CN104101662B - 一种检测新鲜烟叶萜类化合物代谢组学方法 - Google Patents
一种检测新鲜烟叶萜类化合物代谢组学方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN104101662B CN104101662B CN201410375770.4A CN201410375770A CN104101662B CN 104101662 B CN104101662 B CN 104101662B CN 201410375770 A CN201410375770 A CN 201410375770A CN 104101662 B CN104101662 B CN 104101662B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- sample
- tobacco
- tobacco leaves
- terpenoids
- terpene
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Abstract
一种检测新鲜烟叶萜类化合物代谢组学方法，其特征在于：将采集后的鲜烟叶进行冷冻干燥、磨碎，用两步法进行提取，第一步用溶剂萃取法，提取游离的萜类；第二步采用碱裂解法提取结合型的萜类，两步提取合并后进行衍生化，最终样品利用GC-MS全扫描方法同SD全扫描方法进行分析。本发明的突出优点是建立了一种基于GC-MS QQQ平台的烟草萜类物质代谢组方法，该方法可检测到烟草中15种萜类物质，该方法精密度，回收率及样品稳定性均符合检测要求，并且方法简单、高效且重现性好，植物萜类方法检测尚无统一标准，该方法建立对于研究烟草萜类物质代谢具有重要意义。
Description
技术领域
本发明涉及新鲜烟叶的分析检测领域，具体是一种检测新鲜烟叶萜类化合物代谢组学方法，该方法操作灵敏度高、特异性强，能够一次性检测新鲜烟叶中15种萜类代谢物，该技术可以应用于烟草及茄科代谢组学及功能基因组研究。
背景技术
萜类化合物是植物中重要次生代谢物之一，在初生代谢中萜类物质具有重要的生理功能，如质体醌和泛醌（辅酶Q）作为植物电子传递链中重要中间物质，类固醇是细胞膜重要组分，维持着细胞膜的流动性，同时是植物激素代谢的重要调控物质；很多萜类物质与植物抗病密切相关（如植物三萜）；作为次生代谢产物，萜类主要作为药物（如青蒿素）、香味物质（圆柚酮）、印染原料（虾青素）等。
烟草中萜类物质除了具有抗病功效，主要与烟草香气品质密切相关，它们是烟草重要的香气前体物，其降解产物是烟草最重要的香气来源。由异戊二烯为单位构成的萜类化合物，是迄今发现在功能和结构上种类最多、分布最广泛的一类植物代谢物，已鉴定出几万个。挥发性类萜物质在植物对环境胁迫的适应、植物间的相互竞争和协同进化、植物抵抗昆虫危害、草食性动物的采食及病原微生物的侵袭等过程中具有着重要作用；二萜及以上的化合物一般不具有挥发性，常以树脂等形式存在于植物体内。烟草萜类物质与烟草抗逆性、品质形成关系密切，一直是烟草次生代谢研究的热点和难点。与烟叶品质密切相关的萜类代谢物主要包括倍半萜、二萜、三萜和四萜，同时还包含萜酯、甾醇酯、萜苷等物质。
国内外关于烟草萜类物质的分离、鉴定及检测取得了一定进展，但是仍然不能满足研究需求及生产实践。目前，尚缺乏对于烟草萜类代谢物进行全面检测分析的方法体系，国内部分研究者建立了应用液质系统对调制后烟叶进行研究，二萜及以上的萜类物质挥发性差，在液质上响应较弱，同时萜类物质商品化标准品较少，在液质系统难以进行定性分析，不能对烟草萜类物质进行全面检测。目前国内外集中开展的烟草基因组学及代谢组学研究需要对新鲜烟叶萜类代谢物进行全面分析，以期阐明烟草萜类的代谢规律及调控机制。因此，目前基础研究及生产实践都亟需建立新鲜烟叶萜类物质检测分析方法。
发明内容
本发明目的正是针对目前技术状况而提供一种相对系统、灵敏度高、特异性强的检测鲜烟叶中萜类物质代谢组学方法。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：一种检测新鲜烟叶萜类化合物代谢组学方法，按照鲜烟叶制备技术标准进行样品采集，采集后鲜烟叶进行冷冻干燥、磨碎，用两步法进行提取，第一步用溶剂萃取法，提取游离的萜类；第二步采用碱裂解法提取结合型的萜类，两步提取合并后进行衍生化，最终样品检测利用GC-QQQ所建立的MRM(多方应检测模式)进行检测分析。
具体步骤如下：
(1)第一步溶剂提取，该步骤主要用于提取游离萜类物质：称取20 mg左右冻干后烟草样品，放入2 ml离心管，加入提取溶剂正己烷1.5 ml；加入内标氘代十八烷酸（D35-stearic acid）20 μl，内标浓度2 mg/ml；室温下超声提取20 min；12000转/分钟离心10 min，上清转移到2 ml样品瓶，氮气吹干；
(2) 第二步碱裂解法提取结合型的萜类：第一步离心后沉淀加入1.2 ml溶液，该溶液包含80%甲醇和20% 氢氧化钾，70℃，振荡提取30 min，12000 转/分钟离心10 min，上清转移到新的 2ml离心管，沉淀加入1ml 正己烷，涡旋振荡10 s，12000 转/分钟离心10 min，上清正己烷转移到另一2 ml 离心管中，沉淀重复萃取两次，萃取后上清正己烷加入1ml饱和NaCl溶液洗涤，洗涤后正己烷全部合并到第一步溶剂提取最终的2 ml样品瓶中，再次用氮气吹干，加入200μl氯仿溶解样品瓶中萜类成分，取50μl于新的样品瓶，氮气吹干后进行衍生化；
(3)衍生化：50μl氮气吹干样品加入80 μl MSTFA（N-甲基-N-（三甲基硅烷）三氟乙酰胺），60℃，反应30 min，最终样品进行GC-MS全扫方式检测；
(4)检测：用GC-QQQ-MS进行检测分析，条件如下：
色谱柱： DB-35MS； 载气，He； 流速：1mL/min；进样口温度：250度；进样量：1ul；分流比为5:1 ；升温程序：起始温度60，3min；25℃/min 到 210℃；0.8℃/min到220℃；15℃/min到310℃，持续13min。后运行3min。
质谱条件（MS）：离子源-70eV，质谱扫描范围:50-600，离子源温度：250℃，扫描速度:200ms。
多反应检测（MRM）方法: GC-QQQ所建立的MRM是仪器分析的黄金标准，三重串联四极杆质谱可以大幅度降低甚至消除影响 SIM 方法准确度和检测限的基质干扰，这个被称为多反应监测模式 (MRM) 的过程与 SIM 相比有两个基本的优势，首先，检测基于次级“碎片离子”，碎片离子是由分析物的“母离子”在第一个四极杆 Q1 中由一个SIM 装置碰撞解离产生，与 SIM 有同样的选择性，但能很大程度上保证产生的碎片离子中至少有一个是母离子特有的而非干扰物产生的离子。MRM 选择性的提高是与 SIM 相比基线漂移明显减少。其次，在 Q1的质谱过滤过程中，样品中所有低质荷比的离子都被过滤掉，从碰撞解离过程中产生的唯一的碎片离子就能在“零噪声”色谱范围进行检测。将特定碎片离子（高选择性）与背景噪声的消除结合，使得 MRM 即使检测复杂基质时仍能保证很低的检测限。
| 化合物名称 | 保留时间（min） | 母离子 | 子离子 | 碰撞能量（eV） |
| t,t-farnesol（法尼醇） | 12.058 | 135 | 107, 93 | 5 |
| Phytol（叶绿醇） | 17.057 | 123 | 87，67 | 10 |
| D35-stearic acid（氘代十八烷酸） | 18.981 | 376 | 136,76 | 20 |
| beta-4,8,13-cembratriene-1,3-diol | 19.696 | 156 | 141,73 | 5 |
| alpha-4,8,13-cembratriene-1,3-diol | 20.162 | 156 | 141,73 | 5 |
| Sclareol（香紫苏醇） | 21.301 | 156 | 141,73 | 5 |
| Isosclareol（异硬尾醇） | 22.481 | 156 | 141,73 | 5 |
| Squalene（鲨烯） | 27.758 | 149 | 107,93 | 10 |
| 2,3-oxidosqualene（环氧化氧鲨烯） | 29.094 | 135 | 107,93 | 10 |
| Cholesterol（胆固醇） | 30.496 | 329 | 121,109 | 15 |
| Ergosterol（麦角甾醇） | 31.345 | 363 | 239,157 | 5 |
| Campesterol（油菜甾醇） | 31.537 | 255 | 173,159 | 10 |
| Stigmasterol（ 豆甾醇） | 31.918 | 255 | 173,159 | 10 |
| chenodeoxycholic acid（鹅去氧胆酸） | 32.143 | 255 | 173,159 | 15 |
| beta-sitosterol（β-谷甾醇） | 32.529 | 396 | 255,213 | 15 |
| beta-amyrin（β- 香树脂醇） | 32.839 | 218 | 203,189 | 10 |
| alpha-amyrin（α- 香树脂醇） | 33.328 | 218 | 203,189 | 10 |
本发明的突出优点是建立了两步法提取烟草游离和结合萜类的提取方法，该方法提取萜类种类较多，且方法简便，安全性高；同时建立了一种基于GC-MS QQQ平台的烟草萜类物质代谢组方法，该方法可检测到20种标准的萜类物质，其中烟草中存在15种，另外，该方法建立了未知解构的烟草萜类物质MRM检测方法。该方法灵敏度高、特异性强，精密度，回收率及样品稳定性均符合检测要求，填补了目前植物萜类检测无统一标准的空白，对于研究烟草及其他茄科作物的萜类物质代谢具有重要意义。
附图说明
图1 为本发明的测定步骤流程图。
图2 为本发明标准品色谱分离图。
图3 为本发明实际检测样品色谱图。
具体实施方式
本发明结合实例进行进说明，但不限制本发明。
1） 首次提取：称取 20mg 左右的冻干后的烟草样品，于进口2ml 离心管。加入提取溶剂正己烷1.5 ml；加入内标D35-stearic acid （2mg/ml）20 μl；室温下超声提取20min；提取液120000 转/分钟，离心10min。将上清液转移到新的Agilent 2 ml样品瓶中，并用氮气吹干。
2） 二次提取：将1）中提取后的残渣，加入1.2 ml (80％甲醇，20％ 氢氧化钾)溶液，70℃、振荡提取30 min。提取液12 000 转/分钟，离心10 min，将上清转移到新的2 ml离心管①中；加入1 ml 正己烷到下层残渣中，涡旋，随后12 000 转/分钟，离心10min。将上清转移到离心管①中合并，进行萃取。涡旋6 s，12 000 转/分钟，离心1 min。上清正己烷转移到新的离心管中，重复萃取2 次。在离心管中加入1ml 饱和NaCl 溶液洗涤，洗涤后的正己烷合并到首次提取的2 ml样品瓶中，并用氮气吹干。
3） 衍生化：加入200μl 氯仿溶解样品瓶中的萜类成分，取50μl 到新的样品瓶，氮气吹干样品，加入50μl MSTFA， 60℃，反应30min。
采用GC-QQQ-MS 平台进行采用SD扫描方式进行样品分析分析，相应条件如前面所列。其中15个标准物质可以在样品中检测到。
Claims (2)
1.一种检测新鲜烟叶萜类化合物代谢组学方法，其特征在于：将采集后的鲜烟叶进行冷冻干燥、磨碎，用两步法进行提取，第一步用溶剂萃取法，提取游离的萜类；第二步采用碱裂解法提取结合型的萜类，两步提取合并后进行衍生化，最终样品利用GC-MS 全扫描方法同SD全扫描方法进行分析，具体步骤如下：
第一步溶剂提取：称取20 mg左右冻干后烟草样品，放入2 ml离心管，加入提取溶剂正己烷1.5 ml；加入内标氘代十八烷酸（D35-stearic acid）20 μl，内标浓度2 mg/ml；室温下超声提取20 min；12000转/分钟离心10 min，上清转移到2 ml样品瓶，氮气吹干；
第二步碱裂解法提取结合型的萜类：第一步离心后沉淀加入1.2 ml溶液，该溶液包含80%甲醇和20% 氢氧化钾，70℃，振荡提取30 min，12000 转/分钟离心10 min，上清转移到新的 2ml离心管，沉淀加入1ml 正己烷，涡旋振荡10 s，12000 转/分钟离心10 min，上清正己烷转移到另一2 ml 离心管中，沉淀重复萃取两次，萃取后上清正己烷加入1ml饱和NaCl溶液洗涤，洗涤后正己烷全部合并到第一步溶剂提取最终的2 ml样品瓶中，再次用氮气吹干，加入200μl氯仿溶解样品瓶中萜类成分，取50μl于新的2 ml样品瓶，氮气吹干后进行衍生化；
衍生化：50μl氮气吹干样品加入80 μl MSTFA（N-甲基-N-（三甲基硅烷）三氟乙酰胺），60℃，反应30 min，最终样品进行GC-MS全扫方式检测；
检测：用GC-QQQ-MS进行检测分析，条件如下：
色谱柱： DB-35MS； 载气，He； 流速：1mL/min；进样口温度：250度；进样量：1ul；分流比为5:1 ；升温程序：起始温度60，3min；25℃/min 到 210℃；0.8℃/min到220℃；15℃/min到310℃，持续13min，后运行3min；
质谱条件（MS）：离子源-70eV，质谱扫描范围:50-600，离子源温度：250℃，扫描速度:200ms；
多反应检测（MRM）方法。
2.根据权利要求1所述的检测新鲜烟叶萜类化合物代谢组学方法，其特征在于：鲜烟叶样品采集时按照《鲜烟叶样品的制备 液氮法》标准。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201410375770.4A CN104101662B (zh) | 2014-08-01 | 2014-08-01 | 一种检测新鲜烟叶萜类化合物代谢组学方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201410375770.4A CN104101662B (zh) | 2014-08-01 | 2014-08-01 | 一种检测新鲜烟叶萜类化合物代谢组学方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN104101662A CN104101662A (zh) | 2014-10-15 |
| CN104101662B true CN104101662B (zh) | 2015-07-08 |
Family
ID=51669985
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201410375770.4A Active CN104101662B (zh) | 2014-08-01 | 2014-08-01 | 一种检测新鲜烟叶萜类化合物代谢组学方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN104101662B (zh) |
Families Citing this family (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104569215B (zh) * | 2015-01-28 | 2016-03-16 | 无锡市人民医院 | 一种测定血浆中香紫苏醇浓度的方法 |
| CN106290605B (zh) * | 2016-07-22 | 2018-06-12 | 云南中烟工业有限责任公司 | 一种烟草中倍半萜类化合物的测定方法 |
| CN106018626A (zh) * | 2016-07-29 | 2016-10-12 | 云南省烟草农业科学研究院 | 一种基于气相色谱质谱的烟草柱头代谢组学分析方法 |
| CN106018654A (zh) * | 2016-07-29 | 2016-10-12 | 云南省烟草农业科学研究院 | 一种基于气相色谱质谱的烟草花柱代谢组学分析方法 |
| CN106018627A (zh) * | 2016-07-29 | 2016-10-12 | 云南省烟草农业科学研究院 | 一种基于气相色谱质谱的烟草花粉代谢组学分析方法 |
| CN106248836B (zh) * | 2016-09-30 | 2018-06-15 | 中国烟草总公司郑州烟草研究院 | 一种基于挥发性代谢物的烟草代谢组学中新鲜烟叶样品质量的判别方法 |
| CN106324145B (zh) * | 2016-09-30 | 2018-06-15 | 中国烟草总公司郑州烟草研究院 | 一种基于萜类的烟草代谢组学中新鲜烟叶样品质量的判别方法 |
Citations (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101131378A (zh) * | 2007-09-29 | 2008-02-27 | 中国烟草总公司郑州烟草研究院 | 烟叶或烟丝中挥发性和半挥发性有机酸的测定方法 |
| CN101178390A (zh) * | 2007-12-12 | 2008-05-14 | 中国烟草总公司郑州烟草研究院 | 利用气相色谱-质谱联用测定烟草及烟草制品中西柏烷二萜醇的方法 |
| CN101178391A (zh) * | 2007-12-12 | 2008-05-14 | 中国烟草总公司郑州烟草研究院 | 适用于直接测定烟草及烟草制品中西柏烷二萜醇的衍生化试剂 |
| CN102520079A (zh) * | 2011-11-18 | 2012-06-27 | 贵州省烟草科学研究所 | 一种利用uplc快速测定烟叶中茄尼醇含量的方法 |
| CN102565233A (zh) * | 2012-01-18 | 2012-07-11 | 中国烟草总公司郑州烟草研究院 | 一种用于测定新鲜烟叶中挥发、半挥发次生代谢物的方法 |
| CN102590412A (zh) * | 2012-01-18 | 2012-07-18 | 中国烟草总公司郑州烟草研究院 | 一种检测新鲜烟叶中次生代谢物的衍生化gc-ms方法 |
| CN103399102A (zh) * | 2013-07-08 | 2013-11-20 | 中国农业科学院烟草研究所 | 一种测定烟草及烟草制品总茄尼醇的方法 |
| CN103713072A (zh) * | 2014-01-06 | 2014-04-09 | 中国烟草总公司郑州烟草研究院 | 一种gc-ms靶向性烟草样品甾醇提取方法 |
-
2014
- 2014-08-01 CN CN201410375770.4A patent/CN104101662B/zh active Active
Patent Citations (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101131378A (zh) * | 2007-09-29 | 2008-02-27 | 中国烟草总公司郑州烟草研究院 | 烟叶或烟丝中挥发性和半挥发性有机酸的测定方法 |
| CN101178390A (zh) * | 2007-12-12 | 2008-05-14 | 中国烟草总公司郑州烟草研究院 | 利用气相色谱-质谱联用测定烟草及烟草制品中西柏烷二萜醇的方法 |
| CN101178391A (zh) * | 2007-12-12 | 2008-05-14 | 中国烟草总公司郑州烟草研究院 | 适用于直接测定烟草及烟草制品中西柏烷二萜醇的衍生化试剂 |
| CN102520079A (zh) * | 2011-11-18 | 2012-06-27 | 贵州省烟草科学研究所 | 一种利用uplc快速测定烟叶中茄尼醇含量的方法 |
| CN102565233A (zh) * | 2012-01-18 | 2012-07-11 | 中国烟草总公司郑州烟草研究院 | 一种用于测定新鲜烟叶中挥发、半挥发次生代谢物的方法 |
| CN102590412A (zh) * | 2012-01-18 | 2012-07-18 | 中国烟草总公司郑州烟草研究院 | 一种检测新鲜烟叶中次生代谢物的衍生化gc-ms方法 |
| CN103399102A (zh) * | 2013-07-08 | 2013-11-20 | 中国农业科学院烟草研究所 | 一种测定烟草及烟草制品总茄尼醇的方法 |
| CN103713072A (zh) * | 2014-01-06 | 2014-04-09 | 中国烟草总公司郑州烟草研究院 | 一种gc-ms靶向性烟草样品甾醇提取方法 |
Non-Patent Citations (5)
| Title |
|---|
| GC-MS分析生长过程中不同品种烟叶弱极性物质的变化;李方楼 等;《江苏农业科学》;20110531;第39卷(第5期);418-421 * |
| Zhang, Li;Wang, Xiaoyu;Guo, Jizhao.Metabolic Profiling of Chinese Tobacco Leaf of Different Geographical Origins by GC-MS.《JOURNAL OF AGRICULTURAL AND FOOD CHEMISTRY》.2013,第61卷(第11期),2597-2605. * |
| Zhao, Yanni;Zhao, Chunxia;Lu, Xin.Investigation of the Relationship between the Metabolic Profile of Tobacco Leaves in Different Planting Regions and Climate Factors Using a Pseudotargeted Method Based on Gas Chromatography/Mass Spectrometry.《JOURNAL OF PROTEOME RESEARCH》.2013,第12卷(第11期),5072-5083. * |
| 不同氮素水平下内生真菌印度梨形孢定殖对烟草生长发育及物质代谢的影响;王衬 等;《烟草科技》;20140531(第5期);材料与方法部分第1.5节 * |
| 国家烟草专卖局.试验材料.《YC/T 510-2014 鲜烟叶样品的制备 液氮法》.中国标准出版社,2014,第1.3节. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN104101662A (zh) | 2014-10-15 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN104101662B (zh) | 一种检测新鲜烟叶萜类化合物代谢组学方法 | |
| CN102393438B (zh) | 同时测定玩具中16种醛酮类致敏性芳香剂残留量的方法 | |
| Yan et al. | Rapid and global detection and characterization of aconitum alkaloids in Yin Chen Si Ni Tang, a traditional Chinese medical formula, by ultra performance liquid chromatography–high resolution mass spectrometry and automated data analysis | |
| CN104297377B (zh) | 一种植物甾醇的检测分析方法 | |
| CN104965042B (zh) | 地表水体中若干种痕量糖皮质激素及其衍生物的检测方法 | |
| Fu et al. | Multi-responses extraction optimization based on response surface methodology combined with polarity switching HPLC–MS/MS for the simultaneous quantitation of 11 compounds in Cortex Fraxini: Application to four species of Cortex Fraxini and its 3 confusable species | |
| CN110161165A (zh) | 一种同时检测头发中多环芳烃及其羟基代谢物水平的分析方法 | |
| CN111249321A (zh) | 一种同时制备黑穗醋栗多酚及多糖的方法 | |
| Li et al. | Ultra-high performance liquid chromatography/ion mobility time-of-flight mass spectrometry-based untargeted metabolomics combined with quantitative assay unveiled the metabolic difference among the root, leaf, and flower bud of Panax notoginseng | |
| CN103823033A (zh) | 一种白酒中风味化合物的分析检测方法 | |
| CN110849993B (zh) | 一种油茶籽油皂苷类化合物结构推测方法 | |
| CN110715994B (zh) | 用UHPLC-Q-Orbitrap MS分析酸枣仁和理枣仁差异性化学成分的方法 | |
| Huang et al. | Use of liquid chromatography–atmospheric pressure chemical ionization‐ion trap mass spectrometry for identification of oleanolic acid and ursolic acid in Anoectochilus roxburghii (wall.) Lindl | |
| CN103713072B (zh) | 一种gc-ms靶向性烟草样品甾醇提取方法 | |
| CN112114079B (zh) | 一种同时检测使君子中9种化学成分的方法 | |
| CN103105438A (zh) | 同时测定玩具中13种酚醇类致敏性芳香剂残留量的方法 | |
| CN105954430A (zh) | 一种血清胆固醇氧化物的检测方法 | |
| CN104330496A (zh) | 食用植物油中9种营养物的检测方法 | |
| CN105259266A (zh) | 检测啤酒和麦汁中的四种麦香类风味物质的方法 | |
| Wang et al. | Determination of 5α-androst-16-en-3α-ol in truffle fermentation broth by solid-phase extraction coupled with gas chromatography–flame ionization detector/electron impact mass spectrometry | |
| CN103030678B (zh) | 一种利用丙二酰基人参皂苷制备人参稀有皂苷的方法 | |
| CN107238666B (zh) | 一种刺柏挥发性成分的gc-ei/ms分析方法 | |
| Xue et al. | Fast screening and identification of illegal adulterated glucocorticoids in dietary supplements and herbal products using UHPLC-QTOF-MS with all-ion fragmentation acquisition combined with characteristic fragment ion list classification | |
| Lee et al. | Discrimination of Korean ginseng (Panax ginseng) roots using rapid resolution LC-QTOF/MS combined by multivariate statistical analysis | |
| CN104215494B (zh) | 一种利用花粉作为固相萃取剂的样品前处理方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant |