de um gRNA é modifi-
cada. Em algumas modalidades, cada um dos grupos fosfato de uma molécula de gRNA é substituído por grupos fosforotioato.
[00369] Em algumas modalidades, uma ferramenta de software po- de ser usada para otimizar a escolha do gRNA na sequência alvo de um usuário, por exemplo, para minimizar a atividade total fora do alvo em todo o genoma. A atividade fora do alvo pode ser diferente da cli- vagem. Por exemplo, para cada escolha possível de gRNA usando S. pyogenes Cas9, as ferramentas de software podem identificar todas as possíveis sequências fora do alvo (precedendo os NAG ou NGG PAMs) no genoma que contêm até um determinado número (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10) de pares de bases incompatí- veis. A eficiência da clivagem em cada sequência fora do alvo pode ser prevista, por exemplo, usando um esquema de pem queração de- rivado experimentalmente. Cada possível gRNA pode ser classificado de acordo com sua clivagem total prevista fora do alvo; os gRNAs mais bem classificados representam aqueles com maior probabilidade de apresentar maior clivagem no alvo e menos fora do alvo. Outras funções, por exemplo, projeto automatizado de reagente para constru- ção do vetor de gRNA, projeto de primer para o ensaio Surveyor no alvo e projeto de primer para detecção de alto rendimento e quantifica- ção da clivagem fora do alvo via sequenciamento de próxima geração, também podem ser incluídos na ferramenta. IV. Polinucleotídeos
[00370] Em algumas modalidades, a presente descrição fornece polinucleotídeos ou moléculas de ácido nucleico que codificam um sis- tema de regulação de genes descrito neste documento. Conforme usado neste documento, os termos "nucleotídeo" ou "ácido nucleico" se referem a ácido desoxirribonucleico (DNA), ácido ribonucleico (RNA) e híbridos de DNA/RNA. Os polinucleotídeos podem ser de fita simples ou dupla e recombinantes, sintéticos ou isolados. Os polinu-
cleotídeos incluem, mas não estão limitados a: RNA pré-mensageiro (pré-mRNA), RNA mensageiro (mRNA), RNA, DNA genômico (gDNA), DNA amplificado por PCR, DNA complementar (cDNA), DNA sintético ou DNA recombinante. Polinucleotídeos referem-se a uma forma poli- mérica de nucleotídeos de pelo menos 5, pelo menos 10, pelo menos 15, pelo menos 20, pelo menos 25, pelo menos 30, pelo menos 40, pelo menos 50, pelo menos 100, pelo menos 200, pelo menos 300, pelo menos 400, pelo menos 500, pelo menos 1000, pelo menos 5000, pelo menos 10000 ou pelo menos 15000 ou mais nucleotídeos de comprimento, ribonucleotídeos ou desoxirribonucleotídeos ou uma forma modificada de qualquer tipo de nucleotídeo, bem como todos os comprimentos intermediários. É fácil entender que "comprimentos in- termediários", neste contexto, significa qualquer comprimento entre os valores citados, como 6, 7, 8, 9, etc., 101, 102, 103, etc.; 151, 152, 153, etc.; 201, 202, 203, etc.
[00371] Em modalidades particulares, os polinucleotídeos podem ser otimizados por códon. Conforme usado neste documento, o termo "otimizado por códon" refere-se à substituição de códons em um poli- nucleotídeo que codifica um polipeptídeo, a fim de aumentar a expres- são, estabilidade e/ou atividade do polipeptídeo. Os fatores que influ- enciam a otimização do códon incluem, mas não estão limitados a, um ou mais dos seguintes: (i) variação dos desvios de códons entre dois ou mais organismos ou genes ou tabelas de desvios construídos sinte- ticamente, (ii) variação no grau de viés de códons dentro de um orga- nismo, gene ou conjunto de genes, (iii) variação sistemática de có- dons, incluindo contexto, (iv) variação de códons de acordo com seus tRNAs decodificadores, (v) variação de códons de acordo com a % de GC, geral ou em uma posição do trigêmeo, (vi) variação no grau de similaridade com uma sequência de referência, por exemplo, uma se- quência que ocorre naturalmente, (vii) variação no ponto de corte da frequência do códon, (viii) propriedades estruturais dos mRNAs trans- critos a partir da sequência de DNA, (ix) conhecimento prévio sobre a função das sequências de DNA nas quais o projeto do conjunto de substituição de códons deve se basear, (x) variação sistemática dos conjuntos de códons para cada aminoácido, (xi) remoção isolada de sítios espúrios de iniciação da tradução e/ou (xii) eliminação de sítios de poliadenilação fortuitos que, de outro modo, levam a transcritos de RNA truncados.
[00372] As recitações "identidade de sequência", ou, por exemplo, compreendendo uma "sequência de 50% idêntica a", tal conforme usado neste documento, referem-se à medida em que as sequências são idênticas à base de nucleotídeo por nucleotídeo ao longo de uma janela de comparação. Uma "janela de comparação" refere-se a um segmento conceitual de pelo menos 6 posições contíguas, geralmente cerca de 50 a cerca de 100, mais usualmente cerca de 100 a cerca de 150, nas quais uma sequência é comparada a uma sequência de refe- rência com o mesmo número de posições contíguas após as duas se- quências estarem perfeitamente alinhadas. Assim, uma "porcentagem de identidade de sequência" pode ser calculada comparando duas se- quências idealmente alinhadas na janela de comparação, determinan- do o número de posições nas quais a base de ácido nucleico idêntica (por exemplo, A, T, C, G, I) ou o resíduo de aminoácido idêntico (por exemplo, Ala, Pro, Ser, Thr, Gly, Val, Leu, Ile, Phe, Tyr, Trp, Lys, Arg, His, Asp, Glu, Asn, Gln, Cys e Met) ocorre em ambas as sequências para gerar o número de posições correspem quentes, dividindo o nú- mero de posições correspem quentes pelo número total de posições na janela de comparação (ou seja, o tamanho da janela) e multiplican- do o resultado por 100 para gerar a porcentagem de identidade de se- quência.
[00373] Conforme usado neste documento, os termos "variante po-
linucleotídica" e "variante" e similares referem-se a polinucleotídeos que exibem identidade substancial de sequência com uma sequência polinucleotídica de referência ou polinucleotídeos que hibridam com uma sequência de referência sob condições rigorosas definidas a se- guir. Estes termos incluem polinucleotídeos nos quais um ou mais nu- cleotídeos foram adicionados ou excluídos ou substituídos por diferen- tes nucleotídeos em comparação com um polinucleotídeo de referên- cia. A este respeito, é bem entendido na técnica que certas alterações, incluindo mutações, adições, deleções e substituições, podem ser fei- tas a um polinucleotídeo de referência, pelo qual o polinucleotídeo al- terado retém a função ou atividade biológica do polinucleotídeo de re- ferência.
[00374] Em modalidades particulares, polinucleotídeos ou variantes têm pelo menos ou cerca de 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência para uma se- quência de referência.
[00375] Além disso, será apreciado pelos versados na técnica que, como resultado da degenerescência do código genético, existem mui- tas sequências nucleotídicas que codificam um polipeptídeo ou frag- mento de variante deste conforme descrito neste documento. Alguns desses polinucleotídeos suportam homologia mínima com a sequência de nucleotídeos de qualquer gene nativo. No entanto, polinucleotídeos que variam devido a diferenças no uso de códons são contemplados especificamente em modalidades particulares, por exemplo polinucleo- tídeos que são otimizados para seleção de códons humanos e/ou pri- matas. Além disso, também podem ser utilizados alelos dos genes que compreendem as sequências polinucleotídicas fornecidas neste do- cumento. Os alelos são genes endógenos que são alterados como re-
sultado de uma ou mais mutações, tais como deleções, adições e/ou substituições de nucleotídeos.
[00376] Os polinucleotídeos contemplados neste documento, inde- pendentemente do comprimento da própria sequência de codificação, podem ser combinados com outras sequências de DNA, como promo- tores e/ou potencializadores, regiões não traduzidas (UTRs), sequên- cias de sinais, sequências de Kozak, sinais de poliadenilação, sítios adicionais de enzimas de restrição, vários sítios de clonagem, sítios de entrada ribossômica interna (IRES), sítios de reconhecimento de re- combinase (por exemplo, sítios LoxP, FRT e Att), códons de termina- ção, sinais de terminação transcricional e polinucleotídeos que codifi- cam polipeptídeos de auto-clivagem, tags de epítopo, conforme divul- gado em outras partes deste documento ou como conhecido na técni- ca, de modo que seu comprimento total possa variar consideravelmen- te. Portanto, é contemplado que um fragmento de polinucleotídico de quase qualquer comprimento possa ser empregado em modalidades particulares, com o comprimento total sendo preferencialmente limita- do pela facilidade de preparação e uso no protocolo de DNA recombi- nante pretendido.
[00377] Os polinucleotídeos podem ser preparados, manipulados e/ou expressos usando qualquer uma de uma variedade de técnicas bem estabelecidas conhecidas e disponíveis na técnica. Vetores
[00378] Para expressar um sistema de regulação de genes descrito neste documento em uma célula, um cassete de expressão que codifi- ca o sistema de regulação de genes pode ser inserida no vetor apro- priado. O termo "vetor de ácido nucleico" é usado neste documento para referir uma molécula de ácido nucleico capaz de transferir ou transportar outra molécula de ácido nucleico. O ácido nucleico transfe- rido está geralmente ligado a, por exemplo, inserido na molécula de ácido nucleico do vetor. Um vetor de ácido nucleico pode incluir se- quências que dirigem a replicação autônoma numa célula, ou podem incluir sequências suficientes para permitir a integração no DNA da célula hospedeira.
[00379] O termo "cassete de expressão", conforme usado neste do- cumento, refere-se a sequências genéticas dentro de um vetor que pode expressar um RNA e, subsequentemente, uma proteína. A cas- sete de ácido nucleico contém o gene de interesse, por exemplo, um sistema de regulação de genes. A cassete de ácido nucleico é orienta- da posicionalmente e sequencialmente dentro do vetor, de modo que o ácido nucleico na cassete possa ser transcrito em RNA e, quando ne- cessário, traduzido em uma proteína ou polipeptídeo, sofra modifica- ções pós-traducionais apropriadas necessárias para a atividade na cé- lula transformada e ser translocado para o compartimento apropriado para a atividade biológica, direcionando os compartimentos intracelula- res apropriados ou a secreção para os compartimentos extracelulares. De preferência, a cassete tem as suas extremidades 3' e 5' adaptadas para inserção imediata num vetor, por exemplo, possui sítios de endo- nuclease de restrição em cada extremidade. A cassete pode ser remo- vida e inserida em um plasmídeo ou vetor viral como uma única unida- de.
[00380] Em modalidades particulares, os vetores incluem, sem limi- tação, plasmídeos, fagomídeos, cosmídeos, transposons, cromosso- mos artificiais como o cromossomo artificial de levedura (YAC), cro- mossomo artificial bacteriano (BAC) ou cromossomo artificial derivado de P1 (PAC), bacteriófagos como lambda fago ou fago M13 e vírus animais. Em modalidades particulares, as sequências de codificação dos sistemas de regulação de genes divulgados neste documento po- dem ser ligadas a esses vetores para a expressão dos sistemas de regulação de genes em células de mamíferos.
[00381] Em algumas modalidades, vetores não virais são utilizados para distribuir um ou mais polinucleotídeos contemplados neste docu- mento a uma célula efetora do sistema imunológico, por exemplo, uma célula T. Em algumas modalidades, o vetor recombinante compreen- dendo um polinucleotídeo que codifica um ou mais componentes de um sistema de regulação de genes descrito neste documento é um plasmídeo. Numerosos vetores de expressão de plasmídeo adequa- dos são conhecidos dos versados na técnica, e muitos estão comerci- almente disponíveis. Os vetores que se seguem são fornecidos a título de exemplo; para as células hospedeiras eucarióticas: pXT1, pSG5 (Stratagene), pSVK3, pBPV, pMSG e pSVLSV40 (Pharmacia). No en- tanto, qualquer outro vetor de plasmídeo pode ser utilizado desde que seja compatível com a célula hospedeira. Dependendo do tipo de célu- la e sistema de regulação de genes utilizado, qualquer um de vários elementos de controle de transcrição e tradução adequados, incluindo promotores constitutivos e induzíveis, elementos de potencializador de transcrição, terminadores de transcrição, etc., pode ser usado no vetor de expressão (ver, por exemplo, Bitter et al. (1987) Methods in Enzymology, 153:516-544).
[00382] Em algumas modalidades, o vetor recombinante compre- endendo um polinucleotídeo que codifica um ou mais componentes de um sistema de regulação de genes descrito neste documento é um vetor viral. Os vetores virais adequados incluem, mas não estão limita- dos a, vetores virais baseados no vírus vaccinia; poliovírus; adenovírus (ver, por exemplo, Li et al., Invest Opthalmol Vis Sci 35: 2543 2549, 1994; Borras et al., Gene Ther 6: 515 524, 1999; Li e Davidson, PNAS 92: 7700 7704, 1995; Sakamoto et al., H Gene Ther 5: 1088 1097, 1999; WO 94/12649, WO 93/03769; WO 93/19191; WO 94/28938; WO 95/11984 e WO 95/00655); vírus adenoassociado (ver, por exemplo, Patente US. nº 7.078.387; Ali et al., Hum Gene Ther 9:81 86, 1998,
Flannery et al., PNAS 94: 6916 6921, 1997; Bennett et al., Invest Op- thalmol Vis Sci 38: 2857 2863, 1997; Jomary et al., Gene Ther 4: 683 690, 1997, Rolling et al., Hum Gene Ther 10: 641 648, 1999; Ali et al., Hum Mol Genet 5: 591 594, 1996; Srivastava em WO 93/09239, Sa- mulski et al., J. Vir. (1989) 63: 3822-3828; Mendelson et al., Virol. (1988) 166: 154-165; e Flotte et al., PNAS (1993) 90: 10613-10617); SV40; vírus do herpes simplex; vírus da imunodeficiência humana (ver, por exemplo, Miyoshi et al., PNAS 94:10319 23, 1997; Takahashi et al., J. Virol 73: 7812 7816, 1999); um vetor retroviral (por exemplo, ví- rus da leucemia murina, vírus da necrose do baço e vetores derivados de retrovírus, como o vírus Rous Sarcoma, Harvey Sarcoma, vírus de leucose aviária, um lentivírus, vírus de imunodeficiência humana, vírus mieloproliferativo de sarcoma e vírus de tumor mamário); e similar. Exemplos de vetores são vetores pClneo (Promega) para expressão em células de mamíferos; pLenti4/V5-DEST™, pLenti6/V5-DEST™ e pLenti6.2/V5-GW/lacZ (Invitrogen) para transferência gênica mediada por lentivírus e expressão em células de mamíferos.
[00383] Em algumas modalidades, o vetor é um vetor não integra- dor, incluindo, sem limitação, um vetor epissomal ou um vetor que é mantido extracromossomicamente. Conforme usado neste documento, o termo "epissomal" refere-se a um vetor que é capaz de se replicar sem integração no DNA cromossômico do hospedeiro e sem perda gradual de uma célula hospedeira em divisão, o que também significa que o referido vetor se replica extracromossômica ou episomalmente. O vetor é manipulado para abrigar a sequência que codifica a origem da replicação do DNA ou "ori" de um vírus do herpes linfotrófico ou de um vírus herpes gama, um adenovírus, SV40, um vírus do papiloma bovino ou uma levedura, especificamente uma origem de replicação de um vírus do herpes linfotrófico ou um herpesvírus gama correspem quente ao oriP do EBV. Em um aspecto particular, o vírus do herpes linfotrófico pode ser o vírus Epstein Barr (EBV), o vírus do sarcoma de Kaposi (KSHV), o vírus do herpes saimiri (HS) ou o vírus da doença de Marek (MDV). O vírus Epstein Barr (EBV) e o vírus do sarcoma de Ka- posi (KSHV) também são exemplos de um herpesvírus gama.
[00384] Em algumas modalidades, um polinucleotídeo é introduzido em uma célula-alvo ou hospedeira usando um sistema de vetor de transposon. Em certas modalidades, o sistema de vetor de transposon compreende um vetor compreendendo elementos transponíveis e um polinucleotídeo contemplado neste documento; e uma transposase. Em uma modalidade, o sistema de vetor de transposon é um sistema de vetor de transposase único, ver, por exemplo, WO 2008/027384. Transposases exemplificativas incluem, mas não se limitam a: piggyBac, Sleeping Beauty, Mos1, Tc1/mariner, Tol2, mini-Tol2, Tc3, MuA, Himar I, Frog Prince e derivados destes. O transposon piggyBac e a transposase estão descritos, por exemplo, na Patente US.
6.962.810, que é incorporada neste documento por referência na sua totalidade. O transposon e a transposase Sleeping Beauty são descri- tos, por exemplo, em Izsvak et al., J. Mol. Biol. 302: 93-102 (2000), que é incorporado neste documento por referência na sua totalidade. O transposon Tol2 que foi isolado pela primeira vez a partir do peixe medaka Oryzias latipes e pertence à família de transposons hAT é descrito em Kawakami et al. (2000). Mini-Tol2 é uma variante de Tol2 e é descrito em Balciunas et al. (2006). Os transposons Tol2 e Mini- Tol2 facilitam a integração de um transgene no genoma de um orga- nismo quando co-agem com a transposase Tol2. O transposon e transposase de Frog Prince estão descritos, por exemplo, em Miskey et al., Nucleic Acids Res. 31:6873-6881 (2003).
[00385] Em algumas modalidades, uma sequência polinucleotídica que codifica um ou mais componentes de um sistema de regulação de genes descrito neste documento está operacionalmente ligada a um elemento de controle, por exemplo, um elemento de controle transcri- cional, como um promotor. "Elementos de controle" refere-se às regi- ões não traduzidas do vetor (por exemplo, origem da replicação, cas- setes de seleção, promotores, potencializadores, sinais de início de tradução (sequência Shine Dalgarno ou sequência Kozak), íntrons, uma sequência de poliadenilação, regiões não traduzidas 5' e 3') que interagem com as proteínas celulares do hospedeiro para realizar a transcrição e tradução. Tais elementos podem variar em sua força e especificidade. O elemento de controle da transcrição pode ser funcio- nal em uma célula eucariótica (por exemplo, uma célula de mamífero) ou uma célula procariótica (por exemplo, bacteriana ou célula de Ar- chaea). Em algumas modalidades, uma sequência polinucleotídica que codifica um ou mais componentes de um sistema de regulação de ge- nes descrito neste documento está operacionalmente ligada a múlti- plos elementos de controle que permitem a expressão do polinucleotí- deo nas células procarióticas e eucarióticas.
[00386] Dependendo do tipo de célula e sistema de regulação de genes utilizado, qualquer um de vários elementos de controle de transcrição e tradução adequados, incluindo promotores constitutivos e induzíveis, elementos de potencializador de transcrição, terminadores de transcrição, etc., pode ser usado no vetor de expressão (ver por exemplo, Bitter et al. (1987) Methods in Enzymology, 153:516-544). O termo "promotor", conforme usado neste documento, refere-se a um sítio de reconhecimento de um polinucleotídeo (DNA ou RNA) ao qual uma RNA polimerase se liga. Uma RNA polimerase inicia e transcreve polinucleotídeos operacionalmente ligados ao promotor. Em modalida- des particulares, os promotores que operam em células de mamíferos compreendem uma região rica em AT localizada aproximadamente 25 a 30 bases a montante do sítio em que a transcrição é iniciada e/ou outra sequência encontrada de 70 a 80 bases a montante do início da transcrição, uma região CNCAAT em que N pode ser qualquer nucleo- tídeo. O termo "potencializador" refere-se a um segmento de DNA que contém sequências capazes de fornecer transcrição aprimorada e, em alguns casos, pode funcionar independentemente de sua orientação em relação a outra sequência de controle. Um potencializador pode funcionar de forma cooperativa ou aditiva com promotores e/ou outros elementos potencializadores.
[00387] Em algumas modalidades, os polinucleotídeos que codifi- cam um ou mais componentes de um sistema de regulação de genes descritos neste documento estão operacionalmente ligados a um pro- motor. O termo "operacionalmente ligado" refere-se a uma justaposi- ção em que os componentes descritos estão em uma relação que lhes permite funcionar da sua maneira pretendida. Em uma modalidade, o termo refere-se a uma ligação funcional entre uma sequência de con- trole de expressão de ácido nucleico (como um promotor e/ou potenci- alizador) e uma segunda sequência de polinucleotídeo, por exemplo, um polinucleotídeo que codifica um ou mais componentes de um sis- tema de regulação de genes, em que a sequência de controle de ex- pressão direciona a transcrição do ácido nucleico correspem quente à segunda sequência.
[00388] Exemplos não limitativos de promotores eucarióticos ade- quados (promotores funcionais em uma célula eucariótica) incluem aqueles do citomegalovírus (CMV) imediatamente precoce, vírus do herpes simplex (HSV) timidina quinase, um vírus símio viral 40 (SV40) (por exemplo, SV40 precoce e tardio), um promotor do vírus formador do foco do baço (SFFV), repetições terminais longas (LTRs) de retroví- rus (por exemplo, um promotor LTR do vírus da leucemia murina Mo- loney (MoMLV) ou um LTR do vírus do sarcoma Rous (RSV)), um ví- rus do herpes simplex (HSV) (timidina quinase), promotores H5, P7.5 e P11 do vírus vaccinia, promotor do fator de alongamento 1-alfa (EF1α),
promotor da resposta precoce ao crescimento 1 (EGR1), promotor da ferritina H (FerH), um promotor de ferritina L (FerL), um promotor de gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase (GAPDH), um promotor eucarió- tico do fator de iniciação da tradução 4A1 (EIF4A1), um promotor da proteína 5 (HSPA5) de choque térmico 70kDa, uma proteína de cho- que térmico 90kDa beta, membro 1 (HSP90B1), um promotor da prote- ína de choque térmico 70kDa (HSP70), uma β-cinesina (β-KIN) promo- tor, o locus ROSA 26 humano (Irions et al., Nature Biotechnology 25, 1477-1482 (2007)), um promotor Ubiquitin C (UBC), um promotor de fosfoglicerato quinase-1 (PGK), um potencializador de citomegaloví- rus/promotor de β-actina de frango (CAG), um promotor de β-actina e um potencializador do vírus do sarcoma mieloproliferativo, região de controle negativo excluída, promotor dl587rev substituído pelo sítio de ligação ao iniciador (MND) e metalotioneína-l de camundongo. A sele- ção do vetor e do promotor apropriados está bem dentro do nível de conhecimento comum na técnica. O vetor de expressão também pode conter um sítio de ligação de ribossomo para a iniciação da tradução e um terminador de transcrição. O vetor de expressão também pode in- cluir sequências apropriadas para amplificar a expressão. O vetor de expressão também pode incluir sequências nucleotídicas que codifi- cam tags de proteínas (por exemplo, tag 6xHis, tag de hemaglutinina, proteína fluorescente verde, etc.) que são fundidos ao polipeptídeo modificador direcionado ao sítio, resultando assim em um polipeptídeo quimérico.
[00389] Em algumas modalidades, a sequência de polinucleotídeos que codificam um ou mais componentes de um sistema de regulação de genes descritos neste documento estão operacionalmente ligados a um promotor constitutivo. Em tais modalidades, os polinucleotídeos que codificam um ou mais componentes de um sistema de regulação de genes descritos neste documento são expressos de forma constitu-
tiva e/ou ubíqua em uma célula.
[00390] Em algumas modalidades, a sequência de polinucleotídeos que codifica um ou mais componentes de um sistema de regulação de genes descritos neste documento está operacionalmente ligada a um promotor induzível. Em tais modalidades, os polinucleotídeos que codi- ficam um ou mais componentes de um sistema de regulação de genes descritos neste documento são expressos condicionalmente. Confor- me usado neste documento, "expressão condicional" pode se referir a qualquer tipo de expressão condicional incluindo, mas não limitado a expressão induzível; expressão reprimível; expressão em células ou tecidos com um estado fisiológico, biológico ou de doença específico (por exemplo, tipo de célula ou expressão específica de tecido) etc. Exemplos ilustrativos de promotores/sistemas induzíveis incluem, mas não estão limitados a, promotores induzíveis por esteroides, como promotores de genes que codificam receptores de glicocorticoides ou estrogênio (induzíveis por tratamento com o hormônio correspem quente), promotor de metalotionina (induzível por tratamento com vá- rios metais pesados), promotor MX-1 (induzível por interferon), o sis- tema regulável por mifepristona "GeneSwitch" (Sirin et al., 2003, Gene, 323: 67), o interruptor genético induzível por cumato (WO 2002/088346), sistemas de regulaçãoes dependentes de tetraciclina, etc.
[00391] Em algumas modalidades, os vetores descritos neste do- cumento compreendem ainda um sinal de terminação de transcrição. Os elementos que dirigem a terminação eficiente e a poliadenilação dos transcritos heterólogos de ácidos nucleicos aumentam a expres- são gênica heteróloga. Os sinais de terminação da transcrição são ge- ralmente encontrados a jusante do sinal de poliadenilação. Em moda- lidades particulares, os vetores compreendem uma sequência de poli- adenilação 3′ de um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo a ser expresso. O termo "sítio poliA" ou "sequência poliA", conforme usado neste documento, denota uma sequência de DNA que direciona tanto a terminação quanto a poliadenilação do transcrito de RNA nascente pela RNA polimerase II. As sequências de poliadenilação podem pro- mover a estabilidade do mRNA pela adição de uma cauda de poliA na extremidade 3′ da sequência de codificação e, assim, contribuir para aumentar a eficiência da tradução. A clivagem e a poliadenilação são direcionadas por uma sequência poli(A) no RNA. A sequência central de poli(A) para pré-mRNAs de mamíferos possui dois elementos de reconhecimento que flanqueiam um sítio de clivagem-poliadenilação. Tipicamente, um hexâmero AAUAAA quase invariante repousa 20-50 nucleotídeos a montante de um elemento mais variável rico em resí- duos U ou GU. A clivagem do transcrito nascente ocorre entre esses dois elementos e é acoplada à adição de até 250 adenosinas ao pro- duto de clivagem 5'. Em modalidades particulares, a sequência central de poli(A) é uma sequência poliA ideal (por exemplo, AATAAA, AT- TAAA, AGTAAA). Em modalidades particulares, a sequência poli(A) é uma sequência poliA SV40, uma sequência poliA do hormônio do crescimento bovino (BGHpA), uma sequência poliA da β-globina de coelho (rβgpA), variantes destas ou outra sequência poliA heteróloga ou endógena adequada conhecida na técnica.
[00392] Em algumas modalidades, um vetor também pode compre- ender uma sequência que codifica um peptídeo de sinal (por exemplo, para localização nuclear, localização nucleolar, localização mitocondri- al), fundida ao polinucleotídeo que codifica o um ou mais componentes do sistema. Por exemplo, um vetor pode compreender uma sequência de localização nuclear (por exemplo, de SV40) fundida ao polinucleotí- deo que codifica o um ou mais componentes do sistema.
[00393] Os métodos de introdução de polinucleotídeos e vetores recombinantes em uma célula hospedeira são conhecidos na técnica,
e qualquer método conhecido pode ser usado para introduzir compo- nentes de um sistema de regulação de genes em uma célula.
Os mé- todos adequados incluem, por exemplo, infecção viral ou bacteriófago, transfecção, conjugação, fusão de protoplastos, lipofecção, eletropora- ção, precipitação de fosfato de cálcio, transfecção mediada por polieti- lenoimina (PEI), transfecção mediada por DEAE-dextrano, transfecção mediada por lipossomas, tecnologia de pistola de partículas, precipita- ção de fosfato de cálcio, micro injeção direta, distribuição de ácido nu- cleico mediada por nanopartículas (ver, por exemplo, Panyam et al., Adv Drug Deliv Rev. 2012, setembro 13, pii: S0169-409X (12) 00283- 9), métodos de distribuição de microfluídicos (ver, por exemplo, Publi- cação Internacional PCT Nº WO 2013/059343) e semelhantes.
Em al- gumas modalidades, a distribuição por eletroporação compreende mis- turar as células com os componentes de um sistema de regulação de genes em um cartucho, câmara ou cubeta e aplicar um ou mais impul- sos elétricos de duração e amplitude definidas.
Em algumas modalida- des, as células são misturadas com componentes de um sistema de regulação de genes em um vaso conectado a um dispositivo (por exemplo, uma bomba) que alimenta a mistura em um cartucho, câma- ra ou cubeta em que um ou mais impulsos elétricos de duração defini- da e amplitude são aplicados, após o que as células são distribuídas a um segundo vaso.
Exemplos ilustrativos de sistemas de distribuição de polinucleotídeos adequados para uso em modalidades particulares contempladas em modalidades particulares incluem, mas não estão limitados aos fornecidos pela Amaxa Biosystems, Maxcyte, Inc., BTX Molecular Delivery Systems, NeonTM Transfection Systems e Coperni- cus Therapeutics Inc.
Os reagentes de lipofecção são vendidos co- mercialmente (por exemplo, Transfectam™ e Lipofectin™). Lipídios catiônicos e neutros que são adequados para lipofecção eficiente de polinucleotídeos foram descritos na literatura.
Ver, por exemplo, Liu et al. (2003) Gene Therapy. 10: 180-187; e Balazs et al. (2011) Journal of Drug Delivery. 2011: 1-12.
[00394] Em algumas modalidades, vetores compreendendo polinu- cleotídeos que codificam um ou mais componentes de um sistema de regulação de genes descritos neste documento são introduzidos nas células por métodos de distribuição viral, por exemplo, por transdução viral. Em algumas modalidades, vetores compreendendo polinucleotí- deos que codificam um ou mais componentes de um sistema de regu- lação de genes descritos neste documento são introduzidos nas célu- las por métodos de distribuição não virais. Métodos ilustrativos de dis- tribuição não viral de polinucleotídeos contemplados em modalidades particulares incluem, mas não estão limitados a: eletroporação, sono- poração, lipofecção, microinjeção, biolística, virossomas, lipossomas, imunolipossomas, nanopartículas, policação ou lipídio: conjugados de ácidos nucleicos, DNA naked, viríons artificiais, transferência mediada por DEAE-dextrano, pistola de genes e choque térmico.
[00395] Em algumas modalidades, um ou mais componentes de um sistema de regulação de genes ou sequência de polinucleotídeos que codificam um ou mais componentes de um sistema de regulação des- crito neste documento são introduzidos em um veículo de distribuição não viral, como um transposon, uma nanopartícula (por exemplo, uma nanopartícula lipídica), um lipossomo, um exossomo, uma bactéria atenuada ou uma partícula semelhante a vírus. Em algumas modali- dades, o veículo é uma bactéria atenuada (por exemplo, manipulada naturalmente ou artificialmente para ser invasiva, mas atenuada para evitar patogênese, incluindo Listeria monocytogenes, certas cepas de Salmonella, Bifidobacterium longum, e Escherichia coli modificada), bactérias com tropismo nutricional e específico do tecido para direcio- nar células específicas e bactérias que possuem proteínas de superfí- cie modificadas para alterar a especificidade da célula-alvo. Em algu-
mas modalidades, o veículo é um bacteriófago geneticamente modifi- cado (por exemplo, fagos manipulados com grande capacidade de empacotamento, menos imunogenicidade, contendo sequências de manutenção de plasmídeo de mamífero e tendo ligantes de direciona- mento incorporados). Em algumas modalidades, o veículo é uma par- tícula semelhante a vírus de mamífero. Por exemplo, partículas virais modificadas podem ser geradas (por exemplo, pela purificação das partículas "vazias" seguidas pela montagem ex vivo do vírus com a carga desejada). O veículo também pode ser manipulado para incor- porar ligantes de direcionamento para alterar a especificidade do teci- do alvo. Em algumas modalidades, o veículo é um lipossoma biológi- co. Por exemplo, o lipossoma biológico é uma partícula fosfolipídica derivada de células humanas (por exemplo, hemácias-fantasma, que são glóbulos vermelhos quebrados em estruturas esféricas derivadas do sujeito e em que o direcionamento do tecido pode ser alcançado pela ligação de vários tecidos ou células ligantes específicas), exos- somos secretores ou nanovescículas ligadas à membrana (30-100 nm) de origem endocítica (por exemplo, podem ser produzidas a partir de vários tipos de células e, portanto, podem ser absorvidas pelas células sem a necessidade de direcionar ligantes). V. Métodos de produção de células efetoras imunes modificadas
[00396] Em algumas modalidades, a presente descrição fornece métodos para a produção de células efetoras imunes modificadas. Em algumas modalidades, os métodos compreendem a introdução de um sistema de regulação de genes em uma população de células efetoras imunes, em que o sistema de regulação de genes é capaz de reduzir a expressão e/ou a função de um ou mais genes-alvo endógenos.
[00397] Os componentes dos sistemas de regulação de genes des- critos neste documento, por exemplo, um sistema baseado em ácido nucleico ou ácido nucleico/proteína pode ser introduzido nas células-
alvo em uma variedade de formas, usando uma variedade de métodos e formulações de distribuição. Em algumas modalidades, um polinu- cleotídeo que codifica um ou mais componentes do sistema é distribui- ção por um vetor recombinante (por exemplo, um vetor viral ou plas- mídeo, descrito supra). Em algumas modalidades, em que o sistema compreende mais do que um único componente, um vetor pode com- preender uma pluralidade de polinucleotídeos, cada um codificando um componente do sistema. Em algumas modalidades, em que o sis- tema compreende mais de um único componente, pode ser usada uma pluralidade de vetores, em que cada vetor compreende um poli- nucleotídeo que codifica um componente específico do sistema. Em algumas modalidades, a introdução do sistema de regulação de genes na célula ocorre in vitro. Em algumas modalidades, a introdução do sistema de regulação de genes na célula ocorre in vivo. Em algumas modalidades, a introdução do sistema de regulação de genes na célula ocorre ex vivo.
[00398] Em algumas modalidades, a introdução do sistema de regu- lação de genes na célula ocorre in vitro ou ex vivo. Em algumas moda- lidades, as células efetoras imunes são modificadas in vitro ou ex vivo sem manipulação adicional em cultura. Por exemplo, em algumas mo- dalidades, os métodos de produção de uma célula efetora imune modi- ficada descritos neste documento compreendem a introdução de um sistema de regulação de genes in vitro ou ex vivo sem etapas adicio- nais de ativação e/ou expansão. Em algumas modalidades, as células efetoras imunes são modificadas e são posteriormente manipuladas in vitro ou ex vivo. Por exemplo, em algumas modalidades, as células efetoras imunes são ativadas e/ou expandidas in vitro ou ex vivo antes da introdução de um sistema de regulação de genes. Em algumas modalidades, um sistema de regulação de genes é introduzido nas cé- lulas efetoras imunes e é então ativado e/ou expandido in vitro ou ex vivo. Em algumas modalidades, as células modificadas com sucesso podem ser classificadas e/ou isoladas (por exemplo, por citometria de fluxo) de células modificadas sem sucesso para produzir uma popula- ção purificada de células efetoras imunes modificadas. Essas células modificadas com sucesso podem então ser propagadas ainda mais para aumentar o número de células modificadas e/ou criopreservadas para uso futuro.
[00399] Em algumas modalidades, a presente descrição fornece métodos para a produção de células efetoras imunes modificadas compreendendo a obtenção de uma população de células efetoras imunes. A população de células efetoras imunes pode ser cultivada in vitro sob várias condições de cultura necessárias para suportar o cres- cimento, por exemplo, a uma temperatura apropriada (por exemplo, 37 °C) e a atmosfera (por exemplo, ar mais 5% de CO2) e em um meio de cultura apropriado. O meio de cultura pode ser líquido ou semi-sólido, por exemplo, contendo ágar, metilcelulose, etc. Exemplos ilustrativos de meios de cultura de células incluem Minimal Essential Media (MEM), DMEM modificado por Iscove, RPMI 1640Clicks, AIM-V, F-12, X-Vivo 15, X-Vivo 20 e Optimizer, com aminoácidos adicionados, pi- ruvato de sódio, e vitaminas, isentas de soro ou suplementadas com uma quantidade apropriada de soro (ou plasma) ou um conjunto defi- nido de hormônios e/ou uma quantidade de citocina (s) suficiente para o crescimento e expansão das células efetoras imunes.
[00400] Os meios de cultura podem ser suplementados com um ou mais fatores necessários para a proliferação e viabilidade, incluindo, mas não se limitando a, fatores de crescimento como soro (por exem- plo, soro bovino ou humano fetal em cerca de 5% a 10%), interleucina- 2 (IL- 2) insulina, IFN-γ, IL-4, IL-7, IL-21, GM-CSF, IL-10, IL-12, IL-15, TGFβ e TNF-α. Exemplos ilustrativos de outros aditivos para expansão de células T incluem, mas não estão limitados a, surfactante, piasma-
nato, tampões de pH como HEPES e agentes redutores como N-acetil- cisteína e 2-mercaptoetanol, ou quaisquer outros aditivos adequados para o crescimento de células conhecidas pelos versados na técnica, tais como L-glutamina, um tiol, particularmente 2-mercaptoetanol e/ou antibióticos, por exemplo, penicilina e estreptomicina. Normalmente, os antibióticos são incluídos apenas em culturas experimentais, não em culturas de células que devem ser infundidas em um sujeito.
[00401] Em algumas modalidades, a população de células efetoras imunes é obtida a partir de uma amostra derivada de um sujeito. Em algumas modalidades, é obtida uma população de células efetoras imunes é obtida a partir de um primeiro sujeito e a população de célu- las efetoras imunes modificadas produzidas pelos métodos descritos neste documento é administrada a um segundo sujeito diferente. Em algumas modalidades, uma população de células efetoras imunes é obtida de um sujeito e a população de células efetoras imunes modifi- cadas produzidas pelos métodos descritos neste documento é admi- nistrada ao mesmo sujeito. Em algumas modalidades, a amostra é uma amostra de tecido, uma amostra de fluido, uma amostra de célula, uma amostra de proteína ou uma amostra de DNA ou RNA. Em algu- mas modalidades, uma amostra de tecido pode ser derivada de qual- quer tipo de tecido, incluindo, entre outros, pele, cabelo (incluindo raí- zes), medula óssea, osso, músculo, glândula salivar, esôfago, estô- mago, intestino delgado (por exemplo, tecido do duodeno, jejuno ou íleo), intestino grosso, fígado, vesícula biliar, pâncreas, pulmão, rim, bexiga, útero, ovário, vagina, placenta, testículos, tireoide, glândula adrenal, tecido cardíaco, timo, baço, linfonodo, medula espinhal, cére- bro, olho, ouvido, língua, cartilagem, tecido adiposo branco ou tecido adiposo marrom. Em algumas modalidades, uma amostra de tecido pode ser derivada de um tumor cancerígeno, pré-canceroso ou não- canceroso. Em algumas modalidades, uma amostra de fluido compre-
ende swabs bucais, sangue, plasma, mucosa oral, mucosa vaginal, sangue periférico, sangue do cordão umbilical, saliva, sêmen, urina, fluido de ascite, fluido pleural, fluido espinhal, líquido espinhal, lava- gem pulmonar, lágrimas, suor, sêmen, fluido seminal, plasma seminal, fluido prostático, fluido pré-ejaculatório (fluido de Cowper), excremen- tos, líquido cefalorraquidiano, linfa, meio de cultura celular compreen- dendo uma ou mais populações de células, soluções tamponadas compreendendo uma ou mais populações de células e semelhantes.
[00402] Em algumas modalidades, a amostra é processada para enriquecer ou isolar uma população de células efetoras imunes do res- tante da amostra. Em certas modalidades, a amostra é uma amostra de sangue periférico que é então sujeita a leucaférese para separar os glóbulos vermelhos e plaquetas e para isolar linfócitos. Em algumas modalidades, a amostra é um leucopak a partir do qual células efeto- ras imunes podem ser isoladas ou enriquecidas. Em algumas modali- dades, a amostra é uma amostra de tumor que é posteriormente pro- cessada para isolar linfócitos presentes no tumor (ou seja, por frag- mentação e digestão enzimática do tumor para obter uma suspensão celular de linfócitos infiltrantes de tumor).
[00403] Em algumas modalidades, um método para fabricar células efetoras imunes modificadas neste documento contempladas compre- ende a ativação e/ou expansão de uma população de células efetoras imunes, conforme descrito, por exemplo, nas Patentes US. 6.352.694;
6.534.055; 6.905.680; 6.692.964; 5.858.358; 6.887.466; 6.905.681;
7.144.575; 7.067.318; 7.172.869; 7.232.566; 7.175.843; 5.883.223;
6.905.874; 6.797.514; 6.867.041; e Publicação do Pedido de Patente US. Nº 20060121005.
[00404] Em várias modalidades, um método para fabricar células efetoras imunes modificadas contempladas neste documento compre- ende ativar uma população de células compreendendo células efeto-
ras imunes. Em modalidades particulares, as células efetoras imunes são células T. A ativação de células T pode ser realizada fornecendo um sinal de estimulação primário (por exemplo, através do complexo TCR/CD3 de células T ou via estimulação da proteína de superfície CD2) e fornecendo um sinal de co-estimulação secundário através de uma molécula acessória.
[00405] Em algumas modalidades, o complexo TCR/CD3 pode ser estimulado entrando em contato com a célula T com um agente de li- gação CD3 adequado, por exemplo, um ligante CD3 ou um anticorpo monoclonal anti-CD3. Exemplos ilustrativos de anticorpos CD3 inclu- em, mas não estão limitados a OKT3, G19-4, BC3, CRIS-7 e 64.1. Em algumas modalidades, um agente de ligação a CD2 pode ser usado para fornecer um sinal de estimulação primário para as células T. Exemplos ilustrativos de agentes de ligação a CD2 incluem, mas não estão limitados a, ligantes de CD2 e anticorpos anti-CD2, por exemplo, o anticorpo T11.3 em combinação com o anticorpo T11.1 ou T11.2 (Meuer, SC et al. (1984) Cell 36: 897-906) e o anticorpo 9.6 (que reco- nhece o mesmo epítopo que TI 1.1) em combinação com o anticorpo 9-1 (Yang, SY et al. (1986) J. Immunol. 137:1097-1100).
[00406] Além do sinal estimulatório fornecido pelo complexo TCR/CD3 ou CD2, a indução de respostas de células T normalmente requer um segundo sinal coestimulatório fornecido por um ligante que se liga especificamente a uma molécula coestimuladora em uma célula T, fornecendo um sinal coestimulatório que, além do sinal primário for- necido por, por exemplo, a ligação de um complexo TCR/CD3, medeia a resposta desejada das células T. Os ligantes co-estimulatórios ade- quados incluem, mas não estão limitados a, CD7, B7-1 (CD80), B7-2 (CD86), 4-1BBL, OX40L, ligante co-estimulador induzível (ICOS-L), molécula de adesão intercelular (ICAM), CD30L, CD40, CD70, CD83, HLA-G, MICA, MICB, HVEM, receptor beta de linfotoxina, ILT3, ILT4,
um agonista ou anticorpo que se liga ao receptor do ligante Toll e um ligante que se liga especificamente ao B7-H3.
[00407] Em algumas modalidades, um ligante co-estimulatórios compreende um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno deste que se liga especificamente a uma molécula co-estimulatória presente em uma célula T, incluindo, mas não limitada a, CD27, CD28, 4-1BB, OX40, CD30, CD40, ICOS, antígeno-1 associado à função de linfócitos (LFA-1), CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3 e um ligante que se liga especi- ficamente ao CD83. Em modalidades particulares, um agente de liga- ção a CD28 pode ser usado para fornecer um sinal co-estimulatório. Exemplos ilustrativos de agentes de ligação a CD28 incluem, mas não estão limitados a: ligantes naturais de CD28, por exemplo, um ligante natural para CD28 (por exemplo, um membro da família de proteínas B7, como B7-1 (CD80) e B7-2 (CD86); e anticorpo monoclonal anti- CD28 ou fragmento desto capaz de reticular a molécula CD28, por exemplo, anticorpos monoclonais 9.3, B-T3, XR-CD28, KOLT-2, 15E8,
248.23.2 e EX5.3D10.
[00408] Em certas modalidades, agentes de ligação que fornecem sinais estimulatórios e co-estimulatórios estão localizados na superfí- cie de uma célula. Isto pode ser conseguido através da transfecção ou transdução de uma célula com um ácido nucleico que codifica o agen- te de ligação numa forma adequada para a sua expressão na superfí- cie da célula ou, alternativamente, acoplando um agente de ligação à superfície da célula. Em algumas modalidades, o sinal co-estimulatório é fornecido por um ligante co-estimulatório apresentado em uma célula apresentadora de antígeno, como um APC artificial (aAPC). As APCs artificiais podem ser feitas através da manipulação de células K562, U937, 721.221, T2 ou C1R para expressar e/ou secretar de maneira estável uma variedade de moléculas e citocinas coestimulatórias para apoiar o crescimento ex vivo e a expansão a longo prazo de células T geneticamente modificadas. Em uma modalidade específica, os aAPCs K32 ou U32 são usados para direcionar a exibição de uma ou mais moléculas estimulatórias baseadas em anticorpos na superfície da célula aAPC. As populações de células T podem ser expandidas por aAPCs que expressam uma variedade de moléculas coestimulató- rias, incluindo, entre outras, CD137L (4-1BBL), CD134L (OX40L) e/ou CD80 ou CD86. Exemplos de aAPCs são fornecidos nos documentos WO 03/057171 e US2003/0147869, incorporados por referência em sua totalidade.
[00409] Em algumas modalidades, os agentes de ligação que for- necem sinais de ativação e co-estimulação estão localizados em uma superfície sólida (por exemplo, um grânulo ou uma placa). Em algu- mas modalidades, os agentes de ligação que fornecem sinais de ati- vação e co-estimulação são ambos fornecidos em uma forma solúvel (fornecida em solução).
[00410] Em algumas modalidades, a população de células efetoras imunes é expandida em cultura em uma ou mais fases de expansão. "Expansão" refere-se à cultura da população de células efetoras imu- nes por um período predeterminado, a fim de aumentar o número de células efetoras imunes. A expansão de células efetoras imunes pode compreender a adição de um ou mais dos fatores ativadores descritos acima e/ou a adição de um ou mais fatores de crescimento, como uma citocina (por exemplo, IL-2, IL-15, IL-21 e/ou IL-7) para potencializar ou promover a proliferação e/ou sobrevivência celular. Em algumas mo- dalidades, combinações de IL-2, IL-15 e/ou IL-21 podem ser adiciona- das às culturas durante as uma ou mais fases de expansão. Em algu- mas modalidades, a quantidade de IL-2 adicionada durante uma ou mais fases de expansão é inferior a 6000 U/mL. Em algumas modali- dades, a quantidade de IL-2 adicionada durante uma ou mais fases de expansão é de cerca de 5500 U/mL, cerca de 5000 U/mL, cerca de
4500 U/mL, cerca de 4000 U/mL, cerca de 3500 U/mL, cerca de 3000 U/mL, cerca de 2500 U/mL, cerca de 2000 U/mL, cerca de 1500 U/mL, cerca de 1000 U/mL ou cerca de 500 U/mL. Em algumas modalidades, a quantidade de IL-2 adicionada durante as uma ou mais fases de ex- pansão está entre cerca de 500 U/mL e cerca de 5500 U/mL. Em al- gumas modalidades, a população de células efetoras imunes pode ser cocultivada com células alimentadoras durante o processo de expan- são.
[00411] Em algumas modalidades, a população de células efetoras imunes é expandida por um período de tempo predeterminado, em que o período de tempo predeterminado é inferior a cerca de 30 dias. Em algumas modalidades, o período de tempo predeterminado é me- nor que 30 dias, menor que 25 dias, menor que 20 dias, menor que 18 dias, menor que 15 dias ou menor que 10 dias. Em algumas modali- dades, o período de tempo predeterminado é menor que 4 semanas, menor que 3 semanas, menor que 2 semanas ou menor que 1 sema- na. Em algumas modalidades, o período de tempo predeterminado é de cerca de 7 dias, 8 dias, 9 dias, 10 dias, 11 dias, 12 dias, 13 dias, 14 dias, 15 dias, 16 dias, 17 dias, 18 dias, 19 dias, 20 dias ou 21 dias. Em algumas modalidades, o período de tempo predeterminado é de cerca de 5 dias a cerca de 25 dias, cerca de 10 a cerca de 28 dias, cerca de 10 a cerca de 25 dias, cerca de 10 a cerca de 21 dias, cerca de 10 a cerca de 20 dias, cerca de 10 a cerca de 19 dias, cerca de 11 a cerca de 28 dias, cerca de 11 a cerca de 25 dias, cerca de 11 a cerca de 21 dias, cerca de 11 a cerca de 20 dias, cerca de 11 a cerca de 19 dias, cerca de 12 a cerca de 28 dias, cerca de 12 a cerca de 25 dias, cerca de 12 a cerca de 21 dias, cerca de 12 a cerca de 20 dias, cerca de 12 a cerca de 19 dias, cerca de 15 a cerca de 28 dias, cerca de 15 a cer- ca de 25 dias, cerca de 15 a cerca de 21 dias, cerca de 15 a cerca 20 dias, ou cerca de 15 a cerca de 19 dias. Em algumas modalidades, o período de tempo predeterminado é de cerca de 5 dias a cerca de 10 dias, cerca de 10 dias a cerca de 15 dias, cerca de 15 dias a cerca de 20 dias ou cerca de 20 dias a cerca de 25 dias.
[00412] Em algumas modalidades, a população de células efetoras imunes é expandida até que o número de células atinja um limiar pre- determinado. Por exemplo, em algumas modalidades, a população de células efetoras imunes é expandida até que a cultura compreenda pelo menos 5 x 106, 1 x 107, 5 x 107, 1 x 108, 5 x 108, 1 x 109, 5 x 109, 1 x 1010, 5 x 1010, 1 x 1011, 5 x 1011, 1 x 1012, 5 x 1012, 1 x 1013, ou pelo menos 5 x 1013 células no total. Em algumas modalidades, a popula- ção de células efetoras imunes é expandida até a cultura compreender entre cerca de 1 x 109 células no total e cerca de 1 x 1011 células no total.
[00413] Em algumas modalidades, os métodos fornecidos neste documento compreendem pelo menos duas fases de expansão. Por exemplo, em algumas modalidades, a população de células efetoras imunes pode ser expandida após o isolamento de uma amostra, dei- xada em repouso e depois expandida novamente. Em algumas moda- lidades, as células efetoras imunes podem ser expandidas em um con- junto de condições de expansão seguidas por uma segunda rodada de expansão em um segundo conjunto diferente de condições de expan- são. Os métodos para expansão ex vivo de células imunes são conhe- cidos na técnica, por exemplo, conforme descrito nos Publicadores de Pedidos de Patente US. 2018-0207201, 20180282694 e 20170152478 e Patentes US. 8.383.099 e 8.034.334, incorporados neste documento por referência.
[00414] A qualquer momento durante os processos de ativação e/ou expansão, os sistemas de regulação de genes descritos neste documento podem ser introduzidos nas células efetoras imunes para produzir uma população de células efetoras imunes modificadas. Em algumas modalidades, o sistema de regulação de genes é introduzido na população de células efetoras imunes imediatamente após o enri- quecimento de uma amostra. Em algumas modalidades, o sistema de regulação de genes é introduzido na população de células efetoras imunes antes, durante ou após o um ou mais processos de expansão. Em algumas modalidades, o sistema de regulação de genes é introdu- zido na população de células efetoras imunes imediatamente após o enriquecimento de uma amostra ou colheita de um sujeito e antes de qualquer ciclo de expansão. Em algumas modalidades, o sistema de regulação de genes é introduzido na população de células efetoras imunes após uma primeira rodada de expansão e antes de uma se- gunda rodada de expansão. Em algumas modalidades, o sistema de regulação de genes é introduzido na população de células efetoras imunes após uma primeira e uma segunda rodada de expansão.
[00415] Em algumas modalidades, a presente descrição fornece métodos para fabricar populações de células efetoras imunes modifi- cadas compreendendo obter uma população de células efetoras imu- nes, introduzir um sistema de regulação de genes descrito neste do- cumento para a população de células efetoras imunes e expandir a população de células efetoras imunes em uma ou mais rodadas de expansão. Em alguns aspectos desta modalidade, a população de cé- lulas efetoras imunes é expandida em uma primeira rodada de expan- são antes da introdução do sistema de regulação de genes e é expan- dida em uma segunda rodada de expansão após a introdução do sis- tema de regulação de genes. Em alguns aspectos desta modalidade, a população de células efetoras imunes é expandida em uma primeira rodada de expansão e uma segunda rodada de expansão antes da introdução do sistema de regulação de genes. Em alguns aspectos desta modalidade, o sistema de regulação de genes é introduzido na população de células efetoras imunes antes do primeiro e do segundo ciclo de expansão.
[00416] Em algumas modalidades, os métodos descritos neste do- cumento compreendem a remoção de um tumor de um sujeito e o pro- cessamento da amostra de tumor para obter uma população de linfóci- tos infiltrantes de tumor (por exemplo, por fragmentação e digestão enzimática do tumor para obter uma suspensão celular) introduzindo um sistema de regulação de genes descrito neste documento para a população de células efetoras imunes e expandir a população de célu- las efetoras imunes em um ou mais ciclos de expansão. Em alguns aspectos desta modalidade, a população de linfócitos infiltrantes de pulmão é expandida em uma primeira rodada de expansão antes da introdução do sistema de regulação de genes e é expandida em uma segunda rodada de expansão após a introdução do sistema de regula- ção de genes. Em alguns aspectos desta modalidade, a população de linfócitos infiltrantes de tumor é expandida em uma primeira rodada de expansão e uma segunda rodada de expansão antes da introdução do sistema de regulação de genes. Em alguns aspectos desta modalida- de, o sistema de regulação de genes é introduzido na população de linfócitos infiltrantes de tumor antes do primeiro e do segundo ciclo de expansão.
[00417] Em algumas modalidades, as células efetoras imunes modi- ficadas produzidas pelos métodos descritos neste documento podem ser usadas imediatamente. Em algumas modalidades, os métodos de fabricação contemplados neste documento podem compreender ainda a criopreservação de células imunes modificadas para armazenamen- to e/ou preparação para uso em um sujeito. Conforme usado neste documento, "criopreservação", refere-se à preservação das células por arrefecimento a temperaturas abaixo de zero, como (tipicamente) 77 K ou -196 °C (o ponto de ebulição do nitrogênio líquido). Em algumas modalidades, um método de armazenamento de células efetoras imu-
nes modificadas compreende a criopreservação das células efetoras imunes, de modo que as células permaneçam viáveis após o descon- gelamento. Quando necessário, as células efetoras imunes criopreser- vadas modificadas podem ser descongeladas, cultivadas e expandidas para mais células desse tipo. Frequentemente, os agentes crioproteto- res são usados em temperaturas abaixo de zero para evitar que as células sejam preservadas contra danos causados pelo congelamento a baixas temperaturas ou pelo aquecimento até a temperatura ambien- te. Os agentes criopreservadores e as taxas de arrefecimento ideais podem proteger contra a lesão celular. Os agentes crioprotetores que podem ser utilizados incluem, mas não estão limitados a dimetilsulfó- xido (DMSO) (Lovelock e Bishop, Nature, 1959; 183: 1394-1395; Ashwood-Smith, Nature, 1961; 190: 1204-1205), glicerol, polivinilpirro- lidina (Rinfret, Ann. N.Y. Acad. Sci., 1960; 85: 576), e polietileno glicol (Sloviter e Ravdin, Nature, 1962; 196: 48). Em algumas modalidades, as células são congeladas em dimetilsulfóxido a 10% (DMSO), 50% de soro, 40% de meio tamponado ou alguma outra solução comumente usada na técnica para preservar as células em temperaturas tão bai- xas e descongeladas de uma maneira como vulgarmente conhecido na técnica para descongelar células cultivadas congeladas. A. Produzindo células efetoras imunes modificadas usando Sis- temas CRISPR/Cas
[00418] Em algumas modalidades, um método de produção de uma célula efetora imune modificada envolve o contato de uma sequência de DNA alvo com um complexo compreendendo um gRNA e um poli- peptídeo Cas. Conforme discutido acima, um gRNA e o polipeptídeo Cas formam um complexo, em que o domínio de ligação ao DNA do gRNA direciona o complexo para uma sequência de DNA alvo e em que a proteína Cas (ou proteína heteróloga fundida a uma proteína Cas enzimaticamente inativa) modifica a sequência de DNA alvo. Em algumas modalidades, este complexo é formado intracelularmente após a introdução do gRNA e da proteína Cas (ou polinucleotídeos que codificam o gRNA e as proteínas Cas) a uma célula. Em algumas modalidades, o ácido nucleico que codifica a proteína Cas é um ácido nucleico do DNA e é introduzido na célula por transdução. Em algu- mas modalidades, os componentes Cas9 e gRNA de um sistema de edição de genes CRISPR/Cas são codificados por uma única molécula de polinucleotídeo. Em algumas modalidades, o polinucleotídeo que codifica a proteína Cas e o componente de gRNA são compreendidos em um vetor viral e introduzidos na célula por transdução viral. Em al- gumas modalidades, os componentes Cas9 e gRNA de um sistema de edição de genes CRISPR/Cas são codificados por diferentes molécu- las de polinucleotídeo. Em algumas modalidades, o polinucleotídeo que codifica a proteína Cas é compreendido em um primeiro vetor viral e o polinucleotídeo que codifica o gRNA é compreendido em um se- gundo vetor viral. Em alguns aspectos desta modalidade, o primeiro vetor viral é introduzido em uma célula antes do segundo vetor viral. Em alguns aspectos desta modalidade, o segundo vetor viral é intro- duzido em uma célula antes do primeiro vetor viral. Em tais modalida- des, a integração dos vetores resulta na expressão sustentada dos componentes Cas9 e gRNA. No entanto, a expressão sustentada de Cas9 pode levar ao aumento de mutações fora do alvo e ao corte em alguns tipos de células. Portanto, em algumas modalidades, uma se- quência de ácido nucleico de mRNA que codifica a proteína Cas pode ser introduzida na população de células por transfecção. Em tais mo- dalidades, a expressão de Cas9 diminuirá ao longo do tempo e pode reduzir o número de mutações fora do alvo ou sítios de corte. Em al- gumas modalidades, o gRNA e a proteína Cas são introduzidos sepa- radamente por eletroporação.
[00419] Em algumas modalidades, este complexo é formado em um sistema livre de células, misturando as moléculas de gRNA e as prote- ínas Cas e incubando por um período de tempo suficiente para permitir a formação de complexos. Este complexo pré-formado, compreenden- do o gRNA e a proteína Cas e referido neste documento como uma ribonucleoproteína CRISPR (CRISPR-RNP) pode então ser introduzi- do em uma célula para modificar uma sequência de DNA alvo. Em al- gumas modalidades, o CRISPR-RNP é introduzido na célula por ele- troporação.
[00420] Em qualquer uma das modalidades descritas acima para produzir uma célula efetora imune modificada usando o sistema CRISPR/Cas, o sistema pode compreender um ou mais gRNAs direci- onados a um único gene-alvo endógeno, por exemplo, para produzir uma célula efetora modificada com edição única. Alternativamente, em qualquer uma das modalidades descritas acima para produzir uma cé- lula de efeito imune modificada usando o sistema CRISPR/Cas, o sis- tema pode compreender dois ou mais gRNAs direcionando dois ou mais genes-alvo endógenos, por exemplo, para produzir uma célula efetora imune modificada com edição dupla. B. Produção de células efetoras imunes modificadas usando sis- temas shRNA
[00421] Em algumas modalidades, um método de produção de uma célula efetora imune modificada que introduz na célula um ou mais po- linucleotídeos de DNA que codificam uma ou mais moléculas de shR- NA com sequência complementar ao transcrito de mRNA de um gene- alvo. A célula efetora imune pode ser modificada para produzir o shR- NA através da introdução de sequências específicas de DNA no nú- cleo da célula por meio de uma pequena cassete gênica. Tanto os re- trovírus quanto os lentivírus podem ser usados para introduzir DNAs que codificam shRNA em células efetoras imunes. O DNA introduzido pode tornar-se parte do próprio DNA da célula ou persistir no núcleo e instrui a maquinaria celular a produzir shRNAs. Os shRNAs podem ser processados pela atividade do cortador mediado por Dicer ou AGO2 dentro da célula para induzir o knockdown do gene mediado por RNAi. VI. Composições e Kits
[00422] O termo "composição", conforme usado neste documento, refere-se a uma formulação de um sistema de regulação de genes ou uma célula efetora imune modificada descrita neste documento que é capaz de ser administrada ou distribuída a um sujeito ou célula. Tipi- camente, as formulações incluem todas as composições fisiologica- mente aceitáveis, incluindo derivados e/ou pró-drogas, solvatos, este- reoisômeros, racematos ou tautômeros deste, com quaisquer carrea- dores, diluentes e/ou excipientes fisiologicamente aceitáveis. Uma "composição terapêutica" ou "composição farmacêutica" (usada de forma intercambiável neste documento) é uma composição de um sis- tema de regulação de genes ou de uma célula efetora imune modifica- da capaz de ser administrada a um sujeito para o tratamento de uma doença ou distúrbio específico ou contatada com uma célula para mo- dificação de um ou mais genes-alvo endógenos.
[00423] A expressão "farmaceuticamente aceitável" é empregada neste documento para se referir a esses compostos, materiais, com- posições e/ou formas de dosagem que são, no escopo do julgamento médico, adequados para utilização em contato com os tecidos dos se- res humanos e animais sem toxicidade excessiva, irritação, resposta alérgica ou outro problema ou complicação, avaliados de acordo com uma razão risco/benefício razoável.
[00424] Conforme utilizado neste documento, "carreador farmaceu- ticamente aceitável, diluente ou excipiente" inclui, sem limitação, qual- quer adjuvante, carreador, excipiente, agente de deslizamento, agente edulcorante, diluente, conservante, tintura/corante, potencializador de sabor, surfactante, agente umectante, agente dispersante, agente de suspensão, estabilizador, agente isotônico, solvente ou emulsionante que foi aprovado pela United States Food and Drug Administration como sendo aceitável para utilização em seres humanos ou animais domésticos. Os carreadores farmaceuticamente aceitáveis exemplifi- cativos incluem, porém sem limitação, açúcares, tais como lactose, glicose e sacarose; amidos, tais como amido de milho e amido de ba- tata; celulose e seus derivados, tais como carboximetil celulose de só- dio, etil celulose e acetato de celulose; tragacanto; malte; gelatina; tal- co; manteiga de cacau, ceras, gorduras animais e vegetais, parafinas, silicones, bentonitas, ácido silícico, óxido de zinco; óleos, tais como óleo de amendoim, óleo de semente de algodão, óleo de açafrão, óleo de gergelim, azeite de oliva, óleo de milho e óleo de soja; glicóis, tais como propileno glicol; polióis, tais como glicerina, sorbitol, manitol e polietileno glicol; ésteres, tais como oleato de etila e laurato de etila; ágar; agentes de tamponamento, tais como hidróxido de magnésio e hidróxido de alumínio; ácido algínico; água livre de pirogênio; solução salina isotônica; solução de Ringer; álcool etílico; soluções de tampão de fosfato; e quaisquer outras substâncias compatíveis empregadas nas formulações farmacêuticas. Exceto na medida em que qualquer meio convencional e/ou agente é incompatível com os agentes da pre- sente descrição, a sua utilização em composições terapêuticas é con- templada. Ingredientes ativos suplementares também podem ser in- corporados nas composições.
[00425] "Sal farmaceuticamente aceitável" incluem ambos os sais de adição de ácido e de base. Os sais farmaceuticamente aceitáveis incluem os sais de adição ácidos (formados com os grupos amino li- vres da proteína) e que são formados com ácidos inorgânicos, tal co- mo, por exemplo, ácido clorídrico, ácido bromídrico, ácido sulfúrico, ácido nítrico, ácido fosfórico e semelhantes, e ácidos orgânicos, tal como, porém sem limitação, ácido acético, ácido 2,2-dicloroacético,
ácido adípico, ácido algínico, ácido ascórbico, ácido aspártico, ácido benzenossulfônico, ácido benzoico, ácido 4-acetamidobenzoico, ácido canfórico, ácido canfor-10-sulfônico, ácido cáprico, ácido caproico, ácido caprílico, ácido carbônico, ácido cinâmico, ácido cítrico, ácido ciclâmico, ácido dodecilsulfúrico, ácido etano-1,2-dissulfônico, ácido etanossulfônico, ácido 2-hidroxietanossulfônico, ácido fórmico, ácido fumárico, ácido galactárico, ácido gentísico, ácido gluco-heptônico, ácido glucônico, ácido glucurônico, ácido glutâmico, ácido glutárico, ácido 2-oxo-glutárico, ácido glicerofosfórico, ácido glicólico, ácido hipú- rico, ácido isobutírico, ácido láctico, ácido lactobiônico, ácido láurico, ácido maleico, ácido málico, ácido malônico, ácido mandélico, ácido metanossulfônico, ácido múcico, ácido naftaleno-1,5-dissulfônico, áci- do naftaleno-2-sulfônico, ácido 1-hidroxi-2-naftoico, ácido nicotínico, ácido oleico, ácido orótico, ácido oxálico, ácido palmítico, ácido pamoi- co, ácido propiônico, ácido piroglutâmico, ácido pirúvico, ácido salicíli- co, ácido 4-aminossalicílico, ácido sebácico, ácido esteárico, ácido succínico, ácido tartárico, ácido tiociânico, ácido p-toluenossulfônico, ácido trifluoroacético, ácido undecilênico e semelhantes.
Sais forma- dos com os grupos carboxil livres podem também ser derivados de ba- ses inorgânicas tais como, por exemplo, sódio, potássio, lítio, amônio, cálcio, magnésio, ferro, zinco, cobre, manganês, sais de alumínio e semelhantes.
Os sais derivados de bases orgânicas incluem, porém sem limitação, sais de aminas primárias, secundárias e terciárias, ami- nas substituídas, incluindo aminas substituídas de ocorrência natural, aminas cíclicas e resinas de troca iônica básicas, tal como amônia, isopropilamina, trimetilamina, dietilamina, trietilamina, tripropilamina, dietanolamina, etanolamina, deanol, 2-dimetilaminoetanol, 2- dietilaminoetanol, diciclo-hexilamina, lisina, arginina, histidina, cafeína, procaína, hidrabamina, colina, betaína, benetamina, benzatina, etile- nodiamina, glucosamina, metilglucamina, teobromina, trietanolamina,
trometamina, purinas, piperazina, piperidina, N-etilpiperidina, resinas de poliamina e semelhantes. Bases orgânicas particularmente prefe- renciais são isopropilamina, dietilamina, etanolamina, trimetilamina, diciclohexilamina, colina e cafeína.
[00426] Os agentes umectantes, emulsificantes e lubrificantes, tais como laurilsulfato de sódio e estearato de magnésio, bem como agen- tes corantes, agentes de liberação, agentes de revestimento, agentes edulcorantes, aromatizantes e perfumantes, conservantes e antioxi- dantes podem também estar presentes nas composições.
[00427] Exemplos de antioxidantes farmaceuticamente aceitáveis incluem: (1) antioxidantes solúveis em água, tais como ácido ascórbi- co, cloridrato de cisteína, bissulfato de sódio, metabissulfito de sódio, sulfito de sódio e semelhantes; (2) antioxidantes solúveis em óleo, tais como palmitato de ascorbil, hidroxianisol butilado (BHA), hidroxitolueno butilado (BHT), lecitina, galato de propil, alfa-tocoferol e semelhantes; e (3) agentes quelantes de metal, tais como ácido cítrico, ácido etile- nodiaminotetracético (EDTA), sorbitol, ácido tartárico, ácido fosfórico e semelhantes.
[00428] Mais orientações sobre formulações adequadas para vários tipos de administração podem ser encontradas em Remington's Phar- maceutical Sciences, Mace Publishing Company, Philadelphia, Pa., 17ª ed. (1985). Para uma breve revisão dos métodos para distribuição de drogas, ver Langer, Science 249:1527-1533 (1990).
[00429] Em algumas modalidades, a presente descrição fornece kits para a realização de um método descrito neste documento. Em algumas modalidades, um kit pode incluir: (a) uma ou mais moléculas de ácido nucleico capazes de reduzir a expressão ou modificar a função de um produto gênico codi- ficado por um ou mais genes-alvo endógenos; (b) um ou mais polinucleotídeos que codificam uma molé-
cula de ácido nucleico que é capaz de reduzir a expressão ou modifi- car a função de um produto gênico codificado por um ou mais genes- alvo endógenos; (c) uma ou mais proteínas de ácido nucleico capazes de reduzir a expressão ou modificar a função de um produto gênico codi- ficado por um ou mais genes endógenos alvo; (d) um ou mais polinucleotídeos que codificam uma proteí- na de modificação que é capaz de reduzir a expressão ou modificar a função de um produto gênico codificado por um ou mais genes-alvo endógenos; (e) um ou mais gRNAs capazes de se ligar a uma sequên- cia de DNA alvo em um gene endógeno; (f) um ou mais polinucleotídeos que codificam um ou mais gRNAs capazes de se ligar a uma sequência de DNA alvo em um ge- ne endógeno; (g) um ou mais polipeptídeos modificadores direcionados ao sítio, capazes de interagir com um gRNA e modificar uma sequên- cia de DNA alvo em um gene endógeno; (h) um ou mais polinucleotídeos que codificam um polipep- tídeo de modificação direcionado ao sítio, capaz de interagir com um gRNA e modificar uma sequência de DNA alvo em um gene endóge- no; (i) um ou mais DNAs guia (gDNAs) capazes de se ligar a uma sequência de DNA alvo em um gene endógeno; (j) um ou mais polinucleotídeos que codificam um ou mais gDNAs capazes de se ligar a uma sequência de DNA alvo em um ge- ne endógeno; (k) um ou mais polipeptídeos modificadores direcionados ao sítio, capazes de interagir com um gDNA e modificar uma sequên- cia de DNA alvo em um gene endógeno;
(l) um ou mais polinucleotídeos que codificam um polipep- tídeo de modificação direcionado ao sítio, capaz de interagir com um gDNA e modificar uma sequência de DNA alvo em um gene endóge- no; (m) um ou mais gRNAs capazes de se ligar a uma sequên- cia de mRNA codificada por um gene endógeno; (n) um ou mais polinucleotídeos que codificam um ou mais gRNAs capazes de se ligar a uma sequência de mRNA codificada por um gene endógeno; (o) um ou mais polipeptídeos modificadores direcionados ao sítio, capazes de interagir com um gRNA e modificar uma sequên- cia de mRNA codificada por um gene endógeno; (p) um ou mais polinucleotídeos que codificam um polipep- tídeo de modificação direcionado ao sítio, capaz de interagir com um gRNA e modificar uma sequência de mRNA alvo por um gene endó- geno; (q) uma célula efetora imune modificada descrita neste do- cumento; ou (r) ou qualquer combinação dos grupos acima.
[00430] Em algumas modalidades, os kits descritos neste documen- to compreendem ainda um ou mais inibidores do ponto de verificação imune. Vários inibidores do ponto de verificação imune são conhecidos na técnica e receberam aprovação da FDA para o tratamento de um ou mais cânceres. Por exemplo, os inibidores de PD-L1 aprovados pe- la FDA incluem Atezolizumab (Tecentriq®, Genentech), Avelumab (Ba- vencio®, Pfizer) e Durvalumab (Imfinzi®, AstraZeneca); os inibidores de PD-1 aprovados pela FDA incluem Pembrolizumab (Keytruda®, Merck) e Nivolumab (Opdivo®, Bristol-Myers Squibb); e inibidores de CTLA4 aprovados pela FDA incluem Ipilimumab (Yervoy®, Bristol- Myers Squibb). Moléculas inibidoras adicionais do ponto de verificação imune que podem ser alvo de futuras terapias incluem A2AR, B7-H3, B7-H4, BTLA, IDO, LAG3 (por exemplo, BMS-986016, em desenvol- vimento pela BSM), KIR (por exemplo, Lirilumab, em desenvolvimento por BSM), TIM3, TIGIT e VISTA.
[00431] Em algumas modalidades, os kits descritos neste documen- to compreendem um ou mais componentes de um sistema de regula- ção de genes (ou um ou mais polinucleotídeos que codificam um ou mais componentes) e um ou mais inibidores de ponto de verificação imune conhecidos na técnica (por exemplo, um inibidor de PD1, um inibidor de CTLA4, um inibidor de PDL1, etc.). Em algumas modalida- des, os kits descritos neste documento compreendem um ou mais componentes de um sistema de regulação de genes (ou um ou mais polinucleotídeos que codificam um ou mais componentes) e um anti- corpo anti-PD1 (por exemplo, Pembrolizumabe ou Nivolumabe). Em algumas modalidades, os kits descritos neste documento compreen- dem uma célula efetora imune modificada descrita neste documento (ou sua população) e um ou mais inibidores de ponto de verificação imune conhecidos na técnica (por exemplo, um inibidor de PD1, um inibidor de CTLA4, um inibidor de PDL1, etc.). Em algumas modalida- des, os kits descritos neste documento compreendem uma célula efe- tora imune modificada descrita neste documento (ou sua população) e um anticorpo anti-PD1 (por exemplo, Pembrolizumabe ou Nivoluma- be).
[00432] Em algumas modalidades, o kit compreende um ou mais componentes de um sistema de regulação de genes (ou um ou mais polinucleotídeos que codificam um ou mais componentes) e um rea- gente para reconstituir e/ou diluir os componentes. Em algumas moda- lidades, um kit compreendendo um ou mais componentes de um sis- tema de regulação de genes (ou um ou mais polinucleotídeos que co- dificam um ou mais componentes) e compreende ainda um ou mais reagentes adicionais, em que esses reagentes adicionais podem ser selecionados a partir de: um tampão para introduzir o sistema de regu- lação de genes numa célula; um tampão de lavagem; um reagente de controle; um vetor de expressão de controle ou polinucleotídeo de RNA; um reagente para a produção in vitro do sistema de regulação de genes a partir do DNA e semelhantes. Os componentes de um kit podem estar em recipientes separados ou podem ser combinados em um único recipiente.
[00433] Além dos componentes mencionados acima, em algumas modalidades um kit compreende ainda instruções para o uso dos componentes do kit para praticar os métodos da presente descrição. As instruções para a prática de métodos são gravadas em uma mídia de gravação adequada. Por exemplo, as instruções podem ser im- pressas em um substrato, como papel ou plástico, etc. Como tal, as instruções podem estar presentes nos kits como uma bula ou na rotu- lagem do recipiente do kit ou seus componentes (ou seja, associadas à embalagem ou embalagem interna) etc. Em outras modalidades, as instruções estão presentes como um arquivo de dados de armazena- mento eletrônico presente num meio de armazenamento legível por computador adequado, por exemplo, CD-ROM, disquete, unidade flash, etc. Em ainda outras modalidades, as instruções de verdade não estão presentes no kit, mas meios para obtenção das instruções a par- tir de uma fonte remota, por exemplo, através da internet, são forneci- dos. Um exemplo desta modalidade é um kit que inclui um endereço web em que as instruções podem ser visualizadas e/ou a partir do qual as instruções podem ser baixadas. Como com as instruções, este meio para obtenção das instruções é gravado em um substrato ade- quado. VII. Métodos Terapêuticos e Aplicações
[00434] Em algumas modalidades, as células efetoras imunes modi-
ficadas e os sistemas de regulação de genes descritos neste docu- mento podem ser utilizados em uma variedade de aplicações terapêu- ticas. Por exemplo, em algumas modalidades, as células efetoras imu- nes modificadas e/ou sistemas de regulação de genes descritos neste documento podem ser administrados a um sujeito para fins como tera- pia gênica, por exemplo, para tratar uma doença, para uso como anti- viral, para uso como anti -patogênico, para uso como terapêutico anti- câncer ou para pesquisa biológica.
[00435] Em algumas modalidades, o sujeito pode ser um recém- nascido, um jovem ou um adulto. De particular interesse são sujeitos mamíferos. As espécies de mamíferos que podem ser tratadas com os presentes métodos incluem caninos e felinos; equinos; bovinos; ovi- nos; etc. e primatas, particularmente humanos. Modelos animais, par- ticularmente mamíferos pequenos (por exemplo, camundongos, ratos, porquinhos-da-índia, hamsters, coelhos, etc.) podem ser usados para investigações experimentais.
[00436] A administração das células efetoras imunes modificadas descritas neste documento, populações e composições destas podem ocorrer por injeção, irrigação, inalação, consumo, eletro-osmose, he- modiálise, iontoforese e outros métodos conhecidos na técnica. Em algumas modalidades, a via de administração é local ou sistêmica. Em algumas modalidades, a via de administração é intra-arterial, intracra- niana, intradérmica, intraduodenal, intraminal, intrameneal, intraperito- neal, intratecal, intratumoral, intravenosa, intravítrea, oftálmica, paren- teral, espinhal, subcutânea, ureteral, uretral, vaginal ou intrauterina.
[00437] Em algumas modalidades, a via de administração é por in- fusão (por exemplo, contínua ou em bolo). Exemplos de métodos para administração local, isto é, distribuição ao sítio da lesão ou doença, incluem através de um reservatório Ommaya, por exemplo, para distri- buição intratecal (ver, por exemplo, as Patentes US Nºs 5.222.982 e
5.385.582, incorporadas neste documento por referência); por injeção em bolo, por exemplo, por uma seringa, por exemplo, em uma junta; por infusão contínua, por exemplo, por canulação, como por convec- ção (ver, por exemplo, Publicação de Pedido de Patente US. Nº 2007- 0254842, incorporada neste documento por referência); ou implantan- do um dispositivo no qual as células foram fixadas reversivelmente (ver, por exemplo, as Publicações de Pedido de Patente US. Nºs 2008- 0081064 e 2009-0196903, incorporadas neste documento por referên- cia). Em algumas modalidades, a via de administração é por adminis- tração tópica ou injeção direta. Em algumas modalidades, as células efetoras imunes modificadas descritas neste documento podem ser fornecidas ao sujeito isoladamente ou com um substrato ou matriz adequado, por exemplo, para apoiar seu crescimento e/ou organiza- ção no tecido para o qual estão sendo transplantados.
[00438] Em algumas modalidades, pelo menos 1 x 103 células são administradas a um sujeito. Em algumas modalidades, pelo menos 5 x 103 células, 1 x 104 células, 5 x 104 células, 1 x 105 células, 5 x 105 cé- lulas, 1 x 106, 2 x 106, 3 x 106, 4 x 106, 5 x 106, 1 x 107, 1 x 108, 5 x 108, 1 x 109, 5 x 109, 1 x 1010, 5 x 1010, 1 x 1011, 5 x 1011, 1 x 1012, 5 x 1012, ou mais células a um sujeito. Em algumas modalidades, entre cerca de 1 x 107 e cerca de 1 x 1012 células são administradas a um sujeito. Em algumas modalidades, entre cerca de 1 x 108 e cerca de 1 x 1012 célu- las são administradas a um sujeito. Em algumas modalidades, entre cerca de 1 x 109 e cerca de 1 x 1012 células são administradas a um sujeito. Em algumas modalidades, entre cerca de 1 x 1010 e cerca de 1 x 1012 células são administradas a um sujeito. Em algumas modalida- des, entre cerca de 1 x 1011 e cerca de 1 x 1012 células são adminis- tradas a um sujeito. Em algumas modalidades, entre cerca de 1 x 107 e cerca de 1 x 1011 células são administradas a um sujeito. Em algu- mas modalidades, entre cerca de 1 x 107 e cerca de 1 x 1010 células são administradas a um sujeito. Em algumas modalidades, entre cerca de 1 x 107 e cerca de 1 x 109 células são administradas a um sujeito. Em algumas modalidades, entre cerca de 1 x 107 e cerca de 1 x 108 células são administradas a um sujeito. O número de administrações de tratamento para um sujeito pode variar. Em algumas modalidades, a introdução de células efetoras imunes modificadas no sujeito pode ser um evento único. Em algumas modalidades, esse tratamento pode exigir uma série contínua de tratamentos repetidos. Em algumas mo- dalidades, várias administrações das células efetoras imunes modifi- cadas podem ser necessárias antes que um efeito seja observado. Os protocolos exatos dependem da doença ou condição, do estágio da doença e dos parâmetros do sujeito individual que está sendo tratado.
[00439] Em algumas modalidades, os sistemas de regulação de genes descritos neste documento são empregados para modificar DNA ou RNA celular in vivo, como para terapia genética ou para pes- quisa biológica. Em tais modalidades, um sistema de regulação de ge- nes pode ser administrado diretamente ao sujeito, como pelos méto- dos descritos supra. Em algumas modalidades, os sistemas de regula- ção de genes descritos neste documento são empregados para a mo- dificação ex vivo ou in vitro de uma população de células efetoras imu- nes. Em tais modalidades, os sistemas de regulação de genes descri- tos neste documento são administrados a uma amostra compreenden- do células efetoras imunes.
[00440] Em algumas modalidades, as células efetoras imunes modi- ficadas descritas neste documento são administradas a um sujeito. Em algumas modalidades, as células efetoras imunes modificadas descri- tas neste documento administradas a um sujeito são células efetoras imunes autólogas. O termo "autólogo", neste contexto, refere-se a cé- lulas que foram derivadas do mesmo sujeito ao qual são administra- das. Por exemplo, as células efetoras imunes podem ser obtidas de um sujeito, modificado ex vivo de acordo com os métodos descritos neste documento e depois administrado ao mesmo sujeito, a fim de tratar uma doença. Em tais modalidades, as células administradas ao sujeito são células efetoras imunes autólogas. Em algumas modalida- des, as células efetoras imunes modificadas, ou composições destas, administradas a um sujeito são células efetoras imunes alogênicas. O termo "alogênico", neste contexto, refere-se a células que foram deri- vadas de um sujeito e são administradas a outro sujeito. Por exemplo, as células efetoras imunes podem ser obtidas de um primeiro sujeito, modificado ex vivo de acordo com os métodos descritos neste docu- mento e depois administrado a um segundo sujeito, a fim de tratar uma doença. Em tais modalidades, as células administradas ao sujeito são células efetoras imunes alogênicas.
[00441] Em algumas modalidades, as células efetoras imunes modi- ficadas descritas neste documento são administradas a um sujeito a fim de tratar uma doença. Em algumas modalidades, o tratamento compreende a distribuição de uma quantidade eficaz de uma popula- ção de células (por exemplo, uma população de células efetoras imu- nes modificadas) ou composição destas a um sujeito em necessidade desta. Em algumas modalidades, o tratamento refere-se ao tratamento de uma doença em um mamífero, por exemplo, em um humano, inclu- indo (a) inibição da doença, ou seja, interrompendo o desenvolvimento da doença ou impedindo a progressão da doença; (b) alívio da doen- ça, ou seja, causar regressão do estado da doença ou aliviar um ou mais sintomas da doença; e (c) cura da doença, ou seja, remissão de um ou mais sintomas da doença. Em algumas modalidades, o trata- mento pode referir-se a uma redução a curto prazo (por exemplo, tem- porária e/ou aguda) e/ou a longo prazo (por exemplo, sustentada) em um ou mais sintomas da doença. Em algumas modalidades, o trata- mento resulta em uma melhoria ou correção dos sintomas da doença.
A melhoria é uma melhoria observável ou mensurável, ou pode ser uma melhoria no sentimento geral de bem-estar do sujeito.
[00442] A quantidade eficaz de uma célula efetora imune modifica- da administrada a um sujeito em particular dependerá de uma varie- dade de fatores, vários dos quais diferirão de paciente para paciente, incluindo o distúrbio a ser tratado e a gravidade do distúrbio; atividade do (s) agente (s) específico (s) empregado (s); a idade, peso corporal, estado geral de saúde, sexo e dieta do paciente; o momento da admi- nistração, via de administração; a duração do tratamento; drogas usa- das em combinação; o julgamento do médico prescritor; e fatores se- melhantes conhecidos nas técnicas médicas.
[00443] Em algumas modalidades, a quantidade eficaz de uma cé- lula efetora imune modificada pode ser o número de células necessá- rias para resultar em pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 ou mais vezes diminuem a massa ou o volume do tumor, diminuem o número de células tumorais ou diminuem o nú- mero de metástases. Em algumas modalidades, a quantidade eficaz de uma célula efetora imune modificada pode ser o número de células necessárias para alcançar um aumento na expectativa de vida, um aumento na sobrevivência livre de progressão ou livre de doença ou melhoria de vários sintomas fisiológicos associados à doença sendo tratada. Em algumas modalidades, uma quantidade eficaz de células efetoras imunes modificadas será de pelo menos 1 x 103 células, por exemplo 5 x 103 células, 1 x 104 células, 5 x 104 células, 1 x 105 célu- las, 5 x 105 células, 1 x 106, 2 x 106, 3 x 106, 4 x 106, 5 x 106, 1 x 107, 1 x 108, 5 x 108, 1 x 109, 5 x 109, 1 x 1010, 5 x 1010, 1 x 1011, 5 x 1011, 1 x 1012, 5 x 1012, ou mais células.
[00444] Em algumas modalidades, as células efetoras imunes modi- ficadas e os sistemas de regulação de genes descritos neste docu- mento podem ser utilizados no tratamento de um distúrbio proliferativo celular, como um câncer. Os cânceres que podem ser tratados utili- zando as composições e métodos divulgados neste documento inclu- em cânceres do sangue e tumores sólidos. Por exemplo, os cânceres que podem ser tratados usando as composições e métodos divulgados neste documento incluem, mas não estão limitados a, adenoma, carci- noma, sarcoma, leucemia ou linfoma. Em algumas modalidades, o câncer é leucemia linfocítica crônica (CLL), leucemia linfocítica aguda de células B (B-ALL), leucemia linfoblástica aguda (ALL), leucemia mi- eloide aguda (AML), linfoma não Hodgkin (NHL), linfoma difuso de grandes células (DLCL), linfoma difuso de grandes células B (DLBCL), linfoma de Hodgkin, mieloma múltiplo, carcinoma de células renais (RCC), neuroblastoma, câncer colorretal, câncer de bexiga, câncer de mama, câncer colorretal, câncer de ovário, melanoma, sarcoma, cân- cer de próstata, câncer de pulmão, câncer de esôfago, carcinoma he- patocelular, câncer de pâncreas, astrocitoma, mesotelioma, câncer de cabeça e pescoço e meduloblastoma e câncer de fígado. Em algumas modalidades, o câncer é selecionado a partir de um melanoma, câncer de cabeça e pescoço, câncer de bexiga, câncer de pulmão, câncer cervical, câncer de pâncreas, câncer de mama e câncer colorretal. Em algumas modalidades, o câncer é insensível ou resistente ao trata- mento com um inibidor de PD1. Em algumas modalidades, o câncer é insensível ou resistente ao tratamento com um inibidor de PD1 e é se- lecionado a partir de um melanoma, câncer de cabeça e pescoço, câncer de bexiga, câncer de pulmão, câncer cervical, câncer de pân- creas, câncer de mama e câncer colorretal.
[00445] Conforme descrito acima, vários inibidores do ponto de veri- ficação imune são atualmente aprovados para uso em uma variedade de indicações oncológicas (por exemplo, inibidores de CTLA4, inibido- res de PD1, inibidores de PDL1, etc.). Em algumas modalidades, a administração de uma célula efetora imune modificada compreenden-
do redução da expressão e/ou função de um gene-alvo endógeno descrito neste documento resulta em um efeito terapêutico potenciali- zado (por exemplo, uma redução mais significativa no crescimento do tumor, um aumento na infiltração do tumor por linfócitos, um aumento na duração da sobrevivência livre de progressão, etc.) do que é obser- vado após o tratamento com um inibidor do ponto de verificação imu- ne.
[00446] Além disso, algumas indicações oncológicas não respem quem (ou seja, são insensíveis) ao tratamento com inibidores do ponto de verificação imune. Além disso, algumas indicações oncológicas que são inicialmente responsivas (ou seja, sensíveis) ao tratamento com inibidores do ponto de verificação imune desenvolvem um fenótipo re- sistente ao inibidor durante o curso do tratamento. Portanto, em algu- mas modalidades, as células efetoras imunes modificadas descritas neste documento, ou composições destas, são administradas para tra- tar um câncer que é resistente (ou parcialmente resistente) ou insensí- vel (ou parcialmente insensível) ao tratamento com um ou mais inibi- dores do ponto de verificação imune. Em algumas modalidades, a ad- ministração das células efetoras imunes modificadas ou de composi- ções destas a um sujeito que sofre de um câncer que é resistente (ou parcialmente resistente) ou insensível (ou parcialmente insensível) ao tratamento com um ou mais inibidores do ponto de verificação imune resulta em tratamento do câncer (por exemplo, redução no crescimen- to do tumor, aumento na duração da sobrevivência livre de progressão etc.). Em algumas modalidades, o câncer é resistente (ou parcialmente resistente) ou insensível (ou parcialmente insensível) ao tratamento com um inibidor de PD1.
[00447] Em algumas modalidades, as células efetoras imunes modi- ficadas ou composições destas são administradas em combinação com um inibidor de ponto de verificação imune. Em algumas modali-
dades, a administração das células efetoras imunes modificadas em combinação com o inibidor do ponto de verificação imune resulta em um efeito terapêutico potencializado em um câncer que é resistente, refratário ou insensível ao tratamento por um inibidor do ponto de veri- ficação imune do que é observado pelo tratamento com as células efe- toras imunes modificadas ou apenas o inibidor do ponto de verificação imune. Em algumas modalidades, a administração das células efetoras imunes modificadas em combinação com o inibidor do ponto de verifi- cação imune resulta em um efeito terapêutico potencializado em um câncer que é parcialmente resistente, parcialmente refratário ou parci- almente insensível ao tratamento por um inibidor do ponto de verifica- ção imune do que o observado pelo tratamento com as células efeto- ras imunes modificadas ou apenas com o inibidor do ponto de verifica- ção imune. Em algumas modalidades, o câncer é resistente (ou parci- almente resistente), refratário (ou parcialmente refratário) ou insensível (ou parcialmente insensível) ao tratamento com um inibidor de PD1.
[00448] Em algumas modalidades, a administração de uma célula efetora imune modificada descrita neste documento ou composição desta em combinação com um anticorpo anti-PD1 resulta em um efeito terapêutico potencializado em um câncer que é resistente ou insensí- vel ao tratamento apenas pelo anticorpo anti-PD1. Em algumas moda- lidades, a administração de uma célula efetora imune modificada des- crita neste documento ou composição desta em combinação com um anticorpo anti-PD1 resulta em um efeito terapêutico potencializado em um câncer que é parcialmente resistente ou parcialmente insensível ao tratamento apenas pelo anticorpo anti-PD1.
[00449] Os cânceres que demonstram resistência ou sensibilidade à inibição do ponto de verificação imune são conhecidos na técnica e podem ser testados em uma variedade de modelos in vivo e in vitro. Por exemplo, alguns melanomas são sensíveis ao tratamento com um inibidor do ponto de verificação imune, como um anticorpo anti-PD1 e podem ser modelados em um modelo de tumor in vivo B16-Ova (ver Exemplos 6, 15 e 18). Além disso, sabe-se que alguns cânceres color- retais são resistentes ao tratamento com um inibidor de ponto de veri- ficação imune, como um anticorpo anti-PD1 e podem ser modelados em um modelo PMEL/MC38-gp100 (ver Exemplos 7 e 16). Além disso, sabe-se que alguns linfomas são insensíveis ao tratamento com um inibidor do ponto de verificação imune, como um anticorpo anti-PD1, e podem ser modelados em vários modelos por transferência adotiva ou administração subcutânea de linhagens celulares de linfoma, como células Raji (ver Exemplos 11, 13, 14 e 20).
[00450] Em algumas modalidades, as células efetoras imunes modi- ficadas e os sistemas de regulação de genes descritos neste docu- mento podem ser utilizados no tratamento de uma infecção viral. Em algumas modalidades, o vírus é selecionado dentre um dos adenoví- rus, herpesvírus (incluindo, por exemplo, vírus herpes simplex e vírus Epstein Barr e vírus herpes zoster), poxvírus, papovavírus, vírus da hepatite (incluindo, por exemplo, vírus da hepatite B e vírus da hepatite C), vírus do papiloma, ortomixovírus (incluindo, por exemplo, influenza A, influenza B e influenza C), paramixovírus, coronavírus, picornavírus, reovírus, togavírus, flavivírus, bunyaviridae, rabdovírus, rotavírus, vírus respiratórios humanos, vírus da imunodeficiência ou retrovírus.
INCORPORAÇÃO A TÍTULO DE REFERÊNCIA
[00451] Todas as referências, artigos, publicações, patentes, publi- cações de patentes e pedidos de patente citados neste documento são incorporados por referência na sua totalidade para todos os fins. Entre- tanto, a menção de qualquer referência, artigo, publicação, patente, publicação de patente e pedido de patente mencionado no presente documento não é, e não deve ser tomado como, um reconhecimento ou qualquer forma de sugestão de que os mesmos constituam técnica anterior válida ou façam parte do conhecimento geral comum em qual- quer país do mundo.
EXEMPLOS EXEMPLO 1: MATERIAIS E MÉTODOS
[00452] As experiências descritas neste documento utilizam o sis- tema CRISPR/Cas9 para modular a expressão de um ou mais genes- alvo endógenos em diferentes populações de células T. I. Materiais
[00453] gRNAs: Salvo indicação em contrário, todas as experiên- cias utilizam gRNAs de molécula única (sgRNAs). As moléculas de gRNA duplo foram usadas conforme indicado e foram formadas por duplexação de tracrRNA 200 μM (IDT Cat nº 1072534) com 200 μM de crRNA específico do alvo (IDT) em tampão duplex livre de nuclease (IDT Cat nº 11-01-03-01) para 5 min a 95 °C, para formar 100 μM de tracrRNA: crRNA duplex, em que o tracrRNA e o crRNA estão presen- tes na razão de 1:1. As sequências alvo dos gRNAs utilizados nas se- guintes experiências são fornecidas na Tabela 10 abaixo. Tabela 10: Sequências de direcionamento de gRNAs experimen- tais Gene-alvo ID guia Sequência SEQ ID Pdcd1 - murino Nm.Pdcd1 CGGAGGATCTTATGCTGAAC 778 Lag3 - murino Nm.Lag3 GCCAAGTGGACTCCTCCTGG 602 Cblb - murino Nm.Cblb CCTTATCTTCAGTCACATGC 502 CBLB - humano Nm.CBLB TAAACTTACCTGAAACAGCC 521 BCOR - humano Nm.BCOR GTGCAGACTGGAGAATACAG 715 Ptpn2 - murino Nm.Ptpn2_1 CCTTTCTTGCAGATGGAAAA 1156 Ptpn2 - murino Nm.Ptpn2_2 ATGTGCACAGTACTGGCCAA 1219 Setd5 - murino Nm.Setd5_1 AATGGTGACTTCTGCATCCT 1355 Setd5 - murino Nm.Setd5_2 ATATTCATAATCAAATGCAA 1352 Peli1 - murino Nm.Peli1_1 TGCTTTGTTTAAAAGACCTA 1336 Peli1 - murino Nm.Peli1_2 TCAGTTACTACAAAATCAAT 1337 Olfr421 - murino Nm.Oflr421_1 GGAAGAAGTACATCTGCAAG 1368
[00454] Cas9: Cas9 foi expresso nas células-alvo por introdução de mRNA de Cas9 ou de uma proteína Cas9. Salvo indicação em contrá- rio, o mRNA que codifica Cas9 que compreende uma sequência de localização nuclear (mRNA de Cas9-NLS) derivada de S. pyogenes (Trilink L-7206) ou proteína Cas9 derivada de S. pyogenes (IDT Cat nº 1074182) foi usado nas seguintes experiências.
[00455] RNPs: as ribonucleoproteínas de gRNA-Cas9 (RNPs) foram formadas pela combinação de 1,2 μL de tracrRNA 44 μM: duplex de crRNA com 1 μL de proteína Cas9 36 μM e 0,8 μL de PBS. As mistu- ras foram incubadas a RT durante 20 minutos para formar os comple- xos RNP.
[00456] siRNAs: os siRNAs Accell de auto-distribuição (Dharmacon) são usados para silenciar genes em células T CD8 murinas. Alvo de controle (número de catálogo: K-005000-G1-02) ou Ptpn2 (número de catálogo: E-040061-00-0005) siRNA Accell é preparado de acordo com as instruções do fabricante. As células T CD8 de murino purifica- das são ativadas com grânulos anti-CD3/anti-CD28 (Ativador T do Camundongo Dynabeads™ CD3/CD28 para expansão de células T e ativação Cat. Nº 11456D) nos meios de distribuição de siRNA (Catálo- go Dharmacon nº B-005000- 500) contendo 2,5% de FBS inativado pelo calor suplementado com 10 ng/mL de camundongo recombinante IL-2 (Catálogo Biolegend nº 575406). Os siRNAs Accell de auto- distribuição são adicionados a uma concentração final de 1 μM. Após 72 h, os grânulos de ativação são removidos e as células são avalia- das quanto à fosforilação de STAT por citometria de fluxo ou sedimen- tadas para isolamento de RNA e análise de expressão gênica por qRT-PCR.
[00457] Dedos de zinco: Os domínios de nuclease de dedo de zinco manipulado (ZFN) são gerados por Sigma Aldrich em pares de plas- mídeos (CSTZFN-1KT COMPOZR® Nuclease de dedo de zinco per- sonalizado (ZFN) R-3257609). Os plasmídeos são preparados usando o sistema comercial NEB Monarch Miniprep (Cat nº T1010) seguindo o protocolo do fabricante. O modelo de DNA é linearizado usando 10 μg de entrada total e purificado usando o kit NEB Monarch PCR e kit de limpeza de DNA (Cat nº T1030). Uma reação de transcrição in vitro para gerar transcritos de RNA com tampa 5’ é realizada usando 6 μg de modelo de DNA purificado e o sistema de produção de RNA em grande escala Promega T7 RiboMAX (P1300 e P1712), seguindo as condições do fabricante. As transcrições são purificadas usando o kit de purificação Qiagen RNeasy Mini (Cat nº 74104). A integridade e a concentração de cada transcrição de domínio ZFN foram confirmadas usando o sistema Agilent 4200 TapeStation. Os transcritos purificados são poliadenilados usando a Polimerase NEB E. coli Poli(A) (M0276) usando 10 unidades por reação. A adição de caudas poliadeniladas é confirmada por uma mudança de tamanho usando o sistema Agilent 4200 TapeStation. Cada transcrição de mRNA de domínio ZFN madu- ro é combinada com seu par correspem quente e 10 µg de cada par são misturados com 5 x 106 de células T CD8 de camundongo e ele- troporados de acordo com os métodos descritos neste documento pa- ra eletroporação de células T murinas.
[00458] Construtos de expressão de CAR: foram gerados CARs es- pecíficos para as proteínas CD19, Her2/Erbb2 e EGFR humanas. Re- sumidamente, o peptídeo sinal de 22 aminoácidos da subunidade alfa do fator estimulador de colônias de granulócitos-macrófagos humanos (GMSCF-Rα) foi fundido a um domínio scFv específico do antígeno que se liga especificamente a um dos CD19, Her2/Erbb2 ou EGFR. O caule de CD8α humano foi utilizado como um domínio transmembra- nar. Os domínios de sinalização intracelular da cadeia CD3ξ foram fundidos com a extremidade citoplasmática do caule CD8α. Para CARs anti-CD19, o scFv foi derivado do clone anti-CD19 humano FMC63. Para criar um CAR específico para HER2/ERBB2 humano, foi utilizado o scFv anti-humano HER2 derivado de trastuzumab. Da mesma forma, para gerar um CAR específico para EGFR, foi utilizado o scFv anti-EGFR derivado do cetuximabe. Um resumo de construtos CAR exemplificativos é mostrado abaixo e sequências de aminoácidos dos construtos CAR de comprimento total são fornecidas nas SEQ ID NOs: 26, 28 e 30, e sequências de ácido nucleico dos construtos CAR de comprimento total são fornecidas nas SEQ ID NOs: 27, 29 e 31. Tabela 11: Construtos CAR exemplificativos ID de refe- Alvo Domínio Domínio Domínio AA NA rência CAR de liga- intracelu- Trans- SEQ ID SEQ ID ção a Ag lar membra- nar KSQCAR017 EGFR Cetuxi- CD3 zeta dobradiça 26 27 humana mabe CD8a H225 scFv KSQCAR1909 CD19 FMC63 CD3 zeta dobradiça 28 28 humana scFv CD8a KSQCAR010 HER2 Hercepti- CD3 zeta dobradiça 30 31 humana na scFv CD8a
[00459] Construtos de expressão de TCRs manipulados: TCRs re- combinantes específicos para NY-ESO1, MART-1 e WT-1 foram gera- dos. Sequências de proteínas da região variável de TCR-α: TCR-β pa- readas que codificam o TCR 1G4 específico para o peptídeo NY-ESO- 1 SLLMWITQC (SEQ ID NO: 2), os TCRs DMF4 e DMF5 específicos para o peptídeo MART-1 AAGIGILTV (SEQ ID NO: 3), e os TCRs DLT e DLT de alta afinidade específicos para o peptídeo WT-1, cada um apresentado por HLA-A *02:01, foram identificados na literatura (Rob- bins et al, Journal of Immunology 2008 180: 6116 -6131). As cadeias de TCRα foram compostas por segmentos de genes V e J e sequên- cias CDR3α e as cadeias de TCRβ foram compostas por segmento de genes V, D e J e sequências CDR3-β. As sequências de proteínas
TRAC nativas (SEQ ID NO: 22) e TRBC (SEQ ID NOs: 24) foram fun- didas às extremidades do terminal C das regiões variáveis das cadeias α e β, respectivamente, para produzir cadeias α/β 1G4-TCR (SEQ ID NOs: 11 e 12, respectivamente), cadeias 95:LY α/β 1G4-TCR (SEQ ID NOs: 14 e 13, respectivamente), cadeias DLT-TCR α/β (SEQ ID NOs: 5 e 4, respectivamente), cadeias DLT-TCR de α/β de alta afinidade (SEQ ID NOs: 8 e 7, respectivamente), cadeias DMF4-TCR α/β (SEQ ID NOs: 17 e 16, respectivamente) e cadeias DMF5-TCR α/β (SEQ ID NOs: 20 e 19, respectivamente).
[00460] Sequências de DNA otimizadas por códon que codificam as proteínas de cadeia TCRα e TCRβ manipuladas foram geradas em que a sequência P2A (SEQ ID NO: 1) foi inserida entre as sequências de DNA que codificam a cadeia TCRβ e TCRα, de modo que a ex- pressão de ambas as cadeias TCR foi removida de um único promotor de maneira estequiométrica. As cassetes de expressão que codificam as cadeias de TCR manipuladas compreendem, portanto, o seguinte formato: TCRβ - P2A - TCRα. As sequências proteicas finais para cada construto de TCR são fornecidas nas SEQ ID NO: 12 (1G4), SEQ ID NO: 15 (95: LY 1G4), SEQ ID NO: 6 (DLT), SEQ ID NO: 9 (DLT de alta afinidade), SEQ ID NO: 18 (DMF4) e SEQ ID NO: 21 (DMF5).
[00461] Construtos de expressão lentiviral: Os construtos de ex- pressão de CAR e TCR manipulados descritos acima foram então in- seridos em um plasmídeo compreendendo um promotor de SFFV diri- gindo a expressão do receptor manipulado, uma sequência T2A e uma cassete de resistência à puromicina. Salvo indicação em contrário, es- tes plasmídeos compreendem ainda um promotor U6 humano ou mu- rino (dependendo da espécie da qual as células T foram derivadas) dirigindo a expressão de um ou mais sgRNAs. Os construtos de lenti- vírus que compreendem um construto de expressão de TCR manipu- lado podem compreender ainda um sgRNA direcionado ao gene TRAC endógeno, que codifica a região constante da cadeia α do receptor de células T.
[00462] Os lentivírus que codificam os receptores manipulados des- critos acima foram gerados da seguinte maneira. Resumidamente, 289 x 106 das células LentiX-293T foram plaqueadas em um CellSTACK de 5 camadas 24 horas antes da transfecção. OptiMEM livre de soro e TransIT-293 foram combinados e incubados por 5 minutos antes de combinar plasmídeos auxiliares (58 µg de VSVG e 115 µg de PAX2- Gag-Pol) com 231 µg de um plasmídeo manipulado para expressão de receptor e sgRNA descrito acima. Após 20 minutos, esta mistura foi adicionada às células LentiX-293T com meios frescos. Os meios foram substituídos 18 horas após a transfecção e os sobrenadantes virais foram coletados 48 horas após a transfecção. Os sobrenadantes foram tratados com nuclease Benzonase® e passados através de um filtro de 0,45 µm para isolar as partículas virais. As partículas virais foram então concentradas por Filtragem de Fluxo Tangencial (TFF), divididas em alíquotas, tituladas e armazenadas a -80 °C. II. Métodos
[00463] Isolamento e Ativação de Células T Humanas: PBMCs to- tais humanas foram isoladas de leucopacks frescos por centrifugação em gradiente de Ficoll. As células T CD8+ foram então purificadas do total de PBMCs usando um kit de isolamento de células T CD8+ (Stemcell Technologies Cat nº 17953). Para a ativação das células T, as células T CD8+ foram plaqueadas a 2 x 106 células/mL em meio de expansão de células X-VIVO 15 T (Lonza, Cat nº 04-418Q) em um ba- lão T175, com 6,25 μL/mL de ativadores de célula T ImmunoCult (anti- CD3/CD28/CD2, StemCell Technologies, Vancouver BC, Canadá) e 10 ng/mL de IL2 humano. As células T foram ativadas por 18 horas antes da transdução com construtos lentivirais.
[00464] Isolamento e Ativação de TIL: Os linfócitos infiltrantes de tumor também podem ser modificados pelos métodos descritos neste documento. Nesses casos, os tumores são ressecados cirurgicamente de pacientes humanos e cortados em cubos com lâminas de bisturi em pedaços de 1 mm3, com um único pedaço de tumor colocado em cada poço de uma placa de 24. 2 mL de meios TIL completos (RPMI + soro AB masculino humano inativado pelo calor a 10%, piruvato a 1 mM, gentamicina 20 μg/mL, glutamax 1X) suplementado com 6000 U/mL de IL-2 humana recombinante são adicionados a cada poço de TILs iso- lados. 1 mL de meios é removido do poço e substituído por meio fres- co e IL-2 até 3 vezes por semana, conforme necessário. À medida que os poços atingem a confluência, eles são divididos 1:1 em novos mei- os + IL-2. Após 4-5 semanas de cultura, as células são colhidas para expansão rápida.
[00465] Expansão rápida de TIL: os TILs são rapidamente expandi- dos ativando 500.000 TILs com 26 x 106 células alogênicas, células PBMC alogênicas e irradiadas (5000cGy) em 20 mL de meios TIL + 20 mL de meios Aim-V (Invitrogen) + 30 ng/mL de mAb OKT3. 48 horas depois (dia 2), 6000 U/mL de IL-2 são adicionados às culturas. No dia 5, 20 ml de meios são removidos e 20 ml de meios frescos (+ 30 ng/ml de OKT3) são adicionados. No dia 7, as células são contadas e reani- madas a 60 x 106/L células em placas de poço G-Rex6M (Wilson Wolf, Cat # 80660M) ou G-Rex100M (Wilson Wolf, Cat nº 81100S), depen- dendo do número de células acessível. 6000 U/mL de IL-2 fresca são adicionados no dia 9 e 3000 U/mL de IL-2 fresca são adicionados no dia 12. Os TILs são colhidos no dia 14. As células expandidas são congeladas lentamente no Cryostor CS-10 (Stemcell Technologies Cat nº 07930) usando recipientes Coolcell Freezing (Corning) e armazena- das a longo prazo em nitrogênio líquido.
[00466] Isolamento e Ativação de Células T Murinas: As células T WT CD8+murinas foram derivadas de camundongos C57BL/6J (The
Jackson Laboratory, Bar Harbor ME Cat nº 000664). As células T CD8+ específicas de ovalbumina (Ova) foram derivadas de camundongos OT1 (C57BL/6-Tg (TcraTcrb) 1100Mjb/J; Jackson Laboratory). Os ca- mundongos OT1 compreendem um TCR transgênico que reconhece os resíduos 257-264 da proteína ovalbumina (Ova). As células T CD8+ específicas de gp100 foram derivadas de camundongos PMEL (B6.Cg- Thy1<a>/CyTg(TcraTcrb) 8Rest/J; The Jackson Laboratory, Bar Har- bor ME Cat nº 005023). Os baços de camundongos WT ou transgêni- cos foram colhidos e reduzidos a uma suspensão de célula única usando o sistema GentleMACS, de acordo com as recomendações do fabricante. As células T CD8+ purificadas foram obtidas usando o Kit de Isolamento de Células T EasySep Camundongo CD8+ (Catálogo nº 19853). As células T CD8 foram cultivadas a 1 x 106 células/mL em meios de célula T completo (RPMI + 10% de FBS inativado pelo calor, HEPES 20 mM, 100 U/mL de penicilina, 100 μg/mL de estreptomicina, 50 μM de beta-mercaptoetanol) suplementado com 2 ng/mL de ca- mundongo recombinante IL-2 (Catálogo Biolegend nº 575406) e ativa- do com grânulos anti-CD3/anti-CD28 (Ativador T do camundongo Dynabeads ™ CD3/CD28 para expansão de células T e ativação Cat nº 11456D).
[00467] Transdução lentiviral de células T: As células T ativadas 18 horas antes foram semeadas a 5 x 106 células por poço em uma placa de 6 poços, em 1,5 mL de volume de meios X-VIVO 15, 10 ng/mL de IL-2 humana e 12,5 µL Ativador de células T CD3/CD28/CD2 de imu- nocultivo humano. O lentivírus que expressa os receptores manipula- dos foi adicionado a um MOI capaz de infectar 80% de todas as célu- las. Foram adicionados 25 μL de Retronectina (1 mg/mL) a cada poço. Os meios XVIVO-15 foram adicionados a um volume final de 2,0 mL por poço. Salvo indicação em contrário, os lentivírus também expres- saram os sgRNAs. As placas foram centrifugadas a 600 x g durante
1,5 horas a temperatura ambiente. Após 18 horas (Dia 2), as células foram lavadas e semeadas a 1 x 106 células/mL em X-VIVO 15, 10 ng/mL de ativadores de células T IL2 +.
[00468] Eletroporação de células T humanas: 3 dias após a ativa- ção das células T, as células T foram colhidas e ressuspensas em tampão de nucleofecção (suplemento 18% 1, tampão P3 82% a partir do 4D-Nuclefector X kit S da célula primária Amaxa P3 a uma concen- tração de 100 x 106 células/mL adicionaram 1,5 μL de complexos sgRNA/Cas9 RNP (contendo 120 pmol de crRNA: tracrRNA duplex e 20 pmol de Cas9 nuclease) e 2,1 μL (100 pmol) de potencializador de eletroporação foram adicionados por 20 μL de solução celular. 25 μL da mistura de célula/RNP/potencializador foram adicionados a cada poço de eletroporação. As células foram eletroporadas usando o ele- troporador Lonza com o programa "Nucleofection of activated CD8 T- cells". Após eletroporação, 80 μL de meio X-VIVO 15 quente foram adicionados a cada poço e as células foram reunidas em um balão de cultura a uma densidade de 2 x 106 células/mL em meios X-VIVO 15 contendo IL-2 (10 ng/mL). No dia 4, as células foram lavadas, conta- das e semeadas em densidades de 50-100 x 106células/L em meios X- VIVO 15 contendo IL-2 (10 ng/mL) em placas de poço G-Rex6M ou G- Rex100M, dependendo do número de células disponíveis. Nos dias 6 e 8, 10 ng/mL de IL-2 humana recombinante fresca foram adicionados às culturas
[00469] Eletroporação de células T de camundongo: As células T de murino ativadas 48 horas antes foram colhidas, os grânulos de ati- vação foram removidos e as células foram lavadas e ressuspensas no tampão de nucleofecção de Neonn T. Até 2 x 106 células ressuspen- sas em 9uL de tampão T e 20 x 106 células ressuspensas em 90 μL de Tampão T pode ser eletroporado usando a ponta Neon ™ 10 μL e ponta Neon ™ 100 μL, respectivamente. Os complexos gRNA/Cas9
RNP ou mRNAs de ZFN (1 μL por 10 μL de ponta ou 10 μL por 100 μL de ponta) e 10,8 μM de potencializador de eletroporação (2 μL por 10 μL de ponta ou 20 μL por 100 μL de ponta) foram adicionados às célu- las. As células T misturadas com complexos de gRNA/Cas9 RNP ou mRNAs de ZFN foram pipetadas nas pontas Neon™ e eletroporadas usando o Sistema de Transfecção de Neon (1700 V/20 ms/1 pulsos). Imediatamente após a eletroporação, as células foram transferidas pa- ra um balão de cultura a uma densidade de 1,6 x 106 células/mL em meio de célula T completo quente suplementado com 2 ng/mL de IL-2 de Camundongo Recombinante. As células T CD8 murinas editadas foram posteriormente cultivadas a 1 x 106 células/mL em meio de célu- la T completo suplementado com IL-2 por mais 1-4 dias.
[00470] Purificação e caracterização de células T manipuladas: 10 dias após a ativação das células T, as células foram removidas dos balões de cultura e células T editadas, manipuladas de expressão de receptor CD8+ T foram purificadas. A expressão do receptor modifica- do pode ser determinada por coloração de anticorpos, por exemplo, anticorpos para Vβ12 para DMF4 TCR ou Vβ13/13.1 para NY-ESO-1 ou 1G4). Determinação adicional da edição de genes-alvo pode ser avaliada por análise FACS de proteínas de superfície (por exemplo, CD3), de western blot da proteína alvo e/ou análise TIDE/NGS do sítio de corte genômico. As células purificadas podem então ser congela- das lentamente no Cryostor CS-10 (Stemcell Technologies Cat nº 07930) usando recipientes Coolcell Freezing (Corning) e armazenadas a longo prazo em nitrogênio líquido para uso futuro. EXEMPLO 2: CARACTERIZAÇÃO DE CÉLULAS T EDITADAS, MA-
NIPULADAS POR RECEPTOR
[00471] Realizaram-se experiências em que as células de expres- são receptores editadas foram purificadas com base na expressão da superfície celular de CD3. Antes da manipulação, as células T CD8+ expressam moléculas de CD3 na superfície celular como parte de um complexo que inclui as cadeias TCR α/β (Fig. 4A). As células T foram transduzidas com um lentivírus que expressa um CAR, um RNA guia direcionado ao gene TRAC e um RNA guia direcionado ao gene B2M, que foi usado para avaliar a edição de genes não-TCR como um proxy para a edição do gene-alvo. Após a transdução lentiviral e a eletropo- ração do mRNA de Cas9, as células T transduzidas e editadas com sucesso demonstram uma perda da expressão de CD3 de superfície devido à edição do gene TRAC e uma perda da expressão de HLA- ABC devido à edição do gene B2M (Fig. 4B). As células que expres- sam CD3 foram removidas da população geral (Fig. 4B) usando o kit de seleção positivo para CD3 humano EasySep (StemCell Tech Cat nº 18051). As células foram então submetidas a duas rodadas de seleção magnética negativa para CD3. Este processo produziu células T nega- tivas para CD3 altamente purificadas que expressam (Fig.4C). A colo- ração com um reagente CD19-Fc recombinante (que se liga ao CD19 CAR) demonstrou que as células editadas mostram expressão de su- perfície do CD19 CAR, enquanto as células não editadas não (Fig. 4D). Experiências semelhantes foram realizadas com sgRNAs de CD45 e B2M direcionados. A atividade de edição de Cas9 nas células T foi confirmada avaliando a expressão de CD45 e B2M por citometria de fluxo foi avaliada 96 horas depois, e a função eficiente Cas9 é indi- cada por uma perda de expressão de CD45 na superfície das células T, conforme determinado por FACS. A coeletroporação com Cas9 mRNA e Cas9 RNPs levou a uma edição substancial nos locais CD45 e B2M, com 66,3% das células exibindo edição dupla.
[00472] A edição do alvo foi realizada conforme descrito nos exem- plos acima e a edição de um único gene exemplificativo, CBLB, foi confirmada usando o método de análise Tracking of Indels by Decom- position (TIDE) e análise de western blot. O TIDE quantifica a eficácia da edição e identifica os tipos predominantes de inserções e deleções (indels) no DNA de um conjunto de células-alvo.
[00473] O DNA genômico (gDNA) foi isolado a partir de células T editadas usando o Mini Kit de DNA da Qiagen Blood and Cell Culture Cell (Cat nº: 13323), seguindo o protocolo recomendado pelo fornece- dor e quantificado. Após o isolamento do gDNA, a PCR foi realizada para amplificar a região do DNA editado usando os primers de PCR específicos do locus (F: 5’-CCACCTCCAGTTGTTGCATT-3’ (SEQ ID NO: 32); R: 5’- TGCTGCTTCAAAGGGAGGTA-3’ (SEQ ID NO: 33). Os produtos de PCR resultantes foram executados em um gel de agarose a 1%, extraídos e purificados usando o QIAquick Gel Extraction Kit (Cat nº: 28706). Os produtos extraídos foram sequenciados por se- quenciação Sanger e os arquivos de sequência do cromatograma de sequenciação Sanger foram analisados por TIDE. Nas células T edita- das por CBLB editadas por métodos que utilizam complexos de gRNA/Cas9 RNP ou mRNA de Cas9 introduzidos expressando gRNA, a análise TIDE resultante confirmou a edição do gene-alvo CBLB. Além do TIDE, a depleção dos níveis de proteína CBLB foi confirmada por western blot usando um anticorpo anti-CBLB (SCT Cat nº 9498). Os dados são fornecidos nas Figs. 5A e 5B e Fig. 6.
[00474] Outro método pelo qual a edição de um gene é avaliada é pelo sequenciamento da próxima geração. Para este método, o DNA genômico (gDNA) foi isolado das células T editadas usando o Mini Kit de DNA de Cultura de Sangue e Células da Qiagen (Cat nº: 13323), seguindo o protocolo recomendado pelo fabricante e quantificado. Após o isolamento do gDNA, foi realizada a PCR para amplificar a re- gião do DNA genômico editado usando primers de PCR específicos para locus contendo overhangs necessárias para a adição de adapta- dores de sequenciamento Illumina Next Generation. O produto de PCR resultante foi executado em um gel de agarose a 1% para garantir a amplificação específica e adequada do locus genômico antes da lim- peza da PCR ser realizada de acordo com o protocolo recomendado pelo fornecedor, usando o Monarch PCR & DNA Cleanup Kit (Cat nº: T1030S). O produto de PCR purificado foi então quantificado e uma segunda PCR foi realizada para parear os adaptadores de sequencia- mento Illumina e sequências de indexação específicas da amostra ne- cessárias para a multiplexação. Depois disso, o produto de PCR foi executado em um gel de agarose a 1% para avaliar o tamanho antes de ser purificado usando os grânulos AMPure XP (produzidas interna- mente). O produto de PCR purificado foi então quantificado via qPCR usando o Kit de Quantificação de Biblioteca Kapa Illumina (Cat nº: KK4923) e Padrões de DNA de Quantificação de Biblioteca Kapa Illu- mina (Cat nº: KK4903). O produto quantificado foi então carregado no sistema Illumina NextSeq 500 usando o cartucho de reagente de saída média Illumina NextSeq 500/550 v2 (Cat nº: FC-404-2003). A análise dos dados de sequenciação produzidos foi realizada para avaliar in- serções e deleções (indels) no sítio de corte antecipado no DNA do conjunto de células T editado. EXEMPLO 3: IDENTIFICAÇÃO DE ALVOS DE TERAPIA DE
TRANSFERÊNCIA DE CÉLULAS T ADOTIVAS ATRAVÉS DE UMA TRIAGEM GENÔMICA FUNCIONAL OT1/B16-OVA CRISPR/CAS9
[00475] Foram realizadas experiências para identificar alvos que regulam a acumulação de células T nos tumores. Foi realizada uma triagem de CRISPR em que um conjunto de sgRNAs, cada um dos quais tem como alvo um único gene, foi introduzido em uma população de células T específicas para tumores, de modo que cada célula da população compreendesse um único sgRNA direcionado a um único gene. Para determinar o efeito de um gene específico na acumulação de células T em amostras de tumor, a frequência de cada sgRNA na população de células T foi determinada no início do experimento e comparada com a frequência do mesmo sgRNA posteriormente no ex- perimento. Espera-se que a frequência de sgRNAs direcionados a ge- nes que regulam positivamente a acumulação de células T em amos- tras de tumor (por exemplo, genes que regulam positivamente a proli- feração de células T, viabilidade e/ou infiltração tumoral) ao longo do tempo, enquanto a frequência de sgRNAs direcionados a genes que regula negativamente o acúmulo de células T em amostras de tumores (por exemplo, genes que regulam negativamente a proliferação, viabi- lidade e/ou infiltração de células T em tumores) deverá diminuir ao longo do tempo.
[00476] As triagens de CRISPR reunidas foram realizadas com cé- lulas T CD8+ derivadas de Cas9 que expressam camundongos OT1 de acordo com os métodos descritos no Exemplo 1. A biblioteca de sgR- NA reunida foi introduzida em células T CD8+ OTI purificadas cultiva- das in vitro para gerar uma população de células T CD8+ editadas. Após manipulação in vitro, as células T CD8+ OT1 editadas foram ad- ministradas por via intravenosa (iv) a camundongos C56BL/6 portado- res de tumor B16/Ova. Após a expansão in vivo, os órgãos foram co- lhidos e as células CD45+ foram enriquecidas. O DNA genômico das células CD45 + isoladas foi isolado usando kits de extração de DNA Qiagen. A biblioteca de sgRNA foi então amplificada por PCR e se- quenciada usando o sequenciamento de próxima geração Illumina (NGS).
[00477] A distribuição e/ou frequência de cada sgRNA nas amos- tras colhidas de camundongos portadores de tumor foram analisadas e comparadas com a distribuição e/ou frequência de cada sgRNA na população inicial de células T. Análises estatísticas foram realizadas para cada sgRNA individual para identificar guias que foram significati- vamente enriquecidos em populações de células T colhidas em ca- mundongos portadores de tumores e para atribuir uma pontuação de enriquecimento a cada um dos guias.
As pontuações de enriquecimen- to para sgRNA individual direcionado para o mesmo gene foram agre- gadas para identificar genes-alvo que tiveram um efeito consistente e reprodutível na acumulação de células T em vários sgRNAs e em vá- rios camundongos doadores de OT1. Os resultados destes experimen- tos são mostrados abaixo na Tabela 12. Os percentis na Tabela 12 foram calculados usando a seguinte equação: pontuação do percentil = 1- (classificação de enriquecimento de genes/número total de genes triados). Tabela 12: Pontuações Percentuais de Gene-alvo Nome do Alvo Pontuação Percentual Ikzf1 0,995 Nfkbia 0,986 Gata3 0,993 Bcl3 0,698 Ikzf3 0,995 Smad2 0,978 Tgfbr1 0,991 Tgfbr2 0,987 Tnip1 0,991 Tnfaip3 0,998 Ikzf2 0,622 Tanque 0,83 Ptpn6 0,782 Bcor 0,720 Cblb 0,999 Nrp1 0,826 Havcr2 0,86 Lag3 0,82 Bcl2l11 0,9928 Chic2 0,997 Fli1 0,999
Nome do Alvo Pontuação Percentual Pcbp1 0,997 Pbrm1 0,944 Wdr6 0,953 E2F8 0,867 Serpina3 0,822 Sema7a 0,78 Dhodh 0,99 Umps 0,989 Ptpn22 0,638 Ptpn2 0,990 Sh2b3 0,994 Sh2d1a 0,987 Pik3cd 0,814 Egr2 0,665 Setd5 0,998 Peli1 0,988 EXEMPLO 4: IDENTIFICAÇÃO DE ALVOS DE TERAPIA DE TRANSFERÊNCIA DE CÉLULAS T ADOTIVAS ATRAVÉS DE TRI- AGENS GENÔMICAS FUNCIONAIS CAR-T E CRISPR/CAS9 IN VI-
TRO
[00478] Foram realizadas experiências para identificar alvos que regulam a acumulação de amostras de tumor de células CAR-T. Foi realizada uma triagem CRISPR agrupada em todo o genoma, na qual um conjunto de sgRNAs, cada um dos quais tem como alvo um único gene, foi introduzido em uma população de células CAR-T humanas específicas do tumor, de modo que cada célula da população compre- endesse uma única sgRNA direcionada a um único gene. Para deter- minar o efeito de um gene específico na acumulação de células CAR-T em amostras de tumores, a frequência de cada sgRNA na população de células CAR-T foi determinada no início do experimento e compa- rada com a frequência do mesmo sgRNA em um posteriormente no experimento. Espera-se que a frequência de sgRNAs direcionados a genes que regulam positivamente a acumulação de células CAR-T em amostras de tumor (por exemplo, genes que regulam positivamente a proliferação de células T, viabilidade e/ou infiltração tumoral) ao longo do tempo, enquanto espera-se que a frequência de sgRNAs direciona- dos aos genes que regulam negativamente o acúmulo de células CAR- T em amostras de tumores (por exemplo, genes que regulam negati- vamente a proliferação, viabilidade e/ou infiltração de células T em tu- mores) diminuam com o tempo.
[00479] As triagens in vitro foram realizadas utilizando células CAR- T específicas para CD19 humano. As bibliotecas de sgRNA reunidas foram introduzidas nos CART CD19 conforme descrito acima e as cé- lulas foram eletroporadas com mRNA Cas9 como descrito no Exemplo 1 para gerar uma população de CART CD19 editados por Cas9. Os CARTs CD19 editados foram então co-cultivados com uma linhagem celular de carcinoma colorretal aderente (CRC) manipulada para ex- pressar CD19 ou uma linhagem celular de linfoma de Burkitt que ex- pressa CD19 endógeno. Os CART foram colhidos em vários momen- tos ao longo do período de co-cultura e os pellets de células foram congelados. O DNA genômico (gDNA) foi isolado desses pellets de células usando kits de extração de DNA Qiagen e sequenciado usando o sequenciamento de próxima geração Illumina.
[00480] A distribuição e/ou frequência de cada sgRNA nas alíquotas retiradas da co-cultura CART/célula tumoral foi analisada e comparada com a distribuição e/ou frequência de cada sgRNA na população inicial de células CAR-T editada. As análises estatísticas foram realizadas para cada sgRNA individual para identificar sgRNAs que foram signifi- cativamente enriquecidos nas populações de células CAR-T após a co-cultura de células tumorais e para atribuir uma pontuação de enri- quecimento a cada um dos guias. As pontuações de enriquecimento do sgRNA individual que têm como alvo o mesmo gene foram agrega- das para identificar os genes-alvo que têm um efeito consistente e re- produtível na acumulação de células CAR-T em amostras de tumor em vários sgRNAs e na população de células CAR-T. Os alvos foram classificadas e pediram uma investigação mais aprofundada com base no percentil. Os resultados destes experimentos são mostrados abaixo na Tabela 13. Os percentis na Tabela 13 foram calculados usando a seguinte equação: pontuação do percentil = 1- (classificação de enri- quecimento de genes/número total de genes triados). Tabela 13: Pontuações Percentuais do Gene-alvo Nome do Alvo Pontuação Percentual IKZF1 0,999 IKZF3 0,962 TGFBR1 0,778 TNIP1 0,64 TNFAIP3 0,791 FOXP3 0,866 IKZF2 0,907 TANQUE 0,93 PTPN6 0,707 BCOR 0,999 CBLB 0,989 BCL2L11 0,93 CHIC2 0,71 WDR6 0,962 E2F8 0,971 DHODH 0,763 PTPN22 0,617 PTPN2 0,950 EXEMPLO 5: IDENTIFICAÇÃO DE ALVOS DE TERAPIA DE
TRANSFERÊNCIA DE CÉLULAS T ADOTIVAS ATRAVÉS DE UMA TRIAGEM GENÔMICA FUNCIONAL CAR-T/TUMOR CRISPR/CAS9
IN VIVO
[00481] Foram realizadas experiências para identificar alvos que regulam o acúmulo de células CAR-T na presença de tumores. Foi realizada uma triagem de CRISPR reunida, na qual um conjunto de sgRNAs, cada um dos quais tem como alvo um único gene, foi intro- duzido em uma população de células CAR-T humanas específicas do tumor, de modo que cada célula da população compreendesse um único sgRNA direcionado a um único gene. Para determinar o efeito de um gene específico na acumulação de células CAR-T em amostras de tumores, a frequência de cada sgRNA na população de células CAR-T foi determinada no início do experimento e comparada com a frequência do mesmo sgRNA em um posteriormente no experimento. Espera-se que a frequência de sgRNAs direcionados a genes que re- gulam positivamente a acumulação de células T-CAR em amostras de tumor (por exemplo, genes que regulam positivamente a proliferação, viabilidade e/ou infiltração de células T em tumores) aumente ao longo do tempo, enquanto espera-se que a frequência de sgRNAs direciona- dos aos genes que regulam negativamente o acúmulo de células T- CAR em amostras de tumores (por exemplo, genes que regulam nega- tivamente a proliferação, viabilidade e/ou infiltração de células T em tumores) diminuam com o tempo.
[00482] Triagens in vivo realizadas em dois modelos de xenoenxer- to subcutâneos separados: um modelo de linfoma de Burkitt e um mo- delo de câncer colorretal (CRC). Para o modelo de Burkitt, 1 x 106 cé- lulas tumorais de linfoma de Burkitt em Matrigel foram injetadas subcu- taneamente no flanco direito de camundongos NOD/SCID gama (NSG) com 6-8 semanas de idade. Os camundongos foram monitori- zados, randomizados e incluídos no estudo 13 dias após a inoculação, quando os tumores atingiram aproximadamente 200 mm3 em volume. Para o modelo CRC, as células CRC foram manipuladas para expres-
sar CD19, e 5 x 106 células tumorais em Matrigel foram injetadas sub- cutaneamente no flanco direito de camundongos NSG com 6-8 sema- nas de idade. Os camundongos foram monitorizados, randomizados e incluídos no estudo 12 dias após a inoculação, quando os tumores atingiram aproximadamente 200 mm3 em volume. As células CD19 CAR-T manipuladas por Cas9 foram administradas iv via veia da cau- da a 3 x 106 e 10 x 106/camundongo (3M e 10M). Os tumores foram coletados 8 a 10 dias após a injeção de CAR-T e congelados em nitro- gênio líquido. Estes tecidos foram posteriormente dissociados e pro- cessados para extração de DNA genômico.
[00483] A distribuição e/ou frequência de cada sgRNA nas amos- tras de DNA genômico tomadas no final do estudo foi analisada e comparada com a distribuição e/ou frequência de cada sgRNA na po- pulação inicial de células-CAR-T editadas. As análises estatísticas fo- ram realizadas para cada sgRNA individual para identificar sgRNAs significativamente enriquecidos em amostras de DNA genômico cole- tadas no final do estudo e para atribuir uma pontuação de enriqueci- mento a cada um dos guias. As pontuações de enriquecimento para o sgRNA individual que tem como alvo o mesmo gene foram agregadas para identificar os genes-alvo que têm um efeito consistente e reprodu- tível na abundância de células CAR-T em vários sgRNAs e populações de células CAR-T. Os alvos foram classificadas e pediram uma inves- tigação mais aprofundada com base no percentil. Os resultados destes experimentos são mostrados abaixo na Tabela 14. Os percentis na Tabela 14 foram calculados usando a seguinte equação: pontuação do percentil = 1- (classificação de enriquecimento de genes/número total de genes triados). Tabela 14: Pontuações percentuais do gene-alvo Nome do Alvo Pontuação Percentual NFKBIA 0,95
Nome do Alvo Pontuação Percentual SMAD2 0,816 FOXP3 0,92 IKZF2 0,895 TANQUE 0,923 PTPN6 0,979 CBLB 0,958 PPP2R2D 0,926 NRP1 0,795 HAVCR2 0,992 LAG3 0,97 TIGIT 0,916 CTLA4 0,884 BCL2L11 0,776 RBM39 0,94 E2F8 0,968 CALM2 0,902 SERPINA3 0,907 SEMA7A 0,918 PTPN22 0,789 PTPN2 0,947 PIK3CD 0,910 EGR2 0,847 EXEMPLO 6: VALIDAÇÃO DE CÉLULAS T TRANSFERIDAS ADO-
TIVAMENTE EM EDIÇÃO ÚNICA EM UM MODELO DE TUMOR SINGENEICO DE OT1/B16 DE MURINO
[00484] Os alvos com pontuações percentuais de 0,6 ou mais nos Exemplos 3-5 foram selecionados para avaliação adicional em um formato de guia único para determinar se a edição de um gene-alvo em células T específicas de tumor conferia um aumento na eficácia antitumoral. A avaliação de alvos exemplificativos é descrita neste do- cumento, no entanto, esses métodos podem ser usados para avaliar qualquer um dos alvos em potencial descritos acima.
[00485] A eficácia antitumoral de células T editadas única foi avali- ada em camundongos usando o modelo de tumor singeneico subcutâ- neo B16-Ova, que é sensível ao tratamento com anticorpos anti-PD1. Resumidamente, foram injetados subcutaneamente camundongos C57BL/6J fêmeas com 6-8 semanas de idade nos laboratórios Jack- son com 0,5 x 106 células tumorais B16-Ova. Quando os tumores atin- giram um volume de aproximadamente 100 mm3 os camundongos fo- ram randomizados em grupos de 10 e injetados por via intravenosa com células T OT1 CD8+ de camundongo editadas via veia da cauda. Antes da injeção, as células T OT1 foram editadas por eletroporação com complexos gRNA/Cas9 RNP compreendendo (i) um gRNA de controle; (ii) um único gRNA de direcionamento de PD1; (iii) um único gRNA de direcionamento de Cblb; (iv) um único gRNA de direciona- mento de Ptpn2; (v); (v) um único gRNA de direcionamento de Setd5; ou (vi) um único gRNA de direcionamento de Peli1. Para gerar uma população de células T CD8+ específicas de tumor com genes-alvo editados, os baços de camundongos fêmeas OT1 foram colhidos e as células T CD8 foram isoladas conforme descrito no Exemplo 1. As cé- lulas T CD8+ OT1 editadas foram então administradas por via intrave- nosa a camundongos C56BL/6 portadores de tumor B16-Ova. O peso corporal e o volume do tumor foram medidos pelo menos duas vezes por semana. O volume do tumor foi calculado como média e erro pa- drão da média para cada grupo de tratamento. A porcentagem de ini- bição do crescimento tumoral (TGI) foi calculada usando os volumes médios de tumor (TV) de acordo com as seguintes fórmulas: % TGI=(TV-Alvofinal–TV-AlvoInicial)/(TV-Controlefinal–TV-ControletInicial), em que TV = volume tumoral médio, final para Cblb TGI = Dia 18 pós transferência de células T, final para Ptpn2 TGI= Dia 17 pós- transferência de células T, final para Setd5 e Peli1 TGI = Dia 11 pós-
transferência de células T, e inicial = Dia 0 (ou seja, dia de transferên- cia de células T).
[00486] Os resultados das células T editadas com Cblb são mostra- dos na Fig. 7A. Esses dados demonstram que a edição do gene Cblb nas células T leva à eficácia antitumoral com um TGI de 85% no dia
18. Os resultados das células T editadas com Ptpn2 são mostrados na Fig. 7B. Esses dados demonstram que a edição do gene Ptpn2 nas células T aumenta a eficácia antitumoral das células T com um TGI de 108% no dia 17. Os resultados de uma experiência adicional com célu- las T editadas com Ptpn2 são mostrados na Fig. 7C. Os resultados das células T editadas pelo Setd5 são mostrados na Fig. 7D. Esses dados demonstram que a edição do gene Setd5 nas células T aumen- ta a eficácia antitumoral das células T com um TGI de 78% no dia 11. Os resultados das células T editadas pelo Peli1 são mostrados na Fig. 7E. Esses dados demonstram que a edição do gene Peli1 nas células T aumenta a eficácia antitumoral das células T com um TGI de 91% no dia 11. EXEMPLO 7: VALIDAÇÃO DE CÉLULAS T TRANSFERIDAS ADO-
TIVAMENTE EM EDIÇÃO ÚNICA EM UM MODELO DE TUMOR SINGENEICO DE PMEL E MC38/GP100 DE MURINO
[00487] Objetivos com pontuações percentuais de 0,6 ou mais nos Exemplos 3-5 foram selecionados para avaliação adicional em um formato de guia único para determinar se a edição de um gene-alvo em células T específicas de tumores conferia um aumento na eficácia antitumoral em um modelo murino MC38gp100 subcutâneo de tumor singeneico de câncer colorretal (que é insensível ao tratamento com anticorpos anti-PD1). A avaliação de alvos exemplificativos é descrita neste documento, no entanto, esses métodos podem ser usados para avaliar qualquer um dos alvos em potencial descritos acima.
[00488] Resumidamente, camundongos C57BL/6J fêmeas subcuta-
neamente com 6-8 semanas de idade nos laboratórios de Jackson com 1 x 106 células de tumor MC38gp100. Antes da injeção, as célu- las T foram editadas por eletroporação com complexos de gRNA/Cas9 RNP compreendendo (i) um gRNA de controle; (ii) um único gRNA de direcionamento de Ptpn2; ou (iii) um único gRNA de direcionamento a Peli1. Quando os tumores atingiram um volume de aproximadamente 100 mm3 camundongos foram randomizados em grupos de 10 e inje- tados intravenosamente com células T de camundongo editadas por Ptpn2 ou editadas por Peli1 PMEL CD8+ via veia da cauda. O peso corporal e volume do tumor foram medidos pelo menos duas vezes por semana. O volume do tumor foi calculado como média e erro-padrão da média para cada grupo de tratamento.
[00489] Os resultados das células T editadas por Ptpn2são mostra- dos na Fig. 8A. Esses dados demonstram que a edição do gene Ptpn2 nas células T aumenta a eficácia antitumoral das células T com um TGI de 30% no dia 22. Os resultados das células T editadas por Peli1 são mostrados na Fig. 8B.
[00490] Experiências semelhantes são realizadas para avaliar a efi- cácia antitumoral de células T editadas por Setd5no modelo de tumor singeneico PMEL/MC38. Espera-se que essas experiências mostrem uma eficácia antitumoral aprimorada das células T editadas por Setd5em comparação com os controles. EXEMPLO 8: VALIDAÇÃO DE CÉLULAS T TRANSFERIDAS ADO-
TIVAMENTE EM EDIÇÃO ÚNICA EM UM MODELO DE TUMOR SINGENEICO B16-F10 DE MURINO
[00491] Os alvos com pontuações percentuais de 0,6 ou mais nos Exemplos 3-5 são selecionados para avaliação adicional em um for- mato de guia único para determinar se a edição de um gene-alvo em células T específicas de tumores conferiu um aumento na eficácia anti- tumoral no modelo de tumor singeneico agressivo metastático B16 -
F10 com doença que se manifesta como metástase pulmonar. A avali- ação de alvos exemplificativos é descrita neste documento, no entan- to, esses métodos podem ser usados para avaliar qualquer um dos alvos em potencial descritos acima.
[00492] Resumidamente, camundongos fêmeas C57BL/6J fêmeas com 6-8 semanas de idade dos laboratórios Jackson foram injetados por via intravenosa com 0,5 x 106 células tumorais B16-F10. Os ca- mundongos são pesados e atribuídos aos grupos de tratamento usan- do um procedimento de randomização antes da inoculação. No D3 após a inoculação do tumor, os camundongos são injetados por via intravenosa com células T PMEL CD8+ murinas através da veia da cauda. Antes da injeção, essas células são editadas por eletroporação com complexos de gRNA/Cas9 RNP compreendendo (i) um gRNA de controle; (ii) um único gRNA direcionado ao gene Setd5; (iii) um único gRNA direcionado ao gene Peli1; (iv) ou um único gRNA direcionado ao gene Ptpn2. O peso corporal é monitorado pelo menos duas vezes por semana. No dia 15 após a inoculação do tumor (dia 12 após a transferência do PMEL editado), os pulmões dos camundongos são perfundidos e fixados com para-formaldeído a 10%. Após a fixação durante a noite, os pulmões são transferidos para EtOH a 70% para posterior preservação. A eficácia do tumor é avaliada através da avali- ação visual da carga tumoral B16-F10, que pode ser vista como colô- nias negras de células cancerígenas nos pulmões. Espera-se que es- ses dados mostrem uma eficácia antitumoral aprimorada de células T editadas por Setd5, editadas por Ptpn-2 e editadas por Peli1 em com- paração com os controles. EXEMPLO 9: VALIDAÇÃO DE CÉLULAS T ADOTIVAMENTE TRANSFERIDAS EDITADAS EM UM MODELO DE TUMOR SINGE- NEICO SUBCUTÂNEO OT1/EG7OVA MURINO
[00493] A eficácia antitumoral de Peli1 e Setd5 foi adicionalmente avaliada em camundongos usando o modelo de tumor singeneico sub- cutâneo Eg7-Ova. Camundongos C57BL/6J fêmeas com 6-8 semanas de idade dos laboratórios Jackson foram injetados por via subcutânea com 1 x 106 células de tumorais Eg7-Ova. Quando os tumores atingi- ram um volume de aproximadamente 100 mm3 os camundongos foram randomizados em grupos de 10 e injetados por via intravenosa com células T OT1 CD8+ de camundongo editadas via veia da cauda. An- tes da injeção, essas células foram editadas com um guia de controle ou uma única edição do guia para o gene Peli1 ou o gene Setd5. O peso corporal e o volume do tumor foram medidos pelo menos duas vezes por semana. O volume do tumor foi calculado como média e er- ro padrão da média para cada grupo de tratamento.
[00494] A porcentagem de inibição do crescimento tumoral (TGI) foi calculada usando os volumes médios de tumor (TV) de acordo com as seguintes fórmulas: % TGI=(TV-Alvofinal–TV-AlvoInicial)/(TV-Controlefinal–TV-ControletInicial), em que TV = volume tumoral médio, final TGI = Dia 11 pós transferên- cia de células T, e inicial = Dia 0 (ou seja, dia da transferência de célu- las T).
[00495] Estes dados demonstram que a edição do gene Peli1 nas células T aumenta a eficácia antitumoral das células T com um TGI de 64,7%, conforme mostrado na Fig. 9A. Além disso, a edição do gene Setd5 resulta em um TGI de 48,2, conforme mostrado na Fig. 9B. EXEMPLO 10: VALIDAÇÃO DE CÉLULAS T ADOTIVAMENTE TRANSFERIDAS EDITADAS NO MODELO DE TUMOR XENOEN- XERTO A375
[00496] Objetivos com pontuações percentuais de 0,6 ou mais nos Exemplos 3-5 foram selecionados para avaliação adicional em um formato de guia único para determinar se a edição de um gene-alvo em células T específicas de tumor conferia um aumento na eficácia antitumoral no modelo de tumor xenoenxerto A375. A avaliação de al- vos exemplificativos é descrita neste documento, no entanto, esses métodos podem ser usados para avaliar qualquer um dos alvos em potencial descritos acima.
[00497] Resumidamente, os camundongos NSG com 6-8 semanas de idade dos laboratórios Jackson foram injetados por via subcutânea com 5 x 106 células A375. Quando os tumores atingiram um volume de aproximadamente 200 mm3, os camundongos foram randomizados em grupos de 8 e injetados por via intravenosa com 18,87 x 106 células T transgênicas TCR específicas para NY-ESO-1 editadas via veia da cauda. O peso corporal e o volume do tumor foram medidos pelo me- nos duas vezes por semana. O volume do tumor foi calculado como média e erro padrão da média para cada grupo de tratamento (Fig. 10). Experiências semelhantes são realizadas para avaliar a eficácia antitumoral de células T editadas por SETD5, editadas por PTPN-2, e editadas por PELI1-e no modelo de xenoenxerto A375. Espera-se que essas experiências mostrem uma eficácia antitumoral aprimorada das células T editadas em comparação com os controles. EXEMPLO 11: VALIDAÇÃO DE CÉLULAS CD19 CAR-T TRANSFE-
RIDAS ADOTIVAMENTE EM EDIÇÃO ÚNICA EM UM MODELO DE XENOENXERTO RAJI
[00498] São realizadas experiências para avaliar a eficácia antitu- moral de geração de células CD19 CAR-T (humanas) editadas por PTPN2, editadas por SETD5, editadas por PELI1, e editadas por CBLB 1a e no modelo de tumor subcutâneo de xenoenxerto derivado de células Raji. As células Raji são uma linhagem celular de linfoma humano que se sabe ser insensível ao tratamento com anticorpos anti- PD1. Resumidamente, camundongos NSG fêmeas com 6-8 semanas de idade dos laboratórios Jackson são injetados de forma subcutânea com 3 x 106 células tumorais Raji. Quando os tumores atingem um vo-
lume de aproximadamente 200 mm3, os camundongos são randomi- zados em grupos de 5 e injetados por via intravenosa com células CD19 CART humanas editadas via veia da cauda. Antes da injeção, as células CAR-T são editadas por eletroporação com complexos gRNA/Cas9 RNP compreendendo (i) um gRNA de controle; (ii) um único gRNA direcionado ao gene SETD5; (iii) um único gRNA direcio- nado ao gene PTPN2; (iv) ou um único gRNA direcionado ao gene PELI1. O peso corporal e o volume do tumor são medidos pelo menos duas vezes por semana. O volume do tumor é calculado como média e erro padrão da média para cada grupo de tratamento. Espera-se que essas experiências demonstrem uma eficácia antitumoral aprimorada de células CAR-T editadas por SETD5, editadas por PELI1 e editadas por PTPN2em comparação com células de controle, conforme indica- do pela inibição aprimorada do crescimento do tumor e diminuição do volume do tumor ao longo do tempo. EXEMPLO 12: TRIAGEM PARA COMBINAÇÕES COM EDIÇÃO
DUPLA
[00499] Uma biblioteca dupla de sgRNA foi construída em uma es- trutura principal retroviral. A biblioteca consistia em dois promotores U6 (um humano e um de camundongo), cada expressão motriz de um único RNA guia (guia + tracr, sgRNA). Os guias foram clonados como conjuntos para fornecer pares aleatórios entre os guias, de modo que todo sgRNA fosse pareado com todos os outros sgRNA. A biblioteca final de dupla guia foi transfectada para células Phoenix-Eco 293T pa- ra gerar retrovírus ecotrópico murino. As células OT1 transgênicas do TCR que expressam Cas9 foram infectadas com o vírus que expressa sgRNA para editar os dois loci direcionados por cada um dos sgRNAs. As células T transgênicas editadas foram então transferidas para ca- mundongos portando > 400 mm3 de aloenxertos de tumores B16-Ova. Após duas semanas, os tumores foram excisados e as células T infil-
trativas de tumor foram purificadas por digestão dos tumores e enri- quecimento para as células CD45 + presentes nos tumores.
O DNA genômico foi extraído das células CD45+ usando um kit de sangue Qiagen QUIAamp DNA e as inserções retrovirais foram recuperadas por PCR usando primers correspem quentes às sequências da estrutu- ra principal retroviral.
O produto de PCR resultante foi então sequenci- ado para identificar os sgRNAs presentes nos tumores duas semanas após a transferência.
A representação dos pares de guia nas popula- ções finais de células isoladas foi comparada com a população inicial de plasmídeos e a população de células T transgênicas infectadas an- tes da injeção no camundongo.
Esperava-se que a frequência de pa- res sgRNA que melhorassem a aptidão das células T e/ou a infiltração de tumor aumentasse ao longo do tempo, enquanto se esperava que as combinações que prejudicassem a aptidão diminuíssem ao longo do tempo.
A Tabela 15 abaixo mostra a alteração da dobra mediana da frequência de sgRNA na população celular final em comparação com a frequência de sgRNA na população celular inicial transferida in vivo.
Tabela 15: frequência de sgRNA na Triagem de Combinação GeneA GeneB Avg(Tmedian.Ifoldch.all) CBLB CBLB 0,17 CBLB CTLA4 0,21 CBLB LAG3 0,08 CBLB Olfr1389 0,03 CBLB Olfr453 0,04 CBLB PTPN22 0,08 CBLB TGFBR1 0,15 CBLB TGFBR2 0,75 CBLB TIGIT 0,31 CBLB ZAP70 0 Havcr2 Havcr2 0,02
GeneA GeneB Avg(Tmedian.Ifoldch.all) Havcr2 LAG3 0,01 Havcr2 Olfr1389 0 Havcr2 Olfr453 0,01 Havcr2 PDCD1 0,02 LAG3 Olfr1389 0 LAG3 Olfr453 0,02 LAG3 PDCD1 0,02 Olfr1389 Olfr1389 0,01 Olfr1389 Olfr453 0 Olfr1389 PDCD1 0,02 Olfr453 Olfr453 0,01 Olfr453 PDCD1 0,01 Olfr453 PTPN22 0,01 PDCD1 CTLA4 0,59 PDCD1 LAG3 0,02 PDCD1 PDCD1 0,02 PDCD1 PTPN22 0,02 PDCD1 TGFBR1 0,02 PDCD1 TGFBR2 0,07 PDCD1 TIGIT 0,02 PDCD1 ZAP70 0 TGFBR1 CTLA4 0,01 TGFBR1 LAG3 0 TGFBR1 TGFBR1 0,06 TGFBR1 TGFBR2 0,07 TGFBR1 TIGIT 0,03 TGFBR1 ZAP70 0 CBLB PTPN2 1,48 Olfr1389 PTPN2 0,03 Olfr453 PTPN2 0,46 PDCD1 PTPN2 0,07 PTPN2 CTLA4 0,03
GeneA GeneB Avg(Tmedian.Ifoldch.all) PTPN2 LAG3 0,09 PTPN2 PTPN2 0,04 PTPN2 PTPN22 0,07 PTPN2 shredder 0 PTPN2 TGFBR1 0,22 PTPN2 TGFBR2 0,23 PTPN2 TIGIT 0,38 PTPN2 ZAP70 0 EXEMPLO 13: VALIDAÇÃO DE CÉLULAS CD19 CAR-T COM EDI-
ÇÃO DUPLA NO MODELO DE XENOENXERTO RAJI
[00500] Os alvos foram avaliados em estudos de combinação para determinar combinações de genes editados que aumentaram a eficá- cia antitumoral de células T em modelos de tumor xenoenxerto. A ava- liação de alvos exemplificativos é descrita neste documento, no entan- to, esses métodos podem ser usados para avaliar qualquer um dos alvos em potencial descritos acima.
[00501] Como um exemplo de um efeito de combinação para a efi- cácia antitumoral da edição, CBLB e BCOR foram editados, indepen- dentemente ou juntos, em células CD19 CAR-T de 1a geração e avali- ados em camundongos usando o modelo de tumor xenoenxerto deri- vado de células subcutâneas Raji. As células Raji são uma linhagem celular de linfoma que se sabe ser insensível ao tratamento com anti- corpos anti-PD1. Camundongos NSG fêmeas com 6-8 semanas de idade dos laboratórios Jackson foram injetados por via subcutânea com 3x106 células tumorais Raji. Quando os tumores atingem um vo- lume de aproximadamente 200 mm3 os camundongos são randomiza- dos em grupos de 5 e injetados por via intravenosa com células CD19 CART humanas editadas via veia da cauda. Antes da injeção, as célu- las transferidas adotivamente foram editadas com um guia de controle ou uma edição de guia para CBLB e/ou BCOR. O peso corporal e o volume do tumor foram medidos pelo menos duas vezes por semana. O volume do tumor foi calculado como média e erro padrão da média para cada grupo de tratamento. Conforme mostrado na Fig. 11, quan- do comparada a um guia de controle, a transferência adotiva de célu- las CD19 CART humanas editadas por BCOR e CBLB, com genes- alvo editados sozinhos ou juntos, conforme indicado, resultou em uma resposta antitumoral no modelo de camundongo subcutâneo de Linfo- ma de Raji Burkitt. A eficácia antitumoral foi maior quando os dois al- vos foram editados em combinação, em comparação com o alvo isola- do ou com um guia de controle. EXEMPLO 14: A DUPLA EDIÇÃO DE BCOR E CBLB EM CAR-TS
LEVA À POTENCIALIZAÇÃO DA ACUMULAÇÃO E PRODUÇÃO DE CITOCINAS NA PRESENÇA DE TUMOR
[00502] Os CAR-Ts CD19 de 1a geração foram gerados a partir de células T CD8 humanas, e um gene de controle negativo, BCOR, CBLB, ou ambos BCOR e CBLB foram editados por eletroporação usando RNAs guia complexados com Cas9 em formato RNP. Os CD19-CAR-Ts foram co-cultivados com células de Linfoma de Raji Burkitt in vitro na proporção de 1:0, 0,3:1, 1:1, 3:1 e 10:1. Após 24 ho- ras, as contagens totais de células CAR-T foram determinadas e os sobrenadantes foram salvos para análises de citocinas. Conforme mostrado na Fig. 12, os CARTs editados por BCOR e BCOR + CBLB demonstraram acumulação 30% maior em comparação aos CARTs editados por controle ou CBLB, demonstrando que a edição do BCOR confere uma capacidade potencializada das células CAR-T de se acumularem na presença de um tumor. Além disso, os CARTs edita- dos por CBLB e CBLB + BCOR produziram 10 vezes ou mais IL-2 (Fig. 13) e IFNγ (Fig. 14) em comparação com os CARTs editados com con- trole, demonstrando que a edição do CBLB resultou em produção po- tencializada de citocinas pelas células CAR-T conhecida por aumentar a aptidão geral das células T e a capacidade funcional. O aumento da produção de IL-2 pelas células T CD8 é surpreendente, pois essas cé- lulas normalmente não produzem IL-2. Esses dados demonstram que, em alguns casos, a produção de células CAR-T com funções efetoras potencializadas requer edição de múltiplos genes. Por exemplo, neste exemplo, a produção de células CAR-T que demonstraram acúmulo aumentado na presença de um tumor e produção potencializada de citocinas IL-2 e IFNγ exigiram edição dos genes BCOR e CBLB.
[00503] Experiências semelhantes são realizadas para avaliar o efeito das células CAR-T com edição dupla por PTPN2/CBLB, células CAR-T com edição dupla por PELI1/CBLB e células CAR-T com edi- ção dupla por SETD5/CBLB na acumulação na presença de tumor e produção de citocinas. EXEMPLO 15: VALIDAÇÃO DE CÉLULAS T TRANSFERIDAS ADO-
TIVAMENTE COM EDIÇÃO DUPLA EM UM MODELO DE TUMOR SINGENEICO DE OT1/B16 OVA DE MURINO
[00504] Os alvos foram avaliados em estudos de combinação para determinar combinações de genes editados que aumentaram a eficá- cia antitumoral de células T em modelos de tumor singeneico. A avali- ação de alvos exemplificativos é descrita neste documento, no entan- to, esses métodos podem ser usados para avaliar qualquer um dos alvos em potencial descritos acima.
[00505] A eficácia antitumoral das células T de edição dupla por Ptpn2/Cblb foi avaliada em camundongos usando o modelo de tumor singeneico subcutâneo B16Ova. Resumidamente, foram injetados subcutaneamente camundongos C57BL/6J fêmeas com 6-8 semanas de idade nos laboratórios Jackson com 0,5 x 106 células tumorais B16- Ova. Quando os tumores em toda a coorte de camundongos atingiram um volume médio de aproximadamente 485 mm3, os camundongos foram randomizados em grupos de 10 e injetados por via intravenosa com células T murinas OT1 CD8+ editadas via veia da cauda. Antes da injeção, essas células foram editadas por eletroporação com com- plexos gRNA/Cas9 RNP compreendendo (i) um gRNA de controle; (ii) um único gRNA direcionado ao gene PD-1; (iii) um único gRNA direci- onado ao gene Ptpn2; um único gRNA direcionado ao gene Cblb; ou (iv) 2 gRNAs direcionados aos genes Ptpn2 e Cblb. A eficiência de edição do complexo gRNA/Cas9 direcionado aos genes Ptpn2 eCblb foi determinada em 67% e 80%, respectivamente, avaliada pelo méto- do NGS. O peso corporal e o volume do tumor foram medidos pelo menos duas vezes por semana. O volume do tumor foi calculado como média e erro padrão da média para cada grupo de tratamento. A por- centagem de inibição do crescimento tumoral (TGI) foi calculada usan- do o volume médio do tumor de acordo com a seguinte fórmula: % TGI=(TV-Alvofinal – TV-AlvoInicial)/(TV-Controlefinal – TV-ControletInicial) * 100, em que TV = volume tumoral médio, final = Dia 7 após transferência de células T, e inicial = Dia 0 (ou seja, dia da transferência de células T).
[00506] Conforme mostrado na Fig. 15, a transferência de células T com edição dupla por Ptpn2/Cblb em um TGI potencializado em com- paração com a transferência de células T com edição única por PD1 ou de células T com edição única por Ptpn2 (Ptpn2/Cblb TGI = 98% em comparação a 30% e 1% para edições únicas por PD1 e Ptpn2, respectivamente).
[00507] Experiências semelhantes são realizadas para avaliar a efi- cácia antitumoral de células CAR-T com edição dupla por PELI1/CBLB e células CAR-T com edição dupla por SETD5/CBLB no modelo de tumor OT1/B16 Ova Singeneico. EXEMPLO 16: VALIDAÇÃO DE CÉLULAS T TRANSFERIDAS ADO-
TIVAMENTE COM EDIÇÃO DUPLA EM UM MODELO DE TUMOR
PMEL/MC38-GP100 DE MURINO
[00508] A eficácia antitumoral das células T de edição dupla por Ptpn2/Cblb, Peli1/Cblb, e Setd5/Cblb é avaliada em camundongos usando o modelo de tumor singeneico subcutâneo MC38gp100. Re- sumidamente, camundongos C57BL/6J fêmeas com 6-8 semanas de idade dos laboratórios de Jackson são injetados com 1 x 106 células de tumor MC38gp100. Quando os tumores atingiram um volume de aproximadamente 100 mm3 os camundongos foram randomizados em grupos de 10 e injetados por via intravenosa com células T PMEL CD8+ de camundongo editadas via veia da cauda. Antes da injeção, as células T são editadas por eletroporação com complexos de gRNA/Cas9 RNP compreendendo (i) um gRNA de controle; (ii) um único gRNA direcionado ao gene Ptpn2, o gene Peli1, o gene Setd5, ou o gene Cblb; (iv) 2 gRNAs direcionados aos Ptpn2 e Cblb, aos Peli1 e Cblb, ou aos Setd5 e Cblb. O peso corporal e o volume do tumor fo- ram medidos pelo menos duas vezes por semana. O volume do tumor foi calculado como média e erro padrão da média para cada grupo de tratamento. A porcentagem de inibição do crescimento tumoral (TGI) foi calculada usando o volume médio do tumor de acordo com a se- guinte fórmula: (TV-Alvofinal – TV-AlvoInicial)/(TV-Controlefinal – TV-ControletInicial), em que TV = volume tumoral médio, final = Dia 21 após transferência de células T, e inicial = Dia 0 (ou seja, dia da transferência de células T)
[00509] Espera-se que essas experiências mostrem TGI potenciali- zado após a transferência de células T com edição dupla em compa- ração com a transferência de células T com edição única. EXEMPLO 17: VALIDAÇÃO DE CÉLULAS T TRANSFERIDAS ADO-
TIVAMENTE COM EDIÇÃO DUPLA EM UM MODELO DE TUMOR SINGENEICO DE B16-F10 DE MURINO
[00510] A eficácia antitumoral das células T com edição dupla de Ptpn2/Cblb foi avaliada em camundongos usando o modelo de tumor singeneico metastático agressivo B16-F10 com doença manifestando- se como metástase pulmonar. Resumidamente, camundongos C57BL/6J fêmeas com 6-8 semanas de idade dos laboratórios Jack- son foram injetados por via intravenosa com 0,5 x 106 células tumorais B16-F10. Os camundongos foram pesados e atribuídos aos grupos de tratamento usando um procedimento de randomização antes da inocu- lação. No Dia 3 após a inoculação do tumor, os camundongos foram injetados por via intravenosa com células T PMEL CD8+ murinas edi- tadas via veia da cauda. Antes da injeção, essas células foram edita- das por eletroporação com complexos de gRNA/Cas9 RNP compreen- dendo (i) um gRNA de controle; (ii) um único gRNA direcionado ao ge- ne Ptpn2; (iii) um único gRNA direcionado ao gene Cblb; ou (iv) 2 gRNAs direcionados a cada um dos genes Ptpn2 e Cblb. A eficiência de edição do complexo gRNA/Cas9 direcionado aos genes Ptpn2 e Cblb foi determinada em 50% e 67%, respectivamente, avaliada pelo método NGS. O peso corporal foi monitorado pelo menos duas vezes por semana. No dia 15 após a inoculação do tumor (dia 12 após a transferência do PMEL editado), os pulmões dos camundongos foram perfundidos e fixados com para-formaldeído a 10%. Após a fixação durante a noite, os pulmões foram transferidos para EtOH a 70% para posterior preservação. A eficácia do tumor foi avaliada através da ava- liação visual da carga tumoral B16-F10, que pode ser vista como colô- nias negras de células cancerígenas nos pulmões.
[00511] Um grande número de colônias metastáticas foi observado em todos os pulmões do grupo não tratado ou de camundongos trata- dos com células T PMEL CD8+ editadas pelo controle, significando progressão significativa da doença. A eficácia parcial foi observada em camundongos tratados com células Ptpn2 editadas uma vez e as célu-
las Cblb editadas uma vez demonstraram eficácia mínima. A edição dupla de Ptpn2 e Cblb resultou em eficácia antitumoral semelhante em comparação à edição única dos genes Ptpn2 e Cblb. Os resultados desta experiência estão resumidos abaixo na Tabela 16. Tabela 16: Eficácia das células T Ptpn2 e Cblb editadas uma ou duas vezes no modelo de tumor B16-F10 Gene-alvo Resistente a PD-1 - B16F10 (pulmão) Ptpn2 + Cblb + Ptpn2/Cblb ++ Controle - (-) = nenhuma eficácia observada; (+) = respostas modestas na maio- ria dos animais; (++) = respostas fortes na maioria dos animais; (+++) = respostas fortes, incluindo algumas respostas completas, em todos os animais tratados
[00512] Experiências semelhantes são realizadas para avaliar a efi- cácia antitumoral de células T Peli1/Cblb e células T Setd5/Cblb edita- das duas vezes no modelo de tumor B16-F10 Singeneico. EXEMPLO 18: EFICÁCIA DAS CÉLULAS T PD1/LAG3 TRANSGÊ-
NICAS EDITADAS DUAS VEZES EM UM MODELO DE TUMOR DE MURINO B16-OVA
[00513] A eficácia antitumoral das células T PD-1/Lag3 editadas duas vezes foi avaliada em camundongos usando o modelo de tumor singeneico subcutâneo B16Ova. Camundongos C57BL/6J fêmeas com 6-8 semanas de idade nos laboratórios Jackson foram injetados sub- cutaneamente com 0,5 x 106 células tumorais B16-Ova. Quando os tumores em toda a coorte de camundongos atingiram um volume mé- dio de aproximadamente 485 mm3, os camundongos foram randomi- zados em grupos de 10 e injetados por via intravenosa com células T OT1 CD8+ de camundongo editadas via veia da cauda. Antes da inje- ção, essas células foram editadas por eletroporação com complexos de gRNA/Cas9 RNP compreendendo (1) um gRNA de controle não direcionado; (2) um único gRNA direcionado ao gene PD1; (3) um úni- co gRNA direcionado ao gene Lag3; (4) 2 gRNAs, um direcionado a cada um dos genes PD1 e Lag3. O peso corporal e o volume do tumor foram medidos pelo menos duas vezes por semana. O volume do tu- mor foi calculado como média e erro padrão da média para cada grupo de tratamento. A porcentagem de inibição do crescimento tumoral (TGI) foi calculada usando a seguinte fórmula: % TGI = (PD1/Lag3 TVfinal) – PD1/Lag3 TVinicial)/(Controle TVfinal – Con- trole TVinicial), em que TV = volume médio do tumor, final = Dia 10 e inicial = dia da transferência de células T OT1 CD8+ de camundongo editadas.
[00514] Os dados na Fig. 16 mostram que a transferência adotiva de células T PD1 editadas uma vez resultou em um TGI de 70% e a transferência adotiva de células T Lag3 editadas uma vez resultou em um TGI de 36%. Surpreendentemente, as edições combinadas de PD1 e Lag3 não resultaram em maior inibição do crescimento tumoral e demonstraram um TGI de 38%. EXEMPLO 19: VALIDAÇÃO DE ALVOS PARA TRANSFERÊNCIA
DE CÉLULAS T ADOTIVA DE LINFÓCITOS INFILTRANTES DE TUMOR
[00515] A eficácia antitumoral de linfócitos infiltrantes de tumor (TILs) de células T Setd5, Peli1, Cblb, e Ptpn2 editadas uma e duas vezes é avaliada em camundongos usando o modelo de tumor singe- neico subcutâneo B16Ova. Duas coortes de camundongos são usadas nesta experiência: uma coorte de doadores de camundongos CD45.1 Pep Boy (B6.SJL-Ptprca Pepcb/BoyJ) e uma coorte receptora de ca- mundongos CD45.2 C57BL/6J (laboratórios Jackson), cada um com- posto por camundongos fêmeas com 6-8 semanas de idade.
[00516] Para gerar TILs, os doadores CD45.1 Pep Boy (B6.SJL-
Ptprca Pepcb/BoyJ) são injetados por via subcutânea com 0,5 x 106 células B16-Ova. No dia 14, após a inoculação das células tumorais, os tumores são colhidos para gerar linfócitos TILs (TILs) infiltrantes de tumores CD45.1 editados para infundir na segunda coorte de camun- dongos. Os tumores B16-OVA (200-600mm3) são colhidos, cortados em cubos e reduzidos a uma única suspensão de células usando o sistema GentleMACS e o Kit de dissociação de tumor de camundongo (Miltenyi Biotech Catalog nº 130-096-730), de acordo com as reco- mendações do fabricante. A suspensão do tumor é filtrada sobre filtros de células de 70 μm e os TILs são enriquecidos usando Microgrânulos CD4/CD8 (TIL) (Miltenyi Biotech Catalog nº 130-116-480). Os TILs iso- lados são cultivados em placas de 6 poços a 1,5 x 106 células/mL em meio mTIL completo (RPMI + de FBS a 10% inativado pelo calor, HEPES 20 mM, 100 U/mL de penicilina, 100 μg/mL de estreptomicina, 50 μM de beta-mercaptoetanol, 1X de glutamax) suplementado com 3000 U/mL de IL-2 humana recombinante (Peprotech Catalog nº 200- 02). No dia 3, as células são colhidas, lavadas e ressuspensas no tampão de nucleofecção T e eletroporadas com RNPs de gRNA/Cas9 usando o Sistema de Transfecção de Néon, conforme descrito no Exemplo 1. Após a eletroporação, os TILs são cultivados em placas de 6 poços a 1,5 x 106 células/mL em meio mTIL completo suplementado com 3000 U/mL de IL-2 humana recombinante. Nos dias 5 e 7, as cé- lulas são ressuspensas em meio mTIL completo fresco suplementado com 3000 U/mL de IL-2 humana recombinante e plaqueadas em fras- cos a uma densidade de 1 x 106 células/mL. No dia 8, as células são colhidas contadas e ressuspensas em PBS para injeção in vivo.
[00517] Essas células TIL são editadas por eletroporação de com- plexos de gRNA/Cas9 compreendendo (1) um gRNA de controle não direcionado; (2) um único gRNA direcionado ao gene Cblb; (3) um úni- co gRNA direcionado ao gene Ptpn2; (4) um único gRNA direcionado a
Peli1; (5) um único gRNA direcionado a Setd5 (6) 2 gRNAs, um direci- onado a cada um dos genes Cblb e Ptpn2; (7) 2 gRNAs, um direciona- do a cada um dos genes Cblb e Setd5; ou (8) 2 gRNAs, um direciona- do a cada um dos genes Cblb e Peli1.
[00518] Os camungondos receptores CD45.2 C57BL/6J são injec- tados por via subcutânea com 0,5 x 106 células de tumor B16-Ova. Quando os tumores atingiram um volume de aproximadamente 100 mm3, os camundongos são randomizados em grupos de 10 e injetados por via intravenosa com TILs CD45.1 editadas via veia da cauda. Op- cionalmente, os camundongos podem ser injetados por via intraperito- neal com ciclofosfamida (200 mg/kg) para induzir a depleção linfocitá- ria antes da transferência de células T e os TILs editados podem ser administrados por via intravenosa em combinação com o tratamento intraperitoneal com IL-2 humana recombinante (720.000 UI/kg) duas vezes ao dia por no máximo 4 dias.
[00519] O peso corporal e o volume do tumor são medidos pelo menos duas vezes por semana. O volume tumoral é calculado como média e erro padrão da média para cada grupo de tratamento e a % de TGI é calculada de acordo com a seguinte fórmula: % TGI = (TV-alvofinal) –TV-alvoinicial)/(TV-Controlefinal – TV-Controleinicial), em que TV = volume médio do tumor, final = dia 17 e inicial = dia da transferência de TIL editada.
[00520] Espera-se que esses resultados mostrem que, comparada a um guia de controle, a transferência adotiva de TILs de camundongo com edição única ou edição dupla resulta em uma resposta antitumo- ral aprimorada no modelo de rato subcutâneo B16Ova em comparação com o tratamento com células editadas por controle. EXEMPLO 20: VALIDAÇÃO DE ALVOS PARA TERAPIA DE CÉLU-
LAS T MANIPULADAS
[00521] Serão realizadas experiências para validar os efeitos da edição de PELI1, SETD5, PTPN22, PTPN1, PTPN2, SH2B3, SH2D1A, PIK3CD, BCL2L11, FL11, CALM2, DHODH, UMPS, RBM39, SEMA7A, CHIC2, PCBP1, PBRM1, WDR6, E2F8, SERPINA3, GNAS e EGR2 na eficácia antitumoral de células T CAR e células T projetadas para ex- pressar um TCR artificial. As células T manipuladas são editadas co- mo descrito no Exemplo 1 para reduzir a expressão dos genes-alvo. Estas células T editadas são então avaliadas em modelos de xenoen- xerto murino subcutâneo usando o tipo de célula indicado. Por exem- plo, células T projetadas com um CAR específico para CD19 ou TCR artificial podem ser avaliadas como descrito acima no Exemplo 8 em um modelo de célula Raji ou qualquer uma das outras linhas celulares mostradas na Tabela 17, células T projetadas com um CAR específico para NYESO ou TCR artificial pode ser avaliado em um modelo de cé- lula SKMEL5, WM2664 ou IGR1, etc. Tabela 17: Especificidade do receptor projetado e linhagens celu- lares alvo Especificidade do Linhagem Celular Alvo Receptor CD19 Raji, Daudi, Jeko, NALM-6, NALM-16, RAMOS, JeKo1 BCMA Linhagens celulares múltiplas de mieloma NCI- H929, U266-B1 e RPMI-8226 NYESO A375 MART1 SKMEL5, WM2664, IGR1 HER2+ BT474
[00522] Resumidamente, camundongos NSG fêmeas com 6-8 se- manas de idade dos laboratórios Jackson são injetados de forma sub- cutânea com 3 x 106 células tumorais Raji. Quando os tumores atingi- ram um volume de aproximadamente 200 mm3, os camundongos são randomizados em grupos de 5 e injetados por via intravenosa com as células T modificadas por via venosa da cauda. Antes da injeção, as células transferidas adotivamente são editadas com um guia de con-
trole ou uma edição de guia para PELI1, SETD5, PTPN22, PTPN1, PTPN2, SH2B3, SH2D1A, BCL2L11, FL11, CALM2, DHODH, UMPS, RBM39, SEMA7A, CHIC2, PCBP1, PBRM1, WDR6, E2F8, SERPINA3, GNAS e/ou EGR2. O peso corporal e o volume do tumor são medidos pelo menos duas vezes por semana. O volume do tumor é calculado como média e erro padrão da média para cada grupo de tratamento. Espera-se que os resultados dessas experiências mostrem uma eficá- cia antitumoral aumentada de PELI1, SETD5, PTPN22, PTPN1, PTPN2, SH2B3, SH2D1A, BCL2L11, FL11, CALM2, DHODH, UMPS, RBM39, SEMA7A, CHIC2, PCBP1, PBRM1, WDR6, E2F8, SERPINA3, GNAS, e/ou células T manipuladas editadas por EGR2, ou em compa- ração com um guia de controle, medido pela sobrevivência e/ou redu- ção no tamanho do tumor. EXEMPLO 21: VALIDAÇÃO DA EDIÇÃO DE ALVO NA FUNÇÃO T
MANIPULADA PELO RECEPTOR
[00523] Serão realizadas experiências para validar os efeitos da edição de PELI1, SETD5, PTPN22, PTPN1, PTPN2, SH2B3, SH2D1A, EGR2, BCL2L11, FL11, CALM2, DHODH, UMPS, RBM39, SEMA7A, CHIC2, PCBP1, PBRM1, WDR6, E2F8, SERPINA3, e/ou GNAS, em produção de citocinas de células T projetadas. Resumidamente, as células T manipuladas descritas na Tabela 17 acima são geradas a partir de células T CD8 humanas e um ou mais de PELI1, SETD5, PTPN22, PTPN1, PTPN2, SH2B3, SH2D1A, EGR2, BCL2L11, FL11, CALM2, DHODH, UMPS, RBM39, SEMA7A, CHIC2, PCBP1, PBRM1, WDR6, E2F8, SERPINA3 e/ou GNAS são editadas por eletroporação usando RNAs guia complexos para Cas9 em um formato RNP. Os CAR-Ts são cocultivados com a linhagem celular correspem quente indicada na Tabela 18 in vitro numa razão de 1:0, 0,3:1, 1:1, 3:1 e 10:1. Após 24 horas, são determinadas as contagens totais de células T manipuladas e os sobrenadantes são salvos para análises de citoci-
nas. Espera-se que os resultados dessas experiências mostrem maior acúmulo e níveis aumentados de produção de citocinas a partir de cé- lulas T CAR editadas em comparação com células editadas de contro- le. EXEMPLO 22: FABRICAÇÃO DE LINFÓCITOS INFILTRANTES DE
TUMOR COM EDIÇÃO DUPLA
[00524] Os TILs editados são fabricados seguindo protocolos esta- belecidos usados anteriormente em ensaios clínicos aprovados pela FDA para o isolamento e expansão de TILs. Após a remoção do tecido tumoral, o tumor é fragmentado em pedaços de 2 mm3 e homogenei- zado mecanicamente/enzimaticamente e cultivado em 6.000 UI/mL de IL-2 humana recombinante por até 6 semanas ou até que o número de células atinja ou exceda 1 x 108; isso é definido como a fase de expan- são pré-rápida (pré-REP) da fabricação de TIL. Após a conclusão do estágio pré-REP, os TILs são eletroporados com os complexos RNP de gRNA/Cas9 direcionados a genes PELI1, SETD5, PTPN22, PTPN1, PTPN2, SH2B3, SH2D1A, EGR2, BCL2L11, FL11, CALM2, DHODH, UMPS, RBM39, SEMA7A, CHIC2, PCBP1, PBRM1, WDR6, E2F8, SERPINA3, ou GNAS sob condições de cGMP. As células tam- bém podem ser eletroporadas antes ou durante o processo pré-REP. Após a eletroporação, 50 x 106 células são transferidas para um frasco de cultura G-Rex™ de 1 L com uma razão de 1:100 de células alimen- tadoras irradiadas:TIL por aproximadamente 2 semanas. Essa parte da fabricação é definida como a fase de expansão rápida (REP). Após a fase REP, os TIL são colhidos, lavados e suspensos em uma solu- ção para infusão imediata no paciente. EXEMPLO 23: ESTUDOS DE FASE I DE CÉLULAS EFETORAS
IMUNES EDITADAS
[00525] Serão realizados estudos de Fase 1, abertos, de centro único, nos quais pacientes com melanoma metastático recidivados ou refratários à terapia anti-PD-1 serão tratados com as células modifica- das aqui descritas. Os pacientes receberão uma única infusão de célu- las e permanecerão em estudo até experimentar uma progressiva do- ença ou intolerância à terapia. A DP radiológica será determinada por um radiologista local antes da interrupção da participação no estudo.
[00526] Objetivos do estudo: Os objetivos principais do estudo são (1) determinar a dose máxima tolerada (MTD), as toxicidades limitan- tes da dose (DLTs) e a dose de composições celulares (e os medica- mentos concomitantes associados necessários) recomendadas para estudos futuros para pacientes com tumores sólidos avançados; e (2) observar os pacientes quanto a qualquer evidência de atividade anti- câncer das células editadas transferidas. Os objetivos secundários do estudo são: (1) determinar a farmacocinética das composições celula- res; (2) avaliar a atividade no alvo das composições celulares, confor- me determinado por alterações nos biomarcadores farmacodinâmicos em amostras biológicas; e (3) avaliar a proliferação das células modifi- cadas, conforme determinado por persistência de TIL manipulada após o tratamento. Os objetivos exploratórios do estudo são (1) correlacio- nar qualquer mutação genética subjacente à resposta clínica.
[00527] Critérios de avaliação do estudo: Os principais objetivos deste estudo são: Incidência e gravidade dos eventos adversos (EAs), classificados de acordo com os National Cancer Institute Common Terminology Criteria for Adverse Events (Critérios de Terminologia Comum do Instituto Nacional do Câncer para Eventos Adversos) (NCI CTCAE), versão 4.3; Anomalias laboratoriais clínicas; Alterações nos parâmetros do eletrocardiograma de 12 derivações (ECG); Taxa de resposta objetiva (ORR), de acordo com o RECIST v1.1; Resposta do SNC (ORR e sobrevida livre de progressão [PFS], de acordo com o RECIST v1.1, em pacientes com metástases cerebrais ativas). Os cri- térios de avaliação secundários deste estudo são: sintomas relatados pelo paciente e pontuações de qualidade de vida relacionada à saúde (QVRS); Tempo para resposta; Duração da resposta; Taxa de controle de doenças (a porcentagem de pacientes com melhor resposta de resposta completa [CR], PR ou SD), por RECIST v1.1; Tempo de tra- tamento; Imunofenotipagem; Persistência, tráfico e função de TIL ge- neticamente modificadas; Biomarcador farmacodinâmico em amostras pré e pós-dose. Os critérios de avaliação exploratórios deste estudo são: Avaliação de mutações associadas ao câncer e/ou alterações ge- néticas utilizando o FoundationOne® Cancer Gene Panel, ou alternati- va comparável, na biópsia tumoral pré-dose e/ou sangue periférico.
[00528] Regime de tratamento: Um resumo do regime de tratamen- to é o seguinte: (a) Dia -7 e -6: ciclofosfamida 60 mg/kg, iv (b) Dias -5 a -1: fludarabina 25 mg/m2, iv (c) Dia 1: Infusão de células (d) Dia 1-Dia 15: IL-2 (125.000 UI/kg/dia) até um máximo de 14 administrações
[00529] A primeira dose de células administradas não excederá uma dose total de 1 x 109 células. Se o paciente apresentar toxicidade limitante da dose (DLT), dois pacientes adicionais serão tratados com esse nível de dose. Se o primeiro paciente concluir o período de moni- toramento DLT (21 dias) sem experimentar um DLT, os pacientes sub- sequentes serão tratados com doses que não excederão 1 x 1011 TILs.
[00530] Tratamento concomitante: Paliação e cuidados de suporte são permitidos durante o estudo para o gerenciamento de sintomas e condições médicas subjacentes que podem se desenvolver durante o estudo.
[00531] Avaliação da eficácia: A resposta do tumor será determina- da com base no RECIST v1.1 pelo radiologista e/ou investigador local. A avaliação do tumor será realizada a cada 6 semanas até a progres-
são da doença e continuará para os pacientes que tenham desconti- nuado devido a outras razões que não a progressão da doença, até a progressão da doença ou ao início de outra terapia anticâncer. A so- brevivência também será seguida por até 3 anos após o último pacien- te inscrito no estudo.
[00532] Avaliação de segurança: As avaliações de segurança inclui- rão exames físicos e laboratoriais, sinais vitais e ECGs. Os eventos adversos serão classificados de acordo com o NCI CTCAE v4.03. As taxas de incidência de eventos adversos, bem como a frequência de ocorrência de toxicidade geral, categorizadas por graus de toxicidade (gravidade), serão descritas para cada coorte do estudo. Também se- rão geradas listagens dos resultados dos testes de laboratório e serão apresentadas estatísticas descritivas que resumem as alterações nos testes de laboratório ao longo do tempo.
[00533] Avaliações genéticas moleculares: O status de mutação dos genes envolvidos na biologia do tumor será determinado através da análise molecular de amostras de tecido e plasma do tumor. Os re- sultados desses testes serão fornecidos ao investigador e ao patroci- nador imediatamente após a análise, de acordo com o procedimento de teste. Os métodos de análise molecular incluem, mas não estão limitados a, sequenciamento direto e/ou reação em cadeia da polime- rase digital (PCR).
[00534] Sintomas relatados pelo paciente e avaliação da qualidade de vida: Os sintomas relatados pelo paciente e a QVRS serão coleta- dos através da administração do Questionário de Qualidade de Vida (QLQ)-C30 (v.3.0) da European Organisation for Research and Trea- tment of Cancer (Organização Europeia para Pesquisa e Tratamento do Câncer) (EORTC), que foi estudado extensivamente em estudos clínicos globais. O EORTC QLQ-C30 será pontuado para 5 escalas funcionais (funcionamento físico, de função, cognitivo, emocional e so-
cial); 3 escalas de sintomas (fadiga, dor e náusea/vômito); e uma es- cala global de status de saúde/QV. Seis escalas de item único também estão incluídas (dispneia, insônia, perda de apetite, constipação, diar- reia e dificuldades financeiras).
[00535] Avaliações do estudo: Os parâmetros de avaliação para esses estudos incluem imagens radiológicas do tumor antes da admi- nistração da dose e no dia 1 de cada ciclo de número ímpar posterior- mente, coleta de amostras de sangue para análise de farmacocinética (dia 1, 2, 3, semanal x 4, mensal x 6) e análise farmacodinâmica e análise de painel de citocinas (dia 1, 2, 3, semanal x 4, mensal x 6). EXEMPLO 24: DESENVOLVIMENTO DE ENSAIO PARA A AVALIA- ÇÃO DE CÉLULAS T EDITADAS POR PTPN2
[00536] São desenvolvidos ensaios que quantificam a farmacologia dependente de PTPN2. Estes ensaios também se destinam a ser utili- zados para avaliar a farmacologia dependente do alvo em TILs sim- ples e/ou duplamente editados. A atividade de sgRNAs direcionados a PTPN2 em TILs é avaliada nesses ensaios.
[00537] Além do papel negativo do PTPN2 na sinalização do recep- tor de células T (TCR), o PTPN2 é um de regulação negativo da sinali- zação JAK/STAT. Portanto, a farmacologia dependente de PTPN2pode ser medida por aumentos na sinalização JAK/STAT. O PTPN2 também atua como um de regulação negativo da sinalização de citocinas, incluindo IL-2 e IFNγ, desfosforilando diretamente as pro- teínas STAT, como pSTAT1 e pSTAT3. Portanto, os níveis de pSTAT1 e pSTAT3 e a ativação das vias de sinalização a jusante podem servir como um ensaio para medir a farmacologia dependente de PTPN2em TILs. De fato, o knockdown genético de PTPN2 mediado por Cas9 le- va ao aumento dos níveis de pSTAT1 nas células T Jurkat em respos- ta à estimulação por IFNγ (Fig. 17). O PTPN2 também é um de regula- ção negativo da sinalização de TCR. LCK e FYN transmitem sinaliza-
ção positiva a jusante de TCR e são alvos diretos da atividade da fos- fatase PTPN2 após a ativação do TCR. Portanto, o impacto da inativa- ção genética de PTPN2 na sinalização proximal do receptor de células T pode ser avaliado através da quantificação de pLCK e pFYN após estimulação com TCR.
[00538] Em conclusão, a avaliação direta da farmacologia de PTPN2 em células com edição dupla pode ser realizada usando 1) es- timulação de citocinas e ensaios de pSTAT e 2) ensaios de ativação de TCR e sinalização a jusante. Para determinar o impacto da inativa- ção genética de PTPN2 na função celular in vitro, vários parâmetros podem ser avaliados que se correlacionam com a função das células T. Isso inclui a produção de citocinas (por exemplo, IL-6 e IL-12), fenó- tipos iniciais da superfície celular e fenótipos ativados da superfície celular, estado de diferenciação das células T e capacidade de matar tumores. EXEMPLO 25: TESTES DE TELA E VALIDAÇÃO DE LADO A LADO DO PTPN2
[00539] Uma tela de mosaico CRISPR-Cas9 foi realizada para de- terminar as localizações alvo do inibidor candidato dentro de um local alvo abrangendo o gene PTPN2. As células T CD8+ humanas primá- rias foram isoladas como descrito no Exemplo 2 e transduzidas com uma biblioteca lentiviral que expressa sgRNAs projetados para atingir posições genômicas em todo o comprimento do gene PTPN2. Dois dias após a transdução com a biblioteca lentiviral, as células T CD8+ transduzidas foram eletroporadas com mRNA de Cas9 e cultivadas por mais 10 dias. Após 10 dias de cultura subsequente à eletroporação com o mRNA de Cas9, a pesquisa clínica (triagem) foi dividida em dois grupos: uma leitura de proliferação e uma leitura de phosphoSTAT5. Foram realizados ensaios adicionais para validar os gRNAs identifica- dos na triagem "tiling". Foram analisados 104 gRNAs direcionados a
PTPN2 distintos, de acordo com os seguintes parâmetros. Triagem "tiling"
[00540] Leitura da proliferação: As células do primeiro grupo foram colhidas no dia 10 após a eletroporação do mRNA de Cas9. O DNA foi extraído e os amplicons que abrangem os locais de reconhecimento dos vários sgRNAs da biblioteca foram amplificados por PCR e se- quenciados por sequenciamento de próxima geração (NGS). O enri- quecimento ou esgotamento de cada um dos sgRNAs é mostrado na Fig. 18 e é representado como a razão logarítmica das contagens fi- nais divididas pelas contagens de referência.
[00541] Leitura de PhosphoSTAT5: As células foram então colhi- das, fixadas, permeabilizadas e coradas para o resíduo de fosfato de fosfatoSTAT5 intracelular Y694. A triagem de células ativadas por fluo- rescência (FACS) foi usada para isolar as populações de células alta (20% superior) e baixa (50% inferior) de fosfoSTAT5. O DNA foi extra- ído das duas populações e os amplicons que abrangem os locais de reconhecimento dos vários sgRNAs da biblioteca foram amplificados por PCR e sequenciados por NGS. O enriquecimento ou depleção de cada sgRNAs é mostrado na Fig. 19 e é representado como a razão logarítmica das contagens na alta população de pSTAT5 dividida pelas contagens na população total de células.
[00542] Resultados: Essa triagem revelou que a maioria dos sgR- NAs direcionados a PTPN2 não alterou a capacidade proliferativa das células T conforme perfilado nessa triagem. Os sgRNAs individuais causaram uma depleção de células T, que foi interpretada como uma provável consequência do corte fora do alvo. Esses guias foram, por- tanto, excluídos da nossa lista. Além disso, a maioria dos guias PTPN2 causou um aumento nos níveis celulares de pSTAT5. Ensaios adicionais para validação de guia
[00543] Ensaios adicionais foram desenvolvidos para caracterizar ainda mais a eficácia e a atividade alvo dos gRNAs identificados na triagem "tiling" descrita acima. As células foram isoladas e eletropora- das com Cas9: RNPs de gRNA contendo gRNAs específicos de PTPN2 identificados em triagens "tiling". As células foram cultivadas por aproximadamente 10 dias, momento em que foram realizados os seguintes ensaios.
[00544] Ensaio de sensibilidade ao IFN do melanoma: Foi desen- volvido um ensaio de sensibilidade ao interferon do melanoma (IFN) para comparar a capacidade de guias PTPN2 individuais em inibir a função de PTPN2. As células de melanoma são sensíveis a IFNγ e essa sensibilidade é aprimorada quando a função PTPN2 está ativa. As células de melanoma A375 foram eletroporadas com Cas9: RNPs de gRNA contendo um gRNA de controle negativo ou os gRNAs de PTPN2. Após a eletroporação, as células foram cultivadas por 4-8 dias antes da adição de 100 ng/mL de IFNγ. Seis dias após a adição de IFNγ, os números de células foram avaliados usando o Cell Titer Glow. O impacto dos gRNAs direcionados a PTPN2na viabilidade foi quanti- ficado em relação ao gRNA de controle negativo.
[00545] Ensaio de Edição de DNA: Foi desenvolvido um ensaio de edição de DNA para comparar a capacidade de guias individuais de direcionar a edição de seus respectivos alvos no nível do DNA. Após a eletroporação com RNPs de Cas9:gRNA, as células foram cultivadas por aproximadamente 10 dias, momento em que os péletes foram co- lhidos e o DNA foi extraído. Amplificadores que abrangem os loci ge- nômicos alvo para os vários sgRNAs foram amplificados por PCR usando conjuntos de primer específicos para guia e sequenciados por NGS. As leituras de sequenciamento foram alinhadas ao local de corte previsto, e a porcentagem de leituras que exibem uma sequência de DNA editada foi determinada. Os resultados foram avaliados com base em dois critérios: 1) a porcentagem geral de edição fora do alvo e 2) a identidade dos genes editados fora do alvo. Guias ótimos foram identi- ficados com o menor nível percentual de edição fora do alvo e/ou perfil genético mais benigno fora do alvo. Por exemplo, a edição de genes em regiões intragênicas foi vista como um efeito benigno, enquanto a edição em oncogenes ou supressores de tumores conhecidos foi vista como um perfil fora do alvo indesejável
[00546] Ensaio de Western Blot: Um ensaio de Western Blot foi usado para comparar a capacidade de guias individuais para reduzir a expressão de proteínas de seus respectivos alvos. P Após eletropora- ção com RNPs de Cas9:gRNA, as células foram cultivadas por apro- ximadamente 10 dias, os péletes de células foram então colhidos e lisados em tampão RIPA com inibidores de protease e fosfatase. A proteína extraída foi quantificada pelo teste de Bradford e 1 μg foi car- regado em um instrumento Western Blotting automatizado (Wes Sepa- ration Module da Protein Simple) usando o protocolo-padrão da má- quina 12-230 kD Wes Separation Module. Empregaram-se anticorpos primários específicos comercialmente disponíveis, seguidos de incu- bação com anticorpos secundários conjugados com HRP. O sinal f de- tectado por guia de destino foi normalizado para o respectivo sinal vis- to na amostra do guia de controle negativo.
[00547] Resultados de validação: 32 gRNAs direcionados a PTPN2(SEQ ID NOs: 1112-1148) foram identificados como guias óti- mos com base na atividade de edição de DNA, crescimento de proteí- nas, aumento de pSTAT5 e sensibilidade ao IFN-γ nos ensaios de sensibilidade ao melanoma IFN descritos acima. Experiências seme- lhantes foram realizadas para BCOR e TNFAIP3, com 57 gRNAs de BCOR (SEQ ID NOs: 708-764) e 39 gRNAs de TNFAIP3 (SEQ ID NOs: 348-386) identificados como potenciais guias ideias.
Tabela 5A: Coordenadas do genoma humano Alvo Coordenadas Alvo Coordenadas Alvo Coordenadas IKZF1 chr7:50387344 TNFAIP3 chr6:137879270- HAVCR2 chr5:157106863- -50387363 137879289 157106882 IKZF1 chr7:50400471 TNFAIP3 chr6:137878846- HAVCR2 chr5:157088943- -50400490 137878865 157088962 IKZF1 chr7:50327652 TNFAIP3 chr6:137876140- HAVCR2 chr5:157106706- -50327671 137876159 157106725 IKZF1 chr7:50400507 TNFAIP3 chr6:137878571- HAVCR2 chr5:157106886- -50400526 137878590 157106905 IKZF1 chr7:50376576 TNFAIP3 chr6:137878573- HAVCR2 chr5:157106767- -50376595 137878592 157106786 IKZF1 chr7:50400314 TNFAIP3 chr6:137878653- HAVCR2 chr5:157106825- -50400333 137878672 157106844 IKZF1 chr7:50327681 TNFAIP3 chr6:137878827- HAVCR2 chr5:157106718- -50327700 137878846 157106737 IKZF1 chr7:50391851 TNFAIP3 chr6:137878726- HAVCR2 chr5:157104727- -50391870 137878745 157104746 IKZF1 chr7:50368009 TNFAIP3 chr6:137871457- HAVCR2 chr5:157087278- -50368028 137871476 157087297 IKZF1 chr7:50382569 TNFAIP3 chr6:137876104- LAG3 chr12:6774679- -50382588 137876123 6774698 IKZF1 chr7:50376631 TNFAIP3 chr6:137878762- LAG3 chr12:6773300- -50376650 137878781 6773319 IKZF1 chr7:50400366 TNFAIP3 chr6:137876083- LAG3 chr12:6773939- -50400385 137876102 6773958 IKZF1 chr7:50391772 TNFAIP3 chr6:137871402- LAG3 chr12:6775340- -50391791 137871421 6775359 IKZF1 chr7:50399915 TNFAIP3 chr6:137871501- LAG3 chr12:6773781- -50399934 137871520 6773800 IKZF1 chr7:50400414 TNFAIP3 chr6:137874861- LAG3 chr12:6773221- -50400433 137874880 6773240 IKZF1 chr7:50368040 TNFAIP3 chr6:137871362- LAG3 chr12:6773335- -50368059 137871381 6773354 IKZF1 chr7:50382550 TNFAIP3 chr6:137871249- LAG3 chr12:6774608- -50382569 137871268 6774627 IKZF1 chr7:50387353 TNFAIP3 chr6:137874972- LAG3 chr12:6775514- -50387372 137874991 6775533 NFKBIA chr14:3540463 TNFAIP3 chr6:137878495- LAG3 chr12:6773804- 5-35404654 137878514 6773823
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Alvo Coordenadas Alvo Coordenadas Alvo Coordenadas Tgfbr2 chr9:116131610- Havcr2 chr11:46479374- Pdcd1 chr1:94041165- 116131629 46479393 94041184 Tgfbr2 chr9:116131588- Havcr2 chr11:46456495- Pdcd1 chr1:94041421- 116131607 46456514 94041440 Tgfbr2 chr9:116131529- Havcr2 chr11:46479356- Pdcd1 chr1:94041331- 116131548 46479375 94041350 Tgfbr2 chr9:116110272- Havcr2 chr11:46455033- Pdcd1 chr1:94041468- 116110291 46455052 94041487 Tgfbr2 chr9:116109969- Havcr2 chr11:46469534- Pdcd1 chr1:94041239- 116109988 46469553 94041258 Tgfbr2 chr9:116129901- Havcr2 chr11:46456242- Pdcd1 chr1:94041292- 116129920 46456261 94041311 Tgfbr2 chr9:116129988- Havcr2 chr11:46479302- Pdcd1 chr1:94041357- 116130007 46479321 94041376 Tgfbr2 chr9:116110004- Havcr2 chr11:46456496- Pdcd1 chr1:94041207- 116110023 46456515 94041226 Tnip1 chr11:54939673- Havcr2 chr11:46456355- Pdcd1 chr1:94041223- 54939692 46456374 94041242 Tnip1 chr11:54930778- Havcr2 chr11:46469521- Pdcd1 chr1:94041394- 54930797 46469540 94041413 Tnip1 chr11:54934036- Havcr2 chr11:46459111- Pdcd1 chr1:94041179- 54934055 46459130 94041198 Tnip1 chr11:54934071- Havcr2 chr11:46456301- Pdcd1 chr1:94041412- 54934090 46456320 94041431 Tnip1 chr11:54930799- Lag3 chr6:124908571- Pdcd1 chr1:94041268- 54930818 124908590 94041287 Tnip1 chr11:54930820- Lag3 chr6:124909259- Pdcd1 chr1:94041309- 54930839 124909278 94041328 Tnip1 chr11:54933977- Lag3 chr6:124909424- Pdcd1 chr1:94041469- 54933996 124909443 94041488 Tnip1 chr11:54929117- Lag3 chr6:124908491- Pdcd1 chr1:94041189- 54929136 124908510 94041208 Tnfaip3 chr10:19011464- Lag3 chr6:124909299- Pdcd1 chr1:94041331- 19011483 124909318 94041350 Tnfaip3 chr10:19008246- Lag3 chr6:124909474- Pdcd1 chr1:94041239- 19008265 124909493 94041258 Tnfaip3 chr10:19008332- Lag3 chr6:124909286- Pdcd1 chr1:94041292- 19008351 124909305 94041311 Tnfaip3 chr10:19006919- Lag3 chr6:124908450- 19006938 124908469
Alvo Coordenadas Alvo Coordenadas Alvo Coordenadas Tnfaip3 chr10:19008294- Lag3 chr6:124908529- 19008313 124908548 Tnfaip3 chr10:19008234- Lag3 chr6:124909272- 19008253 124909291 Tnfaip3 chr10:19002796- Lag3 chr6:124909399- 19002815 124909418 Tnfaip3 chr10:19006981- Lag3 chr6:124909228- 19007000 124909247 Tabela 6A: Coordenadas do genoma humano Alvo Coordenadas Alvo Coordenadas Alvo Coordenadas BCL2L11 chr2:111123809- PBRM1 chr3:52554752- CALM2 chr2:47167608- 111123828 52554771 47167627 BCL2L11 chr2:111142346- PBRM1 chr3:52603635- CALM2 chr2:47162389- 111142365 52603654 47162408 BCL2L11 chr2:111150125- PBRM1 chr3:52634703- CALM2 chr2:47162623- 111150144 52634722 47162642 BCL2L11 chr2:111164161- PBRM1 chr3:52662232- CALM2 chr2:47161766- 111164180 52662251 47161785 BCL2L11 chr2:111123880- PBRM1 chr3:52609796- CALM2 chr2:47161806- 111123899 52609815 47161825 BCL2L11 chr2:111142303- PBRM1 chr3:52554720- CALM2 chr2:47162544- 111142322 52554739 47162563 BCL2L11 chr2:111128637- PBRM1 chr3:52668623- CALM2 chr2:47167482- 111128656 52668642 47167501 BCL2L11 chr2:111124067- PBRM1 chr3:52679663- CALM2 chr2:47162606- 111124086 52679682 47162625 BCL2L11 chr2:111150032- PBRM1 chr3:52617272- CALM2 chr2:47162351- 111150051 52617291 47162370 BCL2L11 chr2:111153772- PBRM1 chr3:52678502- CALM2 chr2:47162279- 111153791 52678521 47162298 BCL2L11 chr2:111124106- PBRM1 chr3:52558272- CALM2 chr2:47172416- 111124125 52558291 47172435 BCL2L11 chr2:111123866- PBRM1 chr3:52668512- SERPI- chr14:94614673- 111123885 52668531 NA3 94614692 BCL2L11 chr2:111130128- PBRM1 chr3:52643284- SERPI- chr14:94619278- 111130147 52643303 NA3 94619297 BCL2L11 chr2:111123761- PBRM1 chr3:52558266- SERPI- chr14:94614582- 111123780 52558285 NA3 94614601 BCL2L11 chr2:111150081- PBRM1 chr3:52634800- SERPI- chr14:94619423- 111150100 52634819 NA3 94619442
Alvo Coordenadas Alvo Coordenadas Alvo Coordenadas BCL2L11 chr2:111123790- PBRM1 chr3:52603596- SERPI- chr14:94614528- 111123809 52603615 NA3 94614547 BCL2L11 chr2:111153779- PBRM1 chr3:52643330- SERPI- chr14:94614599- 111153798 52643349 NA3 94614618 BCL2L11 chr2:111124008- PBRM1 chr3:52651751- SERPI- chr14:94614744- 111124027 52651770 NA3 94614763 BCL2L11 chr2:111123848- WDR6 chr3:49008972- SERPI- chr14:94614944- 111123867 49008991 NA3 94614963 BCL2L11 chr2:111123849- WDR6 chr3:49011963- SERPI- chr14:94614885- 111123868 49011982 NA3 94614904 CHIC2 chr4:54064267- WDR6 chr3:49011741- SERPI- chr14:94614692- 54064286 49011760 NA3 94614711 CHIC2 chr4:54049066- WDR6 chr3:49014895- SEMA7A chr15:74417586- 54049085 49014914 74417605 CHIC2 chr4:54048982- WDR6 chr3:49012228- SEMA7A chr15:74416690- 54049001 49012247 74416709 CHIC2 chr4:54064276- WDR6 chr3:49007462- SEMA7A chr15:74417405- 54064295 49007481 74417424 CHIC2 chr4:54014101- WDR6 chr3:49012620- SEMA7A chr15:74416640- 54014120 49012639 74416659 CHIC2 chr4:54013870- WDR6 chr3:49012948- SEMA7A chr15:74415947- 54013889 49012967 74415966 CHIC2 chr4:54049029- RBM39 chr20:35729298- SEMA7A chr15:74411646- 54049048 35729317 74411665 CHIC2 chr4:54049258- RBM39 chr20:35738973- SEMA7A chr15:74417429- 54049277 35738992 74417448 CHIC2 chr4:54064203- RBM39 chr20:35725067- SEMA7A chr15:74414850- 54064222 35725086 74414869 CHIC2 chr4:54064222- RBM39 chr20:35714187- SEMA7A chr15:74417393- 54064241 35714206 74417412 CHIC2 chr4:54014065- RBM39 chr20:35716784- DHODH chr16:72014466- 54014084 35716803 72014485 CHIC2 chr4:54064183- RBM39 chr20:35739528- DHODH chr16:72008782- 54064202 35739547 72008801 FLI1 chr11:128772938 RBM39 chr20:35734223- DHODH chr16:72012120- -128772957 35734242 72012139 FLI1 chr11:128810556 RBM39 chr20:35735042- DHODH chr16:72012061- -128810575 35735061 72012080 FLI1 chr11:128768268 RBM39 chr20:35724711- DHODH chr16:72022430- -128768287 35724730 72022449
Alvo Coordenadas Alvo Coordenadas Alvo Coordenadas FLI1 chr11:128772807 RBM39 chr20:35729482- DHODH chr16:72014503- -128772826 35729501 72014522 FLI1 chr11:128807189 RBM39 chr20:35731997- DHODH chr16:72014529- -128807208 35732016 72014548 FLI1 chr11:128768230 RBM39 chr20:35731969- DHODH chr16:72012094- -128768249 35731988 72012113 FLI1 chr11:128807207 RBM39 chr20:35740826- DHODH chr16:72012147- -128807226 35740845 72012166 FLI1 chr11:128810519 RBM39 chr20:35716771- DHODH chr16:72017036- -128810538 35716790 72017055 FLI1 chr11:128810490 RBM39 chr20:35707976- DHODH chr16:72008781- -128810509 35707995 72008800 FLI1 chr11:128810665 RBM39 chr20:35734220- DHODH chr16:72012216- -128810684 35734239 72012235 FLI1 chr11:128772978 RBM39 chr20:35707942- DHODH chr16:72014491- -128772997 35707961 72014510 FLI1 chr11:128772894 RBM39 chr20:35729478- DHODH chr16:72008781- -128772913 35729497 72008800 PCBP1 chr2:70087872- RBM39 chr20:35740555- DHODH chr16:72014548- 70087891 35740574 72014567 PCBP1 chr2:70087909- RBM39 chr20:35736543- UMPS chr3:124738139- 70087928 35736562 124738158 PCBP1 chr2:70087790- RBM39 chr20:35739531- UMPS chr3:124730574- 70087809 35739550 124730593 PCBP1 chr2:70087821- RBM39 chr20:35732003- UMPS chr3:124737663- 70087840 35732022 124737682 PCBP1 chr2:70087998- RBM39 chr20:35714241- UMPS chr3:124737918- 70088017 35714260 124737937 PCBP1 chr2:70088588- RBM39 chr20:35736551- UMPS chr3:124735177- 70088607 35736570 124735196 PCBP1 chr2:70088106- E2F8 chr11:19234923- GNAS chr20:58895661- 70088125 19234942 58895680 PCBP1 chr2:70087940- E2F8 chr11:19234390- GNAS chr20:58903685- 70087959 19234409 58903704 PCBP1 chr2:70088307- E2F8 chr11:19237345- GNAS chr20:58905460- 70088326 19237364 58905479 PCBP1 chr2:70088200- E2F8 chr11:19235005- GNAS chr20:58840352- 70088219 19235024 58840371 PCBP1 chr2:70088063- E2F8 chr11:19225425- GNAS chr20:58840096- 70088082 19225444 58840115
Alvo Coordenadas Alvo Coordenadas Alvo Coordenadas PCBP1 chr2:70087845- E2F8 chr11:19237329- GNAS chr20:58840253- 70087864 19237348 58840272 E2F8 chr11:19234967- GNAS chr20:58891819- 19234986 58891838 E2F8 chr11:19234422- GNAS chr20:58891756- 19234441 58891775 E2F8 chr11:19237906- GNAS chr20:58891768- 19237925 58891787 E2F8 chr11:19237980- GNAS chr20:58840195- 19237999 58840214 E2F8 chr11:19232290- GNAS chr20:58891728- 19232309 58891747 E2F8 chr11:19229509- GNAS chr20:58840198- 19229528 58840217 Tabela 6B: Coordenadas do genoma murino Alvo Coordenadas Alvo Coordenadas Alvo Coordenadas Bcl2l11 chr2:128128713- Fli1 chr9:32461444- Wdr6 chr9:108578530- 128128732 32461463 108578549 Bcl2l11 chr2:128147115- Fli1 chr9:32461386- Wdr6 chr9:108576565- 128147134 32461405 108576584 Bcl2l11 chr2:128128731- Fli1 chr9:32461401- Wdr6 chr9:108578514- 128128750 32461420 108578533 Bcl2l11 chr2:128147173- Fli1 chr9:32465687- Wdr6 chr9:108578497- 128147192 32465706 108578516 Bcl2l11 chr2:128128648- Fli1 chr9:32461420- Wdr6 chr9:108576511- 128128667 32461439 108576530 Bcl2l11 chr2:128128660- Fli1 chr9:32424186- Dhodh chr8:109596082- 128128679 32424205 109596101 Bcl2l11 chr2:128147091- Fli1 chr9:32461239- Dhodh chr8:109601459- 128147110 32461258 109601478 Bcl2l11 chr2:128128682- Fli1 chr9:32424232- Dhodh chr8:109603453- 128128701 32424251 109603472 Bcl2l11 chr2:128128640- Pcbp1 chr6:86525508- Dhodh chr8:109603306- 128128659 86525527 109603325 Bcl2l11 chr2:128147141- Pcbp1 chr6:86524927- Dhodh chr8:109603364- 128147160 86524946 109603383 Bcl2l11 chr2:128158269- Pcbp1 chr6:86525842- Dhodh chr8:109603351- 128158288 86525861 109603370 Bcl2l11 chr2:128158233- Pcbp1 chr6:86525525- Dhodh chr8:109596173- 128158252 86525544 109596192
Alvo Coordenadas Alvo Coordenadas Alvo Coordenadas Bcl2l11 chr2:128147129- Pcbp1 chr6:86525608- Dhodh chr8:109601503- 128147148 86525627 109601522 Bcl2l11 chr2:128128753- Pcbp1 chr6:86525731- Gnas chr2:174334196- 128128772 86525750 174334215 Bcl2l11 chr2:128158301- Pcbp1 chr6:86525676- Gnas chr2:174345476- 128158320 86525695 174345495 Bcl2l11 chr2:128147086- Pcbp1 chr6:86525148- Gnas chr2:174346023- 128147105 86525167 174346042 Bcl2l11 chr2:128128730- Pbrm1 14:31040494- Gnas chr2:174341872- 128128749 31040513 174341891 Bcl2l11 chr2:128128992- Pbrm1 14:31038941- Gnas chr2:174345749- 128129011 31038960 174345768 Chic2 chr5:75027179- Pbrm1 14:31061547- Gnas chr2:174345419- 75027198 31061566 174345438 Chic2 chr5:75044295- Pbrm1 14:31036055- Gnas chr2:174334251- 75044314 31036074 174334270 Chic2 chr5:75044192- Pbrm1 14:31067548- Gnas chr2:174345768- 75044211 31067567 174345787 Chic2 chr5:75011480- Pbrm1 14:31027510- 75011499 31027529 Chic2 chr5:75044214- Pbrm1 14:31067943- 75044233 31067962 Chic2 chr5:75011437- Pbrm1 14:31030854- 75011456 31030873 Chic2 chr5:75027108- 75027127 Chic2 chr5:75044244- 75044263 Tabela 6C: Coordenadas do genoma humano Alvo Coordenadas Alvo Coordenadas Alvo Coordenadas PTPN22 chr1:113858498- PTPN2 chr18:12884115- PTPN2 chr18:12817235- 113858517 12884134 12817254 PTPN22 chr1:113864266- PTPN2 chr18:12840757- PTPN2 chr18:12836793- 113864285 12840776 12836812 PTPN22 chr1:113859433- PTPN2 chr18:12814205- PTPN2 chr18:12801986- 113859452 12814224 12802005 PTPN22 chr1:113859398- PTPN2 chr18:12840777- PTPN2 chr18:12817165- 113859417 12840796 12817184 PTPN22 chr1:113864230- PTPN2 chr18:12814277- PTPN2 chr18:12817179- 113864249 12814296 12817198
Alvo Coordenadas Alvo Coordenadas Alvo Coordenadas PTPN22 chr1:113838546- PTPN2 chr18:12840746- PTPN2 chr18:12794425- 113838565 12840765 12794444 PTPN22 chr1:113871528- PTPN2 chr18:12801989- PTPN2 chr18:12802146- 113871547 12802008 12802165 PTPN22 chr1:113859023- PTPN2 chr18:12819237- SH2B3 chr12:111447192- 113859042 12819256 111447211 PTPN22 chr1:113871587- PTPN2 chr18:12814348- SH2B3 chr12:111446776- 113871606 12814367 111446795 PTPN22 chr1:113859452- PTPN2 chr18:12794428- SH2B3 chr12:111446793- 113859471 12794447 111446812 PTPN22 chr1:113857745- PTPN2 chr18:12831005- SH2B3 chr12:111446954- 113857764 12831024 111446973 PTPN22 chr1:113854941- PTPN2 chr18:12825890- SH2B3 chr12:111418215- 113854960 12825909 111418234 PTPN22 chr1:113856544- PTPN2 chr18:12840723- SH2B3 chr12:111446995- 113856563 12840742 111447014 PTPN22 chr1:113864227- PTPN2 chr18:12840747- SH2B3 chr12:111446833- 113864246 12840766 111446852 PTPN1 chr20:50579277- PTPN2 chr18:12802068- SH2B3 chr12:111446983- 50579296 12802087 111447002 PTPN1 chr20:50568445- PTPN2 chr18:12840716- SH2B3 chr12:111418213- 50568464 12840735 111418232 PTPN1 chr20:50565048- PTPN2 chr18:12840773- SH2B3 chr12:111435010- 50565067 12840792 111435029 PTPN1 chr20:50574621- PTPN2 chr18:12831012- SH2B3 chr12:111446931- 50574640 12831031 111446950 PTPN1 chr20:50565048- PTPN2 chr18:12814240- SH2B3 chr12:111418766- 50565067 12814259 111418785 PTPN1 chr20:50568380- PTPN2 chr18:12802130- SH2B3 chr12:111418358- 50568399 12802149 111418377 PTPN1 chr20:50579816- PTPN2 chr18:12794454- SH2D1A chrX:124346660- 50579835 12794473 124346679 PTPN1 chr20:50568457- PTPN2 chr18:12817208- SH2D1A chrX:124370175- 50568476 12817227 124370194 PTPN1 chr20:50578601- PTPN2 chr18:12819226- SH2D1A chrX:124346692- 50578620 12819245 124346711 PTPN1 chr20:50568418- PTPN2 chr18:12825889- SH2D1A chrX:124346757- 50568437 12825908 124346776 PTPN1 chr20:50579196- PTPN2 chr18:12840782- SH2D1A chrX:124346644- 50579215 12840801 124346663
Alvo Coordenadas Alvo Coordenadas Alvo Coordenadas PTPN2 chr18:12859218- PTPN2 chr18:12836812- SH2D1A chrX:124370278- 12859237 12836831 124370297 PTPN2 chr18:12884109- PTPN2 chr18:12817298- SH2D1A chrX:124346717- 12884128 12817317 124346736 PTPN2 chr18:12817227- PTPN2 chr18:12817324- SH2D1A chrX:124346710- 12817246 12817343 124346729 PTPN2 chr18:12817234- PTPN2 chr18:12819268- SH2D1A chrX:124365739- 12817253 12819287 124365758 PTPN2 chr18:12884091- PTPN2 chr18:12817303- SH2D1A chrX:124371379- 12884110 12817322 124371398 PTPN2 chr18:12884121- PTPN2 chr18:12825927- SH2D1A chrX:124370333- 12884140 12825946 124370352 PTPN2 chr18:12831010- PTPN2 chr18:12817220- SH2D1A chrX:124365793- 12831029 12817239 124365812 PTPN2 chr18:12817208- PTPN2 chr18:12825901- SH2D1A chrX:124371329- 12817227 12825920 124371348 PTPN2 chr18:12817158- PTPN2 chr18:12814222- SH2D1A chrX:124370230- 12817177 12814241 124370249 PTPN2 chr18:12831016- PTPN2 chr18:12831000- PIK3CD chr1:9710569- 12831035 12831019 9710588 PTPN2 chr18:12817228- PTPN2 chr18:12840738- PIK3CD chr1:9722331- 12817247 12840757 9722350 PTPN2 chr18:12830964- PTPN2 chr18:12802057- PIK3CD chr1:9715594- 12830983 12802076 9715613 PTPN2 chr18:12801972- PTPN2 chr18:12802069- PIK3CD chr1:9715609- 12801991 12802088 9715628 PTPN2 chr18:12836818- PTPN2 chr18:12884123- PIK3CD chr1:9717573- 12836837 12884142 9717592 PTPN2 chr18:12817215- PTPN2 chr18:12814294- PIK3CD chr1:9710479- 12817234 12814313 9710498 PTPN2 chr18:12802018- PTPN2 chr18:12817283- PIK3CD chr1:9715638- 12802037 12817302 9715657 PTPN2 chr18:12884116- PTPN2 chr18:12830945- PIK3CD chr1:9716057- 12884135 12830964 9716076 PTPN2 chr18:12840739- PTPN2 chr18:12817284- PIK3CD chr1:9717598- 12840758 12817303 9717617 PTPN2 chr18:12802004- PTPN2 chr18:12817256- PIK3CD chr1:9716516- 12802023 12817275 9716535 PTPN2 chr18:12840767- PTPN2 chr18:12884062- PIK3CD chr1:9715527- 12840786 12884081 9715546
Alvo Coordenadas Alvo Coordenadas Alvo Coordenadas PTPN2 chr18:12817197- PTPN2 chr18:12814295- PIK3CD chr1:9715853- 12817216 12814314 9715872 PTPN2 chr18:12884108- PTPN2 chr18:12817313- PIK3CD chr1:9715576- 12884127 12817332 9715595 PTPN2 chr18:12817221- PTPN2 chr18:12814255- PIK3CD chr1:9721210- 12817240 12814274 9721229 PTPN2 chr18:12836820- PTPN2 chr18:12814253- PIK3CD chr1:9716605- 12836839 12814272 9716624 PTPN2 chr18:12884124- PTPN2 chr18:12814257- EGR2 chr10:62814330- 12884143 12814276 62814349 PTPN2 chr18:12830996- PTPN2 chr18:12814256- EGR2 chr10:62814271- 12831015 12814275 62814290 PTPN2 chr18:12830942- PTPN2 chr18:12840753- EGR2 chr10:62815870- 12830961 12840772 62815889 PTPN2 chr18:12884112- PTPN2 chr18:12830957- EGR2 chr10:62814174- 12884131 12830976 62814193 PTPN2 chr18:12817193- PTPN2 chr18:12802093- EGR2 chr10:62814102- 12817212 12802112 62814121 PTPN2 chr18:12859205- PTPN2 chr18:12817333- EGR2 chr10:62814192- 12859224 12817352 62814211 PTPN2 chr18:12817202- PTPN2 chr18:12794479- EGR2 chr10:62814221- 12817221 12794498 62814240 PTPN2 chr18:12859216- PTPN2 chr18:12814223- EGR2 chr10:62813591- 12859235 12814242 62813610 PTPN2 chr18:12859215- PTPN2 chr18:12802089- EGR2 chr10:62814064- 12859234 12802108 62814083 PTPN2 chr18:12817201- PTPN2 chr18:12794463- EGR2 chr10:62813862- 12817220 12794482 62813881 PTPN2 chr18:12802134- PTPN2 chr18:12794436- EGR2 chr10:62814208- 12802153 12794455 62814227 PTPN2 chr18:12884075- PTPN2 chr18:12794416- EGR2 chr10:62813420- 12884094 12794435 62813439 EGR2 chr10:62814310- 62814329 Tabela 6D: Coordenadas do genoma murino Alvo Coordenadas Alvo Coordenadas Alvo Coordenadas Ptpn22 chr3:103876721- Ptpn2 chr18:67688944- Pik3cd chr4:149660146- 103876740 67688963 149660165 Ptpn22 chr3:103876615- Ptpn2 chr18:67677734- Pik3cd chr4:149660173- 103876634 67677753 149660192
Alvo Coordenadas Alvo Coordenadas Alvo Coordenadas Ptpn22 chr3:103874020- Ptpn2 chr18:67680967- Pik3cd 4:149659809- 103874039 67680986 149659828 Ptpn22 chr3:103874677- Ptpn2 chr18:67688912- Pik3cd 4:149660225- 103874696 67688931 149660244 Ptpn22 chr3:103877303- Ptpn2 chr18:67680881- Pik3cd 4:149663160- 103877322 67680900 149663179 Ptpn22 chr3:103876642- Ptpn2 chr18:67681529- Pik3cd 4:149660111- 103876661 67681548 149660130 Ptpn22 chr3:103877348- Sh2b3 chr5:121828834- Pik3cd 4:149660041- 103877367 121828853 149660060 Ptpn22 chr3:103873719- Sh2b3 chr5:121828921- Pik3cd 4:149655492- 103873738 121828940 149655511 Ptpn22 chr3:103874047- Sh2b3 chr5:121828733- Pik3cd 4:149660056- 103874066 121828752 149660075 Ptpn22 chr3:103874194- Sh2b3 chr5:121828905- Pik3cd 4:149663140- 103874213 121828924 149663159 Ptpn22 chr3:103874168- Sh2b3 chr5:121828674- Egr2 chr10:67539908- 103874187 121828693 67539927 Ptpn22 chr3:103877294- Sh2b3 chr5:121828662- Egr2 chr10:67539973- 103877313 121828681 67539992 Ptpn22 chr3:103874238- Sh2b3 chr5:121829032- Egr2 chr10:67540002- 103874257 121829051 67540021 Ptpn22 chr3:103874682- Sh2b3 chr5:121828981- Egr2 chr10:67540089- 103874701 121829000 67540108 Ptpn1 chr2:167971732- Sh2d1a chrX:42520712- Egr2 chr10:67539868- 167971751 42520731 67539887 Ptpn1 chr2:167965038- Sh2d1a chrX:42520781- Egr2 chr10:67540021- 167965057 42520800 67540040 Ptpn1 chr2:167967806- Sh2d1a chrX:42502816- Egr2 chr10:67539885- 167967825 42502835 67539904 Ptpn1 chr2:167965089- Sh2d1a chrX:42520690- Egr2 chr10:67539953- 167965108 42520709 67539972 Ptpn1 chr2:167974044- Sh2d1a chrX:42527612- Egr2 chr10:67539875- 167974063 42527631 67539894 Ptpn1 chr2:167971797- Sh2d1a chrX:42502726- Egr2 chr10:67540124- 167971816 42502745 67540143 Ptpn1 chr2:167974064- Sh2d1a chrX:42527466- Egr2 chr10:67540275- 167974083 42527485 67540294 Ptpn1 chr2:167971716- Sh2d1a chrX:42502747- Egr2 chr10:67540079- 167971735 42502766 67540098
Alvo Coordenadas Alvo Coordenadas Alvo Coordenadas Ptpn2 chr18:67680998- Pik3cd chr4:149660212- Egr2 chr10:67540067- 67681017 149660231 67540086 Ptpn2 chr18:67677801- Pik3cd chr4:149660042- Egr2 chr10:67540037- 67677820 149660061 67540056 Ptpn2 chr18:67680904- Pik3cd chr4:149660070- Egr2 chr10:67540332- 67680923 149660089 67540351 Ptpn2 chr18:67681553- Pik3cd chr4:149663152- 67681572 149663171 Ptpn2 chr18:67688965- Pik3cd chr4:149660058- 67688984 149660077 Ptpn2 chr18:67680958- Pik3cd chr4:149660158- 67680977 149660177
Tabela 6E: Coordenadas do Tabela 6F: Coordenadas do ge- genoma humano noma murino Alvo Coordenadas Alvo Coordenadas PELI1 chr2:64096299- Peli1 chr11:21142608- 64096318 21142627 PELI1 chr2:64104810- Peli1 chr11:21147009- 64104829 21147028 PELI1 chr2:64095219- Peli1 chr11:21136163- 64095238 21136182 PELI1 chr2:64095027- Peli1 chr11:21142636- 64095046 21142655 PELI1 chr2:64096482- Peli1 chr11:21146988- 64096501 21147007 PELI1 chr2:64096461- Peli1 chr11:21146964- 64096480 21146983 PELI1 chr2:64104824- Peli1 chr11:21140615- 64104843 21140634 PELI1 chr2:64108261- Peli1 chr11:21146939- 64108280 21146958 PELI1 chr2:64108242- 64108261 PELI1 chr2:64096450- 64096469
Tabela 6E: Coordenadas do Tabela 6F: Coordenadas do ge- genoma humano noma murino Alvo Coordenadas Alvo Coordenadas PELI1 chr2:64100442- 64100461 PELI1 chr2:64104751- 64104770 PELI1 chr2:64104794- 64104813
Tabela 6G: Coordenadas do Tabela 6H: Coordenadas do genoma humano genoma murino SETD5 chr3:9440466- Setd5 chr6:113117552- 9440485 113117571 SETD5 chr3:9442224- Setd5 chr6:113116862- 9442243 113116881 SETD5 chr3:9445719- Setd5 chr6:113111519- 9445738 113111538 SETD5 chr3:9434841- Setd5 chr6:113114834- 9434860 113114853 SETD5 chr3:9443309- Setd5 chr6:113116844- 9443328 113116863 SETD5 chr3:9442161- Setd5 chr6:113114853- 9442180 113114872 SETD5 chr3:9447131- Setd5 chr6:113116829- 9447150 113116848 SETD5 chr3:9445176- Setd5 chr6:113115640- 9445195 113115659 SETD5 chr3:9435779- 9435798

Claims (295)

REIVINDICAÇÕES
1. Célula efetora imune modificada caracterizada pelo fato de que compreende um sistema de regulação de genes capaz de reduzir a expressão e/ou função de um ou mais genes-alvo endógenos selecionados dentre: (a) o grupo que consiste em BCL2L11, FLI1, CALM2, DHODH, UMPS, RBM39, SEMA7A, CHIC2, PCBP1, PBRM1, WDR6, E2F8, SERPINA3, e GNAS; (b) o grupo que consiste em PTPN1, PTPN2, PTPN22, SH2B3, SH2D1A, PIK3CD, e EGR2; (c) PELI1; ou (d) SETD5, em que a expressão e/ou função reduzida de um ou mais genes endógenos aprimora uma função efetora da célula efetora imu- ne.
2. Célula efetora imune modificada, de acordo com a rei- vindicação 1, caracterizada pelo fato de que o sistema de regulação de genes é capaz de reduzir a expressão e/ou função de dois ou mais dos genes-alvo endógenos selecionados dentre: (a) o grupo que con- siste em BCL2L11, FLI1, CALM2, DHODH, UMPS, RBM39, SEMA7A, CHIC2, PCBP1, PBRM1, WDR6, E2F8, SERPINA3, e GNAS; (b) o grupo que consiste PTPN1, PTPN2, PTPN22, SH2B3, SH2D1A, PIK3CD, e EGR2; (c) PELI1; ou (d) SETD5.
3. Célula efetora imune modificada caracterizada pelo fato de que compreende um sistema de regulação de genes capaz de reduzir a expressão e/ou função de um ou mais genes-alvo endógenos selecionados do grupo que consiste em IKZF1, IKZF3, GATA3, BCL3, TNIP1, TNFAIP3, NFKBIA, SMAD2, TGFBR1, TGFBR2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6, IKZF2, CBLB, PPP2R2D, NRP1, HAVCR2, LAG3, TIGIT, CTLA4, PTPN6, PDCD1, e BCOR, em que a expressão e/ou função reduzidas de um ou mais genes endógenos aumentam uma função efetora da célula efetora imune.
4. Célula efetora imune modificada, de acordo com a rei-
vindicação 3, caracterizada pelo fato de que o sistema de regulação de genes é capaz de reduzir a expressão e/ou função de dois ou mais genes-alvo endógenos selecionados a partir do grupo que consiste de IKZF1, IKZF3, GATA3, BCL3, TNIP1, TNFAIP3, NFKBIA, SMAD2, TGFBR1, TGFBR2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6, IKZF2, CBLB, PPP2R2D, NRP1, HAVCR2, LAG3, TIGIT, CTLA4, PTPN6, PDCD1, e BCOR.
5. Célula efetora imune modificada, de acordo com a rei- vindicação 4, caracterizada pelo fato de que pelo menos um dos ge- nes-alvo endógenos é selecionado do grupo que consiste em IKZF1, IKZF3, GATA3, BCL3, TNIP1, TNFAIP3, NFKBIA, SMAD2, TGFBR1, TGFBR2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6, e IKZF2 e pelo menos um dos genes-alvo endógenos é selecionado do grupo que consiste em CBLB, PPP2R2D, NRP1, HAVCR2, LAG3, TIGIT, CTLA4, PTPN6, PDCD1, e BCOR.
6. Célula efetora imune modificada, de acordo com a rei- vindicação 1 ou reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que o sis- tema de regulação de genes é ainda capaz de reduzir a expressão e/ou função de um ou mais genes-alvo endógenos selecionados den- tre IKZF1, IKZF3, GATA3, BCL3, TNIP1, TNFAIP3, NFKBIA, SMAD2, TGFBR1, TGFBR2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6, IKZF2, CBLB, PPP2R2D, NRP1, HAVCR2, LAG3, TIGIT, CTLA4, PTPN6, PDCD1, e BCOR.
7. Célula efetora imune modificada, de acordo com a rei- vindicação 6, caracterizada pelo fato de que o sistema de regulação de genes é capaz de reduzir a expressão e/ou função de pelo menos um gene-alvo endógeno selecionado do grupo que consiste em BCL2L11, FLI1, CALM2, DHODH, UMPS, RBM39, SEMA7A, CHIC2, PCBP1, PBRM1, WDR6, E2F8, SERPINA3, e GNAS e pelo menos um gene-alvo endógeno selecionado do grupo que consiste em IKZF1,
IKZF3, GATA3, BCL3, TNIP1, TNFAIP3, NFKBIA, SMAD2, TGFBR1, TGFBR2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6, IKZF2, CBLB, PPP2R2D, NRP1, HAVCR2, LAG3, TIGIT, CTLA4, PTPN6, PDCD1, e BCOR.
8. Célula efetora imune modificada, de acordo com a rei- vindicação 6, caracterizada pelo fato de que o sistema de regulação de genes é capaz de reduzir a expressão e/ou função de pelo menos um gene-alvo endógeno selecionado do grupo que consiste em PTPN1, PTPN2, PTPN22, SH2B3, SH2D1A, PIK3CD, e EGR2 e pelo menos um gene-alvo endógeno selecionado do grupo que consiste em IKZF1, IKZF3, GATA3, BCL3, TNIP1, TNFAIP3, NFKBIA, SMAD2, TGFBR1, TGFBR2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6, IKZF2, CBLB, PPP2R2D, NRP1, HAVCR2, LAG3, TIGIT, CTLA4, PTPN6, PDCD1, e BCOR.
9. Célula efetora imune modificada, de acordo com a rei- vindicação 8, caracterizada pelo fato de que o sistema de regulação de genes é capaz de reduzir a expressão e/ou função de PTPN2 e CBLB.
10. Célula efetora imune modificada, de acordo com a rei- vindicação 8, caracterizada pelo fato de que o sistema de regulação de genes é capaz de reduzir a expressão e/ou função de PTPN2 e BCOR.
11. Célula efetora imune modificada, de acordo com a rei- vindicação 8, caracterizada pelo fato de que o sistema de regulação de genes é capaz de reduzir a expressão e/ou função de PTPN2 e TNFAIP3.
12. Célula efetora imune modificada, de acordo com a rei- vindicação 6, caracterizada pelo fato de que o sistema de regulação de genes é capaz de reduzir a expressão e/ou função de PELI1 e pelo menos um gene-alvo endógeno selecionado a partir do grupo que consiste em IKZF1, IKZF3, GATA3, BCL3, TNIP1, TNFAIP3, NFKBIA,
SMAD2, TGFBR1, TGFBR2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6, IKZF2, CBLB, PPP2R2D, NRP1, HAVCR2, LAG3, TIGIT, CTLA4, PTPN6, PDCD1, e BCOR.
13. Célula efetora imune modificada, de acordo com a rei- vindicação 16, caracterizada pelo fato de que o sistema de regulação de genes é capaz de reduzir a expressão e/ou função de PELI1 e CBLB.
14. Célula efetora imune modificada, de acordo com a rei- vindicação 16, caracterizada pelo fato de que o sistema de regulação de genes é capaz de reduzir a expressão e/ou função de PELI1 e BCOR.
15. Célula efetora imune modificada, de acordo com a rei- vindicação 16, caracterizada pelo fato de que o sistema de regulação de genes é capaz de reduzir a expressão e/ou função de PELI1 e TNFAIP3.
16. Célula efetora imune modificada, de acordo com a rei- vindicação 6, caracterizada pelo fato de que o sistema de regulação de genes é capaz de reduzir a expressão e/ou função de SETD5 e pe- lo menos um gene-alvo endógeno selecionado a partir do grupo que consiste em IKZF1, IKZF3, GATA3, BCL3, TNIP1, TNFAIP3, NFKBIA, SMAD2, TGFBR1, TGFBR2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6, IKZF2, CBLB, PPP2R2D, NRP1, HAVCR2, LAG3, TIGIT, CTLA4, PTPN6, PDCD1, e BCOR.
17. Célula efetora imune modificada, de acordo com a rei- vindicação 16, caracterizada pelo fato de que o sistema de regulação de genes é capaz de reduzir a expressão e/ou função de SETD5 e CBLB.
18. Célula efetora imune modificada, de acordo com a rei- vindicação 16, caracterizada pelo fato de que o sistema de regulação de genes é capaz de reduzir a expressão e/ou função de SETD5 e
BCOR.
19. Célula efetora imune modificada, de acordo com a rei- vindicação 16, caracterizada pelo fato de que o sistema de regulação de genes é capaz de reduzir a expressão e/ou função de SETD5 e TNFAIP3.
20. A célula efetora imune modificada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-17, caracterizada pelo fato de que o sistema de regulação de genes compreende (i) uma ou mais molécu- las de ácido nucleico; (ii) uma ou mais proteínas enzimáticas; ou (iii) uma ou mais moléculas de ácido nucleico guia e uma proteína enzimá- tica.
21. Célula efetora imune modificada, de acordo com a rei- vindicação 20, caracterizada pelo fato de que uma ou mais moléculas de ácido nucleico são selecionadas a partir de um siRNA, um shRNA, um microRNA (miR), um antagomiR ou um RNA antisense.
22. Célula efetora imune modificada, de acordo com a rei- vindicação 20, caracterizada pelo fato de que o sistema de regulação de genes compreende um siRNA ou uma molécula de ácido nucleico shRNA.
23. Célula efetora imune modificada, de acordo com a rei- vindicação 22, caracterizada pelo fato de que os um ou mais genes- alvo endógenos são selecionados a partir do grupo que consiste em IKZF1, IKZF3, GATA3, BCL3, TNIP1, TNFAIP3, NFKBIA, SMAD2, TGFBR1, TGFBR2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6, IKZF2, CBLB, PPP2R2D, NRP1, HAVCR2, LAG3, TIGIT, CTLA4, PTPN6, PDCD1, e BCOR, e em que a molécula de siRNA ou shRNA compreende cerca de 19 a 30 nucleotídeos que se ligam a uma sequência de RNA codifi- cada por uma sequência de DNA definida por um conjunto de coorde- nadas do genoma mostradas na Tabela 5A e na Tabela 5B.
24. Célula efetora imune modificada, de acordo com a rei-
vindicação 23, caracterizada pelo fato de que o siRNA ou shRNA compreende cerca de 19 – 30 nucleotídeos que se ligam a uma se- quência de RNA codificada por uma sequência de DNA selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 154-813.
25. Célula efetora imune modificada, de acordo com a rei- vindicação 22, caracterizada pelo fato de que os um ou mais genes- alvo endógenos são selecionados a partir do grupo que consiste em BCL2L11, FLI1, CALM2, DHODH, UMPS, RBM39, SEMA7A, CHIC2, PCBP1, PBRM1, WDR6, E2F8, SERPINA3, e GNAS, e em que a mo- lécula de siRNA ou shRNA compreende cerca de 19 a 30 nucleotídeos que se ligam a uma sequência de RNA codificada por uma sequência de DNA definida por um conjunto de coordenadas de genoma mostra- das na Tabela 6A e na Tabela 6B.
26. Célula efetora imune modificada, de acordo com a rei- vindicação 25, caracterizada pelo fato de que o siRNA ou shRNA compreende cerca de 19 – 30 nucleotídeos que se ligam a uma se- quência de RNA codificada por uma sequência de DNA selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 814-1064.
27. Célula efetora imune modificada, de acordo com a rei- vindicação 22, caracterizada pelo fato de que o um ou mais genes- alvo endógenos é selecionado a partir do grupo que consiste em PTPN1, PTPN2, PTPN22, SH2B3, SH2D1A, PIK3CD, e EGR2, e em que a molécula de siRNA ou shRNA compreende cerca de 19 a 30 nu- cleotídeos que se ligam a uma sequência de RNA codificada por uma sequência de DNA definida por um conjunto de coordenadas do ge- noma mostradas na Tabela 6C e na Tabela 6D.
28. Célula efetora imune modificada, de acordo com a rei- vindicação 27, caracterizada pelo fato de que o siRNA ou shRNA compreende cerca de 19 – 30 nucleotídeos que se ligam a uma se- quência de RNA codificada por uma sequência de DNA selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs:1065-1329.
29. Célula efetora imune modificada, de acordo com a rei- vindicação 27, caracterizada pelo fato de que o siRNA ou shRNA compreende cerca de 19 – 30 nucleotídeos que se ligam a uma se- quência de RNA codificada por uma sequência de DNA selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 1112-1227.
30. Célula efetora imune modificada, de acordo com a rei- vindicação 22, caracterizada pelo fato de que os um ou mais genes- alvo endógenos são PELI1e em que a molécula de siRNA ou shRNA compreende cerca de 19 a 30 nucleotídeos que se ligam a uma se- quência de RNA codificada por uma sequência de DNA definida por um conjunto de coordenadas de genoma mostrado na Tabela 6E e Tabela 6F.
31. Célula efetora imune modificada, de acordo com a rei- vindicação 30, caracterizada pelo fato de que o siRNA ou shRNA compreende cerca de 19 – 30 nucleotídeos que se ligam a uma se- quência de RNA codificada por uma sequência de DNA selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 1330-1350.
32. Célula efetora imune modificada, de acordo com a rei- vindicação 22, caracterizada pelo fato de que os um ou mais genes- alvo endógenos são SETD5e em que a molécula de siRNA ou shRNA compreende cerca de 19 a 30 nucleotídeos que se ligam a uma se- quência de RNA codificada por uma sequência de DNA definida por um conjunto de coordenadas de genoma mostrado na Tabela 6G e Tabela 6H.
33. Célula efetora imune modificada, de acordo com a rei- vindicação 32, caracterizada pelo fato de que o siRNA ou shRNA compreende cerca de 19 – 30 nucleotídeos que se ligam a uma se- quência de RNA codificada por uma sequência de DNA selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 1351-1367.
34. Célula efetora imune modificada, de acordo com a rei- vindicação 20, caracterizada pelo fato de que o sistema de regulação de genes compreende uma pluralidade de moléculas de siRNA ou shRNA e é capaz de reduzir a expressão e/ou função de dois ou mais genes-alvo endógenos.
35. Célula efetora imune modificada, de acordo com a rei- vindicação 34, caracterizada pelo fato de que pelo menos um dos ge- nes-alvo endógenos é selecionado a partir do grupo que consiste em BCL2L11, FLI1, CALM2, DHODH, UMPS, RBM39, SEMA7A, CHIC2, PCBP1, PBRM1, WDR6, E2F8, SERPINA3, e GNAS e pelo menos um dos genes-alvo endógenos é selecionado do grupo que consiste em IKZF1, IKZF3, GATA3, BCL3, TNIP1, TNFAIP3, NFKBIA, SMAD2, TGFBR1, TGFBR2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6, IKZF2, CBLB, PPP2R2D, NRP1, HAVCR2, LAG3, TIGIT, CTLA4, PTPN6, PDCD1, e BCOR.
36. Célula efetora imune modificada, de acordo com a rei- vindicação 35, caracterizada pelo fato de que pelo menos uma dentre a pluralidade de moléculas de siRNA ou shRNA compreende cerca de 19-30 nucleotídeos que se ligam a uma sequência de RNA codificada por uma sequência de DNA definida por um conjunto de coordenadas de genoma mostradas na Tabela 6A e na Tabela 6B e pelo menos uma dentre a pluralidade de moléculas de siRNA ou shRNA compre- ende cerca de 19-30 nucleotídeos que se ligam a uma sequência de RNA codificada por uma sequência de DNA definida por um conjunto de coordenadas de genoma mostradas na Tabela 5A e na Tabela 5B.
37. Célula efetora imune modificada, de acordo com a rei- vindicação 35 ou 36, caracterizada pelo fato de que pelo menos uma dentre a pluralidade de moléculas de siRNA ou shRNA compreende cerca de 19-30 nucleotídeos que se ligam a uma sequência de RNA codificada por uma sequência de DNA selecionada do grupo que con-
siste nas SEQ ID NOs: 814-1064 e pelo menos um de a pluralidade de moléculas de siRNA ou shRNA compreende cerca de 19-30 nucleotí- deos que se ligam a uma sequência de RNA codificada por uma se- quência de DNA selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 154-813.
38. Célula efetora imune modificada, de acordo com a rei- vindicação 34, caracterizada pelo fato de que pelo menos um dos ge- nes-alvo endógenos é selecionado do grupo que consiste em PTPN1, PTPN2, PTPN22, SH2B3, SH2D1A, PIK3CD, e EGR2 e pelo menos um dos genes-alvo endógenos é selecionado do grupo consistindo em IKZF1, IKZF3, GATA3, BCL3, TNIP1, TNFAIP3, NFKBIA, SMAD2, TGFBR1, TGFBR2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6, IKZF2, CBLB, PPP2R2D, NRP1, HAVCR2, LAG3, TIGIT, CTLA4, PTPN6, PDCD1, e BCOR.
39. Célula efetora imune modificada, de acordo com a rei- vindicação 38, caracterizada pelo fato de que pelo menos uma dentre a pluralidade de moléculas de siRNA ou shRNA compreende cerca de 19-30 nucleotídeos que se ligam a uma sequência de RNA codificada por uma sequência de DNA definida por um conjunto de coordenadas de genoma mostradas na Tabela 6C e na Tabela 6D e pelo menos uma dentre a pluralidade de moléculas de siRNA ou shRNA compre- ende cerca de 19-30 nucleotídeos que se ligam a uma sequência de RNA codificada por uma sequência de DNA definida por um conjunto de coordenadas de genoma mostradas na Tabela 5A e na Tabela 5B.
40. Célula efetora imune modificada, de acordo com a rei- vindicação 39, caracterizada pelo fato de que pelo menos uma dentre a pluralidade de moléculas de siRNA ou shRNA compreende cerca de 19-30 nucleotídeos que se ligam a uma sequência de RNA codificada por uma sequência de DNA selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 1065-1329 e pelo menos um de a pluralidade de molécu-
las de siRNA ou shRNA compreende cerca de 19-30 nucleotídeos que se ligam a uma sequência de RNA codificada por uma sequência de DNA selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 154-
813.
41. Célula efetora imune modificada, de acordo com a rei- vindicação 39 ou 40, caracterizada pelo fato de que pelo menos uma dentre a pluralidade de moléculas de siRNA ou shRNA compreende cerca de 19-30 nucleotídeos que se ligam a uma sequência de RNA codificada por uma sequência de DNA selecionada do grupo que con- siste nas SEQ ID NOs: 1112-1227 e pelo menos um de a pluralidade de moléculas de siRNA ou shRNA compreende cerca de 19-30 nucleo- tídeos que se ligam a uma sequência de RNA codificada por uma se- quência de DNA selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs:499-524.
42. Célula efetora imune modificada, de acordo com a rei- vindicação 34, caracterizada pelo fato de que pelo menos um dos ge- nes-alvo endógenos é PELI1 e pelo menos um dos genes-alvo endó- genos é selecionado do grupo que consiste em IKZF1, IKZF3, GATA3, BCL3, TNIP1, TNFAIP3, NFKBIA, SMAD2, TGFBR1, TGFBR2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6, IKZF2, CBLB, PPP2R2D, NRP1, HAVCR2, LAG3, TIGIT, CTLA4, PTPN6, PDCD1, e BCOR.
43. Célula efetora imune modificada, de acordo com a rei- vindicação 42, caracterizada pelo fato de que pelo menos uma dentre a pluralidade de moléculas de siRNA ou shRNA compreende cerca de 19-30 nucleotídeos que se ligam a uma sequência de RNA codificada por uma sequência de DNA definida por um conjunto de coordenadas de genoma mostradas na Tabela 6E e na Tabela 6F e pelo menos uma dentre a pluralidade de moléculas de siRNA ou shRNA compre- ende cerca de 19-30 nucleotídeos que se ligam a uma sequência de RNA codificada por uma sequência de DNA definida por um conjunto de coordenadas de genoma mostradas na Tabela 5A e na Tabela 5B.
44. Célula efetora imune modificada, de acordo com a rei- vindicação 42 ou 43, caracterizada pelo fato de que pelo menos uma dentre a pluralidade de moléculas de siRNA ou shRNA compreende cerca de 19-30 nucleotídeos que se ligam a uma sequência de RNA codificada por uma sequência de DNA selecionada do grupo que con- siste nas SEQ ID NOs: 1330-1350 e pelo menos um de a pluralidade de moléculas de siRNA ou shRNA compreende cerca de 19-30 nucleo- tídeos que se ligam a uma sequência de RNA codificada por uma se- quência de DNA selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 154-813.
45. Célula efetora imune modificada, de acordo com a rei- vindicação 44, caracterizada pelo fato de que pelo menos uma dentre a pluralidade de moléculas de siRNA ou shRNA compreende cerca de 19-30 nucleotídeos que se ligam a uma sequência de RNA codificada por uma sequência de DNA selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 1351-1367 e pelo menos um de a pluralidade de molécu- las de siRNA ou shRNA compreende cerca de 19-30 nucleotídeos que se ligam a uma sequência de RNA codificada por uma sequência de DNA selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 499-
524.
46. Célula efetora imune modificada, de acordo com a rei- vindicação 34, caracterizada pelo fato de que pelo menos um dos ge- nes-alvo endógenos é SETD5 e pelo menos um dos genes-alvo endó- genos é selecionado do grupo que consiste em IKZF1, IKZF3, GATA3, BCL3, TNIP1, TNFAIP3, NFKBIA, SMAD2, TGFBR1, TGFBR2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6, IKZF2, CBLB, PPP2R2D, NRP1, HAVCR2, LAG3, TIGIT, CTLA4, PTPN6, PDCD1, e BCOR.
47. Célula efetora imune modificada, de acordo com a rei- vindicação 46, caracterizada pelo fato de que pelo menos uma dentre a pluralidade de moléculas de siRNA ou shRNA compreende cerca de 19-30 nucleotídeos que se ligam a uma sequência de RNA codificada por uma sequência de DNA definida por um conjunto de coordenadas de genoma mostradas na Tabela 6G e na Tabela 6H e pelo menos uma dentre a pluralidade de moléculas de siRNA ou shRNA compre- ende cerca de 19-30 nucleotídeos que se ligam a uma sequência de RNA codificada por uma sequência de DNA definida por um conjunto de coordenadas de genoma mostradas na Tabela 5A e na Tabela 5B.
48. Célula efetora imune modificada, de acordo com a rei- vindicação 46 ou 47, caracterizada pelo fato de que pelo menos uma dentre a pluralidade de moléculas de siRNA ou shRNA compreende cerca de 19-30 nucleotídeos que se ligam a uma sequência de RNA codificada por uma sequência de DNA selecionada do grupo que con- siste nas SEQ ID NOs: 1351-1367 e pelo menos um de a pluralidade de moléculas de siRNA ou shRNA compreende cerca de 19-30 nucleo- tídeos que se ligam a uma sequência de RNA codificada por uma se- quência de DNA selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 154-813.
49. Célula efetora imune modificada, de acordo com a rei- vindicação 48, caracterizada pelo fato de que pelo menos uma dentre a pluralidade de moléculas de siRNA ou shRNA compreende cerca de 19-30 nucleotídeos que se ligam a uma sequência de RNA codificada por uma sequência de DNA selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 1351-1367 e pelo menos um de a pluralidade de molécu- las de siRNA ou shRNA compreende cerca de 19-30 nucleotídeos que se ligam a uma sequência de RNA codificada por uma sequência de DNA selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 499-
524.
50. Célula efetora imune modificada, de acordo com a rei- vindicação 20, caracterizada pelo fato de que o sistema de regulação de genes compreende uma proteína enzimática e em que a proteína enzimática foi projetada para se ligar especificamente a uma sequên- cia alvo em um ou mais dos genes endógenos.
51. Célula efetora imune modificada, de acordo com a rei- vindicação 50, caracterizada pelo fato de que a proteína é uma nu- clease efetora do tipo ativador de transcrição (TALEN), uma nuclease de dedo de zinco ou uma meganuclease.
52. Célula efetora imune modificada, de acordo com a rei- vindicação 20, caracterizada pelo fato de que o sistema de regulação de genes compreende uma molécula de ácido nucleico guia e uma proteína enzimática, em que a molécula de ácido nucleico é uma mo- lécula de RNA guia (gRNA) e a proteína enzimática é uma proteína Cas ou um ortólogo Cas.
53. Célula efetora imune modificada, de acordo com a rei- vindicação 52, caracterizada pelo fato de que os um ou mais genes- alvo endógenos são selecionados do grupo que consiste em IKZF1, IKZF3, GATA3, BCL3, TNIP1, TNFAIP3, NFKBIA, SMAD2, TGFBR1, TGFBR2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6, IKZF2, CBLB, PPP2R2D, NRP1, HAVCR2, LAG3, TIGIT, CTLA4, PTPN6, PDCD1, e BCOR, e em que molécula de gRNA compreende uma sequência de domínio de direcionamento que se liga a uma sequência de ácido nucleico defini- da por uma sequência de ácidos nucleicos definida por um conjunto de coordenadas de genoma mostradas em Tabela 5A e Tabela 5B.
54. Célula efetora imune modificada, de acordo com a rei- vindicação 53, caracterizada pelo fato de que a molécula de gRNA compreende uma sequência de domínio alvo que se liga a uma se- quência de DNA alvo selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 154-813.
55. Célula efetora imune modificada, de acordo com a rei- vindicação 53, caracterizada pelo fato de que a molécula de gRNA compreende uma sequência de domínio alvo codificada por uma se- quência de ácido nucleico selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 154-813.
56. Célula efetora imune modificada, de acordo com a rei- vindicação 52, caracterizada pelo fato de que os um ou mais genes- alvo endógenos selecionados do grupo que consiste em BCL2L11, FLI1, CALM2, DHODH, UMPS, RBM39, SEMA7A, CHIC2, PCBP1, PBRM1, WDR6, E2F8, SERPINA3, e GNAS, e em que a molécula de gRNA compreende uma sequência de domínio de direcionamento que se liga a uma sequência de ácido nucleico definida por um conjunto de coordenadas de genoma mostradas na Tabela 6A e na Tabela 6B.
57. Célula efetora imune modificada, de acordo com a rei- vindicação 56, caracterizada pelo fato de que a molécula de gRNA compreende uma sequência de domínio alvo que se liga a uma se- quência de DNA alvo selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 814-1064.
58. Célula efetora imune modificada, de acordo com a rei- vindicação 56, caracterizada pelo fato de que a molécula de gRNA compreende uma sequência de domínio alvo codificada por uma se- quência de ácido nucleico selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 814-1064.
59. Célula efetora imune modificada, de acordo com a rei- vindicação 52, caracterizada pelo fato de que o um ou mais genes- alvo endógenos selecionados do grupo que consiste em PTPN1, PTPN2, PTPN22, SH2B3, SH2D1A, PIK3CD e EGR2e em que a mo- lécula de gRNA compreende uma sequência de domínio de direcio- namento que se liga a uma sequência de ácido nucleico definida por um conjunto de coordenadas do genoma mostrado na Tabela 6C e na Tabela 6D.
60. Célula efetora imune modificada, de acordo com a rei-
vindicação 59, caracterizada pelo fato de que a molécula de gRNA compreende uma sequência de domínio alvo que se liga a uma se- quência de DNA alvo selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 1065-1329.
61. Célula efetora imune modificada, de acordo com a rei- vindicação 59, caracterizada pelo fato de que a molécula de gRNA compreende uma sequência de domínio alvo codificada por uma se- quência de ácido nucleico selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 1065-1329.
62. Célula efetora imune modificada, de acordo com a rei- vindicação 59, caracterizada pelo fato de que a molécula de gRNA compreende uma sequência de domínio alvo que se liga a uma se- quência de DNA alvo selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 1112-1227.
63. Célula efetora imune modificada, de acordo com a rei- vindicação 59, caracterizada pelo fato de que a molécula de gRNA compreende uma sequência de domínio alvo codificada por uma se- quência de ácido nucleico selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 1112-1227.
64. Célula efetora imune modificada, de acordo com a rei- vindicação 52, caracterizada pelo fato de que os um ou mais genes- alvo endógenos são PELI1e em que a molécula de gRNA compreende uma sequência de domínio de direcionamento que se liga a uma se- quência de ácido nucleico definida por um conjunto de coordenadas de genoma mostradas nas Tabelas 6E e 6F.
65. Célula efetora imune modificada, de acordo com a rei- vindicação 64, caracterizada pelo fato de que a molécula de gRNA compreende uma sequência de domínio alvo que se liga a uma se- quência de DNA alvo selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 1330-1350.
66. Célula efetora imune modificada, de acordo com a rei- vindicação 64, caracterizada pelo fato de que a molécula de gRNA compreende uma sequência de domínio alvo codificada por uma se- quência de ácido nucleico selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 1330-1350.
67. Célula efetora imune modificada, de acordo com a rei- vindicação 52, caracterizada pelo fato de que os um ou mais genes- alvo endógenos são SETD5e em que a molécula de gRNA compreen- de uma sequência de domínio de direcionamento que se liga a uma sequência de ácido nucleico definida por um conjunto de coordenadas de genoma mostradas nas Tabelas 6G e 6H.
68. Célula efetora imune modificada, de acordo com a rei- vindicação 67, caracterizada pelo fato de que a molécula de gRNA compreende uma sequência de domínio alvo que se liga a uma se- quência de DNA alvo selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 1351-1367.
69. Célula efetora imune modificada, de acordo com a rei- vindicação 67, caracterizada pelo fato de que a molécula de gRNA compreende uma sequência de domínio alvo codificada por uma se- quência de ácido nucleico selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 1351-1367.
70. Célula efetora imune modificada, de acordo com a rei- vindicação 52, caracterizada pelo fato de que o sistema de regulação de genes compreende uma pluralidade de moléculas de gRNA e é ca- paz de reduzir a expressão e/ou função de dois ou mais genes-alvo endógenos.
71. Célula efetora imune modificada, de acordo com a rei- vindicação 70, caracterizada pelo fato de que pelo menos um dos ge- nes-alvo endógenos selecionados do grupo que consiste em BCL2L11, FLI1, CALM2, DHODH, UMPS, RBM39, SEMA7A, CHIC2,
PCBP1, PBRM1, WDR6, E2F8, SERPINA3, e GNAS e pelo menos um dos genes-alvo endógenos é selecionado do grupo que consiste em IKZF1, IKZF3, GATA3, BCL3, TNIP1, TNFAIP3, NFKBIA, SMAD2, TGFBR1, TGFBR2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6, IKZF2, CBLB, PPP2R2D, NRP1, HAVCR2, LAG3, TIGIT, CTLA4, PTPN6, PDCD1, e BCOR.
72. Célula efetora imune modificada, de acordo com a rei- vindicação 71, caracterizada pelo fato de que pelo menos uma dentre a pluralidade de moléculas de gRNA compreende uma sequência de domínio de direcionamento que se liga a uma sequência de ácido nu- cleico definida por um conjunto de coordenadas de genoma mostradas na Tabela 6A e na Tabela 6B e pelo menos uma dentre a pluralidade de molécula de gRNA compreende uma sequência de domínio de di- recionamento que se liga a uma sequência de ácido nucleico definida por um conjunto de coordenadas de genoma mostradas na Tabela 5A e na Tabela 5B.
73. Célula efetora imune modificada, de acordo com a rei- vindicação 72, caracterizada pelo fato de que pelo menos uma dentre a pluralidade de moléculas de gRNA compreende uma sequência de domínio de direcionamento que se liga a uma sequência de DNA alvo selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 814-1064 e pelo menos uma da pluralidade de moléculas de gRNA compreende uma sequência de domínio de direcionamento que se liga a uma se- quência de DNA alvo selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 154-813.
74. Célula efetora imune modificada, de acordo com a rei- vindicação 72, caracterizada pelo fato de que pelo menos uma dentre a pluralidade de moléculas de gRNA compreende uma sequência de domínio de direcionamento codificada por uma sequência de ácido nu- cleico selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 814-1064 e pelo menos uma dentre a pluralidade de moléculas de gRNA compre- ende uma sequência de domínio de direcionamento codificada por uma sequência de ácido nucleico selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 154-813.
75. Célula efetora imune modificada, de acordo com a rei- vindicação 70, caracterizada pelo fato de que pelo menos um dos ge- nes-alvo endógenos selecionados do grupo que consiste em BCL2L11, FLI1, CALM2, DHODH, UMPS, RBM39, SEMA7A, CHIC2, PCBP1, PBRM1, WDR6, E2F8, SERPINA3, e GNASe pelo menos um dos genes-alvo endógenos é selecionado do grupo que consiste em TNFAIP3, CBLB, e BCOR.
76. Célula efetora imune modificada, de acordo com a rei- vindicação 70, caracterizada pelo fato de que pelo menos um dos ge- nes-alvo endógenos é selecionado do grupo que consiste em PTPN1, PTPN2, PTPN22, SH2B3, SH2D1A, PIK3CD, e EGR2 e pelo menos um dos genes-alvo endógenos é selecionado do grupo consistindo em IKZF1, IKZF3, GATA3, BCL3, TNIP1, TNFAIP3, NFKBIA, SMAD2, TGFBR1, TGFBR2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6, IKZF2, CBLB, PPP2R2D, NRP1, HAVCR2, LAG3, TIGIT, CTLA4, PTPN6, PDCD1, e
BCOR
77. Célula efetora imune modificada, de acordo com a rei- vindicação 76, caracterizada pelo fato de que pelo menos uma dentre a pluralidade de moléculas de gRNA compreende uma sequência de domínio de direcionamento que se liga a uma sequência de ácido nu- cleico definida por um conjunto de coordenadas de genoma mostradas na Tabela 6C e na Tabela 6D e pelo menos uma dentre a pluralidade de molécula de gRNA compreende uma sequência de domínio de di- recionamento que se liga a uma sequência de ácido nucleico definida por um conjunto de coordenadas de genoma mostradas na Tabela 5A e na Tabela 5B.
78. Célula efetora imune modificada, de acordo com a rei- vindicação 77, caracterizada pelo fato de que pelo menos uma dentre a pluralidade de moléculas de gRNA compreende uma sequência de domínio de direcionamento que se liga a uma sequência de DNA alvo selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 1065- 1329 e pelo menos uma da pluralidade de moléculas de gRNA com- preende uma sequência de domínio de direcionamento que se liga a uma sequência de DNA alvo selecionada a partir do grupo que consis- te em SEQ ID NOs: 154-813.
79. Célula efetora imune modificada, de acordo com a rei- vindicação 70, caracterizada pelo fato de que pelo menos um dos ge- nes-alvo endógenos selecionados do grupo que consiste em PTPN1, PTPN2, PTPN22, SH2B3, SH2D1A, PIK3CD, e EGR2 e pelo menos um dos genes-alvo endógenos é selecionado a partir do grupo que consiste em TNFAIP3, CBLB, e BCOR.
80. Célula efetora imune modificada, de acordo com a rei- vindicação 70, caracterizada pelo fato de que pelo menos um dos ge- nes-alvo endógenos é PTPN2 e pelo menos um dos genes-alvo endó- genos é selecionado a partir do grupo que consiste em TNFAIP3, CBLB e BCOR.
81. Célula efetora imune modificada, de acordo com a rei- vindicação 78, caracterizada pelo fato de que pelo menos uma dentre a pluralidade de moléculas de gRNA compreende uma sequência de domínio de direcionamento que se liga a uma sequência de DNA alvo selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 1112- 1227 e pelo menos uma da pluralidade de moléculas de gRNA com- preende uma sequência de domínio de direcionamento que se liga a uma sequência de DNA alvo selecionada a partir do grupo que consis- te em SEQ ID NOs: 499-524.
82. Célula efetora imune modificada, de acordo com a rei-
vindicação 77, caracterizada pelo fato de que pelo menos uma dentre a pluralidade de moléculas de gRNA compreende uma sequência de domínio de direcionamento codificada por uma sequência de ácido nu- cleico selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 1065-1329 e pelo menos uma dentre a pluralidade de moléculas de gRNA com- preende uma sequência de domínio de direcionamento codificada por uma sequência de ácido nucleico selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 154-813.
83. Célula efetora imune modificada, de acordo com a rei- vindicação 82, caracterizada pelo fato de que pelo menos uma dentre a pluralidade de moléculas de gRNA compreende uma sequência de domínio de direcionamento codificada por uma sequência de ácido nu- cleico selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 1112-1227 e pelo menos uma dentre a pluralidade de moléculas de gRNA com- preende uma sequência de domínio de direcionamento codificada por uma sequência de ácido nucleico selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 499-524.
84. Célula efetora imune modificada, de acordo com a rei- vindicação 70, caracterizada pelo fato de que pelo menos um dos ge- nes-alvo endógenos é PELI1e pelo menos um dos genes-alvo endó- genos é selecionado do grupo que consiste em IKZF1, IKZF3, GATA3, BCL3, TNIP1, TNFAIP3, NFKBIA, SMAD2, TGFBR1, TGFBR2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6, IKZF2, CBLB, PPP2R2D, NRP1, HAVCR2, LAG3, TIGIT, CTLA4, PTPN6, PDCD1, e BCOR.
85. Célula efetora imune modificada, de acordo com a rei- vindicação 84, caracterizada pelo fato de que pelo menos uma dentre a pluralidade de moléculas de gRNA compreende uma sequência de domínio de direcionamento que se liga a uma sequência de ácido nu- cleico definida por um conjunto de coordenadas de genoma mostradas na Tabela 6E e na Tabela 6F e pelo menos uma dentre a pluralidade de molécula de gRNA compreende uma sequência de domínio de di- recionamento que se liga a uma sequência de ácido nucleico definida por um conjunto de coordenadas de genoma mostradas na Tabela 5A e na Tabela 5B.
86. Célula efetora imune modificada, de acordo com a rei- vindicação 85, caracterizada pelo fato de que pelo menos uma dentre a pluralidade de moléculas de gRNA compreende uma sequência de domínio de direcionamento que se liga a uma sequência de DNA alvo selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 1330- 1350 e pelo menos uma da pluralidade de moléculas de gRNA com- preende uma sequência de domínio de direcionamento que se liga a uma sequência de DNA alvo selecionada a partir do grupo que consis- te em SEQ ID NOs: 154-813.
87. Célula efetora imune modificada, de acordo com a rei- vindicação 70, caracterizada pelo fato de que pelo menos um dos ge- nes-alvo endógenos é PELI1 e pelo menos um dos genes-alvo endó- genos é selecionado a partir do grupo que consiste em TNFAIP3, CBLB, e BCOR.
88. Célula efetora imune modificada, de acordo com a rei- vindicação 86, caracterizada pelo fato de que pelo menos uma dentre a pluralidade de moléculas de gRNA compreende uma sequência de domínio de direcionamento que se liga a uma sequência de DNA alvo selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 1351- 1367 e pelo menos uma da pluralidade de moléculas de gRNA com- preende uma sequência de domínio de direcionamento que se liga a uma sequência de DNA alvo selecionada a partir do grupo que consis- te em SEQ ID NOs: 499-524.
89. Célula efetora imune modificada, de acordo com a rei- vindicação 85, caracterizada pelo fato de que pelo menos uma dentre a pluralidade de moléculas de gRNA compreende uma sequência de domínio de direcionamento codificada por uma sequência de ácido nu- cleico selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 1330-1350 e pelo menos uma da pluralidade de moléculas de gRNA compreende uma sequência de domínio de direcionamento que se liga a uma sequência de DNA alvo selecionada a partir do grupo que con- siste em SEQ ID NOs: 154-813.
90. Célula efetora imune modificada, de acordo com a rei- vindicação 89, caracterizada pelo fato de que pelo menos uma dentre a pluralidade de moléculas de gRNA compreende uma sequência de domínio de direcionamento codificada por uma sequência de ácido nu- cleico selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 1351-1367 e pelo menos uma dentre a pluralidade de moléculas de gRNA com- preende uma sequência de domínio de direcionamento que se liga em uma sequência de DNA alvo selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 499-524.
91. Célula efetora imune modificada, de acordo com a rei- vindicação 70, caracterizada pelo fato de que pelo menos um dos ge- nes-alvo endógenos é SETD5e pelo menos um dos genes-alvo endó- genos é selecionado do grupo que consiste em IKZF1, IKZF3, GATA3, BCL3, TNIP1, TNFAIP3, NFKBIA, SMAD2, TGFBR1, TGFBR2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6, IKZF2, CBLB, PPP2R2D, NRP1, HAVCR2, LAG3, TIGIT, CTLA4, PTPN6, PDCD1, e BCOR.
92. Célula efetora imune modificada, de acordo com a rei- vindicação 91, caracterizada pelo fato de que pelo menos uma dentre a pluralidade de moléculas de gRNA compreende uma sequência de domínio de direcionamento que se liga a uma sequência de ácido nu- cleico definida por um conjunto de coordenadas de genoma mostradas na Tabela 6G e na Tabela 6H e pelo menos uma dentre a pluralidade de molécula de gRNA compreende uma sequência de domínio de di- recionamento que se liga a uma sequência de ácido nucleico definida por um conjunto de coordenadas de genoma mostradas na Tabela 5A e na Tabela 5B.
93. Célula efetora imune modificada, de acordo com a rei- vindicação 92, caracterizada pelo fato de que pelo menos uma dentre a pluralidade de moléculas de gRNA compreende uma sequência de domínio de direcionamento que se liga a uma sequência de DNA alvo selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 1351- 1367 e pelo menos uma da pluralidade de moléculas de gRNA com- preende uma sequência de domínio de direcionamento que se liga a uma sequência de DNA alvo selecionada a partir do grupo que consis- te em SEQ ID NOs: 154-813.
94. Célula efetora imune modificada, de acordo com a rei- vindicação 70, caracterizada pelo fato de que pelo menos um dos ge- nes-alvo endógenos é SETD5 e pelo menos um dos genes-alvo endó- genos é selecionado a partir do grupo que consiste em TNFAIP3, CBLB, e BCOR.
95. Célula efetora imune modificada, de acordo com a rei- vindicação 93, caracterizada pelo fato de que pelo menos uma dentre a pluralidade de moléculas de gRNA compreende uma sequência de domínio de direcionamento que se liga a uma sequência de DNA alvo selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 1351- 1367 e pelo menos uma da pluralidade de moléculas de gRNA com- preende uma sequência de domínio de direcionamento que se liga a uma sequência de DNA alvo selecionada a partir do grupo que consis- te em SEQ ID NOs: 499-524.
96. Célula efetora imune modificada, de acordo com a rei- vindicação 92, caracterizada pelo fato de que pelo menos uma dentre a pluralidade de moléculas de gRNA compreende uma sequência de domínio de direcionamento codificada por uma sequência de ácido nu- cleico selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 1351-1367 e pelo menos uma dentre a pluralidade de moléculas de gRNA com- preende uma sequência de domínio de direcionamento codificada por uma sequência de ácido nucleico selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 154-813.
97. Célula efetora imune modificada, de acordo com a rei- vindicação 96, caracterizada pelo fato de que pelo menos uma dentre a pluralidade de moléculas de gRNA compreende uma sequência de domínio de direcionamento codificada por uma sequência de ácido nu- cleico selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 1351-1367 e pelo menos uma dentre a pluralidade de moléculas de gRNA com- preende uma sequência de domínio de direcionamento codificada por uma sequência de ácido nucleico selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 499-524.
98. Célula efetora imune modificada, de acordo com qual- quer uma das reivindicações 52-97, caracterizada pelo fato de que: a. a proteína Cas é uma proteína Cas de tipo selvagem que compreende dois domínios enzimaticamente ativos e capaz de induzir quebras de DNA de fita dupla; b. a proteína Cas é um mutante de Nickase de Cas com- preendendo um domínio enzimaticamente ativo e capaz de induzir quebras de DNA de fita simples; ou c. a proteína Cas é uma proteína Cas desativada (dCas) e está associada a uma proteína heteróloga capaz de modular a ex- pressão de um ou mais genes-alvo endógenos.
99. Célula efetora imune modificada, de acordo com qual- quer uma das reivindicações 52-98, caracterizada pelo fato de que a proteína Cas é uma proteína Cas9.
100. Célula efetora imune modificada, de acordo com a rei- vindicação 98, caracterizada pelo fato de que a proteína heteróloga é selecionada a partir do grupo que consiste em proteína que interage com MAX 1 (MXI1), domínio de caixa associada a Krüppel (KRAB), proteína de ligação 2 de metil-CpG (MECP2) e quatro domínios mSin3 concatenados (SID4X).
101. Célula efetora imune modificada, de acordo com qual- quer uma das reivindicações 50-100, caracterizada pelo fato de que o sistema de regulação de genes introduz uma mutação inativadora nos um ou mais genes-alvo endógenos.
102. Célula efetora imune modificada, de acordo com rei- vindicação 101, caracterizada pelo fato de que a mutação inativadora compreende uma exclusão, substituição ou inserção de um ou mais nucleotídeos nas sequências genômicas dos dois ou mais genes en- dógenos.
103. Célula efetora imune modificada, de acordo com a rei- vindicação 102, caracterizada pelo fato de que a deleção é uma dele- ção parcial ou completa dos dois ou mais genes-alvo endógenos.
104. Célula efetora imune modificada, de acordo com a rei- vindicação 102, caracterizada pelo fato de que a mutação inativadora é uma mutação de frameshift.
105. Célula efetora imune modificada, de acordo com qual- quer uma das reivindicações 101-104, caracterizada pelo fato de que a mutação inativadora reduz a expressão e/ou a função dos dois ou mais genes-alvo endógenos.
106. Célula efetora imune modificada, de acordo com qual- quer uma das reivindicações 1-105, caracterizada pelo fato de que o sistema de regulação de genes é introduzido na célula efetora imune por transfecção, transdução, eletroporação ou interrupção física da membrana celular por um dispositivo microfluídico.
107. Célula efetora imune modificada, de acordo com a rei- vindicação 106, caracterizada pelo fato de que o sistema de regula- ção de genes é introduzido como um polinucleotídeo que codifica um ou mais componentes do sistema, uma proteína ou um complexo de ribonucleoproteína (RNP).
108. Célula efetora imune modificada caracterizada pelo fato de que compreende expressão e/ou função reduzida de um ou mais genes endógenos selecionados do grupo que consiste em IKZF1, IKZF3, GATA3, BCL3, TNIP1, TNFAIP3, NFKBIA, SMAD2, TGFBR1, TGFBR2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6, IKZF2, CBLB, PPP2R2D, NRP1, HAVCR2, LAG3, TIGIT, CTLA4, PTPN6, PDCD1, e BCOR, em que a função e/ou expressão reduzida dentre um ou mais genes en- dógenos aprimora uma função efetora da célula efetora imune
109. Célula efetora imune modificada caracterizada pelo fato de que compreende expressão e/ou função reduzida de um ou mais genes endógenos selecionados dentre: (a) o grupo constituído por IKZF1, IKZF3, GATA3, BCL3, TNIP1, TNFAIP3, NFKBIA, SMAD2, TGFBR1, TGFBR2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6, e IKZF2; ou (b) o grupo que consiste em CBLB, PPP2R2D, NRP1, HAVCR2, LAG3, TI- GIT, CTLA4, PTPN6, PDCD1, e BCOR, em que a expressão e/ou função reduzida de um ou mais genes endógenos aprimora uma função efetora da célula efetora imu- ne.
110. Célula efetora imune modificada caracterizada pelo fato de que compreende expressão e/ou função reduzida de um ou mais genes-alvo endógenos selecionados dentre: (a) o grupo que con- siste em BCL2L11, FLI1, CALM2, DHODH, UMPS, RBM39, SEMA7A, CHIC2, PCBP1, PBRM1, WDR6, E2F8, SERPINA3, e GNAS; (b) o grupo que consiste em PTPN1, PTPN2, PTPN22, SH2B3, SH2D1A, PIK3CD, e EGR2; (c) PELI1; ou (d) SETD5, em que a expressão e/ou função reduzida de um ou mais genes endógenos aprimora uma função efetora da célula efetora imu- ne modificada.
111. Célula efetora imune modificada caracterizada pelo fato de que compreende expressão e/ou função reduzida de dois ou mais genes-alvo selecionados de IKZF1, IKZF3, GATA3, BCL3, TNIP1, TNFAIP3, NFKBIA, SMAD2, TGFBR1, TGFBR2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6, IKZF2, CBLB, PPP2R2D, NRP1, HAVCR2, LAG3, TIGIT, CTLA4, PTPN6, PDCD1, e BCOR, em que a expressão e/ou função reduzidas dos dois ou mais genes endógenos aprimora uma função efetora da célula efetora modificada.
112. Célula efetora imune modificada, de acordo com a rei- vindicação 111, caracterizada pelo fato de que compreende expres- são e/ou função reduzida de CBLB e BCOR.
113. Célula efetora imune modificada caracterizada pelo fato de que compreende expressão e/ou função reduzida de dois ou mais genes-alvo, em que pelo menos um gene-alvo é selecionado do grupo que consiste em BCL2L11, FLI1, CALM2, DHODH, UMPS, RBM39, SEMA7A, CHIC2, PCBP1, PBRM1, WDR6, E2F8, SERPINA3, e GNAS, e em que pelo menos um gene-alvo é selecionado do grupo que consiste em IKZF1, IKZF3, GATA3, BCL3, TNIP1, TNFAIP3, NFKBIA, SMAD2, TGFBR1, TGFBR2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6, IKZF2, CBLB, PPP2R2D, NRP1, HAVCR2, LAG3, TIGIT, CTLA4, PTPN6, PDCD1, e BCOR, em que a expressão reduzida e/ou a fun- ção dos dois ou mais genes endógenos aprimora a função efetora do efetor imunológico modificado célula.
114. Célula efetora imune modificada caracterizada pelo fato de que compreende expressão e/ou função reduzida de dois ou mais genes-alvo, em que pelo menos um gene-alvo é selecionado a partir do grupo que consiste em PTPN1, PTPN2, PTPN22, SH2B3, SH2D1A, PIK3CD, e EGR2, e em que pelo menos um dos genes-alvo endógenos é selecionado do grupo que consiste em IKZF1, IKZF3, GATA3, BCL3, TNIP1, TNFAIP3, NFKBIA, SMAD2, TGFBR1,
TGFBR2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6, IKZF2, CBLB, PPP2R2D, NRP1, HAVCR2, LAG3, TIGIT, CTLA4, PTPN6, PDCD1, e BCOR, em que a expressão e/ou função reduzida dentre dois ou mais genes en- dógenos aprimora uma função efetora da célula efetora imune modifi- cada.
115. Célula efetora imune modificada, de acordo com a rei- vindicação 114, caracterizada pelo fato de que compreende expres- são e/ou função reduzida de PTPN2 e CBLB.
116. Célula efetora imune modificada, de acordo com a rei- vindicação 114, caracterizada pelo fato de que compreende expres- são e/ou função reduzida de PTPN2 e BCOR.
117. Célula efetora imune modificada, de acordo com a rei- vindicação 114, caracterizada pelo fato de que compreende expres- são e/ou função reduzida de PTPN2 e TNFAIP3.
118. Célula efetora imune modificada caracterizada pelo fato de que compreende expressão e/ou função reduzida de dois ou mais genes-alvo, em que pelo menos um gene-alvo é PELI1, e em que pelo menos um gene-alvo é selecionado do grupo que consiste em IKZF1, IKZF3, GATA3, BCL3, TNIP1, TNFAIP3, NFKBIA, SMAD2, TGFBR1, TGFBR2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6, IKZF2, CBLB, PPP2R2D, NRP1, HAVCR2, LAG3, TIGIT, CTLA4, PTPN6, PDCD1, e BCOR, em que a expressão e/ou função reduzida dentre dois ou mais genes endógenos aprimora uma função efetora da célula efetora imu- ne modificada.
119. Célula efetora imune modificada, de acordo com a rei- vindicação 118, caracterizada pelo fato de que compreende expres- são e/ou função reduzida de PELI1 e CBLB.
120. Célula efetora imune modificada, de acordo com a rei- vindicação 118, caracterizada pelo fato de que compreende expres- são e/ou função reduzida de PELI1 e BCOR.
121. Célula efetora imune modificada, de acordo com a rei- vindicação 118, caracterizada pelo fato de que compreende expres- são e/ou função reduzida de PELI1 e TNFAIP3.
122. Célula efetora imune modificada caracterizada pelo fato de que compreende expressão e/ou função reduzida de dois ou mais genes-alvo, em que pelo menos um gene-alvo é SETD5, e em que pelo menos um gene-alvo é selecionado do grupo que consiste em IKZF1, IKZF3, GATA3, BCL3, TNIP1, TNFAIP3, NFKBIA, SMAD2, TGFBR1, TGFBR2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6, IKZF2, CBLB, PPP2R2D, NRP1, HAVCR2, LAG3, TIGIT, CTLA4, PTPN6, PDCD1, e BCOR, em que a expressão e/ou função reduzida dentre dois ou mais genes endógenos aprimora uma função efetora da célula efetora imu- ne modificada.
123. Célula efetora imune modificada, de acordo com a rei- vindicação 122, caracterizada pelo fato de que compreende expres- são e/ou função reduzida de SETD5 e CBLB.
124. Célula efetora imune modificada, de acordo com a rei- vindicação 122, caracterizada pelo fato de que compreende expres- são e/ou função reduzida de SETD5 e BCOR.
125. Célula efetora imune modificada, de acordo com a rei- vindicação 122, caracterizada pelo fato de que compreende expres- são e/ou função reduzida de SETD5 e TNFAIP3.
126. Célula efetora imune modificada caracterizada pelo fato de que compreende uma mutação inativadora em um ou mais ge- nes endógenos selecionados do grupo que consiste em IKZF1, IKZF3, GATA3, BCL3, TNIP1, TNFAIP3, NFKBIA, SMAD2, TGFBR1, TGFBR2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6, IKZF2, CBLB, PPP2R2D, NRP1, HAVCR2, LAG3, TIGIT, CTLA4, PTPN6, PDCD1, eBCOR.
127. Célula efetora imune modificada caracterizada pelo fato de que compreende uma mutação inativadora em um ou mais ge-
nes endógenos selecionados dentre: (a) o grupo que consiste em IKZF1, IKZF3, GATA3, BCL3, TNIP1, TNFAIP3, NFKBIA, SMAD2, TGFBR1, TGFBR2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6, e IKZF2; ou (b) o grupo que consiste em CBLB, PPP2R2D, NRP1, HAVCR2, LAG3, TI- GIT, CTLA4, PTPN6, PDCD1, e BCOR.
128. Célula efetora imune modificada caracterizada pelo fato de que compreende uma mutação inativadora em um ou mais ge- nes endógenos selecionados dentre: (a) o grupo que consiste em BCL2L11, FLI1, CALM2, DHODH, UMPS, RBM39, SEMA7A, CHIC2, PCBP1, PBRM1, WDR6, E2F8, SERPINA3, e GNAS; (b) o grupo que consiste em PTPN1, PTPN2, PTPN22, SH2B3, SH2D1A, PIK3CD, e EGR2; (c) PELI1; ou (d) SETD5.
129. Célula efetora imune modificada caracterizada pelo fato de que compreende uma mutação inativadora em dois ou mais genes-alvos nos selecionados de IKZF1, IKZF3, GATA3, BCL3, TNIP1, TNFAIP3, NFKBIA, SMAD2, TGFBR1, TGFBR2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6, IKZF2, CBLB, PPP2R2D, NRP1, HAVCR2, LAG3, TIGIT, CTLA4, PTPN6, PDCD1, e BCOR.
130. Célula efetora imune modificada, de acordo com a rei- vindicação 129, caracterizada pelo fato de que compreende uma mu- tação inativadora nos genes CBLB e BCOR.
131. Célula efetora imune modificada caracterizada pelo fato de que compreende uma mutação inativadora em dois ou mais genes-alvo, em que pelo menos um gene-alvo é selecionado do grupo que consiste em BCL2L11, FLI1, CALM2, DHODH, UMPS, RBM39, SEMA7A, CHIC2, PCBP1, PBRM1, WDR6, E2F8, SERPINA3, e GNAS, e pelo menos um gene-alvo é selecionado do grupo que con- siste em IKZF1, IKZF3, GATA3, BCL3, TNIP1, TNFAIP3, NFKBIA, SMAD2, TGFBR1, TGFBR2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6, IKZF2, CBLB, PPP2R2D, NRP1, HAVCR2, LAG3, TIGIT, CTLA4, PTPN6,
PDCD1, e BCOR.
132. Célula efetora imune modificada caracterizada pelo fato de que compreende uma mutação inativadora em dois ou mais genes-alvo, em que pelo menos um gene-alvo é selecionado a partir do grupo que consiste em PTPN1, PTPN2, PTPN22, SH2B3, SH2D1A, PIK3CD, e EGR2 e pelo menos um gene-alvo é selecionado do grupo que consiste em IKZF1, IKZF3, GATA3, BCL3, TNIP1, TNFAIP3, NFKBIA, SMAD2, TGFBR1, TGFBR2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6, IKZF2, CBLB, PPP2R2D, NRP1, HAVCR2, LAG3, TIGIT, CTLA4, PTPN6, PDCD1, e BCOR.
133. Célula efetora imune modificada, de acordo com a rei- vindicação 132, caracterizada pelo fato de que compreende uma mu- tação inativadora nos genes PTPN2 e CBLB.
134. Célula efetora imune modificada, de acordo com a rei- vindicação 132, caracterizada pelo fato de que compreende uma mu- tação inativadora nos genes PTPN2 e BCOR.
135. Célula efetora imune modificada, de acordo com a rei- vindicação 132, caracterizada pelo fato de que compreende uma mu- tação inativadora nos genes PTPN2 e TNFAIP3.
136. Célula efetora imune modificada caracterizada pelo fato de que compreende uma mutação inativadora em dois ou mais genes-alvo, em que pelo menos um gene-alvo é PELI1 e pelo menos um gene-alvo é selecionado do gene-alvo que consiste em IKZF1, IKZF3, GATA3, BCL3, TNIP1, TNFAIP3, NFKBIA, SMAD2, TGFBR1, TGFBR2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6, IKZF2, CBLB, PPP2R2D, NRP1, HAVCR2, LAG3, TIGIT, CTLA4, PTPN6, PDCD1, e BCOR.
137. Célula efetora imune modificada, de acordo com a rei- vindicação 136, caracterizada pelo fato de que compreende uma mu- tação inativadora nos genes PELI1 e CBLB.
138. Célula efetora imune modificada, de acordo com a rei-
vindicação 136, caracterizada pelo fato de que compreende uma mu- tação inativadora nos genes PELI1 e BCOR.
139. Célula efetora imune modificada, de acordo com a rei- vindicação 136, caracterizada pelo fato de que compreende uma mu- tação inativadora nos genes PELI1 e TNFAIP3.
140. Célula efetora imune modificada caracterizada pelo fato de que compreende uma mutação inativadora em dois ou mais genes-alvo, em que pelo menos um gene-alvo é SETD5 e pelo menos um gene-alvo é selecionado do gene-alvo que consiste em IKZF1, IKZF3, GATA3, BCL3, TNIP1, TNFAIP3, NFKBIA, SMAD2, TGFBR1, TGFBR2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6, IKZF2, CBLB, PPP2R2D, NRP1, HAVCR2, LAG3, TIGIT, CTLA4, PTPN6, PDCD1, e BCOR.
141. Célula efetora imune modificada, de acordo com a rei- vindicação 140, caracterizada pelo fato de que compreende uma mu- tação inativadora nos genes SETD5 e CBLB.
142. Célula efetora imune modificada, de acordo com a rei- vindicação 140, caracterizada pelo fato de que compreende uma mu- tação inativadora nos genes SETD5 e BCOR.
143. Célula efetora imune modificada, de acordo com a rei- vindicação 140, caracterizada pelo fato de que compreende uma mu- tação inativadora nos genes SETD5 e TNFAIP3.
144. Célula efetora imune modificada, de acordo com as reivindicações 126-141, caracterizada pelo fato de que a mutação ina- tivadora compreende uma exclusão, substituição ou inserção de um ou mais nucleotídeos nas sequências genômicas dos dois ou mais genes endógenos.
145. Célula efetora imune modificada, de acordo com a rei- vindicação 144, caracterizada pelo fato de que a deleção é uma dele- ção parcial ou completa dos dois ou mais genes-alvo endógenos.
146. Célula efetora imune modificada, de acordo com a rei-
vindicação 144, caracterizada pelo fato de que a mutação inativadora é uma mutação de frameshift.
147. Célula efetora imune modificada, de acordo com qual- quer uma das reivindicações 126-146, caracterizada pelo fato de que a mutação inativadora reduz a expressão e/ou a função dos dois ou mais genes-alvo endógenos.
148. Célula efetora imune modificada, de acordo com qual- quer uma das reivindicações 1-147, caracterizada pelo fato de que a expressão de um ou mais genes-alvo endógenos é reduzida em pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80% ou pelo menos 90% comparado a uma célula efetora imune não modifica- da ou de controle.
149. Célula efetora imune modificada, de acordo com qual- quer uma das reivindicações 1-147, caracterizada pelo fato de que a função de um ou mais genes-alvo endógenos é reduzida em pelo me- nos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80% ou pelo menos 90% comparado a uma célula efetora imune não modificada ou de controle.
150. Célula efetora imune modificada, de acordo com qual- quer uma das reivindicações 1-149, caracterizada pelo fato de com- preender ainda um receptor imune manipulado exibido na superfície da célula.
151. Célula efetora imune modificada, de acordo com a rei- vindicação 150, caracterizada pelo fato de que o receptor imune ma- nipulado é um CAR compreendendo um domínio de ligação ao antíge- no, um domínio transmembranar e um domínio de sinalização intrace- lular
152. Célula efetora imune modificada, de acordo com a rei- vindicação 150, caracterizada pelo fato de que o receptor imune ma- nipulado é um TCR manipulado.
153. Célula efetora imune modificada, de acordo com qual- quer uma das reivindicações 150-152, caracterizada pelo fato de que o receptor imune manipulado se liga especificamente a um antígeno expresso em uma célula-alvo, em que o antígeno é um antígeno asso- ciado a um tumor.
154. Célula efetora imune modificada, de acordo com qual- quer uma das reivindicações 1-153, caracterizada pelo fato de que compreende ainda um transgene exógeno que expressa uma molécula de ativação imune.
155. Célula efetora imune modificada, de acordo com a rei- vindicação 154, caracterizada pelo fato de que a molécula de ativação imune é selecionada do grupo que consiste em uma citocina, uma quimiocina, uma molécula coestimuladora, um peptídeo de ativação, um anticorpo ou um fragmento de ligação a antígeno respectivo.
156. Célula efetora imune modificada, de acordo com a rei- vindicação 155, caracterizada pelo fato de que o anticorpo ou seu fra- gmento de ligação se liga especificamente e inibe a função da proteína codificada por NRP1, HAVCR2, LAG3, TIGIT, CTLA4ou PDCD1.
157. Célula efetora imune modificada, de acordo com qual- quer uma das reivindicações 1-156, caracterizada pelo fato de que a célula efetora imune é aquela em que a célula efetora imune é um lin- fócito selecionado a partir de uma célula T, uma célula natural killer (NK), uma célula NKT.
158. Célula efetora imune modificada, de acordo com a rei- vindicação 157, caracterizada pelo fato de que o linfócito é um linfóci- to infiltrante de tumor (TIL).
159. Célula efetora imune modificada, de acordo com qual- quer uma das reivindicações 1-158, caracterizada pelo fato de que a função efetora é selecionada a partir da proliferação celular, viabilida- de celular, infiltração tumoral, citotoxicidade, respostas imunes antitu-
morais e/ou resistência à exaustão.
160. Composição caracterizada pelo fato de que compre- ende as células efetoras imunes modificadas de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-159.
161. Composição, de acordo com a reivindicação 160, ca- racterizada pelo fato de que compreende ainda um carreador ou dilu- ente farmaceuticamente aceitável.
162. Composição, de acordo com a reivindicação 160 ou 161, caracterizada pelo fato de que a composição compreende pelo menos 1 x 104, 1 x 105, 1 x 106, 1 x 107, 1 x 108, 1 x 109, 1 x 1010, ou 1 x 1011 células efetoras imunes modificadas.
163. Composição, de acordo com qualquer uma das reivin- dicações 160-162, caracterizada pelo fato de ser adequada para ad- ministração a um sujeito em necessidade.
164. Composição, de acordo com qualquer uma das reivin- dicações 160-163, caracterizada pelo fato de que compreende células efetoras imunes autólogas derivadas do sujeito em necessidade.
165. Composição, de acordo com qualquer uma das reivin- dicações 160-163, caracterizada pelo fato de que compreende células efetoras imunes alogênicas derivadas de um sujeito doador.
166. Sistema de regulação de genes capaz de reduzir a ex- pressão e/ou função de um ou mais genes-alvo endógenos em uma célula selecionada de: (a) o grupo que consiste em IKZF1, IKZF3, GATA3, BCL3, TNIP1, TNFAIP3, NFKBIA, SMAD2, TGFBR1, TGFBR2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6, e IKZF2; ou (b) o grupo que consiste em CBLB, PPP2R2D, NRP1, HAVCR2, LAG3, TIGIT, CTLA4, PTPN6, PDCD1, e BCOR, caracterizado pelo fato de que o sistema compreende (i) uma molécula de ácido nucleico; (ii) um enzimático; ou (iii) uma molé- cula de ácido nucleico guia e uma proteína enzimática
167. Sistema de regulação de genes capaz de reduzir a ex- pressão de um ou mais genes-alvo endógenos numa célula seleciona- da de: (a) o grupo que consiste em BCL2L11, FLI1, CALM2, DHODH, UMPS, RBM39, SEMA7A, CHIC2, PCBP1, PBRM1, WDR6, E2F8, SERPINA3, e GNAS; (b) o grupo que consiste em PTPN1, PTPN2, PTPN22, SH2B3, SH2D1A, PIK3CD, e EGR2; (c) PELI1; ou (d) SETD5, caracterizado pelo fato de que o sistema compreende (i) uma molécula de ácido nucleico; (ii) um enzimático; ou (iii) uma molé- cula de ácido nucleico guia e uma proteína enzimática.
168. Sistema de regulação de genes, de acordo com a rei- vindicação 166 ou reivindicação 167, caracterizado pelo fato de que o sistema compreende uma molécula de ácido nucleico guia RNA (gRNA) e uma endonuclease de Cas.
169. Sistema de regulação de genes, de acordo com a rei- vindicação 168, caracterizado pelo fato de que o um ou mais genes- alvo endógenos são selecionados dentre IKZF1, IKZF3, GATA3, BCL3, TNIP1, TNFAIP3, NFKBIA, SMAD2, TGFBR1, TGFBR2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6, e IKZF2 ou é selecionado de CBLB, PPP2R2D, NRP1, HAVCR2, LAG3, TIGIT, CTLA4, PTPN6, PDCD1, e BCOR e em que a molécula de gRNA compreende uma sequência de domínio de direcionamento que se liga a uma sequência de DNA de destino definida por um conjunto de coordenadas genômicas mostra- das na Tabela 5A e Tabela 5B.
170. Sistema de regulação de genes, de acordo com a rei- vindicação 169, caracterizado pelo fato de que os um ou mais genes- alvo endógenos são selecionados dentre IKZF1, IKZF3, GATA3, BCL3, TNIP1, TNFAIP3, NFKBIA, SMAD2, TGFBR1, TGFBR2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6, e IKZF2 e em que a molécula de gRNA compreende uma sequência de domínio de direcionamento que se liga a uma sequência de DNA alvo selecionada a partir do grupo que con- siste em SEQ ID NOs: 154-498.
171. Sistema de regulação de genes, de acordo com a rei- vindicação 169 ou reivindicação 170, caracterizado pelo fato de que a molécula de gRNA compreende uma sequência de domínio alvo codi- ficada por uma sequência de ácido nucleico selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 154-498.
172. Sistema de regulação de genes, de acordo com a rei- vindicação 169, caracterizado pelo fato de que um ou mais genes- alvo endógenos são selecionados dentre CBLB, PPP2R2D, NRP1, HAVCR2, LAG3, TIGIT, CTLA4, PTPN6, PDCD1, e BCOR e em que a molécula de gRNA compreende uma sequência de domínio alvo liga- se a uma sequência de DNA alvo selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 499-813.
173. Sistema de regulação de genes, de acordo com a rei- vindicação 169 ou reivindicação 172, caracterizado pelo fato de que a molécula de gRNA compreende uma sequência de domínio alvo codi- ficada por uma sequência de ácido nucleico selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs:499-813.
174. Sistema de regulação de genes, de acordo com a rei- vindicação 168, caracterizado pelo fato de que o um ou mais genes- alvo endógenos são selecionados dentre BCL2L11, FLI1, CALM2, DHODH, UMPS, RBM39, SEMA7A, CHIC2, PCBP1, PBRM1, WDR6, E2F8, SERPINA3, e GNAS e em que a molécula de gRNA compreen- de uma sequência de domínio de direcionamento que se liga a uma sequência de DNA alvo definida por um conjunto de coordenadas ge- nômicas mostradas na Tabela 6A e na Tabela 6B.
175. Sistema de regulação de genes, de acordo com a rei- vindicação 174, caracterizada pelo fato de que a molécula de gRNA compreende uma sequência de domínio alvo que se liga a uma se-
quência de DNA alvo selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 814-1064.
176. Sistema de regulação de genes, de acordo com a rei- vindicação 174 ou reivindicação 175, caracterizado pelo fato de que a molécula de gRNA compreende uma sequência de domínio alvo codi- ficada por uma sequência de ácido nucleico selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 814-1064.
177. Sistema de regulação de genes, de acordo com a rei- vindicação 168, caracterizado pelo fato de que um ou mais genes- alvo endógenos são selecionados dentre PTPN1, PTPN2, PTPN22, SH2B3, SH2D1A, PIK3CD, e EGR2 e em que a molécula de gRNA compreende uma sequência de domínio de direcionamento que se liga a uma sequência de DNA alvo definido por um conjunto de coordena- das genômicas mostradas na Tabela 6C e na Tabela 6D.
178. Sistema de regulação de genes, de acordo com a rei- vindicação 177, caracterizada pelo fato de que a molécula de gRNA compreende uma sequência de domínio alvo que se liga a uma se- quência de DNA alvo selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 1065-1329.
179. Sistema de regulação de genes, de acordo com a rei- vindicação 178, caracterizada pelo fato de que a molécula de gRNA compreende uma sequência de domínio alvo que se liga a uma se- quência de DNA alvo selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 1112-1227.
180. Sistema de regulação de genes, de acordo com a rei- vindicação 177 ou reivindicação 178, caracterizado pelo fato de que a molécula de gRNA compreende uma sequência de domínio alvo codi- ficada por uma sequência de ácido nucleico selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 1065-1329.
181. Sistema de regulação de genes, de acordo com a rei-
vindicação 180, caracterizado pelo fato de que a molécula de gRNA compreende uma sequência de domínio alvo codificada por uma se- quência de ácido nucleico selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 1112-1227.
182. Sistema de regulação de genes, de acordo com a rei- vindicação 168, caracterizado pelo fato de que os um ou mais genes- alvo endógenos compreendem PELI1 e em que a molécula de gRNA compreende uma sequência de domínio alvo que se liga a uma se- quência de DNA alvo definida por um conjunto de coordenadas genô- micas mostradas na Tabela 6E e Tabela 6F.
183. Sistema de regulação de genes, de acordo com a rei- vindicação 182, caracterizada pelo fato de que a molécula de gRNA compreende uma sequência de domínio alvo que se liga a uma se- quência de DNA alvo selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 1330-1350.
184. Sistema de regulação de genes, de acordo com a rei- vindicação 182 ou reivindicação 183, caracterizado pelo fato de que a molécula de gRNA compreende uma sequência de domínio alvo codi- ficada por uma sequência de ácido nucleico selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 1330-1350.
185. Sistema de regulação de genes, de acordo com a rei- vindicação 168, caracterizado pelo fato de que os um ou mais genes- alvo endógenos compreendem SETD5 e em que a molécula de gRNA compreende uma sequência de domínio alvo que se liga a uma se- quência de DNA alvo definida por um conjunto de coordenadas genô- micas mostradas na Tabela 6G e Tabela 6H.
186. Sistema de regulação de genes, de acordo com a rei- vindicação 185, caracterizada pelo fato de que a molécula de gRNA compreende uma sequência de domínio alvo que se liga a uma se- quência de DNA alvo selecionada a partir do grupo que consiste em
SEQ ID NOs: 1351-1367.
187. Sistema de regulação de genes, de acordo com a rei- vindicação 185 ou reivindicação 186, caracterizado pelo fato de que a molécula de gRNA compreende uma sequência de domínio alvo codi- ficada por uma sequência de ácido nucleico selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 1351-1367.
188. Sistema de regulação de genes, de acordo com a rei- vindicação 166 ou reivindicação 167, caracterizado pelo fato de que o sistema de regulação de genes compreende uma molécula de ácido nucleico de siRNA ou shRNA.
189. Sistema de regulação de genes, de acordo com a rei- vindicação 188, caracterizado pelo fato de que os um ou mais genes- alvo endógenos são selecionados dentre IKZF1, IKZF3, GATA3, BCL3, TNIP1, TNFAIP3, NFKBIA, SMAD2, TGFBR1, TGFBR2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6, e IKZF2 ou são selecionados de CBLB, PPP2R2D, NRP1, HAVCR2, LAG3, TIGIT, CTLA4, PTPN6, PDCD1, e BCOR e em que a molécula de siRNA ou shRNA compreende cerca de 19 a 30 nucleotídeos que se ligam a uma sequência de RNA codifi- cada por uma sequência de DNA definida por um conjunto de coorde- nadas do genoma mostradas na Tabela 5A e na Tabela 5B.
190. Sistema de regulação de genes, de acordo com a rei- vindicação 189, caracterizado pelo fato de que os um ou mais genes- alvo endógenos são selecionados dentre IKZF1, IKZF3, GATA3, BCL3, TNIP1, TNFAIP3, NFKBIA, SMAD2, TGFBR1, TGFBR2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6, e IKZF2 e em que a molécula de siRNA ou shRNA compreende cerca de 19 a 30 nucleotídeos que se ligam a uma sequência de RNA codificada por uma sequência de DNA seleci- onada de SEQ ID NOs: 154-498.
191. Sistema de regulação de genes, de acordo com a rei- vindicação 189, caracterizado pelo fato de que um ou mais genes-
alvo endógenos são selecionados dentre CBLB, PPP2R2D, NRP1, HAVCR2, LAG3, TIGIT, CTLA4, PTPN6, PDCD1, e BCOR e em que a molécula de siRNA ou shRNA compreende cerca de 19- 30 nucleotí- deos que se ligam a uma sequência de RNA codificada por uma se- quência de DNA selecionada de SEQ ID NOs: 499-813.
192. Sistema de regulação de genes, de acordo com a rei- vindicação 188, caracterizado pelo fato de que os um ou mais genes- alvo endógenos são selecionados dentre BCL2L11, FLI1, CALM2, DHODH, UMPS, RBM39, SEMA7A, CHIC2, PCBP1, PBRM1, WDR6, E2F8, SERPINA3, e GNAS, e em que a molécula de siRNA ou shRNA compreende cerca de 19 a 30 nucleotídeos que se ligam a uma se- quência de RNA codificada por uma sequência de DNA definida por um conjunto de coordenadas de genoma mostradas na Tabela 6A e na Tabela 6B.
193. Sistema de regulação de genes, de acordo com a rei- vindicação 192, caracterizado pelo fato de que a molécula de siRNA ou shRNA compreende cerca de 19 a 30 nucleotídeos que se ligam a uma sequência de RNA codificada por uma sequência de DNA seleci- onada de SEQ ID NOs: 814-1064.
194. Sistema de regulação de genes, de acordo com a rei- vindicação 188, caracterizado pelo fato de que um ou mais genes- alvo endógenos são selecionados de PTPN1, PTPN2, PTPN22, SH2B3, SH2D1A, PIK3CD, e EGR2 em que a molécula de siRNA ou shRNA compreende cerca de 19 a 30 nucleotídeos que se ligam a um Sequência de RNA codificada por uma sequência de DNA definida por um conjunto de coordenadas do genoma mostradas na Tabela 6C e na Tabela 6D.
195. Sistema de regulação de genes, de acordo com a rei- vindicação 194, caracterizado pelo fato de que a molécula de siRNA ou shRNA compreende cerca de 19 a 30 nucleotídeos que se ligam a uma sequência de RNA codificada por uma sequência de DNA seleci- onada de SEQ ID NOs: 1065-1329.
196. Sistema de regulação de genes, de acordo com a rei- vindicação 194 ou a reivindicação 195, caracterizado pelo fato de que a molécula de siRNA ou shRNA compreende cerca de 19 a 30 nucleo- tídeos que se ligam a uma sequência de RNA codificada por uma se- quência de DNA selecionada de SEQ ID NOs: 1112-1227.
197. Sistema de regulação de genes, de acordo com a rei- vindicação 188, caracterizado pelo fato de que os um ou mais genes- alvo endógenos compreendem PELI1 e em que a molécula de siRNA ou shRNA compreende cerca de 19 a 30 nucleotídeos que se ligam a uma sequência de RNA codificada por uma sequência de DNA defini- da por um conjunto de coordenadas de genoma mostradas na Tabela 6E e Tabela 6F.
198. Sistema de regulação de genes, de acordo com a rei- vindicação 197, caracterizado pelo fato de que a molécula de siRNA ou shRNA compreende cerca de 19 a 30 nucleotídeos que se ligam a uma sequência de RNA codificada por uma sequência de DNA seleci- onada de SEQ ID NOs: 1330-1350.
199. Sistema de regulação de genes, de acordo com a rei- vindicação 188, caracterizado pelo fato de que os um ou mais genes- alvo endógenos compreendem SETD5 e em que a molécula de siRNA ou shRNA compreende cerca de 19 a 30 nucleotídeos que se ligam a uma sequência de RNA codificada por uma sequência de DNA defini- da por um conjunto de coordenadas de genoma mostradas na Tabela 6G e Tabela 6H.
200. Sistema de regulação de genes, de acordo com a rei- vindicação 199, caracterizado pelo fato de que a molécula de siRNA ou shRNA compreende cerca de 19 a 30 nucleotídeos que se ligam a uma sequência de RNA codificada por uma sequência de DNA seleci-
onada de SEQ ID NOs: 1351-1367.
201. Sistema de regulação de genes capaz de reduzir a ex- pressão e/ou função de dois ou mais genes-alvo endógenos em uma célula, caracterizado pelo fato de que pelo menos um dos genes- alvo endógenos é selecionado dentre: (a) o grupo que consiste em BCL2L11, FLI1, CALM2, DHODH, UMPS, RBM39, SEMA7A, CHIC2, PCBP1, PBRM1, WDR6, E2F8, SERPINA3, e GNAS; (b) o grupo que consiste em PTPN1, PTPN2, PTPN22, SH2B3, SH2D1A, PIK3CD, e EGR2; (c) PELI1; ou (d) SETD5, e em que pelo menos um dos genes-alvo endógenos é sele- cionado dentre: (e) o grupo que consiste em IKZF1, IKZF3, GATA3, BCL3, TNIP1, TNFAIP3, NFKBIA, SMAD2, TGFBR1, TGFBR2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6, e IKZF2; ou (f) o grupo que consiste em CBLB, PPP2R2D, NRP1, HAVCR2, LAG3, TIGIT, CTLA4, PTPN6, PDCD1, e BCOR, em que o sistema compreende (i) uma molécula de ácido nucleico; (ii) um enzimático; ou (iii) uma molécula de ácido nucleico guia e uma proteína enzimática
202. Sistema de regulação de genes, de acordo com a rei- vindicação 201, caracterizado pelo fato de que o sistema compreende uma pluralidade de moléculas de ácido nucleico de RNA guia (gRNA) e uma endonuclease de Cas.
203. Sistema de regulação de genes, de acordo com a rei- vindicação 202, caracterizado pelo fato de que pelo menos um dos genes-alvo endógenos é selecionado do grupo que consiste em BCL2L11, FLI1, CALM2, DHODH, UMPS, RBM39, SEMA7A, CHIC2, PCBP1, PBRM1, WDR6, E2F8, SERPINA3, e GNAS e pelo menos um dos genes-alvo endógenos é selecionado do grupo que consiste em IKZF1, IKZF3, GATA3, BCL3, TNIP1, TNFAIP3, NFKBIA, SMAD2,
TGFBR1, TGFBR2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6, IKZF2, CBLB, PPP2R2D, NRP1, HAVCR2, LAG3, TIGIT, CTLA4, PTPN6, PDCD1, e BCOR.
204. Sistema de regulação de genes, de acordo com a rei- vindicação 203, caracterizado pelo fato de que pelo menos um dentre a pluralidade de gRNAs se liga a uma sequência de DNA alvo definida por um conjunto de coordenadas genômicas mostradas na Tabela 6A e Tabela 6B, e em que pelo menos uma dentre a pluralidade de gRNAs se liga a uma sequência de DNA alvo definida por um conjunto de coordenadas genômicas mostradas na Tabela 5A e na Tabela 5B.
205. Sistema de regulação de genes, de acordo com a rei- vindicação 203 ou a reivindicação 204, caracterizado pelo fato de que pelo menos uma dentre a pluralidade de moléculas de gRNA compre- ende uma sequência de domínio de direcionamento que se liga a uma sequência de DNA alvo selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 814-1064 e em que pelo menos uma dentre a pluralida- de de moléculas de gRNA compreende uma sequência de domínio de direcionamento que se liga a uma sequência de DNA alvo selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 154-498 ou SEQ ID NOs: 499-813.
206. Sistema de regulação de genes, de acordo com a rei- vindicação 203 ou a reivindicação 204, caracterizado pelo fato de que pelo menos uma dentre a pluralidade de moléculas de gRNA compre- ende uma sequência de domínio de direcionamento codificada por uma sequência de ácido nucleico selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 814-1064 e em que pelo menos uma dentre a plura- lidade de moléculas de gRNA compreende uma sequência de domínio de direcionamento codificada por uma sequência de ácido nucleico selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 154-498 ou SEQ ID NOs: 499-813.
207. Sistema de regulação de genes, de acordo com a rei- vindicação 202, caracterizado pelo fato de que pelo menos um dos genes-alvo endógenos é selecionado do grupo que consiste em PTPN1, PTPN2, PTPN22, SH2B3, SH2D1A, PIK3CD, e EGR2 e pelo menos um dos genes-alvo endógenos é selecionado do grupo que consiste em IKZF1, IKZF3, GATA3, BCL3, TNIP1, TNFAIP3, NFKBIA, SMAD2, TGFBR1, TGFBR2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6, IKZF2, CBLB, PPP2R2D, NRP1, HAVCR2, LAG3, TIGIT, CTLA4, PTPN6, PDCD1, e BCOR.
208. Sistema de regulação de genes, de acordo com a rei- vindicação 207, caracterizado pelo fato de que pelo menos um dentre a pluralidade de gRNAs se liga a uma sequência de DNA alvo definida por um conjunto de coordenadas genômicas mostradas na Tabela 6C e Tabela 6D, e em que pelo menos uma dentre a pluralidade de gRNAs se liga a uma sequência de DNA alvo definida por um conjunto de coordenadas genômicas mostradas na Tabela 5A e na Tabela 5B.
209. Sistema de regulação de genes, de acordo com a rei- vindicação 207 ou a reinvindicação 208, caracterizado pelo fato de que pelo menos uma dentre a pluralidade de moléculas de gRNA compreende uma sequência de domínio de direcionamento que se liga a uma sequência de DNA alvo selecionada a partir do grupo que con- siste nas SEQ ID NOs: 1065-1329 e em que pelo menos uma dentre a pluralidade de moléculas de gRNA compreende uma sequência de domínio de direcionamento que se liga a uma sequência de DNA alvo selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 154-498 ou SEQ ID NOs: 499-813.
210. Sistema de regulação de genes, de acordo com a rei- vindicação 207 ou a reinvindicação 208, caracterizado pelo fato de que pelo menos uma dentre a pluralidade de moléculas de gRNA compreende uma sequência de domínio de direcionamento que se liga a uma sequência de DNA alvo selecionada a partir do grupo que con- siste nas SEQ ID NOs: 1112-1227 e em que pelo menos uma dentre a pluralidade de moléculas de gRNA compreende uma sequência de domínio de direcionamento que se liga a uma sequência de DNA alvo selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 499-524.
211. Sistema de regulação de genes, de acordo com a rei- vindicação 207 ou a reivindicação 208, caracterizado pelo fato de que pelo menos uma dentre a pluralidade de moléculas de gRNA compre- ende uma sequência de domínio de direcionamento codificada por uma sequência de ácido nucleico selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 1065-1329 e em que pelo menos uma dentre a plura- lidade de moléculas de gRNA compreende uma sequência de domínio de direcionamento codificada por uma sequência de ácido nucleico selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 154-498 ou SEQ ID NOs: 499-813.
212. Sistema de regulação de genes, de acordo com a rei- vindicação 207 ou a reivindicação 208, caracterizado pelo fato de que pelo menos uma dentre a pluralidade de moléculas de gRNA compre- ende uma sequência de domínio de direcionamento codificada por uma sequência de ácido nucleico selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 1112-1227 e em que pelo menos uma dentre a plura- lidade de moléculas de gRNA compreende uma sequência de domínio de direcionamento codificada por uma sequência de ácido nucleico selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 499-524.
213. Sistema de regulação de genes, de acordo com a rei- vindicação 202, caracterizado pelo fato de que pelo menos um dos genes-alvo endógenos é PELI1 e pelo menos um dos genes-alvo en- dógenos é selecionado do grupo que consiste em IKZF1, IKZF3, GA- TA3, BCL3, TNIP1, TNFAIP3, NFKBIA, SMAD2, TGFBR1, TGFBR2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6, IKZF2, CBLB, PPP2R2D, NRP1,
HAVCR2, LAG3, TIGIT, CTLA4, PTPN6, PDCD1, e BCOR.
214. Sistema de regulação de genes, de acordo com a rei- vindicação 213, caracterizado pelo fato de que pelo menos um dentre a pluralidade de gRNAs se liga a uma sequência de DNA alvo definida por um conjunto de coordenadas genômicas mostradas na Tabela 6E e Tabela 6F, e em que pelo menos uma dentre a pluralidade de gRNAs se liga a uma sequência de DNA alvo definida por um conjunto de coordenadas genômicas mostradas na Tabela 5A e na Tabela 5B.
215. Sistema de regulação de genes, de acordo com a rei- vindicação 213 ou a reinvindicação 214, caracterizado pelo fato de que pelo menos uma dentre a pluralidade de moléculas de gRNA compreende uma sequência de domínio de direcionamento que se liga a uma sequência de DNA alvo selecionada a partir do grupo que con- siste nas SEQ ID NOs: 1330-1350 e em que pelo menos uma dentre a pluralidade de moléculas de gRNA compreende uma sequência de domínio de direcionamento que se liga a uma sequência de DNA alvo selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 154-498 ou SEQ ID NOs: 499-813.
216. Sistema de regulação de genes, de acordo com a rei- vindicação 213 ou a reinvindicação 214, caracterizado pelo fato de que pelo menos uma dentre a pluralidade de moléculas de gRNA compreende uma sequência de domínio de direcionamento que se liga a uma sequência de DNA alvo selecionada a partir do grupo que con- siste nas SEQ ID NOs: 1351-1367 e em que pelo menos uma dentre a pluralidade de moléculas de gRNA compreende uma sequência de domínio de direcionamento que se liga a uma sequência de DNA alvo selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 499-524.
217. Sistema de regulação de genes, de acordo com a rei- vindicação 213 ou a reivindicação 214, caracterizado pelo fato de que pelo menos uma dentre a pluralidade de moléculas de gRNA compre-
ende uma sequência de domínio de direcionamento codificada por uma sequência de ácido nucleico selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 1330-1350e em que pelo menos uma dentre a plura- lidade de moléculas de gRNA compreende uma sequência de domínio de direcionamento codificada por uma sequência de ácido nucleico selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 154-498 ou SEQ ID NOs: 499-813.
218. Sistema de regulação de genes, de acordo com a rei- vindicação 213 ou a reivindicação 214, caracterizado pelo fato de que pelo menos uma dentre a pluralidade de moléculas de gRNA compre- ende uma sequência de domínio de direcionamento codificada por uma sequência de ácido nucleico selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 1351-1367 e em que pelo menos uma dentre a plura- lidade de moléculas de gRNA compreende uma sequência de domínio de direcionamento codificada por uma sequência de ácido nucleico selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 499-524.
219. Sistema de regulação de genes, de acordo com a rei- vindicação 202, caracterizado pelo fato de que pelo menos um dos genes-alvo endógenos é SETD5 e pelo menos um dos genes-alvo en- dógenos é selecionado do grupo que consiste em IKZF1, IKZF3, GA- TA3, BCL3, TNIP1, TNFAIP3, NFKBIA, SMAD2, TGFBR1, TGFBR2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6, IKZF2, CBLB, PPP2R2D, NRP1, HAVCR2, LAG3, TIGIT, CTLA4, PTPN6, PDCD1, e BCOR.
220. Sistema de regulação de genes, de acordo com a rei- vindicação 219, caracterizado pelo fato de que pelo menos um dentre a pluralidade de gRNAs se liga a uma sequência de DNA alvo definida por um conjunto de coordenadas genômicas mostradas na Tabela 6G e Tabela 6H, e em que pelo menos uma dentre a pluralidade de gRNAs se liga a uma sequência de DNA alvo definida por um conjunto de coordenadas genômicas mostradas na Tabela 5A e na Tabela 5B.
221. Sistema de regulação de genes, de acordo com a rei- vindicação 219 ou a reinvindicação 220, caracterizado pelo fato de que pelo menos uma dentre a pluralidade de moléculas de gRNA compreende uma sequência de domínio de direcionamento que se liga a uma sequência de DNA alvo selecionada a partir do grupo que con- siste nas SEQ ID NOs: 1351-1367 e em que pelo menos uma dentre a pluralidade de moléculas de gRNA compreende uma sequência de domínio de direcionamento que se liga a uma sequência de DNA alvo selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 154-498 ou SEQ ID NOs: 499-813.
222. Sistema de regulação de genes, de acordo com a rei- vindicação 219 ou a reinvindicação 220, caracterizado pelo fato de que pelo menos uma dentre a pluralidade de moléculas de gRNA compreende uma sequência de domínio de direcionamento que se liga a uma sequência de DNA alvo selecionada a partir do grupo que con- siste nas SEQ ID NOs: 1351-1367 e em que pelo menos uma dentre a pluralidade de moléculas de gRNA compreende uma sequência de domínio de direcionamento que se liga a uma sequência de DNA alvo selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 499-524.
223. Sistema de regulação de genes, de acordo com a rei- vindicação 219 ou a reivindicação 220, caracterizado pelo fato de que pelo menos uma dentre a pluralidade de moléculas de gRNA compre- ende uma sequência de domínio de direcionamento codificada por uma sequência de ácido nucleico selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 1351-1367 e em que pelo menos uma dentre a plura- lidade de moléculas de gRNA compreende uma sequência de domínio de direcionamento codificada por uma sequência de ácido nucleico selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 154-498 ou SEQ ID NOs: 499-813.
224. Sistema de regulação de genes, de acordo com a rei-
vindicação 219 ou a reivindicação 220, caracterizado pelo fato de que pelo menos uma dentre a pluralidade de moléculas de gRNA compre- ende uma sequência de domínio de direcionamento codificada por uma sequência de ácido nucleico selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 1351-1367 e em que pelo menos uma dentre a plura- lidade de moléculas de gRNA compreende uma sequência de domínio de direcionamento codificada por uma sequência de ácido nucleico selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 499-524.
225. Sistema de regulação de genes, de acordo com qual- quer uma das reivindicações 166-224, caracterizado pelo fato de que a proteína Cas é: a. uma proteína Cas de tipo selvagem compreendendo dois domínios enzimaticamente ativos e capaz de induzir quebras de DNA de fita dupla; b. um mutante de Nickase de Cas compreendendo um domínio enzimaticamente ativo e capaz de induzir quebras de DNA de fita simples; c. uma proteína Cas desativada (dCas) e está associada a uma proteína heteróloga capaz de modular a expressão de um ou mais genes-alvo endógenos.
226. Sistema de regulação de genes, de acordo com a rei- vindicação 225, caracterizado pelo fato de que a proteína heteróloga é selecionada do grupo que consiste no domínio de interação 1 da MAX (MXI1), domínio de caixa associada a Krüppel (KRAB) e quatro domínios mSin3 concatenados (SID4X).
227. Sistema de regulação de genes, de acordo com a rei- vindicação 225 ou reivindicação 226, caracterizado pelo fato de que a proteína Cas é uma proteína Cas9.
228. Sistema de regulação de genes, de acordo com a rei- vindicação 201, caracterizado pelo fato de que o sistema compreende uma molécula de ácido nucleico e em que a molécula de ácido nuclei- co é um siRNA, um shRNA, um microRNA (miR), um antagomiR ou um RNA antisense.
229. Sistema de regulação de genes, de acordo com a rei- vindicação 228, caracterizado pelo fato de que o sistema compreende uma pluralidade de moléculas de shRNA ou siRNA.
230. Sistema de regulação de genes, de acordo com a rei- vindicação 229, caracterizado pelo fato de que pelo menos um dos genes-alvo endógenos é selecionado do grupo que consiste em BCL2L11, FLI1, CALM2, DHODH, UMPS, RBM39, SEMA7A, CHIC2, PCBP1, PBRM1, WDR6, E2F8, SERPINA3, e GNAS e pelo menos um dos genes-alvo endógenos é selecionado do grupo que consiste em IKZF1, IKZF3, GATA3, BCL3, TNIP1, TNFAIP3, NFKBIA, SMAD2, TGFBR1, TGFBR2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6, IKZF2, CBLB, PPP2R2D, NRP1, HAVCR2, LAG3, TIGIT, CTLA4, PTPN6, PDCD1, e BCOR.
231. Sistema de regulação de genes, de acordo com a rei- vindicação 230, caracterizado pelo fato de que pelo menos uma den- tre a pluralidade de moléculas de siRNA ou shRNA compreende cerca de 19-30 nucleotídeos que se ligam a uma sequência de RNA codifi- cada por uma sequência de DNA definida por um conjunto de coorde- nadas de genoma mostradas na Tabela 6A e na Tabela 6B e pelo me- nos uma dentre a pluralidade de moléculas de siRNA ou shRNA com- preende cerca de 19-30 nucleotídeos que se ligam a uma sequência de RNA codificada por uma sequência de DNA definida por um conjun- to de coordenadas de genoma mostradas na Tabela 5A e na Tabela 5B.
232. Sistema de regulação de genes, de acordo com a rei- vindicação 230 ou reivindicação 231, caracterizado pelo fato de que pelo menos uma dentre a pluralidade de moléculas de siRNA ou shR-
NA compreende cerca de 19-30 nucleotídeos que se ligam a uma se- quência de RNA codificada por uma sequência de DNA selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 814-1064 e em que pelo me- nos um de a pluralidade de moléculas de siRNA ou shRNA compreen- de cerca de 19-30 nucleotídeos que se ligam a uma sequência de RNA codificada por uma sequência de DNA selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 154-498 ou SEQ ID NOs: 499-
813.
233. Sistema de regulação de genes, de acordo com a rei- vindicação 229, caracterizado pelo fato de que pelo menos um dos genes-alvo endógenos é selecionado do grupo que consiste em PTPN1, PTPN2, PTPN22, SH2B3, SH2D1A, PIK3CD, e EGR2 e pelo menos um dos genes-alvo endógenos é selecionado do grupo que consiste em IKZF1, IKZF3, GATA3, BCL3, TNIP1, TNFAIP3, NFKBIA, SMAD2, TGFBR1, TGFBR2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6, IKZF2, CBLB, PPP2R2D, NRP1, HAVCR2, LAG3, TIGIT, CTLA4, PTPN6, PDCD1, e BCOR.
234. Sistema de regulação de genes, de acordo com a rei- vindicação 233, caracterizado pelo fato de que pelo menos uma den- tre a pluralidade de moléculas de siRNA ou shRNA compreende cerca de 19-30 nucleotídeos que se ligam a uma sequência de RNA codifi- cada por uma sequência de DNA definida por um conjunto de coorde- nadas de genoma mostradas na Tabela 6C e na Tabela 6D e pelo me- nos uma dentre a pluralidade de moléculas de siRNA ou shRNA com- preende cerca de 19-30 nucleotídeos que se ligam a uma sequência de RNA codificada por uma sequência de DNA definida por um conjun- to de coordenadas de genoma mostradas na Tabela 5A e na Tabela 5B.
235. Sistema de regulação de genes, de acordo com a rei- vindicação 233 ou reivindicação 234, caracterizado pelo fato de que pelo menos uma dentre a pluralidade de moléculas de siRNA ou shR- NA compreende cerca de 19-30 nucleotídeos que se ligam a uma se- quência de RNA codificada por uma sequência de DNA selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 1065-1329 e em que pelo menos um de a pluralidade de moléculas de siRNA ou shRNA com- preende cerca de 19-30 nucleotídeos que se ligam a uma sequência de RNA codificada por uma sequência de DNA selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 154-498 ou SEQ ID NOs: 499-
813.
236. Sistema de regulação de genes, de acordo com a rei- vindicação 233 ou reivindicação 234, caracterizado pelo fato de que pelo menos uma dentre a pluralidade de moléculas de siRNA ou shR- NA compreende cerca de 19-30 nucleotídeos que se ligam a uma se- quência de RNA codificada por uma sequência de DNA selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 1112-1227 e em que pelo menos um de a pluralidade de moléculas de siRNA ou shRNA com- preende cerca de 19-30 nucleotídeos que se ligam a uma sequência de RNA codificada por uma sequência de DNA selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 499-524.
237. Sistema de regulação de genes, de acordo com a rei- vindicação 229, caracterizado pelo fato de que pelo menos um dos genes-alvo endógenos é PELI1 e pelo menos um dos genes-alvo en- dógenos é selecionado do grupo que consiste em IKZF1, IKZF3, GA- TA3, BCL3, TNIP1, TNFAIP3, NFKBIA, SMAD2, TGFBR1, TGFBR2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6, IKZF2, CBLB, PPP2R2D, NRP1, HAVCR2, LAG3, TIGIT, CTLA4, PTPN6, PDCD1, e BCOR.
238. Sistema de regulação de genes, de acordo com a rei- vindicação 237, caracterizado pelo fato de que pelo menos uma den- tre a pluralidade de moléculas de siRNA ou shRNA compreende cerca de 19-30 nucleotídeos que se ligam a uma sequência de RNA codifi-
cada por uma sequência de DNA definida por um conjunto de coorde- nadas de genoma mostradas na Tabela 6E e na Tabela 6F e pelo me- nos uma dentre a pluralidade de moléculas de siRNA ou shRNA com- preende cerca de 19-30 nucleotídeos que se ligam a uma sequência de RNA codificada por uma sequência de DNA definida por um conjun- to de coordenadas de genoma mostradas na Tabela 5A e na Tabela 5B.
239. Sistema de regulação de genes, de acordo com a rei- vindicação 237 ou reivindicação 238, caracterizado pelo fato de que pelo menos uma dentre a pluralidade de moléculas de siRNA ou shR- NA compreende cerca de 19-30 nucleotídeos que se ligam a uma se- quência de RNA codificada por uma sequência de DNA selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 1330-1350 e em que pelo menos um de a pluralidade de moléculas de siRNA ou shRNA com- preende cerca de 19-30 nucleotídeos que se ligam a uma sequência de RNA codificada por uma sequência de DNA selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 154-498 ou SEQ ID NOs: 499-
813.
240. Sistema de regulação de genes, de acordo com a rei- vindicação 237 ou reivindicação 238, caracterizado pelo fato de que pelo menos uma dentre a pluralidade de moléculas de siRNA ou shR- NA compreende cerca de 19-30 nucleotídeos que se ligam a uma se- quência de RNA codificada por uma sequência de DNA selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 1351-1367 e em que pelo menos um de a pluralidade de moléculas de siRNA ou shRNA com- preende cerca de 19-30 nucleotídeos que se ligam a uma sequência de RNA codificada por uma sequência de DNA selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 499-524.
241. Sistema de regulação de genes, de acordo com a rei- vindicação 229, caracterizado pelo fato de que pelo menos um dos genes-alvo endógenos é SETD5 e pelo menos um dos genes-alvo en- dógenos é selecionado do grupo que consiste em IKZF1, IKZF3, GA- TA3, BCL3, TNIP1, TNFAIP3, NFKBIA, SMAD2, TGFBR1, TGFBR2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6, IKZF2, CBLB, PPP2R2D, NRP1, HAVCR2, LAG3, TIGIT, CTLA4, PTPN6, PDCD1, e BCOR.
242. Sistema de regulação de genes, de acordo com a rei- vindicação 241, caracterizado pelo fato de que pelo menos uma den- tre a pluralidade de moléculas de siRNA ou shRNA compreende cerca de 19-30 nucleotídeos que se ligam a uma sequência de RNA codifi- cada por uma sequência de DNA definida por um conjunto de coorde- nadas de genoma mostradas na Tabela 6G e na Tabela 6H e pelo menos uma dentre a pluralidade de moléculas de siRNA ou shRNA compreende cerca de 19-30 nucleotídeos que se ligam a uma sequên- cia de RNA codificada por uma sequência de DNA definida por um conjunto de coordenadas de genoma mostradas na Tabela 5A e na Tabela 5B.
243. Sistema de regulação de genes, de acordo com a rei- vindicação 241 ou 242, caracterizado pelo fato de que pelo menos uma dentre a pluralidade de moléculas de siRNA ou shRNA compre- ende cerca de 19-30 nucleotídeos que se ligam a uma sequência de RNA codificada por uma sequência de DNA selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 1351-1367 e em que pelo menos um de a pluralidade de moléculas de siRNA ou shRNA compreende cerca de 19-30 nucleotídeos que se ligam a uma sequência de RNA codificada por uma sequência de DNA selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 154-498 ou SEQ ID NOs: 499-813.
244. Sistema de regulação de genes, de acordo com a rei- vindicação 241 ou 242, caracterizado pelo fato de que pelo menos uma dentre a pluralidade de moléculas de siRNA ou shRNA compre- ende cerca de 19-30 nucleotídeos que se ligam a uma sequência de
RNA codificada por uma sequência de DNA selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 1351-1367 e em que pelo menos um de a pluralidade de moléculas de siRNA ou shRNA compreende cerca de 19-30 nucleotídeos que se ligam a uma sequência de RNA codificada por uma sequência de DNA selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 499-524.
245. Sistema de regulação de genes, de acordo com a rei- vindicação 166, 167, ou 201, caracterizado pelo fato de que o sistema compreende uma proteína compreendendo um domínio de ligação ao DNA e um domínio enzimático e é selecionado a partir de uma nu- clease de dedo de zinco e uma nuclease efetora do tipo ativador de transcrição (TALEN).
246. Sistema de regulação de genes caracterizado pelo fa- to de que compreende um vetor que codifica um ou mais gRNAs e um vetor que codifica uma proteína de endonuclease de Cas, em que um ou mais gRNAs compreendem uma sequência de domínio de direcio- namento codificada por uma sequência de ácido nucleico selecionada dentre: SEQ ID NOs: 814-1064, SEQ ID NOs: 1065-1329, SEQ ID NOs: 1330-1350, SEQ ID NOs: 1351-1367, SEQ ID NOs: 154-498 ou SEQ ID NOs: 499-813.
247. Sistema de regulação de genes caracterizado pelo fa- to de que compreende um vetor que codifica uma pluralidade de gRNAs e um vetor que codifica uma proteína de endonuclease de Cas, em que pelo menos uma dentre a pluralidade de gRNA compreende uma sequência de domínio de destino codificada por uma sequência de ácido nucleico selecionada de: SEQ ID NOs: 814-1064, SEQ ID NOs: 1065-1329, SEQ ID NOs: 1330-1350 ou SEQ ID NOs: 1351-1367 e em que pelo menos uma dentre a pluralidade de gRNA compreende uma sequência de domínio de direcionamento codificada por uma sequência de ácido nucleico selecionada dentre: SEQ ID NOs: 154-498 ou SEQ ID NOs: 499-813.
248. Sistema de regulação de genes caracterizado pelo fa- to de que compreende um vetor que codifica um ou mais gRNAs e uma molécula de mRNA que codifica uma proteína de endonuclease de Cas, em que um ou mais gRNAs compreendem uma sequência de domínio de direcionamento codificada por uma sequência de ácido nu- cleico selecionada dentre: SEQ ID NOs: 814-1064, SEQ ID NOs: 1065-1329, SEQ ID NOs: 1330-1350, SEQ ID NOs: 1351-1367, SEQ ID NOs: 154-498 ou SEQ ID NOs: 499-813.
249. Sistema de regulação de genes caracterizado pelo fa- to de que compreende um vetor que codifica uma pluralidade de gRNAs e uma molécula de mRNA que codifica uma proteína de endo- nuclease de Cas, em que pelo menos uma dentre a pluralidade de gRNA compreende uma sequência de domínio de destino codificada por uma sequência de ácido nucleico selecionada de: SEQ ID NOs: 814-1064, SEQ ID NOs: 1065-1329, SEQ ID NOs: 1330-1350 ou SEQ ID NOs: 1351-1367 e em que pelo menos uma dentre a pluralidade de gRNA compreende uma sequência de domínio de direcionamento codificada por uma sequência de ácido nucleico selecionada dentre: SEQ ID NOs: 154-498 ou SEQ ID NOs: 499-813.
250. Sistema de regulação de genes caracterizado pelo fa- to de que compreende um ou mais gRNAs e uma proteína de endonu- clease de Cas, em que os um ou mais gRNAs compreendem uma sequên- cia de domínio de direcionamento codificada por uma sequência de ácido nucleico selecionada entre: SEQ ID NOs: 814-1064, SEQ ID NOs: 1065-1329, SEQ ID NOs: 1330-1350, SEQ ID NOs: 1351- 1367,
SEQ ID NOs: 154-498 ou SEQ ID NOs: 499-813 e em que os um ou mais gRNAs e a proteína da endonu- clease de Cas são complexados para formar um complexo de ribonu- cleoproteína (RNP).
251. Sistema de regulação de genes caracterizado pelo fa- to de que compreende uma pluralidade de gRNAs e uma proteína da endonuclease de Cas: em que pelo menos uma dentre a pluralidade de gRNA compreende uma sequência de domínio de destino codificada por uma sequência de ácido nucleico selecionada de: SEQ ID NOs: 814-1064, SEQ ID NOs: 1065-1329, SEQ ID NOs: 1330-1350 ou SEQ ID NOs: 1351-1367, em que pelo menos uma dentre a pluralidade de gRNA compreende uma sequência de domínio de direcionamento codificada por uma sequência de ácido nucleico selecionada dentre: SEQ ID NOs: 154-498 ou SEQ ID NOs: 499-813, e em que os um ou mais gRNAs e a proteína da endonu- clease de Cas são complexados para formar um complexo de ribonu- cleoproteína (RNP).
252. Kit caracterizado pelo fato de que compreende o sis- tema de regulação de genes de acordo com qualquer uma das reivin- dicações 166- 251.
253. Molécula de ácido nucleico de gRNA caracterizada pelo fato de que compreende uma sequência de ácido nucleico de domínio alvo que se liga a uma sequência alvo em um gene-alvo en- dógeno selecionado dentre: (a) o grupo que consiste em BCL2L11, FLI1, CALM2, DHODH, UMPS, RBM39, SEMA7A, CHIC2, PCBP1, PBRM1, WDR6, E2F8, SERPINA3, e GNAS; (b) o grupo que consiste em PTPN1, PTPN2, PTPN22, SH2B3, SH2D1A, PIK3CD, e EGR2; (c) PELI1; (d) SETD5; (e) IKZF1, IKZF3, GATA3, BCL3, TNIP1, TNFAIP3,
NFKBIA, SMAD2, TGFBR1, TGFBR2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6, e IKZF2; ou (f) CBLB, PPP2R2D, NRP1, HAVCR2, LAG3, TIGIT, CTLA4, PTPN6, PDCD1, e BCOR.
254. Molécula de gRNA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 253-259, caracterizada pelo fato de que: a. o gene endógeno é selecionado do grupo que consiste em BCL2L11, FLI1, CALM2, DHODH, UMPS, RBM39, SEMA7A, CHIC2, PCBP1, PBRM1, WDR6, E2F8, SERPINA3, e GNAS e o gRNA compreende uma sequência de domínio de destino que se liga a um sequência de DNA alvo localizada nas coordenadas genômicas selecionadas dentre as mostradas nas Tabelas 6A e 6B; b. o gene endógeno é selecionado a partir do grupo que consiste no grupo que consiste em PTPN1, PTPN2, PTPN22, SH2B3, SH2D1A, PIK3CD e EGR2 e o gRNA compreende uma sequência de domínio de direcionamento que se liga a uma sequência de DNA alvo localizada nas coordenadas genômicas selecionadas a partir daquelas mostrado na Tabela 6C e na Tabela 6D; c. o gene endógeno é PELI1 e o gRNA compreende uma sequência de domínio alvo que se liga a uma sequência de DNA alvo localizada em coordenadas genômicas selecionadas dentre as mos- tradas na Tabela 6E e na Tabela 6F; d. o gene endógeno é SETD5 e o gRNA compreende uma sequência de domínio alvo que se liga a uma sequência de DNA alvo localizada em coordenadas genômicas selecionadas dentre as mostradas na Tabela 6G e na Tabela 6H; e. o gene endógeno é selecionado do grupo que consiste em IKZF1, IKZF3, GATA3, BCL3, TNIP1, TNFAIP3, NFKBIA, SMAD2, TGFBR1, TGFBR2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6, e IKZF2 e o do- mínio de gRNA compreende um alvo a uma sequência de DNA alvo localizada nas coordenadas genômicas selecionadas dentre as mos-
tradas na Tabela 5A e na Tabela 5B; ou f. o gene endógeno é selecionado do grupo que consiste em CBLB, PPP2R2D, NRP1, HAVCR2, LAG3, TIGIT, CTLA4, PTPN6, PDCD1, e BCOR e o gRNA compreende uma sequência de domínio de direcionamento que se liga a uma sequência de DNA alvo localiza- da nas coordenadas genômicas selecionadas daqueles mostrados na Tabela 5A e na Tabela 5B.
255. Molécula de gRNA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 253-259, caracterizada pelo fato de que o gRNA com- preende uma sequência de domínio de destino que se liga a uma se- quência de DNA alvo selecionada de SEQ ID NOs: 814-1064, SEQ ID NOs: 1065-1329, SEQ ID NOs: 1330-1350, SEQ ID NOs: 1351-1367, SEQ ID NOs: 154-498 ou SEQ ID NOs: 499-813.
256. Molécula de gRNA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 253-259, caracterizada pelo fato de que o gRNA com- preende uma sequência de domínio de destino codificada por uma se- quência selecionada de SEQ ID NOs: 814-1064, SEQ ID NOs: 1065- 1329, SEQ ID NOs: 1330-1350, SEQ ID NOs: 1351-1367, SEQ ID NOs: 154-498 ou SEQ ID NOs: 499-813.
257. Molécula de gRNA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 253-256, caracterizada pelo fato de que a sequência alvo compreende uma sequência PAM.
258. Molécula de gRNA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 253-257, caracterizada pelo fato de que o gRNA é uma molécula de gRNA modular.
259. Molécula de gRNA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 253-257, caracterizada pelo fato de que o gRNA é uma molécula de gRNA dupla.
260. Molécula de gRNA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 253-259, caracterizada pelo fato de que o domínio de direcionamento tem 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 ou mais nucleotídeos de comprimento.
261. Molécula de gRNA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 253-260, caracterizada pelo fato de compreender uma modificação na extremidade 5' ou próxima a ela (por exemplo, dentro de 1-10, 1-5 ou 1-2 nucleotídeos da extremidade 5') e/ou uma modifi- cação em ou próximo da extremidade 3' (por exemplo, dentro de 1-10, 1-5 ou 1-2 nucleotídeos da extremidade 3').
262. Molécula de gRNA, de acordo com a reivindicação 261, caracterizada pelo fato de que o gRNA modificado exibe maior estabilidade em relação às nucleases quando introduzido em uma cé- lula T.
263. Molécula de gRNA, de acordo com 261 a reivindicação ou reivindicação 262, caracterizada pelo fato de que o gRNA modifi- cado exibe uma resposta imune inata reduzida quando introduzida em uma célula T.
264. Molécula polinucleotídica caracterizada pelo fato de que codifica a molécula de gRNA de acordo com qualquer uma das reivindicações 253-263.
265. Composição caracterizada pelo fato de que compre- ende uma ou mais moléculas de gRNA de acordo com qualquer uma das reivindicações 253-263 ou o polinucleotídeo de acordo com a rei- vindicação 264.
266. Kit caracterizado pelo fato de que compreende a mo- lécula de gRNA de acordo com qualquer uma das reivindicações 253- 263 ou o polinucleotídeo de acordo com a reivindicação 264.
267. Método para produzir uma célula efetora imune modifi- cada, caracterizado pelo fato de que compreende: a. obter uma célula efetora imune de um sujeito; b. introduzir o sistema de regulação de genes de qual-
quer uma das reivindicações 166-251 na célula efetora do sistema imunológico; e c. cultivar a célula efetora imune de modo que a expres- são e/ou função de um ou mais genes-alvo endógenos seja reduzida em comparação com uma célula efetora imune que não foi modificada.
268. Método para produzir uma célula efetora imune modifi- cada caracterizada pelo fato de que compreende a introdução do sis- tema de regulação de genes de acordo com qualquer uma das reivin- dicações 166-251 na célula efetora.
269. Método, de acordo com a reivindicação 267 ou 268, caracterizado pelo fato de compreender ainda a introdução de uma sequência polinucleotídica que codifica um receptor imune manipulado selecionado a partir de um CAR e um TCR.
270. Método, de acordo com a reivindicação 269, caracte- rizado pelo fato de que o sistema de regulação de genes e/ou o poli- nucleotídeo que codifica o receptor imune manipulado são introduzidos na célula efetora imune por transfecção, transdução, eletroporação ou interrupção física da membrana celular por um dispositivo microfluídi- co.
271. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 267-270, caracterizado pelo fato de que o sistema de regulação de genes é introduzido como uma sequência polinucleotídica que codi- fica um ou mais componentes do sistema, como uma proteína ou co- mo um complexo de ribonucleoproteína (RNP).
272. Método para produzir uma célula efetora imune modifi- cada, caracterizado pelo fato de que compreende: a. expandir uma população de células efetoras imunes em cultura; e b. introduzir um sistema de regulação de genes de qual- quer uma das reivindicações 166-251 na população de células efeto-
ras imunes.
273. Método, de acordo com a reivindicação 272, caracte- rizado pelo fato de compreender ainda a obtenção da população de células efetoras imunes de um sujeito.
274. Método, de acordo com a 272 reivindicação ou reivin- dicação 273, caracterizado pelo fato de que o sistema de regulação de genes é introduzido na população de células efetoras imunes antes, durante ou após a expansão.
275. Método, de acordo com 272 a reivindicação ou reivin- dicação 273, caracterizado pelo fato de que a expansão da população de células efetoras imunes compreende uma primeira rodada de ex- pansão e uma segunda rodada de expansão.
276. Método, de acordo com a reivindicação 275, caracte- rizado pelo fato de que o sistema de regulação de genes é introduzido na população de células efetoras imunes antes, durante ou após a primeira rodada de expansão.
277. Método, de acordo com a reivindicação 275, caracte- rizado pelo fato de que o sistema de regulação de genes é introduzido na população de células efetoras imunes antes, durante ou após a se- gunda rodada de expansão.
278. Método, de acordo com a reivindicação 275, caracte- rizado pelo fato de que o sistema de regulação de genes é introduzido na população de células efetoras imunes antes do primeiro e do se- gundo ciclo de expansão.
279. Método, de acordo com a reivindicação 275, caracte- rizado pelo fato de que o sistema de regulação de genes é introduzido na população de células efetoras imunes após o primeiro e o segundo ciclo de expansão.
280. Método, de acordo com a reivindicação 275, caracte- rizado pelo fato de que o sistema de regulação de genes é introduzido na população de células efetoras imunes após a primeira rodada de expansão e antes da segunda rodada de expansão.
281. Método para tratar uma doença ou distúrbio em um su- jeito em necessidade do mesmo, caracterizado pelo fato de que com- preende a administração de uma quantidade eficaz de células efetoras imunes modificadas como definidas em qualquer uma das reivindica- ções 1-159 ou a composição como definida em qualquer uma das rei- vindicações 160-165.
282. Método, de acordo com a reivindicação 281, caracte- rizado pelo fato de que a doença ou distúrbio é um distúrbio prolifera- tivo celular, um distúrbio inflamatório ou uma doença infecciosa.
283. Método, de acordo com a reivindicação 281, caracte- rizado pelo fato de que a doença ou distúrbio é um câncer ou uma in- fecção viral.
284. Método, de acordo com a reivindicação 283, caracte- rizado pelo fato de que o câncer é selecionado a partir de uma leuce- mia, um linfoma ou um tumor sólido.
285. Método, de acordo com a reivindicação 284, caracte- rizado pelo fato de que o tumor sólido é um melanoma, um tumor pancreático, um tumor da bexiga, um tumor ou metástase no pulmão, um câncer colorretal ou um câncer de cabeça e pescoço.
286. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 283-285, caracterizado pelo fato de que o câncer é um câncer resistente ou insensível à PD1.
287. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 283-286, caracterizado pelo fato de que o sujeito foi tratado an- teriormente com um inibidor de PD1 ou um inibidor de PDL1.
288. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 283-287, caracterizado pelo fato de que compreende ainda a administração ao sujeito de um anticorpo ou fragmento de ligação do mesmo que se liga e inibe especificamente a função da proteína codi- ficada por NRP1, HAVCR2, LAG3, TIGIT, CTLA4 ou PDCD1.
289. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 281-288, caracterizado pelo fato de que as células efetoras imu- nes modificadas são autólogas ao sujeito.
290. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 281-288, caracterizado pelo fato de que as células efetoras imu- nes modificadas são alogênicas para o sujeito.
291. Método para matar uma célula cancerígena caracteri- zado pelo fato de que compreende expor a célula cancerígena a uma célula efetora imune modificada de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 1-159 ou a composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 160-165.
292. Método, de acordo com a reivindicação 291, caracte- rizado pelo fato de que a exposição é in vitro, in vivo ou ex vivo.
293. Método para aprimorar uma ou mais funções efetoras de uma célula efetora imune, caracterizado pelo fato de que compre- ende a introdução de um sistema de regulação de genes de acordo com qualquer uma das reivindicações 166-251 na célula efetora imu- ne.
294. Método para aprimorar uma ou mais funções efetoras de uma célula efetora imune, caracterizado pelo fato de que compre- ende a introdução de um sistema de regulação de genes de acordo com qualquer uma das reivindicações 166-251 na célula efetora imu- ne, em que a célula efetora modificada demonstra uma ou mais fun- ções efetoras melhoradas em comparação com a imune célula efetora que não foi modificada.
295. Método, de acordo com a reivindicação 294, caracte- rizado pelo fato de que as uma ou mais funções efetoras são selecio- nadas a partir da proliferação celular, viabilidade celular, citotoxicida-
de, infiltração tumoral, aumento da produção de citocinas, respostas imunes antitumorais e/ou resistência à exaustão.
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