TW202304473A - 向中樞神經系統之核酸遞送 - Google Patents

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長庚 彭
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布萊恩 Ｒ 西姆勒
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Abstract

本發明提供具有經封裝核酸( 例如反義寡核苷酸)之聚合物奈米載劑( 例如PLGA 奈米粒子)，用於遞送( 例如鞘內)至中樞神經系統。此等聚合奈米載劑可用於治療中樞神經系統病症。與游離或未調配之反義寡核苷酸相比，其能夠以更高量在更長時段內遞送其貨物( 例如反義寡核苷酸)且將該貨物遞送至更深的腦部區域。反義寡核苷酸之有效遞送及分佈使得投與次數減少且引起患者依從性且改善患者體驗。

Description

向中樞神經系統之核酸遞送
本發明概言之係關於用於將治療劑遞送至中樞神經系統之組合物以及使用該等組合物治療神經病症之方法。
藥物至中樞神經系統(CNS)之遞送一直為治療諸如阿茲海默氏病(Alzheimer’s disease)及帕金森氏病(Parkinson’s disease)等神經疾病的挑戰。為了使藥物到達神經系統，藥物首先必須穿透血腦障壁(BBB)，由於BBB之選擇性，此為重大挑戰。BBB充當半透膜，阻止大多數分子自血液進入神經系統，且僅允許低分子量(＜400 Da)及親脂性化合物穿過。大多數小分子及大分子，諸如單株抗體及反義寡核苷酸均無法穿過此障壁。由於藥物穿透BBB這一具有挑戰性的過程，僅不到10%之神經系統疾病治療劑進入臨床試驗。
直接進入CNS之一種方法為使用鞘內(IT)注射。藉由直接注射至腦脊液(CSF)中，治療劑可直接進入CNS。然而，CSF一天要周轉數次，因此治療劑之停留時間可能會受到限制。此項技術中需要用於將治療劑遞送至CNS之改良方法。
本申請案部分地係關於將治療劑(例如核酸，諸如反義寡核苷酸)遞送至中樞神經系統(CNS)之組合物。亦提供使用此類組合物治療神經疾病之方法。此外，提供增加遞送至人類個體腦部之治療劑之量及/或停留時間的方法。此外，本發明係關於將治療劑遞送至有需要之人類個體腦部更深處的方法。
在一個態樣中，本發明提供一種中樞神經系統(CNS)遞送組合物。該組合物包括聚合物奈米載劑及反義寡核苷酸。反義寡核苷酸被封裝於聚合物奈米載劑中，且在封裝前直接與抗衡劑(一種陽離子分子)預複合。
在一些情況下，聚合物奈米載劑選自由以下組成之群：聚(l-丙交酯)、聚(乙交酯)、聚(d,l-丙交酯) (PLA)、聚(二噁烷酮)、聚(d,l-丙交酯-共-l-丙交酯)、聚(d,l-丙交酯-共-乙交酯)、聚(乙交酯-共-三亞甲基碳酸酯)、聚(己內酯) (「聚己內酯」)、聚(d,l-丙交酯-共-乙交酯) (PLGA)、聚(二噁烷酮)聚(乙交酯-共-三亞甲基碳酸酯)以及其混合物。在一種情況下，聚合物奈米載劑為PLGA。在CNS遞送組合物為PLGA奈米粒子之情況下，PLGA奈米粒子包含比率在2:98至98:2範圍內之乳酸:乙醇酸。在某些情況下，PLGA奈米粒子包含比率選自由以下組成之群的乳酸:乙醇酸：2:98、3:97、4:96、5:95、6:94、7:93、8:92、9:91、10:90、11:89、12:88、13:87、14:86、15:85、16:84、17:83、18:82、19:81、20:80、21:79、22:78、23:77、24:76、25:75、26:74、27:73、28:72、29:71、30:70、31:69、32:68、33:67、34:66、35:65、36:64、37:63、38:62、39:61、40:60、41:59、42:58、43:57、44:56、45:55、46:54、47:53、48:52、49:51、50:50、51:49、52:48、53:47、54:46、55:45、56:44、57:43、58:42、59:41、60:40、61:39、62:38、63:37、64:36、65:35、66:34、67:33、68:32、69:31、70:30、71:29、72:28、73:27、74:26、75:25、76:24、77:23、78:22、79:21、80:20、81:19、82:18、83:17、84:16、85:15、86:14、87:13、88:12、89:11、90:10、91:9、92:8、93:7、94:6、95:5、96:4、97:4、98:2及100:0。
抗衡劑為與反義寡核苷酸形成複合物之陽離子分子。在一些情況下，陽離子分子為陽離子肽。在其他情況下，陽離子分子為殼聚醣。在一些情況下，陽離子分子為十六胺。在一些情況下，陽離子分子為月桂精胺酸。在其他情況下，陽離子分子為聚乙烯亞胺(PEI)。在一些情況下，PEI為線性PEI。在其他情況下，PEI為交聯PEI。
在一些情況下，CNS遞送組合物進一步包括治療劑。在某些情況下，治療劑選自由以下組成之群：小分子、cDNA、mRNA、siRNA、miRNA、適體、核酶及不同的反義寡核苷酸。
在某些情況下，CNS遞送組合物經調配以鞘內遞送至人類個體。
在一些情況下，反義寡核苷酸為間隙體(gapmer)或剪接轉換反義寡核苷酸。在一些情況下，反義寡核苷酸係一種可用於治療神經退化性疾病(例如tau蛋白病、突觸核蛋白病)之寡核苷酸。在某些情況下，反義寡核苷酸包含SEQ ID NO: 1中所示之核酸序列或由該核酸序列組成。在一種情況下，反義寡核苷酸由18個連接的核苷組成，其中寡核苷酸具有由核鹼基序列 MeU MeCA MeC MeU MeU MeU MeCA MeUAA MeUG MeC MeUGG (SEQ ID NO:1)組成之核鹼基序列，其中寡核苷酸之各核苷間鍵為硫代磷酸酯鍵，寡核苷酸之各核苷為2'-甲氧基乙基核苷， MeU為5-甲基-尿嘧啶，且 MeC為5-甲基胞嘧啶。
在另一態樣中，本發明係關於一種治療有需要之人類個體之CNS病症的方法。該方法包括向人類個體投與治療有效量之上述CNS遞送組合物。
在一些情況下，投與係藉由鞘內注射。在某些情況下，鞘內注射為彈丸注射。在某些情況下，CNS病症為突觸核蛋白病或tau蛋白病。在某些情況下，CNS病症為脊髓性肌萎縮(SMA)、肌萎縮側索硬化症(ALS)、帕金森氏病(Parkinson’s disease)、阿茲海默氏病(Alzheimer’s disease)、亨廷頓氏病(Huntington’s disease)、安格爾曼症候群(Angelman syndrome)、額顳葉癡呆(FTD)、克雅氏病(Creutzfeldt–Jakob disease)、脊髓小腦共濟失調3型(SCA3)或門克氏病(Menkes disease)。
在另一態樣中，本發明提供一種在有需要之人類個體中治療SMA、在SMN1基因之兩個功能複本均缺失之人類個體中增加SMN2信使核糖核酸(mRNA)轉錄本中之外顯子7包含或在具有導致功能性SMN蛋白缺乏之SMN1基因突變的人類個體中增加SMN2信使核糖核酸(mRNA)轉錄本中之外顯子7包含之方法。該方法包括藉由注射向人類個體之鞘內空間中投與CNS遞送組合物，其中反義寡核苷酸由18個連接的核苷組成，其中寡核苷酸具有由核鹼基序列 MeU MeCA MeC MeU MeU MeU MeCA MeUAA MeUG MeC MeUGG (SEQ ID NO:1)組成之核鹼基序列，其中寡核苷酸之各核苷間鍵為硫代磷酸酯鍵，寡核苷酸之各核苷為2'-甲氧基乙基核苷， MeU為5-甲基-尿嘧啶，且 MeC為5-甲基胞嘧啶。
在一些實施例中，注射為彈丸注射。
在另一態樣中，本發明係關於一種將反義寡核苷酸遞送至人類個體之CNS的方法。該方法包括藉由鞘內注射投與封裝於PLGA奈米粒子內之反義寡核苷酸，其中PLGA奈米粒子之乳酸:乙醇酸比率在2:98至100:0範圍內，且其中反義寡核苷酸與PEI或另一陽離子分子(例如陽離子肽、殼聚醣、十六胺、月桂精胺酸)複合。
在某些情況下，PLGA奈米粒子包含比率選自由以下組成之群的乳酸:乙醇酸：2:98、3:97、4:96、5:95、6:94、7:93、8:92、9:91、10:90、11:89、12:88、13:87、14:86、15:85、16:84、17:83、18:82、19:81、20:80、21:79、22:78、23:77、24:76、25:75、26:74、27:73、28:72、29:71、30:70、31:69、32:68、33:67、34:66、35:65、36:64、37:63、38:62、39:61、40:60、41:59、42:58、43:57、44:56、45:55、46:54、47:53、48:52、49:51、50:50、51:49、52:48、53:47、54:46、55:45、56:44、57:43、58:42、59:41、60:40、61:39、62:38、63:37、64:36、65:35、66:34、67:33、68:32、69:31、70:30、71:29、72:28、73:27、74:26、75:25、76:24、77:23、78:22、79:21、80:20、81:19、82:18、83:17、84:16、85:15、86:14、87:13、88:12、89:11、90:10、91:9、92:8、93:7、94:6、95:5、96:4、97:4、98:2及100:0。
在某些情況下，人類個體患有CNS病症。在某些情況下，CNS病症為突觸核蛋白病或tau蛋白病。在一些情況下，CNS病症為SMA、ALS、帕金森氏病、阿茲海默氏病、亨廷頓氏病、安格爾曼症候群、額顳葉癡呆(FTD)、克雅氏病、脊髓小腦共濟失調3型(SCA3)或門克氏病。
在一些情況下，反義寡核苷酸在投與後約0.1小時至約1週被遞送至人類個體之CNS ( 例如皮質、紋狀體、丘腦、黑質、小腦)。在一些情況下，反義寡核苷酸在投與後1天至7天被遞送至人類個體之CNS ( 例如皮質、紋狀體、丘腦、黑質、小腦)。在一些情況下，反義寡核苷酸在投與後1天至6天被遞送至人類個體之CNS ( 例如皮質、紋狀體、丘腦、黑質、小腦)。在一些情況下，反義寡核苷酸在投與後1天至5天被遞送至人類個體之CNS ( 例如皮質、紋狀體、丘腦、黑質、小腦)。在一些情況下，反義寡核苷酸在投與後1天至4天被遞送至人類個體之CNS ( 例如皮質、紋狀體、丘腦、黑質、小腦)。在一些情況下，反義寡核苷酸在投與後1天至3天被遞送至人類個體之CNS ( 例如皮質、紋狀體、丘腦、黑質、小腦)。在一些情況下，反義寡核苷酸在投與後1天至2天被遞送至人類個體之CNS ( 例如皮質、紋狀體、丘腦、黑質、小腦)。在一些情況下，反義寡核苷酸在投與後1天被遞送至人類個體之CNS ( 例如皮質、紋狀體、丘腦、黑質、小腦)。在一些情況下，反義寡核苷酸在投與後0.1小時至48小時內被遞送至人類個體之皮質、紋狀體、丘腦、黑質、小腦。在一些情況下，反義寡核苷酸在投與後0.1小時至36小時內被遞送至人類個體之皮質、紋狀體、丘腦、黑質、小腦。在一些情況下，反義寡核苷酸在投與後0.1小時至24小時內被遞送至人類個體之皮質、紋狀體、丘腦、黑質、小腦。在一些情況下，反義寡核苷酸在投與後0.1小時至12小時內被遞送至人類個體之皮質、紋狀體、丘腦、黑質、小腦。在一些情況下，反義寡核苷酸在投與後0.1小時至6小時內被遞送至人類個體之皮質、紋狀體、丘腦、黑質、小腦。在一些情況下，反義寡核苷酸在投與後0.1小時至3小時內被遞送至人類個體之皮質、紋狀體、丘腦、黑質、小腦。在一些情況下，反義寡核苷酸在投與後0.1小時至2小時內被遞送至人類個體之皮質、紋狀體、丘腦、黑質、小腦。在一些情況下，反義寡核苷酸在投與後24小時內被遞送至人類個體之皮質、紋狀體、丘腦、黑質、小腦。在一些情況下，反義寡核苷酸在投與後12小時內被遞送至人類個體之皮質、紋狀體、丘腦、黑質、小腦。在一些情況下，反義寡核苷酸在投與後6小時內被遞送至人類個體之皮質、紋狀體、丘腦、黑質、小腦。在一些情況下，反義寡核苷酸在投與後3小時內被遞送至人類個體之皮質、紋狀體、丘腦、黑質、小腦。在一些情況下，反義寡核苷酸在投與後2小時內被遞送至人類個體之皮質、紋狀體、丘腦、黑質、小腦。在一些情況下，反義寡核苷酸在投與後1小時內被遞送至人類個體之皮質、紋狀體、丘腦、黑質、小腦。
在另一態樣中，本發明提供一種相對於水性緩衝液中反義寡核苷酸溶液之遞送增加遞送至有需要之人類個體之脊髓及/或腦部之反義寡核苷酸之量的方法。該方法包括鞘內注射封裝反義寡核苷酸之PLGA奈米粒子，其中反義寡核苷酸與PEI或另一陽離子分子(例如陽離子肽、殼聚醣、十六胺、月桂精胺酸)預複合，且其中PLGA奈米粒子之乳酸:乙醇酸比率在2:98至100:0範圍內。在某些情況下，PLGA奈米粒子包含比率選自由以下組成之群的乳酸:乙醇酸：2:98、3:97、4:96、5:95、6:94、7:93、8:92、9:91、10:90、11:89、12:88、13:87、14:86、15:85、16:84、17:83、18:82、19:81、20:80、21:79、22:78、23:77、24:76、25:75、26:74、27:73、28:72、29:71、30:70、31:69、32:68、33:67、34:66、35:65、36:64、37:63、38:62、39:61、40:60、41:59、42:58、43:57、44:56、45:55、46:54、47:53、48:52、49:51、50:50、51:49、52:48、53:47、54:46、55:45、56:44、57:43、58:42、59:41、60:40、61:39、62:38、63:37、64:36、65:35、66:34、67:33、68:32、69:31、70:30、71:29、72:28、73:27、74:26、75:25、76:24、77:23、78:22、79:21、80:20、81:19、82:18、83:17、84:16、85:15、86:14、87:13、88:12、89:11、90:10、91:9、92:8、93:7、94:6、95:5、96:4、97:4、98:2及100:0。在一種情況下，PLGA奈米粒子包含比率為50:50之乳酸:乙醇酸。在另一情況下，PLGA奈米粒子包含比率為5:95之乳酸:乙醇酸。在某些情況下，ASO包含SEQ ID NO: 1中所示之核酸序列或由其組成。在某些情況下，ASO包含可用於治療神經退化性疾病之核酸序列或由其組成。
在另一態樣中，本發明提供一種相對於在水性緩衝液中遞送反義寡核苷酸溶液，將反義寡核苷酸更深地遞送至人類個體腦部的方法。該方法包含鞘內注射封裝反義寡核苷酸之PLGA奈米粒子，其中反義寡核苷酸與PEI或另一陽離子分子(例如陽離子肽、殼聚醣、十六胺、月桂精胺酸)預複合，且其中PLGA奈米粒子之乳酸:乙醇酸比率在2:98至100:0範圍內。在某些情況下，PLGA奈米粒子包含比率選自由以下組成之群的乳酸:乙醇酸：2:98、3:97、4:96、5:95、6:94、7:93、8:92、9:91、10:90、11:89、12:88、13:87、14:86、15:85、16:84、17:83、18:82、19:81、20:80、21:79、22:78、23:77、24:76、25:75、26:74、27:73、28:72、29:71、30:70、31:69、32:68、33:67、34:66、35:65、36:64、37:63、38:62、39:61、40:60、41:59、42:58、43:57、44:56、45:55、46:54、47:53、48:52、49:51、50:50、51:49、52:48、53:47、54:46、55:45、56:44、57:43、58:42、59:41、60:40、61:39、62:38、63:37、64:36、65:35、66:34、67:33、68:32、69:31、70:30、71:29、72:28、73:27、74:26、75:25、76:24、77:23、78:22、79:21、80:20、81:19、82:18、83:17、84:16、85:15、86:14、87:13、88:12、89:11、90:10、91:9、92:8、93:7、94:6、95:5、96:4、97:4、98:2及100:0。在一種情況下，PLGA奈米粒子包含比率為50:50之乳酸:乙醇酸。在另一情況下，PLGA奈米粒子包含比率為5:95之乳酸:乙醇酸。在某些情況下，ASO包含SEQ ID NO: 1中所示之核酸序列或由其組成。在某些情況下，ASO包含可用於治療神經退化性疾病之核酸序列或由其組成。
在某些情況下，相對於水性緩衝液中反義寡核苷酸溶液之遞送，更多的反義寡核苷酸被遞送至腦部之紋狀體、丘腦、黑質及/或小腦。反義寡核苷酸之有效遞送及分佈可使得投與次數減少且改善患者體驗及依從性。
除非另有定義，否則本文所用之所有技術及科學術語與本發明所屬領域之普通技術人員通常理解的含義相同。儘管與本文所述之方法及材料類似或等效之方法及材料可用於本發明之實踐或測試，但例示性方法及材料如下所述。本文提及之所有出版物、專利申請案、專利及其他參考文獻以引用方式整體併入。在衝突之情況下，將以包括定義在內的本申請案為準。材料、方法及實例僅為說明性的且非限制性的。
本發明之其他特徵及優點將自以下實施方式及申請專利範圍中顯而易見。
相關申請案之交叉參考
本申請案主張2021年4月1日提出申請之美國臨時申請案第63/169,539號之優先權，該申請案之內容以引用方式整體併入本文中。 序列表
本申請案含有序列表，該序列表已以ASCII格式以電子方式提交，且特此以引用方式整體併入。該ASCII複本創建於2022年3月25日，名為13751-0301WO1_SL.txt，且大小為10,722位元組。
將藥物遞送至中樞神經系統(CNS)一直是治療神經系統疾病之核心問題，因為血腦障壁(BBB)提供了有效障壁，阻止大多數治療分子進入腦部。若無法進入腦部，則此等分子之治療效果可能會受損或被消除。鞘內(IT)注射提供了一種直接進入CNS且繞過BBB之方法。然而，由於在IT投與期間注射治療劑之腦脊液(CSF)一天要周轉數次，因此治療劑之停留時間通常有限。若未充分暴露於CNS，則治療之治療益處可能會受到限制。為了提高IT投與之治療劑之功效，申請者試圖藉由改善寡核苷酸在CNS內之分佈來改善寡核苷酸向CNS內之目標組織的分佈，且從而延長暴露時間且防止藥物快速清除。申請者推斷，以此方式，更大量的治療劑可在到達腦部目標區域後維持更長時間。申請者試圖藉由將治療劑封裝於奈米粒子中來改善分佈，該奈米粒子將以不同於帶負電游離寡核苷酸之方式與組織相互作用，在CNS中具有更長的停留時間且在其存在於CNS中的時間內自奈米粒子釋放所關注治療劑。
聚合物奈米粒子( 例如PLGA奈米粒子)通常被設計為具有緩慢及受控的釋放動力學，且設計此等藥物遞送系統之熟習此項技術者應使釋放曲線與各特定適應症之治療需求相匹配。大多數聚合物奈米粒子在較長時段(數小時至數月)內釋放其內容物，以最大限度地延長停留時間且控製藥物遞送。然而，由於CNS遞送之生物學限制及CSF之快速周轉，本發明係基於採用相當快速(數小時至數天)釋放ASO之奈米粒子的益處。申請者發現，藉由將寡核苷酸封裝於具有相對較短半衰期之奈米粒子中以確保在清除前釋放藥物，可沿著脊柱獲得更多治療劑( 例如ASO)且該治療劑進入更深的腦部區域。為實現這一點，申請者之方法為設計奈米粒子釋放速率，以允許粒子自注射部位進入脊柱之腰部區域到達腦部，且接著在粒子自CSF中清除之前釋放其內容物。此等速率比通常用於延長釋放奈米粒子調配物之速率快得多。將藥物封裝於奈米粒子內會增加在CSF中之保留時間；然而，奈米粒子不會像大多數其他聚合物奈米粒子( 例如PLGA奈米粒子)療法所設計的在完全分解之前永久保留在原地。申請者發現此等聚合物奈米粒子仍足夠小，以至於其將自CNS周圍之鞘內空間中消除，只是不如游離ASO快速。因此，申請者避免開發釋放很長時間之聚合物奈米粒子( 例如PLGA奈米粒子)。相反，申請者依賴於在大約數小時至數天至一周(而非數周至數月)內釋放之聚合物奈米粒子( 例如PLGA奈米粒子)，以確保治療劑( 例如ASO)在粒子仍可進入中樞神經系統及腦部時被釋放且可用。
本發明亦部分地基於以下發現：將奈米粒子投與至中樞神經系統無毒性作用，且將申請者之含有反義寡核苷酸(ASO)之聚合物奈米粒子直接投與至中樞神經系統不顯示副作用。
本發明 尤其提供來自動物研究之結果，該等動物研究調查了聚(dl-丙交酯-共-乙交酯) (PLGA)奈米粒子用於將反義寡核苷酸(ASO)遞送至腦部之功效及安全性。簡言之，PLGA奈米粒子負載有Malat-1 ASO且經表徵。接著將此等粒子腦室內(ICV)注射至小鼠體內。此等注射具有良好耐受性，且在腰椎皮質中顯示出減弱，表明ASO自奈米粒子中釋放，且奈米粒子在此等研究中使用之劑量下係安全的。隨後，藉由鞘內注射將奈米粒子注射至大鼠體內。此研究之結果表明，與單獨的游離未調配ASO相比，封裝於奈米粒子中之ASO使得皮質中之減弱增加1.5至2倍。儘管與游離ASO相比，粒子調配物有所改良，但需要更多的工作來檢查具有不同乳酸:乙醇酸比之PLGA調配物之間的效能差異。在改良奈米粒子製造製程後，改良了供應具有不同乳酸:乙醇酸比之奈米粒子，用於額外的大鼠IT研究，該等研究檢查調配物之耐受性以及寡核苷酸沿脊柱及向腦部之分佈。結果表明，當與游離的未調配ASO相比時，奈米粒子(PLGA 50:50)對皮質之減弱增加。在具有活 體內成像之報告小鼠模型中之進一步ICV投與表明，與對應游離未調配ASO相比，PLGA調配物引起顯著改善。 聚合物奈米載劑組合物
存在兩種廣泛的用於將核酸( 例如寡核苷酸)遞送至體內之目標部位的方法。第一種為化學修飾核酸，通常使用靶向配位體，同時保留結合物之分子性質。第二種為將核酸併入某一形式之奈米載劑中，接著確定寡核苷酸之組織分佈及細胞相互作用。此兩種方法之主要區別在於遞送部分的大小：分子級相對於奈米級。本發明聚焦於奈米級遞送。存在各種奈米級系統，包括脂質奈米載劑及聚合物奈米載劑。本發明係關於聚合物奈米載劑。聚合物奈米載劑包括例如PLGA奈米粒子、聚合物膠束(亦稱為「核-殼」奈米粒子)、由PLGA核及脂質-PEG殼構成之自組裝混合奈米載劑及奈米水凝膠( 例如PRINT奈米水凝膠)。
奈米粒子被視為最通用藥物輸送系統之一，因為其能夠保護治療劑，同時將其有效地遞送至目標組織或器官中。幾種不同類型之聚合物奈米載劑可用於遞送治療劑( 例如寡核苷酸，諸如ASO)。在某些情況下，聚合物奈米粒子為以下中之一者：聚(l-丙交酯)、聚(乙交酯)、聚(d,l-丙交酯) (PLA)、聚(二噁烷酮)、聚(d,l-丙交酯-共-l-丙交酯)、聚(d,l-丙交酯-共-乙交酯)、聚(乙交酯-共-三亞甲基碳酸酯)、聚(己內酯) (「聚己內酯」)、聚(d,l-丙交酯-共-乙交酯) (PLGA)、聚(二噁烷酮)聚(乙交酯-共-三亞甲基碳酸酯)或其混合物。例示性乳酸聚合物描述於例如EP1468035、美國專利第6,706,854號、WO2007/009919A2、EP1907023A、EP2263707A、EP2147036、EP0427185及美國專利第5,610,266號中。
可生物降解聚合物PLGA作為藥物遞送載劑具有巨大潛力。此外，有可能藉由控制諸如聚合物分子量、丙交酯與乙交酯之比以及粒度等參數來調整PLGA藥物基質之整體物理特性，以達成所需藥物負載及釋放速率。在水性環境中，PLGA藉由其酯鍵之水解而降解。因此，聚合物之疏水性及結晶度會影響其降解速率：聚合物之疏水性及結晶度愈高，其降解速率愈慢。在PLGA之兩種單體中，LA更具疏水性，因此PLGA聚合物中存在之LA愈多，其疏水性愈高。此外，PLGA聚合物中存在之LA愈多，其結晶度愈高；此兩種特征之組合使得LA含量較高之PLGA聚合物之降解速率較慢，而GA含量較高之PLGA聚合物之降解速率較快。PLGA之此特性係有用的，且可幫助確定最有效聚合物類型，以選擇所需釋放速率。
在一些情況下，本發明提供PLGA奈米粒子，其包含比率在2:98至100:0範圍內之乳酸:乙醇酸。在某些情況下，本發明提供PLGA奈米粒子，其包含比率在2:98至98:2範圍內之乳酸:乙醇酸。在一些情況下，本發明提供PLGA奈米粒子，其包含比率在5:95至95:5範圍內之乳酸:乙醇酸。在其他情況下，本發明提供PLGA奈米粒子，其包含比率在10:90至90:10範圍內之乳酸:乙醇酸。在其他情況下，本發明提供PLGA奈米粒子，其包含比率在15:85至85:15範圍內之乳酸:乙醇酸。在其他情況下，本發明提供PLGA奈米粒子，其包含比率在20:80至80:20範圍內之乳酸:乙醇酸。在一些情況下，本發明提供PLGA奈米粒子，其包含比率在25:75至75:25範圍內之乳酸:乙醇酸。在其他情況下，本發明提供PLGA奈米粒子，其包含比率在30:70至70:30範圍內之乳酸:乙醇酸。在某些情況下，本發明提供PLGA奈米粒子，其包含比率在35:65至65:35範圍內之乳酸:乙醇酸。在一些情況下，本發明提供PLGA奈米粒子，其包含比率在40:55至55:45範圍內之乳酸:乙醇酸。在一些情況下，本發明提供PLGA奈米粒子，其包含比率在5:95至85:15範圍內之乳酸:乙醇酸。在某些情況下，本發明提供PLGA奈米粒子，該等奈米粒子包含比率選自由以下組成之群的乳酸:乙醇酸：2:98、3:97、4:96、5:95、6:94、7:93、8:92、9:91、10:90、11:89、12:88、13:87、14:86、15:85、16:84、17:83、18:82、19:81、20:80、21:79、22:78、23:77、24:76、25:75、26:74、27:73、28:72、29:71、30:70、31:69、32:68、33:67、34:66、35:65、36:64、37:63、38:62、39:61、40:60、41:59、42:58、43:57、44:56、45:55、46:54、47:53、48:52、49:51、50:50、51:49、52:48、53:47、54:46、55:45、56:44、57:43、58:42、59:41、60:40、61:39、62:38、63:37、64:36、65:35、66:34、67:33、68:32、69:31、70:30、71:29、72:28、73:27、74:26、75:25、76:24、77:23、78:22、79:21、80:20、81:19、82:18、83:17、84:16、85:15、86:14、87:13、88:12、89:11、90:10、91:9、92:8、93:7、94:6、95:5、96:4、97:4、98:2及100:0。在一種情況下，本發明提供PLGA奈米粒子，其包含比率為50:50之乳酸:乙醇酸。在另一情況下，本發明提供PLGA奈米粒子，其包含比率為5:95之乳酸:乙醇酸。在另一情況下，本發明提供PLGA奈米粒子，其包含比率為85:15之乳酸:乙醇酸。
在一些情況下，聚合物奈米載劑( 例如PLGA奈米粒子)具有-0.3至-12.0 mV之總電荷密度。在其他情況下，聚合物奈米載劑( 例如PLGA奈米粒子)具有-0.4至-10.0 mV之總電荷密度。在一些情況下，聚合物奈米載劑( 例如PLGA奈米粒子)具有-0.4至-1.0 mV之總電荷密度。在一些情況下，聚合物奈米載劑( 例如PLGA奈米粒子)具有-0.4至-0.9 mV之總電荷密度。在一些情況下，聚合物奈米載劑( 例如PLGA奈米粒子)具有-0.4至-0.8 mV之總電荷密度。在一些情況下，聚合物奈米載劑( 例如PLGA奈米粒子)具有-0.4至-0.7 mV之總電荷密度。在某些情況下，聚合物奈米載劑( 例如PLGA奈米粒子)具有-0.4至-0.6 mV之總電荷密度。在某些情況下，聚合物奈米載劑( 例如PLGA奈米粒子)具有-0.01至-0.05 mV之總電荷密度。
在一些情況下，聚合物奈米載劑( 例如PLGA奈米粒子)具有0.2至0.9之多分散性指數。在某些情況下，聚合物奈米載劑( 例如PLGA奈米粒子)具有0.2至0.8之多分散性指數。在其他情況下，聚合物奈米載劑( 例如PLGA奈米粒子)具有0.2至0.7之多分散性指數。在一些情況下，聚合物奈米載劑( 例如PLGA奈米粒子)具有0.2至0.6之多分散性指數。在一些情況下，聚合物奈米載劑( 例如PLGA奈米粒子)具有0.2至0.5之多分散性指數。在一些情況下，聚合物奈米載劑( 例如PLGA奈米粒子)具有0.2至0.4之多分散性指數。在某些情況下，聚合物奈米載劑( 例如PLGA奈米粒子)具有0.2至0.3之多分散性指數。
在一些情況下，聚合物奈米粒子( 例如PLGA奈米粒子)具有100 nm至1000 nm之直徑。在某些情況下，聚合物奈米粒子(例如PLGA奈米粒子)具有100 nm至900 nm之直徑。在一些情況下，聚合物奈米粒子( 例如PLGA奈米粒子)具有100 nm至800 nm之直徑。在某些情況下，聚合物奈米粒子( 例如PLGA奈米粒子)具有100 nm至700 nm之直徑。在其他情況下，聚合物奈米粒子( 例如PLGA奈米粒子)具有100 nm至600 nm之直徑。在其他情況下，聚合物奈米粒子( 例如PLGA奈米粒子)具有100 nm至500 nm之直徑。在一些情況下，聚合物奈米粒子( 例如PLGA奈米粒子)具有100 nm至400 nm之直徑。在某些情況下，聚合物奈米粒子( 例如PLGA奈米粒子)具有100 nm至300 nm之直徑。在一些情況下，聚合物奈米粒子(例如PLGA奈米粒子)具有100 nm至250 nm之直徑。在其他情況下，聚合物奈米粒子( 例如PLGA奈米粒子)具有100 nm至200 nm之直徑。
在某些情況下，聚合物奈米載劑( 例如PLGA奈米粒子)具有100至650 nM之直徑、-0.4至-0.6mV之總電荷密度及0.2至0.3之多分散性指數。在某些情況下，聚合物奈米載劑( 例如PLGA奈米粒子)具有100至400 nM之直徑、-0.4至-0.6mV之總電荷密度及0.2至0.3之多分散性指數。在某些情況下，聚合物奈米載劑( 例如PLGA奈米粒子)具有200至300 nM之直徑、-0.4至-0.6mV之總電荷密度及0.2至0.3之多分散性指數。在某些情況下，此等聚合物奈米載劑( 例如PLGA奈米粒子)包含比率選自由以下組成之群的乳酸:乙醇酸：2:98、3:97、4:96、5:95、6:94、7:93、8:92、9:91、10:90、11:89、12:88、13:87、14:86、15:85、16:84、17:83、18:82、19:81、20:80、21:79、22:78、23:77、24:76、25:75、26:74、27:73、28:72、29:71、30:70、31:69、32:68、33:67、34:66、35:65、36:64、37:63、38:62、39:61、40:60、41:59、42:58、43:57、44:56、45:55、46:54、47:53、48:52、49:51、50:50、51:49、52:48、53:47、54:46、55:45、56:44、57:43、58:42、59:41、60:40、61:39、62:38、63:37、64:36、65:35、66:34、67:33、68:32、69:31、70:30、71:29、72:28、73:27、74:26、75:25、76:24、77:23、78:22、79:21、80:20、81:19、82:18、83:17、84:16、85:15、86:14、87:13、88:12、89:11、90:10、91:9、92:8、93:7、94:6、95:5、96:4、97:4、98:2及100:0。
在某些情況下，帶負電(陰離子)寡核苷酸與陽離子分子複合。例示性陽離子分子包括合成陽離子聚合物諸如聚乙烯亞胺(PEI)、天然陽離子聚合物諸如殼聚醣、陽離子肽、陽離子樹枝狀聚合物、十六胺或月桂精胺酸。在一些實施例中，PEI可為線性PEI或交聯PEI。由於PEI為具有多個可滴定胺基之直鏈或支鏈聚合物，因此其可容易地與寡核苷酸形成奈米複合物。在一些實施例中，複合分子可為PepFect6、源自蜂毒肽之陽離子肽、轉錄反式活化因子(TAT)之陽離子肽、人類乳鐵蛋白源性肽或短兩親序列。在一些實施例中，陽離子樹枝狀聚合物為聚酰胺基胺(PAMAM)。
在一些情況下，聚合物奈米粒子( 例如PLGA奈米粒子)進一步包含聚乙二醇(PEG)。中性聚合物，諸如PEG可最大限度地減少網狀內皮系統(RES)之蛋白質結合及攝取。包含PEG之聚合物奈米粒子因此可具有增加的循環時間。在某些情況下，PEG藉由可裂解連接子或短脂質錨與聚合物奈米載劑連接。在一些情況下，聚合物奈米粒子( 例如PLGA奈米粒子)進一步包含葉酸。葉酸可與奈米載劑表面偶聯。在一些情況下，聚合物奈米粒子( 例如PLGA奈米粒子)進一步包含小分子配位體( 例如茴香酰胺)或適體以靶向所關注位點。在一些情況下，聚合物奈米粒子( 例如PLGA奈米粒子)進一步包含轉鐵蛋白受體配位體。在一些情況下，聚合物奈米粒子( 例如PLGA奈米粒子)進一步包含抗轉鐵蛋白受體抗體或其片段。在一些情況下，聚合物奈米粒子( 例如PLGA奈米粒子)進一步包含狂犬病毒肽以將奈米粒子靶向至神經元。在一些情況下，聚合物奈米粒子( 例如PLGA奈米粒子)進一步包含靶向內吞作用之受體位點的靶向配位體。
在某些情況下，除了封裝於奈米粒子內之核酸( 例如寡核苷酸，諸如ASO)之外，聚合物奈米粒子( 例如PLGA奈米粒子)亦包含治療劑。在某些情況下，治療劑選自由以下組成之群：小分子、cDNA、mRNA、siRNA、miRNA、適體、核酶及不同的反義寡核苷酸。
可製備聚合物奈米粒子( 例如PLGA奈米粒子)以使其封裝待遞送之核酸( 例如寡核苷酸，諸如ASO)。在某些情況下，ASO包含SEQ ID NO: 1中所示之序列或由其組成。此類聚合物奈米粒子可包括與核酸( 例如寡核苷酸，諸如ASO)複合之陽離子分子。在某些情況下，陽離子分子為PEI。在一些情況下，此類聚合奈米載劑可同時遞送核酸( 例如ASO)及第二治療劑( 例如小分子藥物或另一ASO)。因此，聚合物奈米粒子可用於將治療劑 活體內共遞送至目標位點( 例如中樞神經系統之任何部分，諸如脊髓、皮質、紋狀體、丘腦、黑質或小腦)。
上述任何聚合物奈米粒子( 例如PLGA奈米粒子)均可調配用於鞘內遞送至人類個體。在某些情況下，聚合物奈米粒子( 例如PLGA奈米粒子)藉由快速彈丸注射進行鞘內投與。在一些情況下，聚合物奈米粒子( 例如PLGA奈米粒子)調配用於遞送至人類個體腦部之紋狀體、丘腦、黑質或小腦中之一或多者。 反義寡核苷酸
反義寡核苷酸(ASO)為合成單股核酸鏈，其與核糖核酸(RNA)結合，從而改變或減少目標RNA之表現。其不僅可藉由破壞靶向轉錄本來減少蛋白質表現，且亦可經由干擾前mRNA剪接來恢復蛋白質表現或修飾蛋白質。本發明包括兩種類型之ASO。在某些情況下，本發明之ASO為「間隙體」。此類ASO主要藉由經由RNA酶H依賴性機制選擇性裂解具有互補位點之mRNA而發揮作用。其具有一個支持RNA酶H活性之中心區域，兩側為經化學修飾之末端，該等末端增加親和力及/或降低對核酸酶之易感性。在一些情況下，本發明之ASO為剪接轉換寡核苷酸(SSO) ( 例如諾西那生(nusinersen))。SSO通常被完全修飾以消除RNA酶H活性且允許在剪接過程中與核前mRNA相互作用。其可設計為與5’或3’剪接點或外顯子剪接增強子或緘默子位點結合。藉由與此等位點結合，其可藉由 例如促進外顯子之選擇使用、外顯子排除或外顯子包含來修飾剪接。
理想地，本發明之合成寡核苷酸( 例如ASO)應結合目標RNA轉錄本上之特定序列且為穩定的。合成寡核苷酸( 例如ASO)對於其所引入之細胞為外來的，因此其成為內源性核酸酶之靶標。為了使合成寡核苷酸在細胞中達到完成任務所需的持久性水準，通常需要保護其免受彼等內源性核酸酶的影響。合成寡核苷酸可藉由此項技術中已知的任何修飾進行修飾，包括但不限於磷酸二酯骨架之修飾、核糖2'OH基團處之修飾以及核糖環及核苷鹼基之修飾。例如，磷酸骨架之修飾可包括硫代磷酸酯(PS)修飾，其中非橋接磷氧經硫取代。此外，其他修飾包括二硫代磷酸酯及膦酰基乙酸酯。 參見例如以引用方式併入之美國專利第6,143,881號、第5,587,361號及第5,599,797號。其他修飾包括2'-O-甲基(2'OMe)、2'氟(2'F)、2'甲氧基乙基(2'-O-MOE)、2'氟阿拉伯糖基(FANA)、2'-H、2'-硫脲嘧啶、鎖核酸(LNA)、受約束乙基(cEt)、橋接核酸(BNA)、乙烯橋接核酸(ENA)、己糖醇核酸(HNA)、阿卓糖醇核酸(ANA)、環己烯核酸(CeNA)、解鎖核酸(UNA)、4'硫代(4'-S)及3'反向無鹼基端帽。在一些實施例中，可藉由用硼烷基磷酸酯(PB)鍵、膦酰基乙酸酯(Pac)鍵或硫代膦酰基乙酸酯骨架鍵取代天然磷酸二酯鍵來修飾核酸。在一些實施例中，核酸可包括超過一個修飾。在一些實施例中，核酸可包含超過兩個修飾。在一些情況下，合成寡核苷酸( 例如ASO)之修飾為以下中之至少一者：2'-O-甲基(2'OMe)修飾、2'氟(2'F)修飾、MOE修飾、2'氟阿拉伯糖基(FANA)修飾、2'-H修飾、2'-硫脲嘧碇修飾、鎖核酸(LNA)修飾、橋接核酸(BNA)修飾、乙烯橋接核酸(ENA)修飾、己糖醇核酸(HNA)修飾、阿卓糖醇核酸(ANA)修飾、環己烯核酸(CeNA)修飾、解鎖核酸(UNA)修飾、4'硫代(4'-S)修飾、硫醇鍵修飾及3'反向無鹼基端帽修飾。
在一些情況下，合成寡核苷酸( 例如ASO)具有一或多個硫代磷酸酯(PS)骨架修飾。此類修飾提高了血液及組織中之核酸酶的穩定性及保護作用。其亦促進蛋白質結合，且因此支持與白蛋白及其他血蛋白之相互作用，且以此方式延緩腎臟清除。此修飾支持RNA酶H活性，因此可用於間隙體及SSO。在某些情況下，ASO包含磷酸二酰胺化物嗎啉基寡聚體(PMO)及/或肽核酸(PNA)修飾。此類修飾產生中性骨架且提供對核酸酶之高抗性。由於此類修飾不支持RNA酶H活性，因此其主要用於SSO，而非間隙體。另一修飾為2’糖位置之改變。此類修飾包括2'-O-Me及2'-O-(2-甲氧基乙基) (MOE)修飾。此等修飾促進RNA樣構形且顯著增加與RNA之結合親和力，同時亦提供增強的核酸酶抗性。在2’位置經完全修飾之寡核苷酸不支持RNA酶H活性，且因此通常最適合於SSO。然而，可藉由使用「間隙體」來達成RNA酶H依賴性反義效應，該間隙體含有約7個殘基之中央未修飾區域，兩側為2’修飾區域。另一種對寡核苷酸有效之修飾為使用橋環。鎖核酸(LNA)化學及受約束乙基(cEt)以及三環DNA (tc-DNA)修飾涉及糖環橋接。此類修飾促進RNA樣結構、表現出核酸酶抗性且顯著提高結合親和力。此等修飾可用於間隙體及SSO。在某些實施例中，本發明之ASO包括一或多個上述修飾。在一些實施例中，本發明之ASO具有PS主鏈。在一些實施例中，本發明之ASO具有混合的PS及磷酸二酯主鏈。在某些實施例中，本發明之ASO具有一或多個2'-O-(2-甲氧基乙基) (MOE)修飾。在某些實施例中，本發明之ASO，所有殘基均具有MOE修飾。在某些實施例中，本發明之ASO包括一或多個cEt。在某些情況下，本發明之ASO之一或多個尿嘧啶經5-甲基-尿嘧啶替代。在某些情況下，本發明之ASO之所有尿嘧啶經5-甲基-尿嘧啶替代。在某些情況下，本發明之ASO之一或多個胞嘧啶經5-甲基-胞嘧啶替代。在某些情況下，本發明之ASO之所有胞嘧啶經5-甲基-胞嘧啶替代。
本發明所涵蓋之ASO之非限制性實例提供於表I中。 表 I：例示性反義寡核苷酸
反義寡核苷酸序列 設計 長度
5'- Me U Me CA Me C Me U Me U Me U Me CA Me UAA Me UG Me C Me UGG-3' ( SEQ ID NO:1) SSO 18
5'- G Me Co Me Co Ao GG MeCTGGTTATG Ao Me Co Me U Me CA-3' ( SEQ ID NO:2) 5-10-5間隙體 20
5'- G Me C Me UA Me U Me UA Me C Me C Me U Me UAA Me C Me C Me CAG-3' (SEQ ID NO:3) SSO 18
其中： 加底線之核苷具有2'-O-(2-甲氧基乙基) (MOE)修飾； 「o」為磷酸二酯核苷間鍵，且「o」之不存在表示硫代磷酸酯核苷間鍵； 「 MeU」為5-甲基-尿嘧啶；且 「 MeC」為5-甲基-胞嘧啶。
本發明所涵蓋之其他非限制性及例示性ASO提供於以下各者中：Evers等人, Advanced Drug Delivery Reviews, 87:90–103 (2015) ( 參見例如表2及其中引用之參考文獻)；Bennett等人, Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol., 61:831–52 (2021) ( 參見例如表1及其中引用之參考文獻)；Silva等人, Brain, 143; 407–429 (2020) ( 參見例如表2及其中引用之參考文獻)；US 10,385,341；US 9,683,235；及US 10,407,680，其全部內容均以引用方式整體併入本文中。
本文所述之ASO被封裝於聚合物奈米載劑( 例如PLGA)中。在某些情況下，本文所述之ASO與陽離子分子( 例如PEI)複合。 醫藥組合物
本文揭示之聚合物奈米粒子可與醫藥學上可接受之載劑組合以形成醫藥組合物。如熟習此項技術者將理解的，載劑可基於如下所述之投與途徑、目標問題的位置、遞送之藥物、藥物遞送之時程等來選擇。
可注射製劑，例如無菌可注射水性或油性懸浮液可使用適合之分散劑或濕潤劑及懸浮劑來調配。無菌可注射製劑亦可為在無毒的腸胃外可接受稀釋劑或溶劑中之無菌可注射溶液、懸浮液或乳液，例如作為在1,3-丁二醇中之溶液。可使用之可接受媒劑及溶劑包括水、林格氏溶液、USP及等張氯化鈉溶液。此外，無菌不揮發油通常用作溶劑或懸浮介質。為此目的，可使用任何溫和的不揮發油，包括合成甘油單酯或甘油二酯。此外，諸如油酸等脂肪酸用於製備注射劑。在一個實施例中，結合物懸浮於包含1% (w/v)羧甲基纖維素鈉及0.1% (v/v) TWEEN™80之載液中。可注射調配物可經滅菌，例如藉由經由細菌截留過濾器過濾，或藉由在投與前對可溶解或分散於無菌水或所選可注射稀釋劑中之固體組合物進行最終滅菌。
應理解，含有核酸試劑( 例如ASO)之聚合物奈米粒子之確切劑量由個別醫師鑒於待治療之患者來選擇，通常，調整劑量及投與以向正在治療的患者提供有效量之核酸試劑奈米粒子。如本文所用，含有核酸試劑( 例如ASO)之奈米粒子的「有效量」係指引發所需生物反應所必需的量。如一般熟習此項技術者將理解的，含有核酸試劑( 例如ASO)之聚合物奈米粒子( 例如PLGA奈米粒子)之有效量可根據諸如期望的生物學終點、待遞送之藥物、目標組織、投與途徑等因素而變化。例如，含有核酸試劑( 例如ASO)之聚合物奈米粒子之有效量可為使得腫瘤尺寸在所需時段內減小所需量的量。可能需要考慮的其他因素包括疾病狀態之嚴重程度；年齡；接受治療之患者的體重及性別；飲食、投與時間及頻率；藥物組合；反應敏感性；及對療法之耐受性/反應。
本發明之聚合物奈米粒子可調配成劑量單位形式以便於投與及劑量均勻性。如本文所用之表述「劑量單位形式」係指適合於待治療患者之奈米粒子之物理離散單位。然而，應理解，組合物之每日總用量將由主治醫師在合理的醫學判斷範圍內決定。對於任何奈米粒子，最初可在細胞培養分析或動物模型(通常為小鼠、兔、狗或豬)中估計治療有效劑量。動物模型亦用於達成所需濃度範圍及投與途徑。然後可使用此類資訊來確定適用於人類投與之劑量及途徑。奈米粒子之治療功效及毒性可藉由細胞培養物或實驗動物中之標準藥學程序來確定， 例如，ED 50(對50%群體治療有效之劑量)及LD 50(對50%群體致死之劑量)。毒性與治療作用之劑量比為治療指數，且其可表示為比率LD 50/ED 50。表現出大治療指數之醫藥組合物可在一些實施例中為有用的。自細胞培養分析及動物研究中獲得之資料可用於制定一系列供人類使用之劑量。
在一些實施例中，考慮適合於冷凍之組合物，包括本文揭示之聚合物奈米粒子，及適合於冷凍之溶液， 例如將糖，諸如單醣、二醣或多醣， 例如蔗糖及/或海藻糖，及/或鹽及/或環糊精溶液添加至奈米粒子懸浮液中。糖( 例如蔗糖或海藻糖)可用作 例如冷凍保護劑以防止粒子在冷凍時聚集。例如，本文提供包含複數種所揭示奈米粒子、蔗糖、離子鹵化物及水之奈米粒子調配物；其中奈米粒子/蔗糖/水/離子鹵化物為約3-40%/10-40%/20-95%/0.1-10% (w/w/w/w)或約5-10%/10-15%/80-90%/1-10% (w/w/w/w)。例如，此類溶液可包括如本文所揭示之奈米粒子、按重量計約5％至約20％之蔗糖及濃度為約10-100 mM之離子鹵化物，諸如氯化鈉。在另一實施例中，本文提供包含複數種所揭示奈米粒子、海藻糖、環糊精及水之奈米粒子調配物；其中奈米粒子/海藻糖/水/環糊精為約3-40%/1-25%/20-95%/1-25% (w/w/w/w)或約5-10%/1-25%/80-90%/10-15% (w/w/w/w)。 遞送方法
本發明提供將核酸( 例如寡核苷酸，諸如反義寡核苷酸)遞送至人類個體之中樞神經系統(CNS)的方法。由於血腦障壁(BBB)，進入CNS係一項艱難的任務。BBB由外被細胞及星形膠質細胞過程網路所支持之緊密連接內皮細胞構成，且小至蔗糖之分子無法穿透。寡核苷酸亦在很大程度上無法穿透BBB。
處理此遞送問題之一種方法為直接投與寡核苷酸。此可例如藉由鞘內注射來完成。當鞘內投與時，寡核苷酸在CNS中廣泛分佈，且被神經元及神經膠質細胞兩者吸收。
在某些情況下，藉由鞘內注射將包含核酸( 例如反義寡核苷酸)之聚合物奈米載劑( 例如PLGA奈米粒子)投與至人類個體。在一些情況下，鞘內注射為彈丸注射。在某些實施例中，反義寡核苷酸封裝於PLGA奈米粒子內。在一些情況下，反義寡核苷酸與陽離子分子( 例如PEI、殼聚醣、十六胺、月桂精胺酸或陽離子肽)複合。在一些情況下，PLGA奈米粒子之乳酸:乙醇酸比率在2:98至98:2範圍內。在某些情況下，PLGA奈米粒子包含比率選自由以下組成之群的乳酸:乙醇酸：2:98、3:97、4:96、5:95、6:94、7:93、8:92、9:91、10:90、11:89、12:88、13:87、14:86、15:85、16:84、17:83、18:82、19:81、20:80、21:79、22:78、23:77、24:76、25:75、26:74、27:73、28:72、29:71、30:70、31:69、32:68、33:67、34:66、35:65、36:64、37:63、38:62、39:61、40:60、41:59、42:58、43:57、44:56、45:55、46:54、47:53、48:52、49:51、50:50、51:49、52:48、53:47、54:46、55:45、56:44、57:43、58:42、59:41、60:40、61:39、62:38、63:37、64:36、65:35、66:34、67:33、68:32、69:31、70:30、71:29、72:28、73:27、74:26、75:25、76:24、77:23、78:22、79:21、80:20、81:19、82:18、83:17、84:16、85:15、86:14、87:13、88:12、89:11、90:10、91:9、92:8、93:7、94:6、95:5、96:4、97:4、98:2及100:0。
本發明提供聚合物奈米粒子載劑遞送，該等載劑以「快速」釋放動力學釋放其封裝之貨物( 例如ASO)。「快速」意指在鞘內注射聚合物奈米粒子載劑後約0.1小時至約1週內釋放貨物。在一些實施例中，貨物在鞘內注射聚合物奈米粒子載劑後7天、6天、5天、4天、3天、2天或1天內釋放。在其他實施例中，貨物在鞘內注射聚合物奈米粒子載劑後0.1小時、0.2小時、0.3小時、0.4小時、0.5小時、0.6小時、0.7小時、0.8小時、0.9小時、1小時、2小時、3小時、4小時、5小時、6小時、7小時、8小時、9小時、10小時、11小時、12小時、13小時、14小時、15小時、16小時、17小時、18小時、19小時、20小時、21小時、22小時、23小時、24小時、36小時或48小時內釋放。
本文揭示之組合物及遞送方法允許相對於游離的未調配ASO遞送增加遞送至人類個體腦部之核酸( 例如反義寡核苷酸)的量。
此外，相對於未調配之ASO遞送，本文揭示之組合物及遞送方法允許增加遞送之核酸( 例如ASO)在人類個體之CNS中存在及活躍的時間。
此外，相對於未調配之ASO遞送，本文揭示之組合物及遞送方法允許將核酸( 例如ASO)遞送至人類個體腦部的更深處。在一些情況下，相對於未調配之ASO遞送，更多的核酸(例如ASO)被遞送至人類個體腦部之紋狀體、丘腦、黑質及/或小腦。 治療方法
本發明提供治療有需要之人類個體之CNS病症的方法。該方法包括向該個體投與治療有效量的本文所述之聚合物奈米載劑組合物。在某些情況下，CNS病症為突觸核蛋白病或tau蛋白病。在某些情況下，CNS病症為脊髓性肌萎縮(SMA)、肌萎縮側索硬化症(ALS)、帕金森氏病、阿茲海默氏病、亨廷頓氏病、安格爾曼症候群、額顳葉癡呆(FTD)、克雅氏病、脊髓小腦共濟失調3型(SCA3)或門克氏病。在一些情況下，聚合物奈米載劑包含反義寡核苷酸，該反義寡核苷酸包含SEQ ID NO:1中所示之序列或由其組成。在一些情況下，聚合物奈米載劑進一步包含額外治療劑(例如小分子化合物)。在一些情況下，聚合物奈米載劑包含0.05 mg/kg至25 mg/kg之間的ASO劑量。在一些情況下，聚合物奈米載劑包含0.05 mg/kg至20 mg/kg之間的ASO劑量。在一些情況下，聚合物奈米載劑包含0.05 mg/kg至15 mg/kg之間的ASO劑量。在一些情況下，聚合物奈米載劑包含0.05 mg/kg至10 mg/kg之間的ASO劑量。在一些情況下，聚合物奈米載劑包含0.05 mg/kg至5 mg/kg之間的ASO劑量。在一些情況下，聚合物奈米載劑包含0.05 mg/kg至4 mg/kg之間的ASO劑量。在一些情況下，聚合物奈米載劑包含0.05 mg/kg至3 mg/kg之間的ASO劑量。在一些情況下，聚合物奈米載劑包含0.05 mg/kg至2 mg/kg之間的ASO劑量。在一些情況下，聚合物奈米載劑包含0.05 mg/kg至1 mg/kg之間的ASO劑量。醫療保健提供者可容易地確定治療有效量， 尤其係基於接受治療之人類個體之年齡、性別及疾病階段。在一些情況下，聚合物奈米載劑係藉由鞘內(IT)注射投與。在某些情況下，IT注射為彈丸注射。
在一種情況下，本發明提供一種治療人類個體之脊髓性肌萎縮(SMA)的方法。在另一情況下，提供一種方法，該方法在SMN1基因之兩個功能複本均缺失之人類個體中增加SMN2信使核糖核酸(mRNA)轉錄本中之外顯子7包含。在又一情況下，提供一種方法，用於在具有導致功能性SMN蛋白缺乏之SMN1基因突變的人類個體中增加SMN2信使核糖核酸(mRNA)轉錄本中之外顯子7包含。在此等方法之一個實施例中，藉由向人類個體之鞘內空間中注射CNS遞送組合物(例如PLGA奈米粒子)而對人類個體進行投與，該組合物包含可用於治療SMA之ASO ( 例如諾西那生)。在一個實施例中，封裝於投與至人類個體之聚合物奈米載劑中之反義寡核苷酸包含核鹼基序列 MeU MeCA MeC MeU MeU MeU MeCA MeUAA MeUG MeC MeUGG (SEQ ID NO:1)或由其組成，其中寡核苷酸之各核苷間鍵為硫代磷酸酯鍵，寡核苷酸之各核苷為2’-甲氧基乙基核苷， MeU為5-甲基-尿嘧啶，且 MeC為5-甲基胞嘧啶。
在某些情況下，鞘內注射係藉由彈丸注射。
提供以下實例以更好地說明主張之發明，且不應解釋為限製本發明之範疇。就提及具體材料而言，其僅出於說明目的，且不旨在限製本發明。熟習此項技術者可在不發揮創造性能力且不背離本發明之範疇的情況下開發等效方法或反應物。 實例 實例 1 ：研究 1 - 材料及方法研究1描述於實例1-6中。 材料●    PLGA丙交酯:乙交酯(50:50)，酯封端，平均100,000 Da ●    PLGA丙交酯:乙交酯(85:15)，酯封端，190,000-240,000 Da ●    PLGA L-丙交酯:乙交酯(5:95)，190,000-210,000 Da ●    聚乙烯亞胺(PEI)，線性，2.5 kDa，Sigma 764604 ●    乙酸乙酯 ●    Malat-1反義寡核苷酸： G Me Co M e Co Ao GG MeCTGGTTATG Ao Me Co Me U Me CA(SEQ ID NO:2)(其中「o」為磷酸二酯(若未標有「o」，則為硫代磷酸酯； MeU為5-甲基-尿嘧啶； MeC為5-甲基-胞嘧啶；且加底線之核苷為MOE)，7 kDa ●    磷酸鹽緩衝鹽水，1X，pH 7.4，Life Technologies 10010023 ●    聚乙烯醇 ●    改質聚醚砜中空纖維過濾器模組，750 kDa截止 ●    注射用水 ●    2% Brij S100界面活性劑 ●    蘋果酸緩衝液，pH 3 PLGA 奈米粒子製備方案
使用雙乳液溶劑蒸發技術製備負載Malat-1之聚(dl-丙交酯-共-乙交酯) (PLGA)粒子。三種不同類型之PLGA聚合物—PLGA丙交酯:乙交酯(50:50)、PLGA丙交酯:乙交酯(85:15)及PLGA丙交酯:乙交酯(5:95)—用於產生奈米粒子。由於三種聚合物之乳酸(LA)與乙醇酸(GA)之比不同，因此反義寡核苷酸(ASO)之釋放速率應不同，其中釋放最慢之奈米粒子係由於具有最高LA含量。
簡言之，聚乙烯醇(PVA)溶液係藉由將PVA溶解於磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)中而產生。將PLGA溶解於乙酸乙酯中。將聚乙烯亞胺(PEI)溶解於水中。將ASO溶解於pH 7.4之PBS中。ASO溶液及PEI溶液以一比一莫耳比混合在一起。PEI為帶正電聚合物，且與帶負電ASO複合以防止電荷排斥且允許封裝至帶負電PLGA中。接著將ASO-PEI複合物與PLGA溶液混合且進行超音波處理以產生油包水乳液。接著將該乳液添加至充當奈米粒子穩定劑之PVA溶液中，且進行超音波處理以產生水包油包水乳液。接著藉由蒸發移除乙酸乙酯。純化乳液，且使用PBS藉由切向流過濾(TFF)交換緩衝液。所得乳液藉由若干分析技術表徵，以量測粒子之尺寸、多分散性及ASO負載，且接著在-20℃下儲存，直至向動物投與。 實例 2 ：負載 ASO 之 PLGA 奈米粒子的表徵
此處呈現之結果概述當Malat-1 ASO封裝於粒子中時用每種類型之PLGA製成之奈米粒子的表徵。 表 1中所示之尺寸分佈表明用85:15 PLGA製成之粒子具有最大流體動力學直徑，而用PLGA 50:50製成之粒子具有最小流體動力學直徑。用85:15及5:95 PLGA製成之粒子接近中性，而用50:50製成之粒子為略負性的。大多數粒子之多分散性(PDI)小於0.3，表明粒度分佈窄。對各調配物進行三次量測，且報告了平均讀數。 表 1.含有Malat-1 ASO之PLGA奈米粒子調配物之尺寸分佈、多分散性及電荷
樣品 直徑 (nm) 多分散性指數 ζ 電位 (mV)
PLGA 85:15 437.7 0.23 -0.27
PLGA 50:50 355.1 0.34 -11
PLGA 5:95 389.9 0.28 -0.69
實例 3 ：奈米粒子中之 Malat-1 ASO 濃度
奈米粒子中Malat-1 ASO之濃度係藉由自粒子中提取ASO後在260 nm處之UV吸光度確定。UV讀數及對應ASO濃度如 表 2中所示。 表 2 ：PLGA調配物之負載能力
樣品 260 nm 處之吸光度 稀釋因子 ASO 濃度 (mg/mL)
PLGA 85:15 0.1816 700X 4.8
PLGA 50:50 0.3216 500X 5.8
PLGA 5:95 0.6514 200X 4.7
實例 4 ：自 PLGA 奈米粒子中活體外釋放 ASO
使用由5:95、50:50及85:15之三種不同PLGA組成製成的粒子研究負載ASO之奈米粒子的 活體外釋放動力學。釋放動力學係在開放系統中之SOTAX USB IV溶解裝置上進行。聚合物之機械及化學特性、溶脹行為、耐水解性及隨後的生物降解速率直接受PLGA結晶度影響，該結晶度進一步取決於共聚物鏈中之個別單體組分之莫耳比。當與PLA共聚時，結晶PGA會降低PLGA之結晶度，且從而提高水解及降解速率。兩組奈米粒子釋放ASO之結果可見於 圖 1中。6 mg/mL濃度之游離ASO (未封裝於奈米粒子中)用作對照。使用8 mL/min流動速率，發現用5:95 PLGA製成之奈米粒子釋放最快，其次是50:50及85:15。 實例 5 ：在小鼠腦室內遞送 PLGA 奈米粒子
比較未調配Malat-1 ASO相對於奈米粒子封裝之Malat-1在C57B6小鼠中之效果的功效研究係藉由將溶液腦室內(ICV)注射至小鼠中來進行。在五個不同組中之每一者中對10隻小鼠進行注射(總共50隻小鼠)：緩衝PBS對照組、未調配Malat-1 ASO組(50 µg)及三個PLGA奈米粒子組，其LA:GA比為85:15、50:50及5:95，含有大約50 µg Malat1 ASO。在ICV注射後追蹤動物1週。調配物耐受性良好，無可觀測的安全信號。 圖 2中示出CNS之各個區域的減弱水準。
在注射奈米粒子調配物之小鼠中，在腰脊髓區中觀測到顯著減弱。此表明Malat-1 ASO自奈米粒子中釋放且能夠作用於預期目標。與85:15及5:95 PLGA奈米粒子相比，給與50:50 LA:GA比率奈米粒子之動物尤其在腰椎皮質中表現出更高的減弱，表明與其他奈米粒子組相比，自50:50奈米粒子釋放之ASO具有更好的分佈且提供更有效的遞送。 實例 6 ：在大鼠中鞘內遞送 PLGA 奈米粒子
為了測試Malat-1 ASO在鞘內(IT)空間中之奈米粒子遞送，製備了相同調配物且向大鼠鞘內注射。與實例5中之小鼠ICV研究類似的實驗設計用於此大鼠研究。此實驗共使用了50隻大鼠，五個劑量群組各10隻大鼠：緩衝液PBS對照組、未調配Malat-1 ASO組(150 µg)及三個PLGA奈米粒子組，85:15、50:50及5:95。2週後處死大鼠，且量測CNS及腦部之不同區域中Malat-1表現的減弱百分比。注射溶液後在大鼠中未觀測到安全問題。在所有組之脊髓區域中大於90%之信號減弱( 圖 3)表明注射表現良好。
亦在腦部之不同區域，特別是大腦皮質中量測Malat-1之表現( 圖 4)。此資料表明，ASO係自PLGA粒子遞送且到達腦部之更深區域，諸如紋狀體。另外，此實驗表明經由IT注射投與係安全的。
總之，製備了具有三種不同釋放速率之ASO封裝奈米粒子，且藉由ICV注射將其注射至小鼠體內。此等小鼠中之減弱表明ASO自奈米粒子中釋放且仍具活性。此外，未注意到安全信號。將此等相同調配物鞘內注射至大鼠中。此等大鼠中之減弱進一步表明，ASO可自奈米粒子中釋放且到達腦部之更深區域。 實例 7： 研究 2 - 材料及方法研究2描述於實例7-11中。 材料●    PLGA丙交酯:乙交酯(50:50)，酯封端，平均100,000 Da ●    PLGA丙交酯:乙交酯(85:15)，酯封端，190,000-240,000 Da ●    PLGA L-丙交酯:乙交酯(5:95)，190,000-210,000 Da ●    聚乙烯亞胺(PEI)，線性，2.5 kDa，Sigma 764604 ●    乙酸乙酯 ●    Malat-1反義寡核苷酸： G Me Co M e Co Ao GG MeCTGGTTATG Ao Me Co Me U Me CA(SEQ ID NO:2) (其中「o」為磷酸二酯(若未標有「o」，則為硫代磷酸酯； MeU為5-甲基-尿嘧啶； MeC為5-甲基-胞嘧啶；且加底線之核苷為MOE)，7 kDa ●    磷酸鹽緩衝鹽水，1X，pH 7.4，Life Technologies 10010023 ●    聚乙烯醇 ●    改質聚醚砜中空纖維過濾器模組，750 kDa截止 ●    注射用水 PLGA 奈米粒子製備方案
使用雙乳液溶劑蒸發技術製備負載Malat-1 ASO之聚(dl-丙交酯-共-乙交酯) (PLGA)粒子。三種不同類型之PLGA聚合物—PLGA丙交酯:乙交酯(50:50)、PLGA丙交酯:乙交酯(85:15)及PLGA丙交酯:乙交酯(5:95)用於產生奈米粒子。
遵循實例1中之相同方案，且對ASO-PEI結合進行增強之預複合步驟。簡言之，將PLGA聚合物溶解於乙酸乙酯中且與PEI-ASO預複合物混合以形成油包水乳液。在製備初級乳液之前，藉由將PEI加熱至80℃且以300 rpm混合而將PEI溶解於去離子水中。將溶解之PEI溶液之溫度降至60℃以形成ASO-PEI預複合物。用2.5% w/v PVA溶液進一步乳化油包水乳液以形成水包油包水乳液。最終乳液在環境條件下攪拌18小時以移除溶劑。純化最終產物，且使用PBS藉由切向流過濾(TFF)交換緩衝液。此等所得奈米粒子藉由若干分析技術表徵，以量測尺寸、多分散性及ASO負載，且接著在-20℃下冷凍儲存，直至向動物投與。 實例 8 ：負載 ASO 之 PLGA 奈米粒子的表徵
粒子均小於300nm，PDI值低於0.25，表明單分散尺寸分佈(參見 表 3)。LA:GA比率為5:95之粒子具有最小流體動力學直徑(176 nm)，且LA:GA比率為85:15之粒子具有最大粒度(288.6 nm)。對於所有三種調配物均觀測到接近中性的電荷。 表 3.含有Malat-1 ASO之PLGA奈米粒子調配物之尺寸分佈、多分散性及電荷
樣品 直徑 (nm) 多分散性指數 ζ 電位 (mV)
PLGA 85:15 288.6 0.24 0.04
PLGA 50:50 236.9 0.16 -0.05
PLGA 5:95 176 0.11 -0.21
實例 9 ：奈米粒子中之 ASO 負載
藉由自奈米粒子中提取ASO且在SoloVPE上量測260 nm處之UV吸光度來測定奈米粒子中之Malat-1 ASO濃度的量。量測之ASO濃度展示於 表 4中。 表 4.PLGA調配物中之Malat-1濃度
樣品 ASO濃度(mg/mL)
PLGA 5:95 2.27
PLGA 50:50 2.26
PLGA 85:15 2.28
實例 10 ：自 PLGA 奈米粒子中 活體外釋放 ASO
使用呈閉環組態之全自動流通池溶解裝置(USP 4，Sotax)量測負載ASO之奈米粒子的 活體外釋放動力學。使用內徑為22.4 mm之池。使用波長為260 nm之UV分光光度計即時量測溶解液之ASO濃度。在該過程中溫度保持於37℃下。PBS溶解介質通過該等池之流動速率為16 mL/min。溶解裝置經由該等池泵送及再循環PBS，且當ASO自奈米粒子中釋放時，偵測到濃度變化。由此產生累積釋放曲線，且其在圖5中可見。濃度為2.9 mg/mL之未封裝ASO用作對照。發現以5:95 LA:GA比率製成之奈米粒子具有最快釋放。此係預期的，因為此聚合物具有最低LA濃度，且因此結晶度及疏水性最低。以85:15比率製成之奈米粒子由於其較高乙醇酸含量及較高親水性而具有最慢釋放。 實例 11 ：在大鼠中鞘內遞送 PLGA 奈米粒子
藉由鞘內注射溶液且量測不同腦組織切片中Malat-1基因之減弱，在Sprague-Dawley大鼠中測試了負載Malat-1 ASO之PLGA奈米粒子的基因調節作用。在五個不同組中之每一者中對十隻大鼠進行注射，包括緩衝液PBS對照組、未調配之游離Malat-1組(75 µg)及三個如上所述之奈米粒子組，85:15、50:50、5:95，均含有大約75 µg Malat-1。在IT注射後監測動物2週。調配物耐受性良好，無可觀測的安全問題。圖6中示出CNS之各個區域的減弱水準。所有組之脊髓區域中之減弱均超過90% (圖6)表明注射表現良好，因為注射成功後預期此區域中之減弱接近完全。皮質及紋狀體中之Malat-1減弱表明當粒子在CNS中分佈時，ASO自粒子中釋放(圖6)。與50:50及5:95相比，具有85:15組成之PLGA粒子顯示出較低減弱百分比。與未調配ASO之對照劑量相比，5:95及50:50粒子之減弱增加。
總之，將具有不同釋放速率之Malat-1 ASO封裝之PLGA奈米粒子鞘內投與至大鼠體內。與未調配ASO相比，具有快速及中等釋放速率之粒子表現出改善的減弱。 為了確認粒子降解速率對CNS中之ASO減弱的影響，對另一大鼠IT研究進行測試。 實例 12 ：研究 3 - 材料及方法研究3描述於實例12-15中。 材料●    PLGA丙交酯:乙交酯(50:50)，酯封端，平均40,000 Da ●    PLGA丙交酯:乙交酯(75:25)，酯封端，40,000 Da ●    PLA L-丙交酯，40,000 Da ●    聚乙烯亞胺(PEI)，線性，2.5 kDa，Sigma 764604 ●    乙酸乙酯 ●    Malat-1反義寡核苷酸： G Me Co M e Co Ao GG MeCTGGTTATG Ao Me Co Me U Me CA(SEQ ID NO:2) (其中「o」為磷酸二酯(若未標有「o」，則為硫代磷酸酯； MeU為5-甲基-尿嘧啶； MeC為5-甲基-胞嘧啶；且加底線之核苷為MOE)，7 kDa ●    磷酸鹽緩衝鹽水，1X，pH 7.4，Life Technologies 10010023 ●    Brij S100 % ●    改質聚醚砜中空纖維過濾器模組，500 kDa截止 ●    注射用水 ●    %10蔗糖 PLGA 奈米粒子製備方案
在此研究中，使用雙乳液溶劑蒸發技術製備負載Malat-1 ASO之PLGA奈米粒子。使用三種不同類型之PLGA聚合物—PLGA丙交酯:乙交酯(50:50)、PLGA丙交酯:乙交酯(75:15)及PLA丙交酯:乙交酯(100:0)。如先前所述，將PLGA聚合物溶解於乙酸乙酯中且與PEI-ASO (2.8:1)預複合物混合以形成油包水乳液。用0.2% w/v Brij S100 %溶液進一步乳化油包水乳液以形成水包油包水乳液。最終乳液在環境條件下攪拌18小時以移除溶劑。純化最終產物，且使用PBS藉由切向流過濾(TFF)交換緩衝液，且隨後添加至10%蔗糖調配物中以防止在冷凍/解凍循環期間發生任何非特異性聚集。此等所得奈米粒子藉由若干分析技術表徵，以量測尺寸、多分散性及ASO負載，且接著在-20℃下冷凍儲存，直至向動物投與。 實例 13 ： ASO 封裝之 PLGA 奈米粒子的表徵
由於PDI小於0.2，因此各批次之粒度均為一致的且分佈均勻( 表 5)。與其他調配物相比，PLGA 75:25組合物產生負電荷。 表 5.含有Malat-1 ASO之PLGA奈米粒子調配物之尺寸分佈、多分散性及電荷
樣品 直徑 (nm) 多分散性指數 ζ 電位 (mV)
PLGA 75:25 236 0.14 -9.88
PLGA 50:50 175 0.13 -2.91
PLA 223 0.15 1.27
實例 14 ：奈米粒子中之 ASO 濃度
藉由自奈米粒子中提取ASO且在SoloVPE上量測260 nm處之UV吸光度來測定奈米粒子中之Malat-1 ASO濃度的量。量測之ASO濃度展示於 表 6中。 表 6.PLGA調配物中之Malat-1濃度
樣品 ASO濃度(mg/mL)
PLGA 75:25 2.63
PLGA 50:50 2.73
PLA 2.65
實例 15 ：在大鼠中鞘內遞送 PLGA 奈米粒子
藉由鞘內注射溶液且量測不同腦組織切片中Malat-1基因之減弱，在Sprague-Dawley大鼠中測試了負載Malat-1之PLGA奈米粒子的減弱作用。在五個不同組中之每一者中對十隻大鼠進行注射，包括緩衝液PBS對照組、游離Malat-1組(75 µg)及三個如上所述之奈米粒子組，100:0、75:25、50:50，均含有大約75 µg Malat-1。在IT注射後使動物存活2週。調配物耐受性良好，無可觀測的安全問題。圖7中示出CNS之各個區域的減弱水準。所有組之脊髓區域中之減弱均超過90% (圖7)表明注射表現良好，因為注射成功後預期此區域中之減弱接近完全。皮質及紋狀體中之Malat-1減弱表明當粒子在CNS中分佈時，ASO自粒子中釋放(圖7)。與對應未調配ASO相比，所有奈米粒子調配物均在皮質及紋狀體中顯示類似的減弱率。結果表明，與未調配ASO相比，PLGA調配物提供了至少類似的治療。與未調配ASO及其他奈米粒子調配物相比，PLGA 50:50奈米粒子顯示甚至略高的功效。此研究亦證實經由IT投與安全地遞送PLGA奈米粒子。目前在囓齒動物中之鞘內投與方法僅顯示一個時間點來評估CNS中之減弱水準。因此，在接下來的研究中，吾人藉由使用即時成像方法確定CNS組織中之ASO攝取來研究PLGA奈米粒子之影響。 實例 16 ：研究 4 - 材料及方法研究4描述於實例16-19中。 材料●    PLGA丙交酯:乙交酯(50:50)，酯封端，平均200,000 Da ●    聚乙烯亞胺(PEI)，線性，2.5 kDa，Sigma 764604 ●    乙酸乙酯β-球蛋白反義寡核苷酸： G Me C Me UA Me U Me UA Me C Me C Me U Me UAA Me C Me C Me CAG(SEQ ID NO:3) (其中： 加底線之核苷具有2’-O-(2-甲氧基乙基) (MOE)修飾)，7 kDa ●    磷酸鹽緩衝鹽水，1X，pH 7.4，Life Technologies 10010023 ●    Brij S100 % ●    改質聚醚砜中空纖維過濾器模組，500 kDa截止 ●    %10蔗糖 PLGA 奈米粒子製備方案
使用PLGA丙交酯:乙交酯(50:50)與雙乳液溶劑蒸發技術製備負載β-球蛋白ASO之PLGA奈米粒子。將預複合β-球蛋白ASO-PEI溶液混合於2% Brij S100界面活性劑中，接著在100%下進行60秒超音波處理，且在80%下進行60秒超音波處理。藉由使用pH為3之蘋果酸緩衝液產生二級乳液，以增強初級乳液中預複合介質之穩定性，從而在PLGA粒子中達成目標ASO負載。接著，藉由在PBS中稀釋將最終溶液之pH調節至7.2。懸浮液藉由若干分析技術表徵，以量測粒子之尺寸、多分散性及ASO負載，且接著在用於動物之前儲存於-20℃下。 實例 17 ： β- 球蛋白 ASO 封裝之 PLGA 奈米粒子的表徵
使用先前用於Malat-1調配物之相同方法量測負載β-球蛋白ASO之PLGA奈米粒子的粒度。結果表明，負載β-球蛋白之奈米粒子約為264 nm，均勻分佈之PDI值為0.19。 實例 18 ：奈米粒子中之 β- 球蛋白 ASO 濃度
藉由自奈米粒子中提取ASO且在SoloVPE上量測260 nm處之UV吸光度來測定奈米粒子中封裝之β-球蛋白的濃度。測得的β-球蛋白ASO濃度為3.3 mg/mL。 實例 19 ：報告小鼠模型中之 活體內即時成像以評估 ASO 攝取
使用螢光素酶報告小鼠模型研究了負載ASO之奈米粒子的效力增益。AAV報告構築體旨在藉由生物發光成像讀出剪接校正。構築體中之螢光素酶報告基因被β-球蛋白內含子分裂，該內含子在存在β-球蛋白ASO之情況下剪接出來，引起螢光素酶基因之表現。在出生後第0天經由IV注射投與AAV構築體，以達成AAV在腦部之廣泛表現。在6-8周齡小鼠中，以等效於33 μg ASO之劑量ICV注射ASO調配物，且使用IVIS成像儀在多個時間點拍攝頭部上方之生物發光成像。在腹膜內注射D-螢光素受質之後10分鐘拍攝各影像。圖8示出在ASO投與前生物發光相對於基線值之倍數變化。在2周成像研究期間之任何給定時間點，給與封裝β-球蛋白之動物體內之生物發光信號顯著高於投與未調配ASO之彼等動物。結果證實，PLGA奈米粒子能夠在長時段內在腦部提供更快及更高的ASO攝取。 其他實施例
儘管本發明已結合其詳細描述進行了描述，但前述描述旨在說明且不限制由所附申請專利範圍之範疇限定的本發明之範疇。其他態樣、優點及修改在以下申請專利範圍之範疇內。
圖 1示出在2小時內以8 mL/min之流動速率按比例放大ASO負載製備之PLGA奈米粒子的藥物釋放曲線。 圖 2描繪向小鼠ICV注射奈米粒子之減弱水準。 圖 3示出在鞘內(IT)注射奈米粒子調配物後脊髓中之減弱。 圖 4說明在IT注射奈米粒子調配物後皮質及紋狀體中之減弱。 圖 5示出PLGA奈米粒子及游離ASO在48小時內之釋放曲線。 圖 6說明在T注射奈米粒子調配物後脊髓、小腦、皮質及紋狀體中之減弱。 圖 7描繪在IT注射奈米粒子調配物後脊髓、小腦、皮質及紋狀體中之減弱。 圖 8示出在報告小鼠模型中ICV注射奈米粒子調配物後腦部之螢光素酶強度。 

          <![CDATA[<110> 美商百健MA公司(BIOGEN MA INC.)]]>
          <![CDATA[<120> 向中樞神經系統之核酸遞送]]>
          <![CDATA[<130> 13751-0301TW1]]>
          <![CDATA[<140>]]>
          <![CDATA[<141>]]>
          <![CDATA[<150> 63/169,539]]>
          <![CDATA[<151> 2021-04-01]]>
          <![CDATA[<160> 3     ]]>
          <![CDATA[<170> PatentIn version 3.5]]>
          <![CDATA[<210> 1]]>
          <![CDATA[<211> 18]]>
          <![CDATA[<212> RNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221> 經修飾之_鹼基]]>
          <![CDATA[<222> (1)..(1)]]>
          <![CDATA[<223> 2'-O-(2-甲氧基乙基) 5-甲基-尿嘧啶]]>
          <![CDATA[<220>]]>
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          <![CDATA[<223> 硫代磷酸酯核苷間鍵]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221> 經修飾之_鹼基]]>
          <![CDATA[<222> (2)..(2)]]>
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          <![CDATA[<222> (2)..(3)]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
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          gcuauuaccu uaacccag                                                     18
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Claims (33)

  1. 一種中樞神經系統(CNS)遞送組合物，其包含聚合物奈米載劑及反義寡核苷酸，其中該反義寡核苷酸封裝於該聚合物奈米載劑內，且其中該反義寡核苷酸直接與陽離子分子預複合。
  2. 如請求項1之CNS遞送組合物，其中該聚合物奈米載劑選自由以下組成之群：聚(l-丙交酯)、聚(乙交酯)、聚(d,l-丙交酯) (PLA)、聚(二噁烷酮)、聚(d,l-丙交酯-共-l-丙交酯)、聚(d,l-丙交酯-共-乙交酯)、聚(乙交酯-共-三亞甲基碳酸酯)、聚(己內酯) (「聚己內酯」)、聚(d,l-丙交酯-共-乙交酯) (PLGA)、聚(二噁烷酮)聚(乙交酯-共-三亞甲基碳酸酯)以及其混合物。
  3. 如請求項1之CNS遞送組合物，其中該聚合物奈米載劑為PLGA。
  4. 如請求項3之CNS遞送組合物，其中該組合物為PLGA奈米粒子，該奈米粒子包含比率在2:98至100:0範圍內之乳酸:乙醇酸。
  5. 如請求項1至4中任一項之CNS遞送組合物，其中該陽離子分子為陽離子肽。
  6. 如請求項1至4中任一項之CNS遞送組合物，其中該陽離子分子為殼聚醣、十六胺或月桂精胺酸。
  7. 如請求項1至5中任一項之CNS遞送組合物，其中該陽離子分子為聚乙烯亞胺(PEI)。
  8. 如請求項7之CNS遞送組合物，其中該PEI為線性PEI或交聯PEI。
  9. 如請求項1至8中任一項之CNS遞送組合物，其進一步包含治療劑。
  10. 如請求項9之CNS遞送組合物，其中該治療劑選自由小分子、cDNA、mRNA、siRNA、miRNA、適體及核酶組成之群。
  11. 如請求項1至10中任一項之CNS遞送組合物，其經調配以用於鞘內遞送至人類個體。
  12. 如請求項1至11中任一項之CNS遞送組合物，其中該反義寡核苷酸為間隙體或剪接轉換反義寡核苷酸。
  13. 如請求項1至11中任一項之CNS遞送組合物，其中該反義寡核苷酸由SEQ ID NO:1中所示之核酸序列組成。
  14. 如請求項1至11中任一項之CNS遞送組合物，其中該反義寡核苷酸由18個連接的核苷組成，其中該寡核苷酸具有由核鹼基序列 MeU MeCA MeC MeU MeU MeU MeCA MeUAA MeUG MeC MeUGG (SEQ ID NO:1)組成之核鹼基序列，其中該寡核苷酸之各核苷間鍵為硫代磷酸酯鍵，該寡核苷酸之各核苷為2’-甲氧基乙基核苷， MeU為5-甲基-尿嘧啶，且 MeC為5-甲基胞嘧啶。
  15. 一種治療有需要之人類個體之CNS病症的方法，該方法包含向該人類個體投與治療有效量之如請求項1至14中任一項之CNS遞送組合物。
  16. 如請求項15之方法，其中該投與係藉由鞘內注射。
  17. 一種在有需要之人類個體中治療脊髓性肌萎縮(SMA)、在SMN1基因之兩個功能複本均缺失之人類個體中增加SMN2信使核糖核酸(mRNA)轉錄本中之外顯子7包含或在具有導致功能性SMN蛋白缺乏之SMN1基因突變的人類個體中增加SMN2信使核糖核酸(mRNA)轉錄本中之外顯子7包含之方法，該方法包含藉由注射向該人類個體之鞘內空間中投與如請求項14之CNS遞送組合物。
  18. 如請求項15至17中任一項之方法，其中該注射為彈丸注射。
  19. 一種將反義寡核苷酸遞送至人類個體之CNS的方法，該方法包含藉由鞘內注射投與封裝於PLGA奈米粒子內之該反義寡核苷酸，其中該PLGA奈米粒子之乳酸:乙醇酸比在2:98至100:0範圍內，且其中該反義寡核苷酸與PEI或另一陽離子分子預複合。
  20. 如請求項19之方法，其中該人類個體患有CNS病症。
  21. 如請求項20之方法，其中該CNS病症為SMA、ALS、帕金森氏病(Parkinson’s disease)、阿茲海默氏病(Alzheimer’s disease)、亨廷頓氏病(Huntington’s disease)、安格爾曼症候群(Angelman syndrome)、額顳葉癡呆(FTD)、克雅氏病(Creutzfeldt–Jakob disease)、脊髓小腦共濟失調3型(SCA3)、門克氏病(Menkes disease)、突觸核蛋白病或tau蛋白病。
  22. 如請求項19至21中任一項之方法，其中在投與後0.1小時至1週將該反義寡核苷酸遞送至該人類個體之CNS。
  23. 如請求項19至21中任一項之方法，其中在投與後1天至6天將該反義寡核苷酸遞送至該人類個體之CNS。
  24. 如請求項19至21中任一項之方法，其中在投與後0.1小時至48小時內將該反義寡核苷酸遞送至該人類個體之皮質。
  25. 如請求項19至21中任一項之方法，其中在投與後6小時內將該反義寡核苷酸遞送至該人類個體之紋狀體。
  26. 如請求項19至25中任一項之方法，其中該另一陽離子分子為陽離子肽、殼聚醣、十六胺或月桂精胺酸。
  27. 如請求項19至25中任一項之方法，其中該PEI為線性PEI或交聯PEI。
  28. 一種相對於水性緩衝液中反義寡核苷酸溶液之遞送增加遞送至有需要之人類個體腦部之該反義寡核苷酸之量的方法，該方法包含鞘內注射封裝該反義寡核苷酸之PLGA奈米粒子，其中該反義寡核苷酸與PEI或另一陽離子分子預複合，且其中該PLGA奈米粒子之乳酸:乙醇酸比在2:98至100:0範圍內。
  29. 一種相對於水性緩衝液中之反義寡核苷酸溶液將該反義寡核苷酸遞送至人類個體腦部更深處的方法，該方法包含鞘內注射封裝該反義寡核苷酸之PLGA奈米粒子，其中該反義寡核苷酸與PEI或另一陽離子分子預複合，且其中該PLGA奈米粒子之乳酸:乙醇酸比在2:98至100:0範圍內。
  30. 如請求項29之方法，其中相對於該水性緩衝液中之該反義寡核苷酸溶液，更多的該反義寡核苷酸被遞送至腦部之紋狀體、丘腦、黑質及/或小腦。
  31. 一種相對於水性緩衝液中之反義寡核苷酸溶液減少向人類個體之脊髓及/或腦部投與該反義寡核苷酸之次數的方法，該方法包含鞘內注射封裝該反義寡核苷酸之PLGA奈米粒子，其中該反義寡核苷酸與PEI或另一陽離子分子預複合，且其中該PLGA奈米粒子之乳酸:乙醇酸比在2:98至100:0範圍內。
  32. 如請求項28至31中任一項之方法，其中該PEI為線性PEI或交聯PEI。
  33. 如請求項28至31中任一項之方法，其中該另一陽離子分子為陽離子肽、殼聚醣、十六胺或月桂精胺酸。
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