JP2024513403A - 中枢神経系への核酸送達 - Google Patents
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Abstract
中枢神経系に（例えば、くも膜下腔内に）送達するためのカプセル化された核酸（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）を有する高分子ナノキャリア（例えば、ＰＬＧＡナノ粒子）を特徴とする。これらの高分子ナノキャリアは、中枢神経系障害の治療に有用である。それらは、遊離または非製剤化アンチセンスオリゴヌクレオチドよりも、より高い量、より長い期間、及び脳のより深い領域にそれらのカーゴ（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）を送達することができる。アンチセンスオリゴヌクレオチドの効率的な送達及び分布は、投与回数及び患者のコンプライアンスを低減させることをもたらし、かつペイシェントエクスペリエンスを改善する。【選択図】図８
Description
関連出願の相互参照
本出願は、２０２１年４月１日に出願された米国仮出願第６３／１６９，５３９号に対する優先権の権利を主張し、その内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０２１年４月１日に出願された米国仮出願第６３／１６９，５３９号に対する優先権の権利を主張し、その内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出された配列表を含み、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。２０２２年３月２５日に作成された当該ＡＳＣＩＩコピーは、１３７５１－０３０１ＷＯ１＿ＳＬ．ｔｘｔという名称であり、サイズは、１０，７２２バイトである。
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出された配列表を含み、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。２０２２年３月２５日に作成された当該ＡＳＣＩＩコピーは、１３７５１－０３０１ＷＯ１＿ＳＬ．ｔｘｔという名称であり、サイズは、１０，７２２バイトである。
本開示は、概して、治療剤を中枢神経系に送達するための組成物、及び神経障害の治療においてそれを使用する方法に関する。
中枢神経系（ＣＮＳ）への薬物の送達は、神経学的疾患（アルツハイマー病及びパーキンソン病など）の治療において難題であった。薬物が神経系に到達するためには、まず、血液脳関門（ＢＢＢ）を貫通しなければならず、これは、ＢＢＢの選択性に起因して、大きな課題である。ＢＢＢは、半透膜として作用し、大部分の分子が血液から神経系に侵入することを防止し、低分子量（４００Ｄａ未満）かつ親油性の化合物のみが通過することを可能にする。大部分の小分子及び巨大分子（モノクローナル抗体及びアンチセンスオリゴヌクレオチドなど）は、このバリアを通過することができない。ＢＢＢを越えて薬物が浸透するこの困難なプロセスに起因して、神経疾患の治療剤のうち臨床試験に進むのは１０％未満である。
ＣＮＳに直接アクセスする１つの方法は、くも膜下腔内（ＩＴ）注射の使用を介することである。脳脊髄液（ＣＳＦ）に直接注射することによって、治療薬は、ＣＮＳに直接アクセスできる。しかしながら、ＣＳＦは、１日に数回入れ替わるため、治療薬の滞留時間は、限定され得る。当該技術分野では、ＣＮＳに治療剤を送達するための改善された方法が必要である。
本出願は、一部分において、治療剤（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドなどの核酸）を中枢神経系（ＣＮＳ）に送達するための組成物に関する。また、そのような組成物を使用して神経学的疾患を治療する方法も特徴とする。加えて、ヒト対象の脳に送達される治療剤の量及び／または滞留時間を増加させる方法が、提供される。更に、本開示は、治療剤を、それを必要とするヒト対象の脳内により深く送達する方法に関する。
一態様では、本開示は、中枢神経系（ＣＮＳ）送達組成物を特徴とする。本組成物は、高分子ナノキャリアと、アンチセンスオリゴヌクレオチドと、を含む。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、高分子ナノキャリア内にカプセル化され、カプセル化される前に、対抗剤（カチオン性分子）と直接事前複合体化される。
いくつかの場合において、高分子ナノキャリアは、ポリ（ｌ－ラクチド）、ポリ（グリコリド）、ポリ（ｄ，ｌ－ラクチド）（ＰＬＡ）、ポリ（ジオキサノン）、ポリ（ｄ，ｌ－ラクチド－ｃｏ－ｌ－ラクチド）、ポリ（ｄ，ｌ－ラクチド－ｃｏ－グリコリド）、ポリ（グリコリド－ｃｏ－トリメチレンカーボネート）、ポリ（カプロラクトン）（「ポリカプロラクトン」）、ポリ（ｄ，ｌ－ラクチド－ｃｏ－グリコリド）（ＰＬＧＡ）、ポリ（ジオキサノン）ポリ（グリコリド－ｃｏ－トリメチレンカーボネート）、及びそれらの混合物からなる群から選択される。ある場合において、高分子ナノキャリアは、ＰＬＧＡである。ＣＮＳ送達組成物がＰＬＧＡナノ粒子である場合、ＰＬＧＡナノ粒子は、２：９８～９８：２の範囲の比率で乳酸：グリコール酸を含む。ある特定の場合において、ＰＬＧＡナノ粒子は、以下からなる群から選択される比率で乳酸：グリコール酸を含む：２：９８、３：９７、４：９６、５：９５、６：９４、７：９３、８：９２、９：９１、１０：９０、１１：８９、１２：８８、１３：８７、１４：８６、１５：８５、１６：８４、１７：８３、１８：８２、１９：８１、２０：８０、２１：７９、２２：７８、２３：７７、２４：７６、２５：７５、２６：７４、２７：７３、２８：７２、２９：７１、３０：７０、３１：６９、３２：６８、３３：６７、３４：６６、３５：６５、３６：６４、３７：６３、３８：６２、３９：６１、４０：６０、４１：５９、４２：５８、４３：５７、４４：５６、４５：５５、４６：５４、４７：５３、４８：５２、４９：５１、５０：５０、５１：４９、５２：４８、５３：４７、５４：４６、５５：４５、５６：４４、５７：４３、５８：４２、５９：４１、６０：４０、６１：３９、６２：３８、６３：３７、６４：３６、６５：３５、６６：３４、６７：３３、６８：３２、６９：３１、７０：３０、７１：２９、７２：２８、７３：２７、７４：２６、７５：２５、７６：２４、７７：２３、７８：２２、７９：２１、８０：２０、８１：１９、８２：１８、８３：１７、８４：１６、８５：１５、８６：１４、８７：１３、８８：１２、８９：１１、９０：１０、９１：９、９２：８、９３：７、９４：６、９５：５、９６：４、９７：４、９８：２、及び１００：０。
対抗剤は、アンチセンスオリゴヌクレオチドと複合体を形成するカチオン性分子である。いくつかの場合において、カチオン性分子は、カチオン性ペプチドである。他の場合において、カチオン性分子は、キトサンである。いくつかの場合において、カチオン性分子は、ヘキサデシルアミンである。いくつかの場合において、カチオン性分子は、ラウリン酸アルギネートである。更に他の場合において、カチオン性分子は、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）である。ある場合には、ＰＥＩは、直鎖ＰＥＩである。他の場合には、ＰＥＩは、架橋ＰＥＩである。
いくつかの場合において、ＣＮＳ送達組成物は、治療剤を更に含む。ある特定の場合において、治療剤は、小分子、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アプタマー、リボザイム、及び異なるアンチセンスオリゴヌクレオチドからなる群から選択される。
ある特定の場合において、ＣＮＳ送達組成物は、ヒト対象へのくも膜下腔内送達のために製剤化される。
いくつかの場合において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ギャップマーまたはスプライススイッチングアンチセンスオリゴヌクレオチドである。いくつかの場合において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、神経変性疾患（例えば、タウオパチー、シヌクレイノパチー）の治療に有用なものである。ある特定の場合において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号１に記載の核酸配列を含むか、またはそれからなる。ある場合において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、１８個の連結したヌクレオシドからなり、オリゴヌクレオチドは、核酸塩基配列ＭｅＵＭｅＣＡＭｅＣＭｅＵＭｅＵＭｅＵＭｅＣＡＭｅＵＡＡＭｅＵＧＭｅＣＭｅＵＧＧ（配列番号１）からなる核酸塩基配列を有し、オリゴヌクレオチドの各ヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート結合であり、オリゴヌクレオチドの各ヌクレオシドは、２’－メトキシエチルヌクレオシドであり、ＭｅＵは、５－メチル－ウラシルであり、ＭｅＣは、５－メチルシトシンである。
別の態様では、本開示は、ＣＮＳ障害の治療を必要とするヒト対象におけるＣＮＳ障害を治療する方法に関する。本方法は、ヒト対象に、治療有効量の上記のＣＮＳ送達組成物を投与することを含む。
いくつかの場合において、投与は、くも膜下腔内注射によるものである。ある特定の場合において、くも膜下腔内注射は、ボーラス注射である。ある場合には、ＣＮＳ障害は、シヌクレイノパチーまたはタウオパチーである。ある特定の場合において、ＣＮＳ障害は、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病、アンジェルマン症候群、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、クロイツフェルトヤコブ病、脊髄小脳失調症３型（ＳＣＡ３）、またはメンクス病である。
別の態様では、本開示は、ＳＭＮ１遺伝子の両方の機能的コピーの損失を有するヒト対象におけるＳＭＮ２メッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）転写産物中のエクソン７の包含を増加させる、または機能性ＳＭＮタンパク質欠乏を引き起こすＳＭＮ１遺伝子の変異を有するヒト対象におけるＳＭＮ２メッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）転写産物中のエクソン７の包含を増加させる、ＳＭＡの治療を必要とするヒト対象におけるＳＭＡを治療する方法を特徴とする。本方法は、ヒト対象のくも膜下腔内空間への注射によって、ＣＮＳ送達組成物を投与することを含み、アンチセンスオリゴヌクレオチドが、１８個の連結したヌクレオシドからなり、オリゴヌクレオチドは、核酸塩基配列ＭｅＵＭｅＣＡＭｅＣＭｅＵＭｅＵＭｅＵＭｅＣＡＭｅＵＡＡＭｅＵＧＭｅＣＭｅＵＧＧ（配列番号１）からなる核酸塩基配列を有し、オリゴヌクレオチドの各ヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート結合であり、オリゴヌクレオチドの各ヌクレオシドは、２’－メトキシエチルヌクレオシドであり、ＭｅＵは、５－メチル－ウラシルであり、ＭｅＣは、５－メチルシトシンである。
いくつかの実施形態において、注射は、ボーラス注射である。
別の態様では、本開示は、ヒト対象のＣＮＳに、アンチセンスオリゴヌクレオチドを送達するための方法に関する。本方法は、くも膜下腔内注射によって、ＰＬＧＡナノ粒子内にカプセル化されたアンチセンスオリゴヌクレオチドを投与することを含み、ＰＬＧＡナノ粒子の乳酸：グリコール酸比は、２：９８～１００：０の範囲であり、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＰＥＩまたは別のカチオン性分子（例えば、カチオン性ペプチド、キトサン、ヘキサデシルアミン、ラウリン酸アルギネート）と複合体化されている。
ある特定の場合において、ＰＬＧＡナノ粒子は、以下からなる群から選択される比率で乳酸：グリコール酸を含む：２：９８、３：９７、４：９６、５：９５、６：９４、７：９３、８：９２、９：９１、１０：９０、１１：８９、１２：８８、１３：８７、１４：８６、１５：８５、１６：８４、１７：８３、１８：８２、１９：８１、２０：８０、２１：７９、２２：７８、２３：７７、２４：７６、２５：７５、２６：７４、２７：７３、２８：７２、２９：７１、３０：７０、３１：６９、３２：６８、３３：６７、３４：６６、３５：６５、３６：６４、３７：６３、３８：６２、３９：６１、４０：６０、４１：５９、４２：５８、４３：５７、４４：５６、４５：５５、４６：５４、４７：５３、４８：５２、４９：５１、５０：５０、５１：４９、５２：４８、５３：４７、５４：４６、５５：４５、５６：４４、５７：４３、５８：４２、５９：４１、６０：４０、６１：３９、６２：３８、６３：３７、６４：３６、６５：３５、６６：３４、６７：３３、６８：３２、６９：３１、７０：３０、７１：２９、７２：２８、７３：２７、７４：２６、７５：２５、７６：２４、７７：２３、７８：２２、７９：２１、８０：２０、８１：１９、８２：１８、８３：１７、８４：１６、８５：１５、８６：１４、８７：１３、８８：１２、８９：１１、９０：１０、９１：９、９２：８、９３：７、９４：６、９５：５、９６：４、９７：４、９８：２、及び１００：０。
ある特定の場合において、ヒト対象は、ＣＮＳ障害を有する。いくつかの場合において、ＣＮＳ障害は、シヌクレイノパチーまたはタウオパチーである。ある場合には、ＣＮＳ障害は、ＳＭＡ、ＡＬＳ、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病、アンジェルマン症候群、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、クロイツフェルトヤコブ病、脊髄小脳失調症３型（ＳＣＡ３）、またはメンケス病である。
いくつかの場合において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、投与から約０．１時間～約１週間後、ヒト対象のＣＮＳ（例えば、皮質、線条体、視床、黒質、小脳）に送達される。いくつかの場合において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、投与から１日～７日後、ヒト対象のＣＮＳ（例えば、皮質、線条体、視床、黒質、小脳）に送達される。いくつかの場合において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、投与から１日～６日後、ヒト対象のＣＮＳ（例えば、皮質、線条体、視床、黒質、小脳）に送達される。いくつかの場合において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、投与から１日～５日後、ヒト対象のＣＮＳ（例えば、皮質、線条体、視床、黒質、小脳）に送達される。いくつかの場合において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、投与から１日～４日後、ヒト対象のＣＮＳ（例えば、皮質、線条体、視床、黒質、小脳）に送達される。いくつかの場合において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、投与から１日～３日後、ヒト対象のＣＮＳ（例えば、皮質、線条体、視床、黒質、小脳）に送達される。いくつかの場合において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、投与から１日～２日後、ヒト対象のＣＮＳ（例えば、皮質、線条体、視床、黒質、小脳）に送達される。いくつかの場合において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、投与から１日後、ヒト対象のＣＮＳ（例えば、皮質、線条体、視床、黒質、小脳）に送達される。いくつかの場合において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、投与後０．１時間～４８時間以内に、ヒト対象の皮質、線条体、視床、黒質、小脳に送達される。いくつかの場合において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、投与後０．１時間～３６時間以内に、ヒト対象の皮質、線条体、視床、黒質、小脳に送達される。いくつかの場合において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、投与後０．１時間～２４時間以内に、ヒト対象の皮質、線条体、視床、黒質、小脳に送達される。いくつかの場合において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、投与後０．１時間～１２時間以内に、ヒト対象の皮質、線条体、視床、黒質、小脳に送達される。いくつかの場合において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、投与後０．１時間～６時間以内に、ヒト対象の皮質、線条体、視床、黒質、小脳に送達される。いくつかの場合において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、投与後０．１時間～３時間以内に、ヒト対象の皮質、線条体、視床、黒質、小脳に送達される。いくつかの場合において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、投与後０．１時間～２時間以内に、ヒト対象の皮質、線条体、視床、黒質、小脳に送達される。いくつかの場合において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、投与後２４時間以内に、ヒト対象の皮質、線条体、視床、黒質、小脳に送達される。いくつかの場合において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、投与後１２時間以内に、ヒト対象の皮質、線条体、視床、黒質、小脳に送達される。いくつかの場合において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、投与後６時間以内に、ヒト対象の皮質、線条体、視床、黒質、小脳に送達される。いくつかの場合において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、投与後３時間以内に、ヒト対象の皮質、線条体、視床、黒質、小脳に送達される。いくつかの場合において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、投与後２時間以内に、ヒト対象の皮質、線条体、視床、黒質、小脳に送達される。いくつかの場合において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、投与後１時間以内に、ヒト対象の皮質、線条体、視床、黒質、小脳に送達される。
別の態様では、本開示は、水性緩衝液中のアンチセンスオリゴヌクレオチドの溶液の送達と比較して、アンチセンスオリゴヌクレオチドの量の増加を必要とするヒト対象の脊髄及び／または脳に送達されるアンチセンスオリゴヌクレオチドの量を増加させる方法を提供する。本方法は、アンチセンスオリゴヌクレオチドをカプセル化するＰＬＧＡナノ粒子をくも膜下腔内に注入することを含み、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＰＥＩまたは別のカチオン性分子（例えば、カチオン性ペプチド、キトサン、ヘキサデシルアミン、ラウリン酸アルギネート）と事前複合体化されており、ＰＬＧＡナノ粒子の乳酸：グリコール酸比は、２：９８～１００：０の範囲である。ある特定の場合において、ＰＬＧＡナノ粒子は、以下からなる群から選択される比率で乳酸：グリコール酸を含む：２：９８、３：９７、４：９６、５：９５、６：９４、７：９３、８：９２、９：９１、１０：９０、１１：８９、１２：８８、１３：８７、１４：８６、１５：８５、１６：８４、１７：８３、１８：８２、１９：８１、２０：８０、２１：７９、２２：７８、２３：７７、２４：７６、２５：７５、２６：７４、２７：７３、２８：７２、２９：７１、３０：７０、３１：６９、３２：６８、３３：６７、３４：６６、３５：６５、３６：６４、３７：６３、３８：６２、３９：６１、４０：６０、４１：５９、４２：５８、４３：５７、４４：５６、４５：５５、４６：５４、４７：５３、４８：５２、４９：５１、５０：５０、５１：４９、５２：４８、５３：４７、５４：４６、５５：４５、５６：４４、５７：４３、５８：４２、５９：４１、６０：４０、６１：３９、６２：３８、６３：３７、６４：３６、６５：３５、６６：３４、６７：３３、６８：３２、６９：３１、７０：３０、７１：２９、７２：２８、７３：２７、７４：２６、７５：２５、７６：２４、７７：２３、７８：２２、７９：２１、８０：２０、８１：１９、８２：１８、８３：１７、８４：１６、８５：１５、８６：１４、８７：１３、８８：１２、８９：１１、９０：１０、９１：９、９２：８、９３：７、９４：６、９５：５、９６：４、９７：４、９８：２、及び１００：０。ある場合において、ＰＬＧＡナノ粒子は、５０：５０の比率で乳酸：グリコール酸を含む。別の場合において、ＰＬＧＡナノ粒子は、５：９５の比率で乳酸：グリコール酸を含む。ある特定の場合において、ＡＳＯは、配列番号１に記載の核酸配列を含むか、またはそれからなる。ある特定の場合において、ＡＳＯは、神経変性疾患を治療するのに有用な核酸配列を含むか、またはそれからなる。
別の態様では、本開示は、水性緩衝液中のアンチセンスオリゴヌクレオチドの溶液の送達と比較して、ヒト対象の脳内にアンチセンスオリゴヌクレオチドをより深く送達する方法を提供する。本方法は、アンチセンスオリゴヌクレオチドをカプセル化するＰＬＧＡナノ粒子をくも膜下腔内に注入することを含み、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＰＥＩまたは別のカチオン性分子（例えば、カチオン性ペプチド、キトサン、ヘキサデシルアミン、ラウリン酸アルギネート）と事前複合体化されており、ＰＬＧＡナノ粒子の乳酸：グリコール酸比は、２：９８～１００：０の範囲である。ある特定の場合において、ＰＬＧＡナノ粒子は、以下からなる群から選択される比率で乳酸：グリコール酸を含む：２：９８、３：９７、４：９６、５：９５、６：９４、７：９３、８：９２、９：９１、１０：９０、１１：８９、１２：８８、１３：８７、１４：８６、１５：８５、１６：８４、１７：８３、１８：８２、１９：８１、２０：８０、２１：７９、２２：７８、２３：７７、２４：７６、２５：７５、２６：７４、２７：７３、２８：７２、２９：７１、３０：７０、３１：６９、３２：６８、３３：６７、３４：６６、３５：６５、３６：６４、３７：６３、３８：６２、３９：６１、４０：６０、４１：５９、４２：５８、４３：５７、４４：５６、４５：５５、４６：５４、４７：５３、４８：５２、４９：５１、５０：５０、５１：４９、５２：４８、５３：４７、５４：４６、５５：４５、５６：４４、５７：４３、５８：４２、５９：４１、６０：４０、６１：３９、６２：３８、６３：３７、６４：３６、６５：３５、６６：３４、６７：３３、６８：３２、６９：３１、７０：３０、７１：２９、７２：２８、７３：２７、７４：２６、７５：２５、７６：２４、７７：２３、７８：２２、７９：２１、８０：２０、８１：１９、８２：１８、８３：１７、８４：１６、８５：１５、８６：１４、８７：１３、８８：１２、８９：１１、９０：１０、９１：９、９２：８、９３：７、９４：６、９５：５、９６：４、９７：４、９８：２、及び１００：０。ある場合において、ＰＬＧＡナノ粒子は、５０：５０の比率で乳酸：グリコール酸を含む。別の場合において、ＰＬＧＡナノ粒子は、５：９５の比率で乳酸：グリコール酸を含む。ある特定の場合において、ＡＳＯは、配列番号１に記載の核酸配列を含むか、またはそれからなる。ある特定の場合において、ＡＳＯは、神経変性疾患を治療するのに有用な核酸配列を含むか、またはそれからなる。
ある特定の場合において、アンチセンスオリゴヌクレオチドのより多くが、水性緩衝液中のアンチセンスオリゴヌクレオチドの溶液の送達と比較して、脳の線条体、視床、黒質、及び／または小脳に送達される。アンチセンスオリゴヌクレオチドの効率的な送達及び分布は、投与回数を低減することをもたらし、かつペイシェントエクスペリエンス及びコンプライアンスを改善することができる。
別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本発明の実践または試験において、本明細書において記載されるものに類似するかまたは同等である方法及び材料を使用することができるが、例示的な方法及び材料が以下に記載される。本明細書において言及される全ての出版物、特許出願、特許、及び他の参照文献は、それらの全体を参照することによって援用される。矛盾する場合には、定義を含む本出願が優先される。材料、方法、及び実施例は、単に例示的なものであり、限定を意図したものではない。
本発明の他の特徴及び利点は、以下の詳細な説明及び特許請求の範囲から明らかとなるであろう。
中枢神経系（ＣＮＳ）への薬物の送達は、血液脳関門（ＢＢＢ）がほとんどの治療分子が脳内に入るのを防ぐ効果的なバリケードを提供するため、神経学的疾患の治療における中心的な問題である。脳へのアクセスがないと、これらの分子の治療効果が損なわれ得るか、または排除され得る。くも膜下腔内（ＩＴ）注入は、ＣＮＳに直接アクセスし、ＢＢＢをバイパスする方法を提供する。しかしながら、ＩＴ投与中に治療薬が注入される脳脊髄液（ＣＳＦ）が１日に数回入れ替わるため、治療薬の滞留時間はしばしば制限される。ＣＮＳへの十分な曝露がなければ、治療の治療的有用性は制限され得る。ＩＴ投与された治療薬の有効性を高めるために、出願人は、ＣＮＳ内の標的組織へのオリゴヌクレオチドの分布を改善しようとし、したがって、ＣＮＳ内のオリゴヌクレオチドの分布を改善することによって、曝露時間を延長し、薬物の迅速なクリアランスを防止しようとした。出願人は、このようにして、より多くの量の治療薬がより長い時間脳内の標的領域に到達することができると推論した。出願人は、負に荷電した遊離オリゴヌクレオチドとは異なる方法で組織と相互作用し、ＣＮＳにより長い滞留時間を有し、ナノ粒子がＣＮＳに存在する間に対象となる治療薬をナノ粒子から放出する、ナノ粒子に治療薬をカプセル化することによって、分布の改善を試みた。
高分子ナノ粒子（例えば、ＰＬＧＡナノ粒子）は、通常、緩慢かつ制御された放出動態を有するように設計されており、これらの薬物送達システムを設計する当業者は、各特定の適応症のための治療上の必要性に放出プロファイルを一致させるべきである。ほとんどの高分子ナノ粒子は、長期間（数時間から数カ月）にわたってそれらの内容物を放出して、滞留時間を最大化し、薬物の送達を制御する。しかしながら、本開示は、ＣＮＳ送達の生物学的制限及びＣＳＦの速いターンオーバ－により、むしろ速やかに（数時間～数日） ＡＳＯを放出するナノ粒子を用いることの利点に基づく。出願人は、半減期が比較的短いナノ粒子にオリゴヌクレオチドをカプセル化し、クリアランス前に確実に薬剤を放出させることによって、脊柱に沿って脳のより深い領域により多くの治療剤（例えば、ＡＳＯ）を得ることができることを見出す。これを達成するために、出願人のアプローチは、粒子が脊椎の腰部領域から脳に移動し、次いで粒子がＣＳＦから除去される前にそれらの内容物を放出することを可能にするナノ粒子放出速度を設計することである。これらの速度は、徐放性ナノ粒子製剤に典型的に用いられるものよりもはるかに高速である。ナノ粒子内に薬物をカプセル化することは、ＣＳＦ内の保持時間を増加させるが、ナノ粒子は、他のほとんどの高分子ナノ粒子（例えば、ＰＬＧＡナノ粒子）療法が設計されているように完全に分解されるまで永久にそこに留まることはない。出願人は、これらの高分子ナノ粒子が依然として十分に小さいため、遊離ＡＳＯほど速くはなく、ＣＮＳ周辺のくも膜下腔内空間から除去されることを見出す。したがって、出願人は、非常に長い間放出する高分子ナノ粒子（例えば、ＰＬＧＡナノ粒子）の開発を控える。むしろ、本出願人は、粒子が依然として中枢神経系及び脳にアクセスする間に、治療剤（例えば、ＡＳＯ）が放出され、利用可能であることを確実にするために、数時間から数日から数週間（数週間から数カ月ではない）の順で放出する高分子ナノ粒子（例えば、ＰＬＧＡナノ粒子）に依存する。
本開示はまた、中枢神経系へのナノ粒子の投与が毒性効果を有さず、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）を含有する本出願人の高分子ナノ粒子の中枢神経系への直接投与が悪影響を示さないという知見にも一部基づいている。
本開示は、とりわけ、脳へのアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）の送達のためのポリ（ｄｌ－ラクチド－ｃｏ－グリコリド）（ＰＬＧＡ）ナノ粒子の有効性及び安全性を調査する動物研究からの結果を提供する。簡潔には、ＰＬＧＡナノ粒子を、Ｍａｌａｔ－１ ＡＳＯで負荷し、特徴付けた。次いで、これらの粒子を、マウスの脳室内（ＩＣＶ）に注射した。これらの注射は、良好な耐容性を示し、腰椎脊髄皮質においてノックダウンを示し、ＡＳＯがナノ粒子から放出され、ナノ粒子がこれらの研究で使用された用量で安全であることを示した。続いて、ナノ粒子を、くも膜下腔内注射によってラットに注射した。この研究の結果は、ナノ粒子にカプセル化されて投与されたＡＳＯが、遊離非製剤化ＡＳＯ単独と比較して、皮質におけるノックダウンが１．５～２倍増加することを示す。遊離ＡＳＯと比較して、粒子製剤から改善があったが、異なる乳酸：グリコール酸比を有するＰＬＧＡ製剤間の性能差を調べるために、より多くの作業が必要であった。ナノ粒子製造プロセスの改良後、脊柱及び脳に沿ったオリゴヌクレオチドの製剤及び分布の耐容性を調べた追加のラットＩＴ研究のために、異なる乳酸：グリコール酸比をナノ粒子に供給するために改善が加えられた。結果は、遊離非製剤化ＡＳＯと比較して、ナノ粒子からの皮質中のノックダウンの増加（ＰＬＧＡ５０：５０）があったことを実証した。ライブインビボイメージングを用いたレポーターマウスモデルにおける更なるＩＣＶ投与では、ＰＬＧＡ製剤が、対応する遊離非製剤化ＡＳＯと比較して有意な改善をもたらしたことが示された。
高分子ナノキャリア組成物
核酸（例えば、オリゴヌクレオチド）を体内の標的部位に送達するための２つの広範なアプローチがある。１つ目は、コンジュゲートの分子的性質を維持しながら、通常は標的リガンドを用いて核酸を化学的に修飾することである。２つ目は、核酸を何らかの形態のナノキャリアに組み込んでから、オリゴヌクレオチドの組織分布及び細胞相互作用を判定することである。これらの２つのアプローチの間の大きな違いは、分子スケール対ナノスケールの送達部位のサイズにある。本開示は、ナノスケールの送達に焦点を当てている。脂質ナノキャリア及び高分子ナノキャリアを含む様々なナノスケール系が存在する。本開示は、高分子ナノキャリアに関する。高分子ナノキャリアとしては、例えば、ＰＬＧＡナノ粒子、高分子ミセル（「コアシェル」ナノ粒子としても知られている）、ＰＬＧＡコア及び脂質ＰＥＧシェルからなる自己組織化したハイブリッドナノキャリア、ならびにナノハイドロゲル（例えば、ＰＲＩＮＴナノハイドロゲル）が挙げられる。
核酸（例えば、オリゴヌクレオチド）を体内の標的部位に送達するための２つの広範なアプローチがある。１つ目は、コンジュゲートの分子的性質を維持しながら、通常は標的リガンドを用いて核酸を化学的に修飾することである。２つ目は、核酸を何らかの形態のナノキャリアに組み込んでから、オリゴヌクレオチドの組織分布及び細胞相互作用を判定することである。これらの２つのアプローチの間の大きな違いは、分子スケール対ナノスケールの送達部位のサイズにある。本開示は、ナノスケールの送達に焦点を当てている。脂質ナノキャリア及び高分子ナノキャリアを含む様々なナノスケール系が存在する。本開示は、高分子ナノキャリアに関する。高分子ナノキャリアとしては、例えば、ＰＬＧＡナノ粒子、高分子ミセル（「コアシェル」ナノ粒子としても知られている）、ＰＬＧＡコア及び脂質ＰＥＧシェルからなる自己組織化したハイブリッドナノキャリア、ならびにナノハイドロゲル（例えば、ＰＲＩＮＴナノハイドロゲル）が挙げられる。
ナノ粒子は、標的組織または器官に効率的に送達しながら治療剤を保護することができるため、最も汎用性の高い薬物送達系のうちの１つと考えられている。いくつかの異なるタイプの高分子ナノキャリアは、治療剤（例えば、ＡＳＯなどのオリゴヌクレオチド）の送達のために使用することができる。ある特定の場合において、ポリマーナノ粒子は、ポリ（ｌ－ラクチド）、ポリ（グリコリド）、ポリ（ｄ，ｌ－ラクチド）（ＰＬＡ）、ポリ（ジオキサノン）、ポリ（ｄ，ｌ－ラクチド－ｃｏ－ｌ－ラクチド）、ポリ（ｄ，ｌ－ラクチド－ｃｏ－グリコリド）、ポリ（グリコリド－ｃｏ－トリメチレンカーボネート）、ポリ（カプロラクトン）（「ポリカプロラクトン」）、ポリ（ｄ，ｌ－ラクチド－ｃｏ－グリコリド）（ＰＬＧＡ）、ポリ（ジオキサノン）ポリ（グリコリド－ｃｏ－トリメチレンカーボネート）、またはそれらの混合物のうちの１つである。例示的な乳酸ポリマーは、例えば、ＥＰ１４６８０３５、米国特許第６，７０６，８５４号、ＷＯ２００７／００９９１９Ａ２、ＥＰ１９０７０２３Ａ、ＥＰ２２６３７０７Ａ、ＥＰ２１４７０３６、ＥＰ０４２７１８５、及び米国特許第５，６１０，２６６号に記載されている。
生分解性ポリマーＰＬＧＡは、薬物送達のキャリアとして莫大な可能性を有する。加えて、ポリマー分子量、ラクチド対グリコリドの比率、及び粒径などのパラメータを制御することによって、ＰＬＧＡ－薬物マトリックスの全体的な物理的特性を調整して、所望の薬物負荷及び放出速度を達成することが可能である。水性環境では、ＰＬＧＡは、そのエステル結合の加水分解によって分解する。このため、ポリマーの疎水性及び結晶性は、その分解速度に影響を与え、ポリマーが、疎水性が高く、かつ結晶性が高いほど、分解が遅くなる。ＰＬＧＡの２つのモノマーのうち、ＬＡはより疎水性であるため、ＰＬＧＡポリマー中に存在するＬＡが多いほど、それはより疎水性である。また、ＰＬＧＡポリマーに存在するＬＡが多いほど、結晶性が高くなり、これらの２つの特徴の組み合わせにより、ＬＡ含有量の高いＰＬＧＡポリマーの分解速度が遅くなり、ＧＡ含有量の高いＰＬＧＡポリマーの分解速度が速くなる。ＰＬＧＡのこの特徴は有用であり、所望の放出速度のために選択する最も効果的なポリマーのタイプを判定するのに役立つことができる。
いくつかの場合において、本開示は、２：９８～１００：０の範囲の比率で乳酸：グリコール酸を含むＰＬＧＡナノ粒子を特徴とする。ある特定の場合において、本開示は、２：９８～９８：２の範囲の比率で乳酸：グリコール酸を含むＰＬＧＡナノ粒子を特徴とする。いくつかの場合において、本開示は、５：９５～９５：５の範囲の比率で乳酸：グリコール酸を含むＰＬＧＡナノ粒子を特徴とする。他の場合において、本開示は、１０：９０～９０：１０の範囲の比率で乳酸：グリコール酸を含むＰＬＧＡナノ粒子を特徴とする。他の場合において、本開示は、１５：８５～８５：１５の範囲の比率で乳酸：グリコール酸を含むＰＬＧＡナノ粒子を特徴とする。更に他の場合において、本開示は、２０：８０～８０：２０の範囲の比率で乳酸：グリコール酸を含むＰＬＧＡナノ粒子を特徴とする。いくつかの場合において、本開示は、２５：７５～７５：２５の範囲の比率で乳酸：グリコール酸を含むＰＬＧＡナノ粒子を特徴とする。他の場合において、本開示は、３０：７０～７０：３０の範囲の比率で乳酸：グリコール酸を含むＰＬＧＡナノ粒子を特徴とする。ある特定の場合において、本開示は、３５：６５～６５：３５の範囲の比率で乳酸：グリコール酸を含むＰＬＧＡナノ粒子を特徴とする。いくつかの場合において、本開示は、４０：５５～５５：４５の範囲の比率で乳酸：グリコール酸を含むＰＬＧＡナノ粒子を特徴とする。いくつかの場合において、本開示は、５：９５～８５：１５の範囲の比率で乳酸：グリコール酸を含むＰＬＧＡナノ粒子を特徴とする。ある特定の場合において、本開示は、以下からなる群から選択される比率で乳酸：グリコール酸を含むＰＬＧＡナノ粒子を特徴とする：２：９８、３：９７、４：９６、５：９５、６：９４、７：９３、８：９２、９：９１、１０：９０、１１：８９、１２：８８、１３：８７、１４：８６、１５：８５、１６：８４、１７：８３、１８：８２、１９：８１、２０：８０、２１：７９、２２：７８、２３：７７、２４：７６、２５：７５、２６：７４、２７：７３、２８：７２、２９：７１、３０：７０、３１：６９、３２：６８、３３：６７、３４：６６、３５：６５、３６：６４、３７：６３、３８：６２、３９：６１、４０：６０、４１：５９、４２：５８、４３：５７、４４：５６、４５：５５、４６：５４、４７：５３、４８：５２、４９：５１、５０：５０、５１：４９、５２：４８、５３：４７、５４：４６、５５：４５、５６：４４、５７：４３、５８：４２、５９：４１、６０：４０、６１：３９、６２：３８、６３：３７、６４：３６、６５：３５、６６：３４、６７：３３、６８：３２、６９：３１、７０：３０、７１：２９、７２：２８、７３：２７、７４：２６、７５：２５、７６：２４、７７：２３、７８：２２、７９：２１、８０：２０、８１：１９、８２：１８、８３：１７、８４：１６、８５：１５、８６：１４、８７：１３、８８：１２、８９：１１、９０：１０、９１：９、９２：８、９３：７、９４：６、９５：５、９６：４、９７：４、９８：２、及び１００：０。ある場合において、本開示は、５０：５０の比率で乳酸：グリコール酸を含むＰＬＧＡナノ粒子を特徴とする。別の場合において、本開示は、５：９５の比率で乳酸：グリコール酸を含むＰＬＧＡナノ粒子を特徴とする。更に別の場合において、本開示は、８５：１５の比率で乳酸：グリコール酸を含むＰＬＧＡナノ粒子を特徴とする。
いくつかの場合において、高分子ナノキャリア（例えば、ＰＬＧＡナノ粒子）は、－０．３～－１２．０ｍＶの全電荷密度を有する。他の場合において、高分子ナノキャリア（例えば、ＰＬＧＡナノ粒子）は、－０．４～－１０ ．０ｍＶの全電荷密度を有する。いくつかの場合において、高分子ナノキャリア（例えば、ＰＬＧＡナノ粒子）は、－０．４～－１．０ｍＶの全電荷密度を有する。いくつかの場合において、高分子ナノキャリア（例えば、ＰＬＧＡナノ粒子）は、－０．４～－０．９ｍＶの全電荷密度を有する。いくつかの場合において、高分子ナノキャリア（例えば、ＰＬＧＡナノ粒子）は、－０．４～－０．８ｍＶの全電荷密度を有する。いくつかの場合において、高分子ナノキャリア（例えば、ＰＬＧＡナノ粒子）は、－０．４～－０．７ｍＶの全電荷密度を有する。ある特定の場合において、高分子ナノキャリア（例えば、ＰＬＧＡナノ粒子）は、０．４～０．６ｍＶの全電荷密度を有する。ある特定の場合において、高分子ナノキャリア（例えば、ＰＬＧＡナノ粒子）は、０．０１～０．０５ｍＶの全電荷密度を有する。
いくつかの場合において、高分子ナノキャリア（例えば、ＰＬＧＡナノ粒子）は、０．２～０．９の多分散指数を有する。ある特定の場合において、高分子ナノキャリア（例えば、ＰＬＧＡナノ粒子）は、０．２～０．８の多分散指数を有する。他の場合において、高分子ナノキャリア（例えば、ＰＬＧＡナノ粒子）は、０．２～０．７の多分散指数を有する。いくつかの場合において、高分子ナノキャリア（例えば、ＰＬＧＡナノ粒子）は、０．２～０．６の多分散指数を有する。いくつかの場合において、高分子ナノキャリア（例えば、ＰＬＧＡナノ粒子）は、０．２～０．５の多分散指数を有する。いくつかの場合において、高分子ナノキャリア（例えば、ＰＬＧＡナノ粒子）は、０．２～０．４の多分散指数を有する。ある特定の場合において、高分子ナノキャリア（例えば、ＰＬＧＡナノ粒子）は、０．２～０．３の多分散指数を有する。
いくつかの場合において、高分子ナノ粒子（例えば、ＰＬＧＡナノ粒子）は、１００ｎｍ～１０００ｎｍの直径を有する。ある特定の場合において、高分子ナノ粒子（例えば、ＰＬＧＡナノ粒子）は、１００ｎｍ～９００ｎｍの直径を有する。いくつかの場合において、高分子ナノ粒子（例えば、ＰＬＧＡナノ粒子）は、１００ｎｍ～８００ｎｍの直径を有する。ある特定の場合において、高分子ナノ粒子（例えば、ＰＬＧＡナノ粒子）は、１００ｎｍ～７００ｎｍの直径を有する。他の場合において、高分子ナノ粒子（例えば、ＰＬＧＡナノ粒子）は、１００ｎｍ～６００ｎｍの直径を有する。更に他の場合において、高分子ナノ粒子（例えば、ＰＬＧＡナノ粒子）は、１００ｎｍ～５００ｎｍの直径を有する。いくつかの場合において、高分子ナノ粒子（例えば、ＰＬＧＡナノ粒子）は、１００ｎｍ～４００ｎｍの直径を有する。ある特定の場合において、高分子ナノ粒子（例えば、ＰＬＧＡナノ粒子）は、１００ｎｍ～３００ｎｍの直径を有する。いくつかの場合において、高分子ナノ粒子（例えば、ＰＬＧＡナノ粒子）は、１００ｎｍ～２５０ｎｍの直径を有する。他の場合において、高分子ナノ粒子（例えば、ＰＬＧＡナノ粒子）は、１００ｎｍ～２００ｎｍの直径を有する。
ある特定の場合において、高分子ナノキャリア（例えば、ＰＬＧＡナノ粒子）は、１００～６５０ｎＭの直径、－０．４～－０．６ｍＶの全電荷密度、及び０．２～０．３の多分散指数を有する。ある特定の場合において、高分子ナノキャリア（例えば、ＰＬＧＡナノ粒子）は、１００～４００ｎＭの直径、－０．４～－０．６ｍＶの全電荷密度、及び０．２～０．３の多分散指数を有する。ある特定の場合において、高分子ナノキャリア（例えば、ＰＬＧＡナノ粒子）は、２００～３００ｎＭの直径、－０．４～－０．６ｍＶの全電荷密度、及び０．２～０．３の多分散指数を有する。ある特定の場合において、これらの高分子ナノキャリア（例えば、ＰＬＧＡナノ粒子）は、以下からなる群から選択される比率で乳酸：グリコール酸を含む：２：９８、３：９７、４：９６、５：９５、６：９４、７：９３、８：９２、９：９１、１０：９０、１１：８９、１２：８８、１３：８７、１４：８６、１５：８５、１６：８４、１７：８３、１８：８２、１９：８１、２０：８０、２１：７９、２２：７８、２３：７７、２４：７６、２５：７５、２６：７４、２７：７３、２８：７２、２９：７１、３０：７０、３１：６９、３２：６８、３３：６７、３４：６６、３５：６５、３６：６４、３７：６３、３８：６２、３９：６１、４０：６０、４１：５９、４２：５８、４３：５７、４４：５６、４５：５５、４６：５４、４７：５３、４８：５２、４９：５１、５０：５０、５１：４９、５２：４８、５３：４７、５４：４６、５５：４５、５６：４４、５７：４３、５８：４２、５９：４１、６０：４０、６１：３９、６２：３８、６３：３７、６４：３６、６５：３５、６６：３４、６７：３３、６８：３２、６９：３１、７０：３０、７１：２９、７２：２８、７３：２７、７４：２６、７５：２５、７６：２４、７７：２３、７８：２２、７９：２１、８０：２０、８１：１９、８２：１８、８３：１７、８４：１６、８５：１５、８６：１４、８７：１３、８８：１２、８９：１１、９０：１０、９１：９、９２：８、９３：７、９４：６、９５：５、９６：４、９７：４、９８：２、及び１００：０。
ある特定の場合において、負に荷電した（アニオン性）オリゴヌクレオチドは、カチオン性分子と複合体化される。例示的なカチオン性分子としては、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）などの合成カチオン性ポリマー、キトサンなどの天然カチオン性ポリマー、カチオン性ペプチド、カチオン性デンドリマー、ヘキサデシルアミン、またはラウリン酸アルギネートが挙げられる。いくつかの実施形態において、ＰＥＩは、直鎖ＰＥＩまたは架橋ＰＥＩであり得る。ＰＥＩは、複数の滴定可能なアミノ基を有する直鎖または分岐ポリマーであるため、オリゴヌクレオチドとナノ複合体を容易に形成することができる。いくつかの実施形態において、複合体分子は、ＰｅｐＦｅｃｔ６、ミツバチメリチンに由来するカチオン性ペプチド、転写のトランスアクチベーター（ＴＡＴ）のカチオン性ペプチド、ヒトラクトフェリン由来ペプチド、または短い両親媒性配列であり得る。いくつかの実施形態において、カチオン性デンドリマーは、ポリアミドアミン（ＰＡＭＡＭ）である。
いくつかの場合において、高分子ナノ粒子（例えば、ＰＬＧＡナノ粒子）は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を更に含む。ＰＥＧなどの中性ポリマーは、網状内皮系（ＲＥＳ）によるタンパク質の結合及び取り込みを最小限に抑えることができる。したがって、ＰＥＧを含む高分子ナノ粒子は、循環時間を増加させることができる。ある特定の場合において、ＰＥＧは、切断可能なリンカーまたは短い脂質アンカーを用いて高分子ナノキャリアに連結される。いくつかの場合において、高分子ナノ粒子（例えば、ＰＬＧＡナノ粒子）は、葉酸を更に含む。葉酸は、ナノキャリア表面に結合することができる。いくつかの場合において、高分子ナノ粒子（例えば、ＰＬＧＡナノ粒子）は、対象となる部位を標的とする小分子リガンド（例えば、アニスアミド）またはアプタマーを更に含む。いくつかの場合において、高分子ナノ粒子（例えば、ＰＬＧＡナノ粒子）は、トランスフェリン受容体リガンドを更に含む。いくつかの場合において、高分子ナノ粒子（例えば、ＰＬＧＡナノ粒子）は、抗トランスフェリン受容体抗体またはその断片を更に含む。いくつかの場合において、高分子ナノ粒子（例えば、ＰＬＧＡナノ粒子）は、ナノ粒子をニューロンに標的とする狂犬病ウイルスペプチドを更に含む。いくつかの場合において、高分子ナノ粒子（例えば、ＰＬＧＡナノ粒子）は、エンドサイトーシスの受容体部位を標的とする標的リガンドを更に含む。
ある特定の場合において、高分子ナノ粒子（例えば、ＰＬＧＡナノ粒子）は、ナノ粒子内にカプセル化された核酸（例えば、ＡＳＯなどのオリゴヌクレオチド）に加えて治療剤を含む。ある特定の場合において、治療剤は、小分子、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アプタマー、リボザイム、及び異なるアンチセンスオリゴヌクレオチドからなる群から選択される。
高分子ナノ粒子（例えば、ＰＬＧＡナノ粒子）は、送達される核酸（例えば、ＡＳＯなどのオリゴヌクレオチド）をカプセル化するように調製することができる。ある特定の場合において、ＡＳＯは、配列番号１に示される配列を含むか、またはそれからなる。そのような高分子ナノ粒子は、核酸（例えば、ＡＳＯなどのオリゴヌクレオチド）と複合体化したカチオン性分子を含むことができる。ある特定の場合において、カチオン性分子は、ＰＥＩである。いくつかの場合において、そのような高分子ナノキャリアは、核酸（例えば、ＡＳＯ）及び第２の治療剤（例えば、小分子薬または別のＡＳＯ）の両方を輸送することができる。したがって、高分子ナノ粒子は、標的部位（例えば、脊髄、皮質、線条体、視床、黒質、または小脳などの中枢神経系の任意の部分）への治療剤のインビボ共送達のために使用することができる。
上記の高分子ナノ粒子（例えば、ＰＬＧＡナノ粒子）のうちのいずれも、ヒト対象へのくも膜下腔内送達のために製剤化することができる。いくつかの場合において、高分子ナノ粒子（例えば、ＰＬＧＡナノ粒子）は、ボーラス注射によってくも膜下腔内に投与される。いくつかの場合において、高分子ナノ粒子（例えば、ＰＬＧＡナノ粒子）は、ヒト対象の脳の線条体、視床、黒質、または小脳のうちの１つ以上への送達のために製剤化される。
アンチセンスオリゴヌクレオチド
アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）は、リボ核酸（ＲＮＡ）に結合し、それによって標的ＲＮＡの発現を変化または低減させる合成一本鎖核酸である。それらは、標的転写産物の分解によってタンパク質の発現を低減させるだけでなく、プレｍＲＮＡスプライシングとの干渉を通じてタンパク質の発現を復元するまたはタンパク質を修飾することもできる。本開示は、両方のタイプのＡＳＯを包含する。ある特定の場合において、本開示のＡＳＯは、「ギャップマー」である。そのようなＡＳＯは、主に、ＲＮａｓｅ Ｈ依存性機序を介して相補的な部位を有するｍＲＮＡを選択的に切断することによって作用する。それらは、ヌクレアーゼに対する親和性を増加させ、及び／または感受性を低減する化学的に修飾された末端に隣接するＲＮａｓｅ Ｈ活性を支援する中央領域を有する。いくつかの場合において、本開示のＡＳＯは、スプライススイッチングオリゴヌクレオチド（ＳＳＯ）（例えば、ヌシネルセン）である。ＳＳＯは、一般に、ＲＮａｓｅ Ｈ活性を除去し、スプライシング中に核プレｍＲＮＡとの相互作用を可能にするように完全に修飾される。これらは、５’もしくは３’スプライス接合部、またはエクソン内スプライシングエンハンサーもしくはサイレンサー部位に結合するように設計することができる。そのような部位に結合することによって、それらは、例えば、エクソンの代替的な使用、エクソン除外、またはエクソン包含を促進することによって、スプライシングを修飾することができる。
アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）は、リボ核酸（ＲＮＡ）に結合し、それによって標的ＲＮＡの発現を変化または低減させる合成一本鎖核酸である。それらは、標的転写産物の分解によってタンパク質の発現を低減させるだけでなく、プレｍＲＮＡスプライシングとの干渉を通じてタンパク質の発現を復元するまたはタンパク質を修飾することもできる。本開示は、両方のタイプのＡＳＯを包含する。ある特定の場合において、本開示のＡＳＯは、「ギャップマー」である。そのようなＡＳＯは、主に、ＲＮａｓｅ Ｈ依存性機序を介して相補的な部位を有するｍＲＮＡを選択的に切断することによって作用する。それらは、ヌクレアーゼに対する親和性を増加させ、及び／または感受性を低減する化学的に修飾された末端に隣接するＲＮａｓｅ Ｈ活性を支援する中央領域を有する。いくつかの場合において、本開示のＡＳＯは、スプライススイッチングオリゴヌクレオチド（ＳＳＯ）（例えば、ヌシネルセン）である。ＳＳＯは、一般に、ＲＮａｓｅ Ｈ活性を除去し、スプライシング中に核プレｍＲＮＡとの相互作用を可能にするように完全に修飾される。これらは、５’もしくは３’スプライス接合部、またはエクソン内スプライシングエンハンサーもしくはサイレンサー部位に結合するように設計することができる。そのような部位に結合することによって、それらは、例えば、エクソンの代替的な使用、エクソン除外、またはエクソン包含を促進することによって、スプライシングを修飾することができる。
理想的には、本開示の合成オリゴヌクレオチド（例えば、ＡＳＯ）は、標的ＲＮＡ転写産物上の特定の配列に結合し、安定であるべきである。合成オリゴヌクレオチド（例えば、ＡＳＯ）は、それらが導入される細胞には外来であり、したがって、それらは、内因性ヌクレアーゼの標的となる。合成オリゴヌクレオチドが、それらのタスクを達成するために必要とされ得る細胞内での持続性のレベルを達成するためには、それらは、一般的に、それらの内因性ヌクレアーゼから保護される必要がある。合成オリゴヌクレオチドは、ホスホジエステル骨格の修飾、リボース２’ＯＨ基での修飾、ならびにリボース環及びヌクレオシド塩基の修飾を含むが、これらに限定されない、当該技術分野で既知の任意の修飾によって修飾することができる。例えば、リン酸塩骨格の修飾は、非架橋リン酸塩酸素が硫黄で置き換えられるホスホロチオエート（ＰＳ）修飾を含むことができる。加えて、他の修飾としては、ホスホロジチオエート及びホスホノアセテートが挙げられる。例えば、米国特許第６，１４３，８８１号、同第５，５８７，３６１号、及び同第５，５９９，７９７号を参照されたく、これらは参照により組み込まれる。他の修飾には、２’－Ｏ－メチル（２’ＯＭｅ）、２’フルオロ（２’Ｆ）、２’メトキシエチル（２’－Ｏ－ＭＯＥ）、２’フルオララビノ（ＦＡＮＡ）、２’－Ｈ、２’－チオウラシル、ロック核酸（ＬＮＡ）、拘束エチル（ｃＥｔ）、架橋核酸（ＢＮＡ）、エチレン架橋核酸（ＥＮＡ）、ヘキシトール核酸（ＨＮＡ）、アルトリトール核酸（ＡＮＡ）、シクロヘキセン核酸（ＣｅＮＡ）、ロック解除核酸（ＵＮＡ）、４’チオ（４’－Ｓ）、及び３’反転非塩基性エンドキャップが含まれる。いくつかの実施形態において、核酸は、天然のホスホジエステル結合をボラノホスフェート（ＰＢ）結合、ホスホノアセテート（Ｐａｃ）結合、またはチオホスホノアセテート骨格結合で置換することによって修飾され得る。いくつかの実施形態において、核酸は、１つを超える修飾を含み得る。いくつかの実施形態において、核酸は、２つを超える修飾を含み得る。ある場合には、合成オリゴヌクレオチド（例えば、ＡＳＯ）の修飾は、２’－Ｏ－メチル（２’ＯＭｅ）修飾、２’フルオロ（２’Ｆ）修飾、ＭＯＥ修飾、２’フルオララビノ（ＦＡＮＡ）修飾、２’－Ｈ修飾、２’－チオウラシル修飾、ロック核酸（ＬＮＡ）修飾、架橋核酸（ＢＮＡ）修飾、エチレン架橋核酸（ＥＮＡ）修飾、ヘキシトール核酸（ＨＮＡ）修飾、アルトリトール核酸（ＡＮＡ）修飾、シクロヘキセン核酸（ＣｅＮＡ）修飾、アンロック核酸（ＵＮＡ）修飾、４’チオ（４’－Ｓ）修飾、チオール結合修飾、及び３’反転非塩基性エンドキャップ修飾のうちの少なくとも１つである。
いくつかの場合において、合成オリゴヌクレオチド（例えば、ＡＳＯ）は、１つ以上のホスホロチオエート（ＰＳ）骨格修飾を有する。そのような修飾は、血液及び組織中のヌクレアーゼからの安定性及び保護を改善する。それらはまた、タンパク質結合を促進し、したがって、アルブミン及び他の血液タンパク質との相互作用を支援し、このようにして腎クリアランスを遅らせる。この修飾は、ＲＮａｓｅ Ｈ活性を支援しているため、ギャップマー及びＳＳＯの両方で使用することができる。ある特定の場合において、ＡＳＯは、ホスホロジアミデートモルホリノオリゴマー（ＰＭＯ）及び／またはペプチド核酸（ＰＮＡ）修飾を含む。そのような修飾は、中性骨格を生成し、ヌクレアーゼに対する高い耐性を提供する。そのような修飾は、ＲＮａｓｅ Ｈ活性を支援しないため、それらは、主にギャップマーではなくＳＳＯで使用される。別の修飾は、２’糖位置での変化である。そのような修飾としては、２’－Ｏ－Ｍｅ及び２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）（ＭＯＥ）修飾が挙げられる。これらの修飾は、ＲＮＡ様コンフォメーションを促進し、ＲＮＡへの結合親和性を有意に増加させる一方で、強化されたヌクレアーゼ耐性も提供する。２’位で完全に修飾されたオリゴヌクレオチドは、ＲＮａｓｅ Ｈ活性を支援しないため、一般にＳＳＯに最適である。しかしながら、ＲＮＡｓｅ Ｈ依存性アンチセンス効果は、２’修飾領域に隣接する約７個の残基の中央非修飾領域を含む「ギャップマー」を使用することによって達成することができる。オリゴヌクレオチドに有効であり得る別の修飾は、架橋環の使用である。ロック核酸（ＬＮＡ）化学及び拘束エチル（ｃＥｔ）ならびに三環ＤＮＡ（ｔｃ－ＤＮＡ）修飾は、糖環の架橋を伴う。そのような修飾は、ＲＮＡ様構造を促進し、ヌクレアーゼ耐性を示し、結合親和性の劇的な増加をもたらす。これらの修飾は、ギャップマー及びＳＳＯの両方で使用することができる。ある特定の実施形態において、本開示のＡＳＯは、上述の修飾のうちの１つ以上を含む。いくつかの実施形態において、本開示のＡＳＯは、ＰＳ骨格を有する。いくつかの実施形態において、本開示のＡＳＯは、混合ＰＳ及びホスホジエステル骨格を有する。ある特定の実施形態において、本開示のＡＳＯは、１つ以上の２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）（ＭＯＥ）修飾を有する。ある特定の実施形態において、本開示のＡＳＯは、全ての残基がＭＯＥ修飾を有する。ある特定の実施形態において、本開示のＡＳＯは、１つ以上のｃＥｔを含む。ある特定の場合において、本開示のＡＳＯの１つ以上のウラシルは、５－メチル－ウラシルによって置き換えられる。ある特定の場合において、本開示のＡＳＯの全てのウラシルは、５－メチル－ウラシルによって置き換えられる。ある特定の場合において、本開示のＡＳＯの１つ以上のシトシンは、５－メチル－シトシンによって置き換えられる。ある特定の場合において、本開示のＡＳＯの全てのシトシンは、５－メチル－シトシンによって置き換えられる。
本開示に包含されるＡＳＯの非限定的な例を、表Ｉに提供する。
本開示に包含される他の非限定的かつ例示的なＡＳＯは、Ｅｖｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ，８７：９０－１０３（２０１５）（例えば、表２及びそこに引用される参考文献を参照されたい）、Ｂｅｎｎｅｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．，６１：８３１－５２（２０２１）（例えば、表１及びその中で引用される参考文献を参照されたい）、Ｓｉｌｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒａｉｎ，１４３；４０７－４２９（２０２０）（例えば、表２及びその中で引用される参考文献を参照されたい）、ＵＳ１０，３８５，３４１、ＵＳ９，６８３，２３５、及びＵＳ１０，４０７，６８０を参照されたく、これらの全ての内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
本明細書に記載のＡＳＯは、高分子ナノキャリア（例えば、ＰＬＧＡ）にカプセル化される。ある特定の場合において、本明細書に記載のＡＳＯは、カチオン性分子（例えば、ＰＥＩ）と複合体化される。
薬学的組成物
本明細書に開示される高分子ナノ粒子は、薬学的に許容されるキャリアと組み合わせて薬学的組成物を形成し得る。当業者によって理解されるであろうように、キャリアは、以下に記載される投与経路、標的問題の位置、送達される薬物、薬物の送達の経過などに基づいて選択され得る。
本明細書に開示される高分子ナノ粒子は、薬学的に許容されるキャリアと組み合わせて薬学的組成物を形成し得る。当業者によって理解されるであろうように、キャリアは、以下に記載される投与経路、標的問題の位置、送達される薬物、薬物の送達の経過などに基づいて選択され得る。
注射可能な調製物、例えば、滅菌注射可能な水性または油性懸濁液は、好適な分散剤または湿潤剤及び懸濁剤を使用して製剤化され得る。滅菌注射可能な調製物はまた、例えば、１，３－ブタンジオール中の溶液として、非毒性の非経口的に許容される希釈剤または溶媒中の滅菌注射可能な溶液、懸濁液、またはエマルジョンであり得る。使用され得る許容されるビヒクル及び溶媒の中には、水、リンゲル溶液、Ｕ．Ｓ．Ｐ．、及び等張塩化ナトリウム溶液である。加えて、無菌の固定油が、溶媒または懸濁培地として従来用いられる。この目的のために、合成モノ－またはジグリセリドを含む、任意のブランドの固定油が用いられ得る。加えて、オレイン酸などの脂肪酸が、注射剤の調製において使用され得る。一実施形態において、コンジュゲートは、１％（ｗ／ｖ）カルボキシメチルセルロースナトリウム及び０．１％（ｖ／ｖ）ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０を含む、キャリア流体中に懸濁される。注射用製剤は、例えば、細菌保持フィルタを介した濾過によって、または投与前に滅菌水もしくは選択された注射用希釈剤に溶解もしくは分散することができる固体組成物の末端滅菌によって滅菌することができる。
核酸剤（例えば、ＡＳＯ）を含有する高分子ナノ粒子の正確な投与量は、治療される患者を考慮して個々の医師によって選択され、一般に、投与量及び投与は、治療される患者に、有効量の核酸剤ナノ粒子を提供するように調整されることを理解されたい。本明細書で使用される場合、核酸剤（例えば、ＡＳＯ）を含有するナノ粒子の「有効量」は、所望の生物学的応答を誘発するために必要な量を指す。当業者には理解されようが、核酸剤（例えば、ＡＳＯ）を含有する高分子ナノ粒子（例えば、ＰＬＧＡナノ粒子）の有効量は、所望の生物学的エンドポイント、送達される薬物、標的組織、投与経路などの要因に応じて変化し得る。例えば、核酸剤（例えば、ＡＳＯ）を含有する高分子ナノ粒子の有効量は、所望の期間にわたって腫瘍サイズを所望の量低減させる量であり得る。考慮され得る追加の要因としては、疾患状態の重症度、年齢、処置される患者の体重、及び性別、食生活、投与の時間及び頻度、薬物併用、反応感受性、ならびに療法に対する寛容／応答が挙げられる。
本開示の高分子ナノ粒子は、投与の容易さ及び投薬量の均一性のために単位剤形に製剤化され得る。本明細書で使用される「単位剤形」という表現は、治療される患者に適したナノ粒子の物理的に別個の単位を指す。しかしながら、組成物の毎日の総使用量は、健全な医学的判断の範囲内で主治医によって決定されることが理解されるであろう。いかなるナノ粒子についても、治療有効量は、細胞培養アッセイまたは動物モデル、通常はマウス、ウサギ、イヌ、またはブタのうちのいずれかで最初に推定することができる。動物モデルはまた、望ましい濃度範囲及び投与経路を達成するために使用される。次いで、そのような情報を使用して、ヒトにおける投与のための有用な用量及び経路を決定することができる。ナノ粒子の治療有効性及び毒性は、細胞培養物または実験動物における標準的な薬学的手順、例えば、ＥＤ５０（用量は、集団の５０％で治療上有効である）及びＬＤ５０（用量は、集団の５０％にとって致死的である）によって判定することができる。毒性対治療効果の用量比は、治療指数であり、比率、ＬＤ５０／ＥＤ５０として表すことができる。大きな治療指数を示す薬学的組成物は、いくつかの実施形態で有用であり得る。細胞培養アッセイ及び動物研究から得られたデータを使用して、ヒト使用のための用量の範囲を製剤化することができる。
いくつかの実施形態において、本明細書に開示される高分子ナノ粒子を含む、凍結に好適な組成物が企図され、凍結に好適な溶液、例えば、単糖、二糖、もしくは多糖、例えば、スクロース及び／またはトレハロース、及び／または塩及び／またはシクロデキストリン溶液が、ナノ粒子懸濁液に添加される。糖（例えば、スクロースまたはトレハロース）は、例えば、凍結時に粒子が凝集するのを防ぐために、抗凍結剤として作用し得る。例えば、複数の開示されたナノ粒子、スクロース、イオン性ハロゲン化物、及び水を含むナノ粒子製剤が、本明細書に提供され、ナノ粒子／スクロース／水／イオン性ハロゲン化物は、約３～４０％／１０～４０％／２０～９５％／０．１～１０％（ｗ／ｗ／ｗ／ｗ）または約５～１０％／１０～１５％／８０～９０％／１～１０％（ｗ／ｗ／ｗ／ｗ）である。例えば、そのような溶液は、本明細書に開示されるナノ粒子、約５重量％～約２０重量％のスクロース、及び約１０～１００ｍＭの濃度の塩化ナトリウムなどのイオン性ハロゲン化物を含み得る。別の例では、複数の開示されるナノ粒子、トレハロース、シクロデキストリン、及び水を含むナノ粒子製剤が、本明細書に提供され、ナノ粒子／トレハロース／水／シクロデキストリンは、約３～４０％／１～２５％／２０～９５％／１～２５％（ｗ／ｗ／ｗ／ｗ）または約５～１０％／１～２５％／８０～９０％／１０～１５％（ｗ／ｗ／ｗ／ｗ）である。
送達の方法
本開示は、核酸（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドなどのオリゴヌクレオチド）をヒト対象の中枢神経系（ＣＮＳ）に送達する方法を特徴とする。ＣＮＳへのアクセスは、血液脳関門（ＢＢＢ）のために困難な課題である。ＢＢＢは、周皮細胞及び星細胞プロセスのネットワークによって支持される緊密に連結された内皮細胞で構成され、スクロースのような小さい分子に対しては不浸透性である。ＢＢＢはまた、オリゴヌクレオチドに対して大部分が不浸透性である。
本開示は、核酸（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドなどのオリゴヌクレオチド）をヒト対象の中枢神経系（ＣＮＳ）に送達する方法を特徴とする。ＣＮＳへのアクセスは、血液脳関門（ＢＢＢ）のために困難な課題である。ＢＢＢは、周皮細胞及び星細胞プロセスのネットワークによって支持される緊密に連結された内皮細胞で構成され、スクロースのような小さい分子に対しては不浸透性である。ＢＢＢはまた、オリゴヌクレオチドに対して大部分が不浸透性である。
この送達問題に対処する１つの方法は、オリゴヌクレオチドの直接投与によるものである。これは、例えば、くも膜下腔内注射によって行うことができる。くも膜下腔内に投与されるとき、オリゴヌクレオチドは、ＣＮＳ内に広く分布し、ニューロン及びグリア細胞の両方によって取り込まれる。
ある特定の場合において、核酸（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）を含む高分子ナノキャリア（例えば、ＰＬＧＡナノ粒子）は、くも膜下腔内注射によってヒト対象に投与される。ある場合には、くも膜下腔内注射は、ボーラス注射である。ある特定の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＰＬＧＡナノ粒子内にカプセル化される。ある場合には、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、カチオン性分子（例えば、ＰＥＩ、キトサン、ヘキサデシルアミン、ラウリン酸アルギネート、またはカチオン性ペプチド）と複合体化される。ある場合には、ＰＬＧＡナノ粒子の乳酸：グリコール酸比は、２：９８～９８：２の範囲である。ある特定の場合において、ＰＬＧＡナノ粒子は、以下からなる群から選択される比率で乳酸：グリコール酸を含む：２：９８、３：９７、４：９６、５：９５、６：９４、７：９３、８：９２、９：９１、１０：９０、１１：８９、１２：８８、１３：８７、１４：８６、１５：８５、１６：８４、１７：８３、１８：８２、１９：８１、２０：８０、２１：７９、２２：７８、２３：７７、２４：７６、２５：７５、２６：７４、２７：７３、２８：７２、２９：７１、３０：７０、３１：６９、３２：６８、３３：６７、３４：６６、３５：６５、３６：６４、３７：６３、３８：６２、３９：６１、４０：６０、４１：５９、４２：５８、４３：５７、４４：５６、４５：５５、４６：５４、４７：５３、４８：５２、４９：５１、５０：５０、５１：４９、５２：４８、５３：４７、５４：４６、５５：４５、５６：４４、５７：４３、５８：４２、５９：４１、６０：４０、６１：３９、６２：３８、６３：３７、６４：３６、６５：３５、６６：３４、６７：３３、６８：３２、６９：３１、７０：３０、７１：２９、７２：２８、７３：２７、７４：２６、７５：２５、７６：２４、７７：２３、７８：２２、７９：２１、８０：２０、８１：１９、８２：１８、８３：１７、８４：１６、８５：１５、８６：１４、８７：１３、８８：１２、８９：１１、９０：１０、９１：９、９２：８、９３：７、９４：６、９５：５、９６：４、９７：４、９８：２、及び１００：０。
本開示は、「高速」放出動態を有するそれらのカプセル化されたカーゴ（例えば、ＡＳＯ）を放出する高分子ナノ粒子担体の送達を特徴とする。「高速」とは、高分子ナノ粒子キャリアのくも膜下腔内注射の約０．１時間～約１週間以内にカーゴの放出を意味する。いくつかの実施形態において、カーゴは、高分子ナノ粒子キャリアのくも膜下腔内注射の７日、６日、５日、４日、３日、２日、または１日以内に放出される。他の実施形態において、カーゴは、高分子ナノ粒子キャリアのくも膜下腔内注射の０．１時間、０．２時間、０．３時間、０．４時間、０．５時間、０．６時間、０．７時間、０．８時間、０．９時間、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１３時間、１４時間、１５時間、１６時間、１７時間、１８時間、１９時間、２０時間、２１時間、２２時間、２３時間、２４時間、３６時間、または４８時間以内に放出される。
本明細書に開示される組成物及び送達方法は、遊離非製剤化ＡＳＯ送達と比較して、ヒト対象の脳に送達される核酸（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）の量を増加させることを可能にする。
加えて、本明細書に開示される組成物及び送達方法は、送達される核酸（例えば、ＡＳＯ）が、非製剤化ＡＳＯ送達と比較して、ヒト対象のＣＮＳに存在し、かつ活性である時間を増加させることを可能にする。
更に、本明細書に開示される組成物及び送達方法は、非製剤化ＡＳＯ送達と比較して、ヒト対象の脳内により深く核酸（例えば、ＡＳＯ）を送達することを可能にする。いくつかの場合において、より多くの核酸（例えば、ＡＳＯ）が、非製剤化ＡＳＯ送達と比較して、ヒト対象の脳の線条体、視床、黒質、及び／または小脳に送達される。
治療の方法
本開示は、ＣＮＳ障害の治療を必要とするヒト対象におけるＣＮＳ障害を治療する方法を特徴とする。本方法は、対象に、治療有効量の本明細書に記載の高分子ナノキャリア組成物を投与することを含む。いくつかの場合において、ＣＮＳ障害は、シヌクレイノパチーまたはタウオパチーである。ある特定の場合において、ＣＮＳ障害は、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病、アンジェルマン症候群、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、クロイツフェルトヤコブ病、脊髄小脳失調症３型（ＳＣＡ３）、またはメンクス病である。いくつかの場合において、高分子ナノキャリアは、配列番号１に記載の配列を含むか、またはそれからなるアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む。いくつかの場合において、高分子ナノキャリアは、追加の治療剤（例えば、小分子化合物）を更に含む。いくつかの場合において、高分子ナノキャリアは、０．０５ｍｇ／ｋｇ～２５ｍｇ／ｋｇの用量のＡＳＯを含む。いくつかの場合において、高分子ナノキャリアは、０．０５ｍｇ／ｋｇ～２０ｍｇ／ｋｇの用量のＡＳＯを含む。いくつかの場合において、高分子ナノキャリアは、０．０５ｍｇ／ｋｇ～１５ｍｇ／ｋｇの用量のＡＳＯを含む。いくつかの場合において、高分子ナノキャリアは、０．０５ｍｇ／ｋｇ～１０ｍｇ／ｋｇの用量のＡＳＯを含む。いくつかの場合において、高分子ナノキャリアは、０．０５ｍｇ／ｋｇ～５ｍｇ／ｋｇの用量のＡＳＯを含む。いくつかの場合において、高分子ナノキャリアは、０．０５ｍｇ／ｋｇ～４ｍｇ／ｋｇの用量のＡＳＯを含む。いくつかの場合において、高分子ナノキャリアは、０．０５ｍｇ／ｋｇ～３ｍｇ／ｋｇの用量のＡＳＯを含む。いくつかの場合において、高分子ナノキャリアは、０．０５ｍｇ／ｋｇ～２ｍｇ／ｋｇの用量のＡＳＯを含む。いくつかの場合において、高分子ナノキャリアは、０．０５ｍｇ／ｋｇ～１ｍｇ／ｋｇの用量のＡＳＯを含む。治療有効量は、とりわけ、治療されているヒト対象の年齢、性別、及び疾患の段階に基づいて、医療提供者によって容易に決定することができる。ある場合には、高分子ナノキャリアは、くも膜下腔内（ＩＴ）注射によって投与される。ある特定の場合において、ＩＴ注射は、ボーラス注射である。
本開示は、ＣＮＳ障害の治療を必要とするヒト対象におけるＣＮＳ障害を治療する方法を特徴とする。本方法は、対象に、治療有効量の本明細書に記載の高分子ナノキャリア組成物を投与することを含む。いくつかの場合において、ＣＮＳ障害は、シヌクレイノパチーまたはタウオパチーである。ある特定の場合において、ＣＮＳ障害は、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病、アンジェルマン症候群、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、クロイツフェルトヤコブ病、脊髄小脳失調症３型（ＳＣＡ３）、またはメンクス病である。いくつかの場合において、高分子ナノキャリアは、配列番号１に記載の配列を含むか、またはそれからなるアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む。いくつかの場合において、高分子ナノキャリアは、追加の治療剤（例えば、小分子化合物）を更に含む。いくつかの場合において、高分子ナノキャリアは、０．０５ｍｇ／ｋｇ～２５ｍｇ／ｋｇの用量のＡＳＯを含む。いくつかの場合において、高分子ナノキャリアは、０．０５ｍｇ／ｋｇ～２０ｍｇ／ｋｇの用量のＡＳＯを含む。いくつかの場合において、高分子ナノキャリアは、０．０５ｍｇ／ｋｇ～１５ｍｇ／ｋｇの用量のＡＳＯを含む。いくつかの場合において、高分子ナノキャリアは、０．０５ｍｇ／ｋｇ～１０ｍｇ／ｋｇの用量のＡＳＯを含む。いくつかの場合において、高分子ナノキャリアは、０．０５ｍｇ／ｋｇ～５ｍｇ／ｋｇの用量のＡＳＯを含む。いくつかの場合において、高分子ナノキャリアは、０．０５ｍｇ／ｋｇ～４ｍｇ／ｋｇの用量のＡＳＯを含む。いくつかの場合において、高分子ナノキャリアは、０．０５ｍｇ／ｋｇ～３ｍｇ／ｋｇの用量のＡＳＯを含む。いくつかの場合において、高分子ナノキャリアは、０．０５ｍｇ／ｋｇ～２ｍｇ／ｋｇの用量のＡＳＯを含む。いくつかの場合において、高分子ナノキャリアは、０．０５ｍｇ／ｋｇ～１ｍｇ／ｋｇの用量のＡＳＯを含む。治療有効量は、とりわけ、治療されているヒト対象の年齢、性別、及び疾患の段階に基づいて、医療提供者によって容易に決定することができる。ある場合には、高分子ナノキャリアは、くも膜下腔内（ＩＴ）注射によって投与される。ある特定の場合において、ＩＴ注射は、ボーラス注射である。
ある場合において、本開示は、ヒト対象における脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）を治療する方法を特徴とする。別の場合において、ＳＭＮ１遺伝子の両方の機能的コピーの損失を有するヒト対象におけるＳＭＮ２メッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）転写産物中のエクソン７の包含を増加させる方法が、提供される。更に別の場合において、機能性ＳＭＮタンパク質欠乏を引き起こすＳＭＮ１遺伝子の変異を有するヒト対象におけるＳＭＮ２メッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）転写産物中のエクソン７の包含を増加させるための方法を、特徴とする。これらの方法の一実施形態において、ヒト対象は、ＳＭＡ（例えば、ヌシネルセン）を治療するために使用することができるＡＳＯを含むＣＮＳ送達組成物（例えば、ＰＬＧＡナノ粒子）をヒト対象のくも膜下腔内空間への注射によって投与される。一実施形態において、ヒト対象に投与される高分子ナノキャリアにカプセル化されるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、核酸塩基配列ＭｅＵＭｅＣＡＭｅＣＭｅＵＭｅＵＭｅＵＭｅＣＡＭｅＵＡＡＭｅＵＧＭｅＣＭｅＵＧＧ（配列番号１）を含むか、またはそれからなり、オリゴヌクレオチドの各ヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート結合であり、オリゴヌクレオチドの各ヌクレオシドは、２’－メトキシエチルヌクレオシドであり、ＭｅＵは、５－メチル－ウラシルであり、ＭｅＣは、５－メチルシトシンである。
ある特定の場合において、くも膜下腔内注射は、ボーラス注射によるものである。
以下の実施例は、特許請求対象の発明をより十分に例示するために提供されるものであり、本発明の範囲を限定するものとして解釈すべきではない。具体的な材料が言及される範囲で、それは単に例示の目的のためのものであり、本発明を限定することは意図しない。当業者は、発明能力の訓練なしに、及び本発明の範囲から逸脱することなしに、同等の手段または反応物を開発することができる。
実施例１：研究１－材料及び方法
研究１は、実施例１～６に記載されている。
材料
・ＰＬＧＡラクチド：グリコリド（５０：５０）、エステル末端処理、平均１００，０００Ｄａ
・ＰＬＧＡラクチド：グリコリド（８５：１５）、エステル末端処理、１９０，０００～２４０，０００Ｄａ
・ＰＬＧＡ Ｌ－ラクチド：グリコリド（５：９５）、１９０，０００～２１０，０００Ｄａ
・ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、直鎖、２．５ｋＤａ、Ｓｉｇｍａ ７６４６０４
・酢酸エチル
・Ｍａｌａｔ－１ アンチセンスオリゴヌクレオチド：
（式中、「ｏ」はホスホジエステルである（「ｏ」ホスホロチオエートで標識されていない場合、ＭｅＵは５－メチル－ウラシルであり、ＭｅＣは５－メチル－シトシンであり、下線付きのヌクレオシドはＭＯＥである）、７ｋＤａ
・リン酸緩衝生理食塩水、１×、ｐＨ７．４、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ １００１００２３
・ポリビニルアルコール
・修飾ポリエーテルスルホン中空繊維フィルタモジュール、７５０ｋＤａカットオフ
・注射用水
・２％ Ｂｒｉｊ（登録商標） Ｓ１００界面活性剤
・リンゴ酸緩衝液、ｐＨ３
研究１は、実施例１～６に記載されている。
材料
・ＰＬＧＡラクチド：グリコリド（５０：５０）、エステル末端処理、平均１００，０００Ｄａ
・ＰＬＧＡラクチド：グリコリド（８５：１５）、エステル末端処理、１９０，０００～２４０，０００Ｄａ
・ＰＬＧＡ Ｌ－ラクチド：グリコリド（５：９５）、１９０，０００～２１０，０００Ｄａ
・ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、直鎖、２．５ｋＤａ、Ｓｉｇｍａ ７６４６０４
・酢酸エチル
・Ｍａｌａｔ－１ アンチセンスオリゴヌクレオチド：
・リン酸緩衝生理食塩水、１×、ｐＨ７．４、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ １００１００２３
・ポリビニルアルコール
・修飾ポリエーテルスルホン中空繊維フィルタモジュール、７５０ｋＤａカットオフ
・注射用水
・２％ Ｂｒｉｊ（登録商標） Ｓ１００界面活性剤
・リンゴ酸緩衝液、ｐＨ３
ＰＬＧＡナノ粒子調製プロトコル
二重エマルジョン溶媒蒸発技術を使用して、Ｍａｌａｔ－１負荷ポリ（ｄｌ－ラクチド－ｃｏ－グリコリド）（ＰＬＧＡ）粒子を調製した。３つの異なるタイプのＰＬＧＡポリマー（ＰＬＧＡラクチド：グリコリド（５０：５０）、ＰＬＧＡラクチド：グリコリド（８５：１５）、及びＰＬＧＡラクチド：グリコリド（５：９５））を使用して、ナノ粒子を作製した。３つのポリマーは、乳酸（ＬＡ）対グリコール酸（ＧＡ）の比率が異なるため、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）の放出速度は、変化するはずであり、最も遅い放出ナノ粒子は、最高のＬＡ含有量を有する結果である。
二重エマルジョン溶媒蒸発技術を使用して、Ｍａｌａｔ－１負荷ポリ（ｄｌ－ラクチド－ｃｏ－グリコリド）（ＰＬＧＡ）粒子を調製した。３つの異なるタイプのＰＬＧＡポリマー（ＰＬＧＡラクチド：グリコリド（５０：５０）、ＰＬＧＡラクチド：グリコリド（８５：１５）、及びＰＬＧＡラクチド：グリコリド（５：９５））を使用して、ナノ粒子を作製した。３つのポリマーは、乳酸（ＬＡ）対グリコール酸（ＧＡ）の比率が異なるため、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）の放出速度は、変化するはずであり、最も遅い放出ナノ粒子は、最高のＬＡ含有量を有する結果である。
要するに、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）溶液を、ＰＶＡをリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中に溶解させることによって作製した。ＰＬＧＡを、酢酸エチル中に溶解した。ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を、水中に溶解した。ＡＳＯを、ｐＨ７．４でＰＢＳ中に溶解した。ＡＳＯ溶液及びＰＥＩ溶液を、１対１のモル比で一緒に混合した。ＰＥＩは、正に荷電したポリマーであり、負に荷電したＡＳＯに複合体化されて、電荷反発を防止し、負に荷電したＰＬＧＡへのカプセル化を可能にする。次いで、ＡＳＯ－ＰＥＩ複合体を、ＰＬＧＡ溶液と混合し、超音波処理して油中水エマルジョンを作製した。次いで、このエマルジョンを、ナノ粒子の安定剤として作用するＰＶＡ溶液に添加し、超音波処理して、水中油中水型エマルジョンを作製した。次いで、酢酸エチルを蒸発によって除去した。エマルジョンを精製し、ＰＢＳを使用した接線流濾過（ＴＦＦ）によって、緩衝液を交換した。得られたエマルジョンを、粒子のサイズ、多分散性、及びＡＳＯ負荷を測定するためのいくつかの分析技術によって特徴付け、次いで、動物に投与するまで－２０℃で保存した。
実施例２：ＡＳＯ負荷ＰＬＧＡナノ粒子の特性評価
ここで提示される結果は、Ｍａｌａｔ－１ ＡＳＯが粒子内にカプセル化されたときに、各タイプのＰＬＧＡで作製されたナノ粒子の特性評価を要約する。表１に示されるサイズ分布は、８５：１５のＰＬＧＡで作製された粒子が最大の流体力学的直径を有し、５０：５０のＰＬＧＡで作製された粒子が最小であることを示す。８５：１５及び５：９５のＰＬＧＡで作製された粒子は、ほぼ中性であったが、５０：５０で作製された粒子は、わずかに陰性であった。粒子の大部分は、０．３未満の多分散性（ＰＤＩ）を有し、これは狭いサイズ分布を示した。各製剤に対して３回の測定を行い、平均読み取り値を報告する。
ここで提示される結果は、Ｍａｌａｔ－１ ＡＳＯが粒子内にカプセル化されたときに、各タイプのＰＬＧＡで作製されたナノ粒子の特性評価を要約する。表１に示されるサイズ分布は、８５：１５のＰＬＧＡで作製された粒子が最大の流体力学的直径を有し、５０：５０のＰＬＧＡで作製された粒子が最小であることを示す。８５：１５及び５：９５のＰＬＧＡで作製された粒子は、ほぼ中性であったが、５０：５０で作製された粒子は、わずかに陰性であった。粒子の大部分は、０．３未満の多分散性（ＰＤＩ）を有し、これは狭いサイズ分布を示した。各製剤に対して３回の測定を行い、平均読み取り値を報告する。
実施例３：ナノ粒子中のＭａｌａｔ－１ ＡＳＯ濃度
粒子からＡＳＯを抽出した後、２６０ｎｍのＵＶ吸光度によって、ナノ粒子中のＭａｌａｔ－１ ＡＳＯの濃度を判定した。ＵＶ読み取り値及び対応するＡＳＯ濃度を表２に示す。
粒子からＡＳＯを抽出した後、２６０ｎｍのＵＶ吸光度によって、ナノ粒子中のＭａｌａｔ－１ ＡＳＯの濃度を判定した。ＵＶ読み取り値及び対応するＡＳＯ濃度を表２に示す。
実施例４：ＰＬＧＡナノ粒子からのＡＳＯのインビトロ放出
ＡＳＯ負荷ナノ粒子のインビトロ放出動態を、３つの異なるＰＬＧＡ組成物、５：９５、５０：５０、及び８５：１５から作製された粒子を使用して調査した。開放系において、ＳＯＴＡＸ ＵＳＢ ＩＶ溶解装置上で放出動態を行った。機械的及び化学的特性、膨張挙動、加水分解に対する耐性、及びその後のポリマーの生分解速度は、ＰＬＧＡの結晶化度によって直接影響され、これは、コポリマー鎖中の個々のモノマー成分のモル比に更に依存する。結晶性ＰＧＡは、ＰＬＡと共重合すると、ＰＬＧＡの結晶化度を低減し、結果として、加水分解及び分解の速度を増加させる。ナノ粒子の２つの群からのＡＳＯの放出の結果は、図１で見ることができる。６ｍｇ／ｍＬの濃度の遊離ＡＳＯ（ナノ粒子にカプセル化されていない）を対照として使用した。８ｍＬ／分の流速を使用して、５：９５のＰＬＧＡで作製したナノ粒子は、５０：５０及び８５：１５に続いて最速の放出を有することが見出された。
ＡＳＯ負荷ナノ粒子のインビトロ放出動態を、３つの異なるＰＬＧＡ組成物、５：９５、５０：５０、及び８５：１５から作製された粒子を使用して調査した。開放系において、ＳＯＴＡＸ ＵＳＢ ＩＶ溶解装置上で放出動態を行った。機械的及び化学的特性、膨張挙動、加水分解に対する耐性、及びその後のポリマーの生分解速度は、ＰＬＧＡの結晶化度によって直接影響され、これは、コポリマー鎖中の個々のモノマー成分のモル比に更に依存する。結晶性ＰＧＡは、ＰＬＡと共重合すると、ＰＬＧＡの結晶化度を低減し、結果として、加水分解及び分解の速度を増加させる。ナノ粒子の２つの群からのＡＳＯの放出の結果は、図１で見ることができる。６ｍｇ／ｍＬの濃度の遊離ＡＳＯ（ナノ粒子にカプセル化されていない）を対照として使用した。８ｍＬ／分の流速を使用して、５：９５のＰＬＧＡで作製したナノ粒子は、５０：５０及び８５：１５に続いて最速の放出を有することが見出された。
実施例５：マウスにおけるＰＬＧＡナノ粒子の脳室内送達
Ｃ５７Ｂ６マウスにおける非製剤化Ｍａｌａｔ－１ ＡＳＯとナノ粒子がカプセル化されたＭａｌａｔ－１の効果を比較する有効性研究を、マウスに脳室内（ＩＣＶ）溶液を注射することによって行った。１０匹のマウスを、緩衝液ＰＢＳ対照群、非製剤化Ｍａｌａｔ－１ ＡＳＯ群（５０μｇ）、ならびにそれらのＬＡ：ＧＡ比８５：１５、５０：５０、及び５：９５によって説明される３つのＰＬＧＡナノ粒子群の５つの異なる群の各々に注入し（合計５０匹のマウス）、約５０μｇのＭａｌａｔ１ ＡＳＯを含有した。動物を、ＩＣＶ注射後１週間追跡した。製剤は、良好な耐容性を示し、観察可能な安全性シグナルはなかった。ノックダウンレベルを、図２にＣＮＳの様々な領域について示す。
Ｃ５７Ｂ６マウスにおける非製剤化Ｍａｌａｔ－１ ＡＳＯとナノ粒子がカプセル化されたＭａｌａｔ－１の効果を比較する有効性研究を、マウスに脳室内（ＩＣＶ）溶液を注射することによって行った。１０匹のマウスを、緩衝液ＰＢＳ対照群、非製剤化Ｍａｌａｔ－１ ＡＳＯ群（５０μｇ）、ならびにそれらのＬＡ：ＧＡ比８５：１５、５０：５０、及び５：９５によって説明される３つのＰＬＧＡナノ粒子群の５つの異なる群の各々に注入し（合計５０匹のマウス）、約５０μｇのＭａｌａｔ１ ＡＳＯを含有した。動物を、ＩＣＶ注射後１週間追跡した。製剤は、良好な耐容性を示し、観察可能な安全性シグナルはなかった。ノックダウンレベルを、図２にＣＮＳの様々な領域について示す。
ナノ粒子製剤を注射したマウスでは、腰椎脊髄領域で有意なノックダウンが観察された。これは、Ｍａｌａｔ－１ ＡＳＯがナノ粒子から放出され、意図された標的に作用することができることを示す。ＬＡ：ＧＡ比が５０：５０のナノ粒子を投与された動物は、特に腰椎脊髄皮質における８５：１５及び５：９５のＰＬＧＡナノ粒子と比較して、より高いノックダウンを示し、ＡＳＯが５０：５０のナノ粒子から放出されたことを示し、他のナノ粒子群と比較して、より良好な分布を有し、より効果的な送達を提供した。
実施例６：ラットにおけるＰＬＧＡナノ粒子のくも膜下腔内送達
くも膜下腔内（ＩＴ）空間におけるＭａｌａｔ－１ ＡＳＯのナノ粒子送達を試験するために、同じ製剤を調製し、ラットにくも膜下腔内に注射した。実施例５のマウスＩＣＶ研究と同様の実験設計を、このラット研究に使用した。この実験において、合計５０匹のラットを使用し、緩衝液ＰＢＳ対照群、非製剤化Ｍａｌａｔ－１ ＡＳＯ群（１５０μｇ）、ならびに３つのＰＬＧＡナノ粒子群、８５：１５、５０：５０、及び５：９５の５つの用量コホートの各々において１０匹のラットを使用した。２週間後にラットを殺処分し、ＣＮＳ及び脳の様々な領域におけるＭａｌａｔ－１発現のパーセントノックダウンを測定した。溶液を注射した後、ラットにおける安全性の問題は観察されなかった。全ての群の脊髄領域における９０％を超えるシグナルノックダウン（図３）は、注射が良好に行われたことを示す。
くも膜下腔内（ＩＴ）空間におけるＭａｌａｔ－１ ＡＳＯのナノ粒子送達を試験するために、同じ製剤を調製し、ラットにくも膜下腔内に注射した。実施例５のマウスＩＣＶ研究と同様の実験設計を、このラット研究に使用した。この実験において、合計５０匹のラットを使用し、緩衝液ＰＢＳ対照群、非製剤化Ｍａｌａｔ－１ ＡＳＯ群（１５０μｇ）、ならびに３つのＰＬＧＡナノ粒子群、８５：１５、５０：５０、及び５：９５の５つの用量コホートの各々において１０匹のラットを使用した。２週間後にラットを殺処分し、ＣＮＳ及び脳の様々な領域におけるＭａｌａｔ－１発現のパーセントノックダウンを測定した。溶液を注射した後、ラットにおける安全性の問題は観察されなかった。全ての群の脊髄領域における９０％を超えるシグナルノックダウン（図３）は、注射が良好に行われたことを示す。
Ｍａｌａｔ－１の発現はまた、脳の異なる領域、特に大脳皮質でも測定された（図４）。このデータは、ＡＳＯがＰＬＧＡ粒子から送達され、線条体などの脳のより深い領域に到達したことを示す。また、本実験は、ＩＴ注射による投与が安全であることを示した。
結論として、３つの異なる放出速度を有するＡＳＯがカプセル化されたナノ粒子を作製し、ＩＣＶ注射によってマウスに注射した。これらのマウスにおけるノックダウンは、ＡＳＯがナノ粒子から放出され、依然として活性であることを示した。更に、安全性シグナルは記録されなかった。これらの同じ製剤を、ラットにくも膜下腔内注射した。これらのラットにおけるノックダウンは、ＡＳＯがナノ粒子から放出され、脳のより深い領域に到達することができることを更に示した。
実施例７：研究２－材料及び方法
研究２は、実施例７～１１に記載されている。
材料
・ＰＬＧＡラクチド：グリコリド（５０：５０）、エステル末端処理、平均１００，０００Ｄａ
・ＰＬＧＡラクチド：グリコリド（８５：１５）、エステル末端処理、１９０，０００～２４０，０００Ｄａ
・ＰＬＧＡ Ｌ－ラクチド：グリコリド（５：９５）、１９０，０００～２１０，０００Ｄａ
・ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、直鎖、２．５ｋＤａ、Ｓｉｇｍａ ７６４６０４
・酢酸エチル
・Ｍａｌａｔ－１ アンチセンスオリゴヌクレオチド：
（式中、「ｏ」はホスホジエステルである（「ｏ」ホスホロチオエートで標識されていない場合、ＭｅＵは５－メチル－ウラシルであり、ＭｅＣは５－メチル－シトシンであり、下線付きのヌクレオシドはＭＯＥである）、７ｋＤａ
・リン酸緩衝生理食塩水、１×、ｐＨ７．４、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ １００１００２３
・ポリビニルアルコール
・修飾ポリエーテルスルホン中空繊維フィルタモジュール、７５０ｋＤａカットオフ
・注射用水
研究２は、実施例７～１１に記載されている。
材料
・ＰＬＧＡラクチド：グリコリド（５０：５０）、エステル末端処理、平均１００，０００Ｄａ
・ＰＬＧＡラクチド：グリコリド（８５：１５）、エステル末端処理、１９０，０００～２４０，０００Ｄａ
・ＰＬＧＡ Ｌ－ラクチド：グリコリド（５：９５）、１９０，０００～２１０，０００Ｄａ
・ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、直鎖、２．５ｋＤａ、Ｓｉｇｍａ ７６４６０４
・酢酸エチル
・Ｍａｌａｔ－１ アンチセンスオリゴヌクレオチド：
・リン酸緩衝生理食塩水、１×、ｐＨ７．４、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ １００１００２３
・ポリビニルアルコール
・修飾ポリエーテルスルホン中空繊維フィルタモジュール、７５０ｋＤａカットオフ
・注射用水
ＰＬＧＡナノ粒子調製プロトコル
二重エマルジョン溶媒蒸発技術を使用して、Ｍａｌａｔ－１ ＡＳＯ負荷ポリ（ｄｌ－ラクチド－ｃｏ－グリコリド）（ＰＬＧＡ）粒子を調製した。３つの異なるタイプのＰＬＧＡポリマー（ＰＬＧＡラクチド：グリコリド（５０：５０）、ＰＬＧＡラクチド：グリコリド（８５：１５）、及びＰＬＧＡラクチド：グリコリド（５：９５））を使用して、ナノ粒子を作製した。
二重エマルジョン溶媒蒸発技術を使用して、Ｍａｌａｔ－１ ＡＳＯ負荷ポリ（ｄｌ－ラクチド－ｃｏ－グリコリド）（ＰＬＧＡ）粒子を調製した。３つの異なるタイプのＰＬＧＡポリマー（ＰＬＧＡラクチド：グリコリド（５０：５０）、ＰＬＧＡラクチド：グリコリド（８５：１５）、及びＰＬＧＡラクチド：グリコリド（５：９５））を使用して、ナノ粒子を作製した。
実施例１における同じプロトコルに続いて、ＡＳＯ－ＰＥＩコンジュゲーションにおける強化された事前複合体化工程を行った。簡潔には、ＰＬＧＡポリマーを、酢酸エチル中に溶解し、ＰＥＩ－ＡＳＯ事前複合体と混合して、油中水エマルジョンを形成した。一次エマルジョンを作製する前に、ＰＥＩを脱イオン水中に溶解し、８０℃まで加熱し、３００ｒｐｍで混合した。溶解したＰＥＩ溶液の温度を６０℃まで低下させて、ＡＳＯ－ＰＥＩ事前複合体を形成した。油中水型エマルジョンを、２．５％ｗ／ｖ ＰＶＡ溶液で更に乳化して、油中水型水エマルジョンを形成した。最終エマルジョンを、周囲条件で１８時間撹拌して、溶媒を除去した。最終生成物を精製し、緩衝液を、ＰＢＳを使用した接線流量濾過（ＴＦＦ）によって交換した。これらの得られたナノ粒子を、サイズ、多分散性、及びＡＳＯ負荷を測定するためのいくつかの分析技術によって特徴付け、次いで、動物に投与するまで－２０℃で凍結保存した。
実施例８：ＡＳＯ負荷ＰＬＧＡナノ粒子の特性評価
粒子は全て、３００ｎｍ未満であり、ＰＤＩ値は０．２５未満であり、単分散サイズ分布を示した（表３を参照のこと）。５：９５のＬＡ：ＧＡ比を有する粒子は、最小の流体力学的直径（１７６ｎｍ）を有し、８５：１５のＬＡ：ＧＡ比を有する粒子は、最大の粒径（２８８．６ｎｍ）を有した。ほぼ中性電荷は、３つの製剤全てについて観察された。
粒子は全て、３００ｎｍ未満であり、ＰＤＩ値は０．２５未満であり、単分散サイズ分布を示した（表３を参照のこと）。５：９５のＬＡ：ＧＡ比を有する粒子は、最小の流体力学的直径（１７６ｎｍ）を有し、８５：１５のＬＡ：ＧＡ比を有する粒子は、最大の粒径（２８８．６ｎｍ）を有した。ほぼ中性電荷は、３つの製剤全てについて観察された。
実施例９：ナノ粒子中のＡＳＯ負荷
ナノ粒子中のＭａｌａｔ－１ ＡＳＯ濃度の量を、ナノ粒子からＡＳＯを抽出し、ＳｏｌｏＶＰＥ上で２６０ｎｍでのＵＶ吸光度を測定することによって判定した。測定されたＡＳＯ濃度を表４に示す。
ナノ粒子中のＭａｌａｔ－１ ＡＳＯ濃度の量を、ナノ粒子からＡＳＯを抽出し、ＳｏｌｏＶＰＥ上で２６０ｎｍでのＵＶ吸光度を測定することによって判定した。測定されたＡＳＯ濃度を表４に示す。
実施例１０：ＰＬＧＡナノ粒子からのＡＳＯのインビトロ放出
ＡＳＯ負荷ナノ粒子のインビトロ放出動態を、完全自動フロースルー細胞溶解装置（ＵＳＰ４、Ｓｏｔａｘ）を用いて、閉ループ構成で測定した。内径２２．４ｍｍの細胞を使用した。２６０ｎｍの波長のＵＶ分光光度計を使用して、溶解流体のＡＳＯ濃度をリアルタイムで測定した。プロセス中、温度を３７℃に維持した。細胞を通るＰＢＳ溶解培地の流量は、１６ｍＬ／分であった。溶解装置は、ＰＢＳをポンプで送り、細胞を介して再循環させ、ＡＳＯがナノ粒子から放出されると、濃度の変化が検出された。このことから、累積放出曲線を作製し、図５で見ることができる。２．９ｍｇ／ｍＬ濃度のカプセル化されていないＡＳＯを対照として使用した。５：９５のＬＡ：ＧＡ比で作製されたナノ粒子は、最速の放出を有することが見出された。このポリマーはＬＡ濃度が最も低く、したがって結晶性及び疎水性が最も低いため、これが予想される。８５：１５の比率で作製されたナノ粒子は、グリコール酸の含有量がより高く、親水性がより高いため、放出が最も遅かった。
ＡＳＯ負荷ナノ粒子のインビトロ放出動態を、完全自動フロースルー細胞溶解装置（ＵＳＰ４、Ｓｏｔａｘ）を用いて、閉ループ構成で測定した。内径２２．４ｍｍの細胞を使用した。２６０ｎｍの波長のＵＶ分光光度計を使用して、溶解流体のＡＳＯ濃度をリアルタイムで測定した。プロセス中、温度を３７℃に維持した。細胞を通るＰＢＳ溶解培地の流量は、１６ｍＬ／分であった。溶解装置は、ＰＢＳをポンプで送り、細胞を介して再循環させ、ＡＳＯがナノ粒子から放出されると、濃度の変化が検出された。このことから、累積放出曲線を作製し、図５で見ることができる。２．９ｍｇ／ｍＬ濃度のカプセル化されていないＡＳＯを対照として使用した。５：９５のＬＡ：ＧＡ比で作製されたナノ粒子は、最速の放出を有することが見出された。このポリマーはＬＡ濃度が最も低く、したがって結晶性及び疎水性が最も低いため、これが予想される。８５：１５の比率で作製されたナノ粒子は、グリコール酸の含有量がより高く、親水性がより高いため、放出が最も遅かった。
実施例１１：ラットにおけるＰＬＧＡナノ粒子のくも膜下腔内送達
くも膜下腔内に溶液を注射し、脳組織の異なる切片におけるＭａｌａｔ－１遺伝子のノックダウンを測定することによって、Ｓｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙラットにおいて、Ｍａｌａｔ－１ ＡＳＯ負荷ＰＬＧＡナノ粒子の遺伝子調節効果を試験した。１０匹のラットを、緩衝液ＰＢＳ対照群、非製剤化遊離Ｍａｌａｔ－１群（７５μｇ）、及び上記の３つのナノ粒子群８５：１５、５０：５０、５：９５を含む５つの異なる群の各々に注射し、全てが約７５μｇのＭａｌａｔ－１を含有した。動物を、ＩＴ注射後、２週間モニタリングした。製剤は、良好な耐容性を示し、観察可能な安全性の問題はなかった。ノックダウンレベルを、図６にＣＮＳの様々な領域について示す。全てのグループの脊髄領域における９０％を超えるシグナルノックダウン（図６）は、この領域でのほぼ完全なノックダウンが成功した注射で予想されるため、注射が良好に行われたことを示す。皮質及び線条体におけるＭａｌａｔ－１ノックダウンは、ＡＳＯがＣＮＳを介して分布したときに粒子から放出されたことを示す（図６）。８５：１５の組成を有するＰＬＧＡ粒子は、５０：５０及び５：９５と比較して、より低いノックダウンパーセンテージを示した。非製剤化ＡＳＯの対照用量と比較して、５：９５及び５０：５０の粒子からのノックダウンの増加があった。
くも膜下腔内に溶液を注射し、脳組織の異なる切片におけるＭａｌａｔ－１遺伝子のノックダウンを測定することによって、Ｓｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙラットにおいて、Ｍａｌａｔ－１ ＡＳＯ負荷ＰＬＧＡナノ粒子の遺伝子調節効果を試験した。１０匹のラットを、緩衝液ＰＢＳ対照群、非製剤化遊離Ｍａｌａｔ－１群（７５μｇ）、及び上記の３つのナノ粒子群８５：１５、５０：５０、５：９５を含む５つの異なる群の各々に注射し、全てが約７５μｇのＭａｌａｔ－１を含有した。動物を、ＩＴ注射後、２週間モニタリングした。製剤は、良好な耐容性を示し、観察可能な安全性の問題はなかった。ノックダウンレベルを、図６にＣＮＳの様々な領域について示す。全てのグループの脊髄領域における９０％を超えるシグナルノックダウン（図６）は、この領域でのほぼ完全なノックダウンが成功した注射で予想されるため、注射が良好に行われたことを示す。皮質及び線条体におけるＭａｌａｔ－１ノックダウンは、ＡＳＯがＣＮＳを介して分布したときに粒子から放出されたことを示す（図６）。８５：１５の組成を有するＰＬＧＡ粒子は、５０：５０及び５：９５と比較して、より低いノックダウンパーセンテージを示した。非製剤化ＡＳＯの対照用量と比較して、５：９５及び５０：５０の粒子からのノックダウンの増加があった。
結論として、異なる放出速度を有するＭａｌａｔ－１ ＡＳＯがカプセル化されたＰＬＧＡナノ粒子を、ラットにくも膜下腔内に投与した。速い及び中程度の放出速度を有する粒子は、非製剤化ＡＳＯと比較して改善されたノックダウンを示した。ＣＮＳにおけるＡＳＯノックダウンに対する粒子分解速度の効果を確認するために、別のラットＩＴ研究を試験した。
実施例１２：研究３－材料及び方法
研究３は、実施例１２～１５に記載されている。
材料
・ＰＬＧＡラクチド：グリコリド（５０：５０）、エステル末端処理、平均４０，０００Ｄａ
・ＰＬＧＡラクチド：グリコリド（７５：２５）、エステル末端処理、４０，０００Ｄａ
・ＰＬＡ Ｌ－ラクチド、４０，０００Ｄａ
・ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、直鎖、２．５ｋＤａ、Ｓｉｇｍａ ７６４６０４
・酢酸エチル
・Ｍａｌａｔ－１ アンチセンスオリゴヌクレオチド：
（式中、「ｏ」はホスホジエステルである（「ｏ」ホスホロチオエートで標識されていない場合、ＭｅＵは５－メチル－ウラシルであり、ＭｅＣは５－メチル－シトシンであり、下線付きのヌクレオシドはＭＯＥである）、７ｋＤａ
・リン酸緩衝生理食塩水、１×、ｐＨ７．４、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ １００１００２３
・Ｂｒｉｊ（登録商標） Ｓ１００ ％
・修飾ポリエーテルスルホン中空繊維フィルタモジュール、５００ｋＤａカットオフ
・注射用水
・１０％スクロース
研究３は、実施例１２～１５に記載されている。
材料
・ＰＬＧＡラクチド：グリコリド（５０：５０）、エステル末端処理、平均４０，０００Ｄａ
・ＰＬＧＡラクチド：グリコリド（７５：２５）、エステル末端処理、４０，０００Ｄａ
・ＰＬＡ Ｌ－ラクチド、４０，０００Ｄａ
・ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、直鎖、２．５ｋＤａ、Ｓｉｇｍａ ７６４６０４
・酢酸エチル
・Ｍａｌａｔ－１ アンチセンスオリゴヌクレオチド：
・リン酸緩衝生理食塩水、１×、ｐＨ７．４、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ １００１００２３
・Ｂｒｉｊ（登録商標） Ｓ１００ ％
・修飾ポリエーテルスルホン中空繊維フィルタモジュール、５００ｋＤａカットオフ
・注射用水
・１０％スクロース
ＰＬＧＡナノ粒子調製プロトコル
この研究では、二重エマルジョン溶媒蒸発技術を使用して、Ｍａｌａｔ－１ ＡＳＯ負荷ＰＬＧＡナノ粒子を調製した。３つの異なるタイプのＰＬＧＡポリマー（ＰＬＧＡラクチド：グリコリド（５０：５０）、ＰＬＧＡラクチド：グリコリド（７５：１５）、及びＰＬＡラクチド：グリコリド（１００：０））を使用した。前述のように、ＰＬＧＡポリマーを、酢酸エチル中に溶解し、ＰＥＩ－ＡＳＯ（２．８：１）事前複合体と混合して、油中水型エマルジョンを形成した。油中水型エマルジョンを、０．２％ｗ／ｖ Ｂｒｉｊ（登録商標） Ｓ１００％溶液で更に乳化して、油中水型水エマルジョンを形成した。最終エマルジョンを、周囲条件で１８時間撹拌して、溶媒を除去した。最終生成物を精製し、緩衝液を、ＰＢＳを使用した接線流量濾過（ＴＦＦ）によって交換し、その後、凍結／解凍サイクル中の任意の非特異的凝集を防止するために、１０％スクロース製剤に添加した。これらの得られたナノ粒子を、サイズ、多分散性、及びＡＳＯ負荷を測定するためのいくつかの分析技術によって特徴付け、次いで、動物に投与するまで－２０℃で凍結保存した。
この研究では、二重エマルジョン溶媒蒸発技術を使用して、Ｍａｌａｔ－１ ＡＳＯ負荷ＰＬＧＡナノ粒子を調製した。３つの異なるタイプのＰＬＧＡポリマー（ＰＬＧＡラクチド：グリコリド（５０：５０）、ＰＬＧＡラクチド：グリコリド（７５：１５）、及びＰＬＡラクチド：グリコリド（１００：０））を使用した。前述のように、ＰＬＧＡポリマーを、酢酸エチル中に溶解し、ＰＥＩ－ＡＳＯ（２．８：１）事前複合体と混合して、油中水型エマルジョンを形成した。油中水型エマルジョンを、０．２％ｗ／ｖ Ｂｒｉｊ（登録商標） Ｓ１００％溶液で更に乳化して、油中水型水エマルジョンを形成した。最終エマルジョンを、周囲条件で１８時間撹拌して、溶媒を除去した。最終生成物を精製し、緩衝液を、ＰＢＳを使用した接線流量濾過（ＴＦＦ）によって交換し、その後、凍結／解凍サイクル中の任意の非特異的凝集を防止するために、１０％スクロース製剤に添加した。これらの得られたナノ粒子を、サイズ、多分散性、及びＡＳＯ負荷を測定するためのいくつかの分析技術によって特徴付け、次いで、動物に投与するまで－２０℃で凍結保存した。
実施例１３：ＡＳＯカプセル化ＰＬＧＡナノ粒子の特性評価
粒径は、各バッチについて一貫しており、ＰＤＩが０．２未満であったので均一に分布した（表５）。ＰＬＧＡ７５：２５組成物は、他の製剤と比較して負電荷を得た。
粒径は、各バッチについて一貫しており、ＰＤＩが０．２未満であったので均一に分布した（表５）。ＰＬＧＡ７５：２５組成物は、他の製剤と比較して負電荷を得た。
実施例１４：ナノ粒子中のＡＳＯ濃度
ナノ粒子中のＭａｌａｔ－１ ＡＳＯ濃度の量を、ナノ粒子からＡＳＯを抽出し、ＳｏｌｏＶＰＥ上で２６０ｎｍでのＵＶ吸光度を測定することによって判定した。測定されたＡＳＯ濃度を表６に示す。
ナノ粒子中のＭａｌａｔ－１ ＡＳＯ濃度の量を、ナノ粒子からＡＳＯを抽出し、ＳｏｌｏＶＰＥ上で２６０ｎｍでのＵＶ吸光度を測定することによって判定した。測定されたＡＳＯ濃度を表６に示す。
実施例１５：ラットにおけるＰＬＧＡナノ粒子のくも膜下腔内送達
くも膜下腔内に溶液を注射し、脳組織の異なる切片におけるＭａｌａｔ－１遺伝子のノックダウンを測定することによって、Ｓｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙラットにおいて、Ｍａｌａｔ－１負荷ＰＬＧＡナノ粒子のノックダウン効果を試験した。１０匹のラットを、緩衝液ＰＢＳ対照群、遊離Ｍａｌａｔ－１群（７５μｇ）、及び上記の３つのナノ粒子群１００：０、７５：２５、５０：５０を含む５つの異なる群の各々に注射し、全てが約７５μｇのＭａｌａｔ－１を含有した。動物を、ＩＴ注射後、２週間生存させた。製剤は、良好な耐容性を示し、観察可能な安全性の問題はなかった。ノックダウンレベルを、図７にＣＮＳの様々な領域について示す。全てのグループの脊髄領域における９０％を超えるシグナルノックダウン（図７）は、この領域でのほぼ完全なノックダウンが成功した注射で予想されるため、注射が良好に行われたことを示す。皮質及び線条体におけるＭａｌａｔ－１ノックダウンは、ＡＳＯがＣＮＳを介して分布したときに粒子から放出されたことを示す（図７）。全てのナノ粒子製剤は、対応する非製剤化ＡＳＯと比較して、皮質及び線条体において同様のノックダウン速度を示した。結果は、ＰＬＧＡ製剤が、非製剤化ＡＳＯと比較した場合、少なくとも同様の治療を提供したことを示した。ＰＬＧＡの５０：５０ナノ粒子は、非製剤化ＡＳＯ及び他のナノ粒子製剤と比較して、更にわずかに高い有効性を示す。この研究はまた、ＩＴ投与によるＰＬＧＡナノ粒子の安全な送達を確認した。げっ歯類における現在のくも膜下腔内投与方法は、ＣＮＳにおけるノックダウンレベルを評価するための単一の時点のみを示す。したがって、次の研究では、リアルタイムイメージング法を使用して、ＣＮＳ組織におけるＡＳＯ取り込みを判定することによって、ＰＬＧＡナノ粒子の影響を調査した。
くも膜下腔内に溶液を注射し、脳組織の異なる切片におけるＭａｌａｔ－１遺伝子のノックダウンを測定することによって、Ｓｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙラットにおいて、Ｍａｌａｔ－１負荷ＰＬＧＡナノ粒子のノックダウン効果を試験した。１０匹のラットを、緩衝液ＰＢＳ対照群、遊離Ｍａｌａｔ－１群（７５μｇ）、及び上記の３つのナノ粒子群１００：０、７５：２５、５０：５０を含む５つの異なる群の各々に注射し、全てが約７５μｇのＭａｌａｔ－１を含有した。動物を、ＩＴ注射後、２週間生存させた。製剤は、良好な耐容性を示し、観察可能な安全性の問題はなかった。ノックダウンレベルを、図７にＣＮＳの様々な領域について示す。全てのグループの脊髄領域における９０％を超えるシグナルノックダウン（図７）は、この領域でのほぼ完全なノックダウンが成功した注射で予想されるため、注射が良好に行われたことを示す。皮質及び線条体におけるＭａｌａｔ－１ノックダウンは、ＡＳＯがＣＮＳを介して分布したときに粒子から放出されたことを示す（図７）。全てのナノ粒子製剤は、対応する非製剤化ＡＳＯと比較して、皮質及び線条体において同様のノックダウン速度を示した。結果は、ＰＬＧＡ製剤が、非製剤化ＡＳＯと比較した場合、少なくとも同様の治療を提供したことを示した。ＰＬＧＡの５０：５０ナノ粒子は、非製剤化ＡＳＯ及び他のナノ粒子製剤と比較して、更にわずかに高い有効性を示す。この研究はまた、ＩＴ投与によるＰＬＧＡナノ粒子の安全な送達を確認した。げっ歯類における現在のくも膜下腔内投与方法は、ＣＮＳにおけるノックダウンレベルを評価するための単一の時点のみを示す。したがって、次の研究では、リアルタイムイメージング法を使用して、ＣＮＳ組織におけるＡＳＯ取り込みを判定することによって、ＰＬＧＡナノ粒子の影響を調査した。
実施例１６：研究４－材料及び方法
研究４は、実施例１６～１９に記載されている。
研究４は、実施例１６～１９に記載されている。
材料
・ＰＬＧＡラクチド：グリコリド（５０：５０）、エステル末端処理、平均２００，０００Ｄａ
・ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、直鎖、２．５ｋＤａ、Ｓｉｇｍａ ７６４６０４
・酢酸エチルβ－グロビンアンチセンスオリゴヌクレオチド：
（式中、下線付きヌクレオシドは、２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）（ＭＯＥ）修飾を有する）、７ｋＤａ
・リン酸緩衝生理食塩水、１×、ｐＨ７．４、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ １００１００２３
・Ｂｒｉｊ（登録商標） Ｓ１００ ％
・修飾ポリエーテルスルホン中空繊維フィルタモジュール、５００ｋＤａカットオフ
・１０％スクロース
・ＰＬＧＡラクチド：グリコリド（５０：５０）、エステル末端処理、平均２００，０００Ｄａ
・ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、直鎖、２．５ｋＤａ、Ｓｉｇｍａ ７６４６０４
・酢酸エチルβ－グロビンアンチセンスオリゴヌクレオチド：
・リン酸緩衝生理食塩水、１×、ｐＨ７．４、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ １００１００２３
・Ｂｒｉｊ（登録商標） Ｓ１００ ％
・修飾ポリエーテルスルホン中空繊維フィルタモジュール、５００ｋＤａカットオフ
・１０％スクロース
ＰＬＧＡナノ粒子調製プロトコル
二重エマルジョン溶媒蒸発技術を使用して、β－グロビンＡＳＯ負荷ＰＬＧＡナノ粒子を、ＰＬＧＡラクチド：グリコリド（５０：５０）を用いて調製した。事前複合体化されたβ－グロビンＡＳＯ－ＰＥＩ溶液を、２％ Ｂｒｉｊ（登録商標） Ｓ１００界面活性剤中で混合し、続いて１００％で６０秒間の超音波処理、及び８０％で６０秒間の超音波処理を行った。ＰＬＧＡ粒子中の標的ＡＳＯ負荷を達成するために、一次エマルジョン中の事前複合体化された媒体の安定性を強化するために、ｐＨ３のリンゴ酸緩衝液を使用することによって二次エマルジョンを作製した。次いで、ＰＢＳ中で希釈することによって、最終溶液のｐＨを７．２に調節した。懸濁液を、粒子のサイズ、多分散性、及びＡＳＯ負荷を測定するためのいくつかの分析技術によって特徴付け、次いで、動物に使用する前に－２０℃で保存した。
二重エマルジョン溶媒蒸発技術を使用して、β－グロビンＡＳＯ負荷ＰＬＧＡナノ粒子を、ＰＬＧＡラクチド：グリコリド（５０：５０）を用いて調製した。事前複合体化されたβ－グロビンＡＳＯ－ＰＥＩ溶液を、２％ Ｂｒｉｊ（登録商標） Ｓ１００界面活性剤中で混合し、続いて１００％で６０秒間の超音波処理、及び８０％で６０秒間の超音波処理を行った。ＰＬＧＡ粒子中の標的ＡＳＯ負荷を達成するために、一次エマルジョン中の事前複合体化された媒体の安定性を強化するために、ｐＨ３のリンゴ酸緩衝液を使用することによって二次エマルジョンを作製した。次いで、ＰＢＳ中で希釈することによって、最終溶液のｐＨを７．２に調節した。懸濁液を、粒子のサイズ、多分散性、及びＡＳＯ負荷を測定するためのいくつかの分析技術によって特徴付け、次いで、動物に使用する前に－２０℃で保存した。
実施例１７：β－グロビンＡＳＯをカプセル化したＰＬＧＡナノ粒子の特性評価
β－グロビンＡＳＯ負荷ＰＬＧＡナノ粒子の粒径を、以前にＭａｌａｔ－１製剤に使用したのと同じ方法を使用して測定した。結果は、β－グロビン負荷ナノ粒子が約２６４ｎｍであり、均一に分布するＰＤＩ値が０．１９であることを示した。
β－グロビンＡＳＯ負荷ＰＬＧＡナノ粒子の粒径を、以前にＭａｌａｔ－１製剤に使用したのと同じ方法を使用して測定した。結果は、β－グロビン負荷ナノ粒子が約２６４ｎｍであり、均一に分布するＰＤＩ値が０．１９であることを示した。
実施例１８：ナノ粒子中のβ－グロビンＡＳＯ濃度
ナノ粒子にカプセル化されたβ－グロビンの濃度は、ナノ粒子からＡＳＯを抽出し、ＳｏｌｏＶＰＥ上で２６０ｎｍでのＵＶ吸光度を測定することによって判定した。測定されたβ－グロビンＡＳＯ濃度は、３．３ｍｇ／ｍＬであった。
ナノ粒子にカプセル化されたβ－グロビンの濃度は、ナノ粒子からＡＳＯを抽出し、ＳｏｌｏＶＰＥ上で２６０ｎｍでのＵＶ吸光度を測定することによって判定した。測定されたβ－グロビンＡＳＯ濃度は、３．３ｍｇ／ｍＬであった。
実施例１９：ＡＳＯ取り込みを評価するためのレポーターマウスモデルにおけるインビボライブイメージング
ＡＳＯ負荷ナノ粒子の効力増加を、ルシフェラーゼレポーターマウスモデルを使用して調査した。ＡＡＶレポーター構築物は、生物発光イメージングによってスプライス補正を読み出すように設計された。構築物中のルシフェラーゼレポーター遺伝子は、ベータ－グロビンイントロンによって分割され、これは、ベータ－グロビンＡＳＯの存在下でスプライシングされ、ルシフェラーゼ遺伝子の発現をもたらす。ＡＡＶ構築物を、出生後０日目にＩＶ注射を通して投与して、脳におけるＡＡＶの広範な発現を達成した。６～８週齢のマウスにおいて、ＡＳＯ製剤を３３μｇのＡＳＯに相当する用量でＩＣＶ注射し、ＩＶＩＳイメージャーを使用して頭上の生物発光イメージングを複数の時点で行った。各画像は、Ｄ－ルシフェリン基質の腹腔内注射の１０分後に撮影した。図８は、ＡＳＯ投与前のベースライン値からの生物発光の倍率変化を示す。カプセル化されたβ－グロビンを投与された動物における生物発光シグナルは、２週間のイメージング研究中の任意の所与の時点で、非製剤化ＡＳＯによって投与されたものよりも有意に高い。結果は、ＰＬＧＡナノ粒子が長期間にわたって脳内でより速くかつより高いＡＳＯ取り込みを提供することができたことを確認する。
ＡＳＯ負荷ナノ粒子の効力増加を、ルシフェラーゼレポーターマウスモデルを使用して調査した。ＡＡＶレポーター構築物は、生物発光イメージングによってスプライス補正を読み出すように設計された。構築物中のルシフェラーゼレポーター遺伝子は、ベータ－グロビンイントロンによって分割され、これは、ベータ－グロビンＡＳＯの存在下でスプライシングされ、ルシフェラーゼ遺伝子の発現をもたらす。ＡＡＶ構築物を、出生後０日目にＩＶ注射を通して投与して、脳におけるＡＡＶの広範な発現を達成した。６～８週齢のマウスにおいて、ＡＳＯ製剤を３３μｇのＡＳＯに相当する用量でＩＣＶ注射し、ＩＶＩＳイメージャーを使用して頭上の生物発光イメージングを複数の時点で行った。各画像は、Ｄ－ルシフェリン基質の腹腔内注射の１０分後に撮影した。図８は、ＡＳＯ投与前のベースライン値からの生物発光の倍率変化を示す。カプセル化されたβ－グロビンを投与された動物における生物発光シグナルは、２週間のイメージング研究中の任意の所与の時点で、非製剤化ＡＳＯによって投与されたものよりも有意に高い。結果は、ＰＬＧＡナノ粒子が長期間にわたって脳内でより速くかつより高いＡＳＯ取り込みを提供することができたことを確認する。
他の実施形態
本発明は、その詳細な説明とともに記載されているが、前述の説明は、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲を例示することを意図しており、限定することを意図していない。他の態様、利点、及び修正は、以下の特許請求の範囲内である。
本発明は、その詳細な説明とともに記載されているが、前述の説明は、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲を例示することを意図しており、限定することを意図していない。他の態様、利点、及び修正は、以下の特許請求の範囲内である。
Claims (33)
- 高分子ナノキャリアと、アンチセンスオリゴヌクレオチドと、を含む、中枢神経系（ＣＮＳ）送達組成物であって、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、前記高分子ナノキャリア内にカプセル化され、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、カチオン性分子と直接事前複合体化される、前記中枢神経系（ＣＮＳ）送達組成物。
- 前記高分子ナノキャリアが、ポリ（ｌ－ラクチド）、ポリ（グリコリド）、ポリ（ｄ，ｌ－ラクチド）（ＰＬＡ）、ポリ（ジオキサノン）、ポリ（ｄ，ｌ－ラクチド－ｃｏ－ｌ－ラクチド）、ポリ（ｄ，ｌ－ラクチド－ｃｏ－グリコリド）、ポリ（グリコリド－ｃｏ－トリメチレンカーボネート）、ポリ（カプロラクトン）（「ポリカプロラクトン」）、ポリ（ｄ，ｌ－ラクチド－ｃｏ－グリコリド）（ＰＬＧＡ）、ポリ（ジオキサノン）ポリ（グリコリド－ｃｏ－トリメチレンカーボネート）、及びそれらの混合物からなる群から選択される、請求項１に記載のＣＮＳ送達組成物。
- 前記高分子ナノキャリアが、ＰＬＧＡである、請求項１に記載のＣＮＳ送達組成物。
- 前記組成物が、２：９８～１００：０の範囲の比率で乳酸：グリコール酸を含むＰＬＧＡナノ粒子である、請求項３に記載のＣＮＳ送達組成物。
- 前記カチオン性分子が、カチオン性ペプチドである、請求項１～４のいずれか１項に記載のＣＮＳ送達組成物。
- 前記カチオン性分子が、キトサン、ヘキサデシルアミン、またはラウリン酸アルギネートである、請求項１～４のいずれか１項に記載のＣＮＳ送達組成物。
- 前記カチオン性分子が、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）である、請求項１～５のいずれか１項に記載のＣＮＳ送達組成物。
- 前記ＰＥＩが、直鎖ＰＥＩまたは架橋ＰＥＩである、請求項７に記載のＣＮＳ送達組成物。
- 治療剤を更に含む、請求項１～８のいずれか１項に記載のＣＮＳ送達組成物。
- 前記治療剤が、小分子、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アプタマー、及びリボザイムからなる群から選択される、請求項９に記載のＣＮＳ送達組成物。
- ヒト対象へのくも膜下腔内送達のために製剤化される、請求項１～１０のいずれか１項に記載のＣＮＳ送達組成物。
- 前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、ギャップマーまたはスプライススイッチングアンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項１～１１のいずれか１項に記載のＣＮＳ送達組成物。
- 前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、配列番号１に記載の核酸配列からなる、請求項１～１１のいずれか１項に記載のＣＮＳ送達組成物。
- 前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、１８個の連結したヌクレオシドからなり、前記オリゴヌクレオチドが、核酸塩基配列ＭｅＵＭｅＣＡＭｅＣＭｅＵＭｅＵＭｅＵＭｅＣＡＭｅＵＡＡＭｅＵＧＭｅＣＭｅＵＧＧ（配列番号１）からなる核酸塩基配列を有し、前記オリゴヌクレオチドの各ヌクレオシド間結合が、ホスホロチオエート結合であり、前記オリゴヌクレオチドの各ヌクレオシドが、２’－メトキシエチルヌクレオシドであり、ＭｅＵが、５－メチル－ウラシルであり、ＭｅＣが、５－メチルシトシンである、請求項１～１１のいずれか１項に記載のＣＮＳ送達組成物。
- ＣＮＳ障害の治療を必要とするヒト対象におけるＣＮＳ障害を治療する方法であって、前記ヒト対象に、治療有効量の請求項１～１４のいずれか１項に記載のＣＮＳ送達組成物を投与することを含む、前記方法。
- 前記投与が、くも膜下腔内注射によるものである、請求項１５に記載の方法。
- ＳＭＮ１遺伝子の両方の機能的コピーの損失を有するヒト対象におけるＳＭＮ２メッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）転写産物中のエクソン７の包含を増加させる、または機能性ＳＭＮタンパク質欠乏を引き起こす前記ＳＭＮ１遺伝子の変異を有するヒト対象におけるＳＭＮ２メッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）転写産物中のエクソン７の包含を増加させる、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）の治療を必要とするヒト対象における脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）を治療する方法であって、前記ヒト対象のくも膜下腔内空間への注射によって、請求項１４に記載のＣＮＳ送達組成物を投与することを含む、前記方法。
- 前記注射が、ボーラス注射である、請求項１５～１７のいずれか１項に記載の方法。
- ヒト対象のＣＮＳに、アンチセンスオリゴヌクレオチドを送達するための方法であって、ＰＬＧＡナノ粒子内にカプセル化された前記アンチセンスオリゴヌクレオチドをくも膜下腔内注射によって投与することを含み、前記ＰＬＧＡナノ粒子の乳酸：グリコール酸比が、２：９８～１００：０の範囲であり、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、ＰＥＩまたは別のカチオン性分子と事前複合体化されている、前記方法。
- 前記ヒト対象が、ＣＮＳ障害を有する、請求項１９に記載の方法。
- 前記ＣＮＳ障害が、ＳＭＡ、ＡＬＳ、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病、アンジェルマン症候群、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、クロイツフェルトヤコブ病、脊髄小脳失調症３型（ＳＣＡ３）、メンケス病、シヌクレイノパチー、またはタウオパチーである、請求項２０に記載の方法。
- 前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、投与から０．１時間～１週間後に、前記ヒト対象のＣＮＳに送達される、請求項１９～２１のいずれか１項に記載の方法。
- 前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、投与から１日～６日後に、前記ヒト対象のＣＮＳに送達される、請求項１９～２１のいずれか１項に記載の方法。
- 前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、投与後０．１時間～４８時間以内に、前記ヒト対象の皮質に送達される、請求項１９～２１のいずれか１項に記載の方法。
- 前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、投与後６時間以内に、前記ヒト対象の線条体に送達される、請求項１９～２１のいずれか１項に記載の方法。
- 他のカチオン性分子が、カチオン性ペプチド、キトサン、ヘキサデシルアミン、またはラウリン酸アルギネートである、請求項１９～２５のいずれか１項に記載の方法。
- 前記ＰＥＩが、直鎖ＰＥＩまたは架橋ＰＥＩである、請求項１９～２５のいずれか１項に記載の方法。
- 水性緩衝液中のアンチセンスオリゴヌクレオチドの溶液の送達と比較して、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドの量の増加を必要とするヒト対象の脳に送達される前記アンチセンスオリゴヌクレオチドの量を増加させる方法であって、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドをカプセル化するＰＬＧＡナノ粒子をくも膜下腔内に注射することを含み、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、ＰＥＩまたは別のカチオン性分子と事前複合体化され、前記ＰＬＧＡナノ粒子の乳酸：グリコール酸比が、２：９８～１００：０の範囲である、前記方法。
- 水性緩衝液中のアンチセンスオリゴヌクレオチドの溶液と比較して、ヒト対象の脳に前記アンチセンスオリゴヌクレオチドをより深く送達する方法であって、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドをカプセル化するＰＬＧＡナノ粒子をくも膜下腔内に注射することを含み、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、ＰＥＩまたは別のカチオン性分子と事前複合体化され、前記ＰＬＧＡナノ粒子の乳酸：グリコール酸比が、２：９８～１００：０の範囲である、前記方法。
- 前記アンチセンスオリゴヌクレオチドのより多くが、前記水性緩衝液中の前記アンチセンスオリゴヌクレオチドの溶液と比較して、前記脳の線条体、視床、黒質、及び／または小脳に送達される、請求項２９に記載の方法。
- 水性緩衝液中のアンチセンスオリゴヌクレオチドの溶液と比較して、ヒト対象の脊髄及び／または脳への前記アンチセンスオリゴヌクレオチドの投与の数を低減させる方法であって、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドをカプセル化するＰＬＧＡナノ粒子をくも膜下腔内に注射することを含み、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、ＰＥＩまたは別のカチオン性分子と事前複合体化され、前記ＰＬＧＡナノ粒子の乳酸：グリコール酸比が、２：９８～１００：０の範囲である、前記方法。
- 前記ＰＥＩが、直鎖ＰＥＩまたは架橋ＰＥＩである、請求項２８～３１のいずれか１項に記載の方法。
- 前記別のカチオン性分子が、カチオン性ペプチド、キトサン、ヘキサデシルアミン、またはラウリン酸アルギネートである、請求項２８～３１のいずれか１項に記載の方法。
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