CN106248836B - 一种基于挥发性代谢物的烟草代谢组学中新鲜烟叶样品质量的判别方法 - Google Patents

一种基于挥发性代谢物的烟草代谢组学中新鲜烟叶样品质量的判别方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种基于挥发性代谢物的烟草代谢组学中新鲜烟叶样品质量的判别方法，其特征在于：采用气相色谱串联质谱对新鲜烟叶样品中十五醛和维生素E含量进行相对定量分析，计算其比值，对代谢组学研究中的新鲜烟叶样品质量进行判别，本发明具有准确可靠，简单可行的优点，可为烟草代谢特征分析及相关烟草代谢组学研究提供借鉴。

Description

一种基于挥发性代谢物的烟草代谢组学中新鲜烟叶样品质量 的判别方法
技术领域
本发明涉及分析化学领域，具体说是涉及一种判别烟草代谢组学研究所用的新鲜烟叶样品质量是否满足代谢组学研究需要的判别方法。
背景技术
植物代谢组学是通过考察植物受刺激或扰动后代谢产物的变化或其随时间的变化，来研究植物体的一种技术。在代谢组学轮廓分析的流程中，典型样品的采集是首要并且极其重要的步骤，获得合格样品，以真实客观的反映样品的代谢状态，是代谢组学分析进行的基础和前提。植物新鲜烟叶样品的采集，需要在低温下淬灭以停止其生理活动以保证其停止在采样时的代谢状态，标准做法为采摘植物样品后，锡纸包裹，置于-196℃液氮冷冻，用于新鲜烟叶样品分析或者冻干样品分析。在样品采摘到分析前的这一段过程，需保证新鲜烟叶在液氮中保存且在液氮条件下研磨，否则会造成烟叶的酶促褐变。由于烟草样品保存不当而导致的质量发生变化，代谢物水平不能反映烟草样品真实状态的情况时有发生。急需一种简单、快速的分析方法对植物代谢组学研究中的烟草样品质量进行判别。
烟草挥发性代谢物作为烟草中一类最重要的化学成分之一，其组成和含量对烟叶的吃味、刺激性和烟叶香气都有直接的影响，然而目前建立的分析方法大都是基于衍生化的GC/MS方法，但是，衍生化反应前，萃取液必须完全吹干或者冷冻干燥，这就导致了该方法必然会损失低沸点代谢物质信息。为了弥补衍生化方法缺失的部分代谢物信息，建立了直接进样的非靶向GC/MS分析方法。并提出将新鲜烟叶中的挥发性代谢物含量或含量比值用于代谢组学新鲜烟叶样品质量的判别。
发明内容
本发明目的在于提供一种基于挥发性代谢物的烟草代谢组学中新鲜烟叶样品质量的判别方法。本发明的方法利用新鲜烟叶中十五醛和维生素E含量的比值对代谢组学研究中的新鲜烟叶样品质量进行判别，本发明操作简单快速，结果准确可靠。
本发明的目的是通过下述技术措施来实现：
本发明的基于挥发性代谢物的烟草代谢组学中新鲜烟叶样品质量的判别方法采用气相色谱串联质谱对新鲜烟叶样品中十五醛和维生素E含量进行相对定量分析，计算其比值，对代谢组学研究中的新鲜烟叶样品质量进行判别；具体方法如下：
1）称量100~110 mg冻干后新鲜烟叶粉末置于离心管中，加入3mL超纯水、3mL甲基叔丁基醚、以及50μL的1mg/mL氘代苯乙酮的内标溶液, 震荡提取2h后，静置10min后取上清液1mL，经0.45μm滤膜过滤后直接采用GC-MS进行测试分析；
2）GC/MS分析方法的气相色谱参数：色谱柱：DB-5ms (30m×0.25mm×0.25μm) ；色谱柱前接脱活预柱(1m×0.25mm×0.25μm)；载气：He；进样口温度：290℃；进样量：1μL；不分流进样；程序升温：以5℃/min的速度从50℃升至300℃(10min)；
3）GC/MS分析方法的质谱参数：传输线温度 280℃，电离电压：70ev；扫描模式：选择离子模式（SIM）；选择离子如下：氘代苯乙酮（IS）（110），3-己烯-1-醇（67），对二甲苯（91），2,3-辛二酮（99），对薄荷烯（95），柠檬烯（68），苯甲醇（109），苯乙醛（91），4-甲基苯甲醛（119），苯乙醇（91），2,3-二氢-3,5二羟基-6-甲基-4(H)-吡喃-4-酮（144），4-甲基苯乙酮（119），2,3-二氢苯并呋喃（120），3,5-二甲基苯甲醛（133），5-乙酰基甲基-2-糠醛（126），E-5-异丙基-8-甲基-6,8-壬二烯-2-酮（93），1,1,6-三甲基-1,2-二氢萘（157），1,2,3,4-四氢-1,1,6-三甲基萘（159），2,6-二甲基萘（156），十五醛（82），3,7,11,15-四甲基-2-十六碳烯（70），新植二烯（95），2,6,10,14-四甲基-2-十六碳烯（70)，植醇(81)，十六酸甲酯（87），7-羟基-6-甲氧基-2H-1-苯并吡喃-2-酮（192），亚油酸甲酯（294），亚麻酸甲酯（296），十八酸甲酯（298），二十七烷（57），二十八烷（57），二十九烷（57），2-甲基-二十九烷（57)，三十烷（57），三十一烷（57），三十二烷（57），三十三烷（57）。
本发明中所述冻干后新鲜烟叶粉末为大田采摘的新鲜烟叶，经-196℃液氮罐保存运输，液氮冷冻研磨并冻干后，在-80℃冰箱保存待用烟末。
本发明所述的采用气相色谱串联质谱对新鲜烟叶样品中十五醛和维生素E含量进行相对定量分析，分析步骤如下：GC-MS分析数据可定性新鲜烟叶中的十五醛和维生素E，通过测定十五醛、维生素E以及内标氘代苯乙酮的峰面积响应，对新鲜烟叶样品中十五醛和维生素E进行相对定量，将十五醛和维生素E相对定量的结果求比值，并作为区分代谢组学合格样品及变质的不合格样品的标准，即待测样品中十五醛和维生素E含量的比值在0.35以下的为合格样品，可用于代谢组学分析，十五醛和维生素E的比值在2以上的为变质的不合格样品，其比值处于0.35与2之间的为部分合格样品。
本发明经过大量烟草新鲜烟叶样品的分析研究，发现新鲜烟叶如果保存不当，其挥发性代谢物含量会发生变化，十五醛和维生素E含量的比值也会明显升高，此类样品将不能用于代谢组学分析。因此可以以十五醛和维生素E含量的比值作为一个标准对代谢组学研究中的新鲜烟叶样品质量进行判别。
本发明的有益效果如下：
由于本发明利用新鲜烟叶样品中十五醛和维生素E含量的比值和样品质量的相关性，对代谢组学新鲜烟叶样品质量进行判别，使得本发明具有以下特点：1）操作简单快速；2）结果准确可靠；3）样品用量少，可为烟草代谢特征分析及相关烟草代谢组学研究提供借鉴。
具体实施方式
本发明以下将结合实施例作进一步描述：
实施例1
采用GC-MS方法测定新鲜烟叶样品中的挥发性代谢物含量，发现褐化样品的十五醛和维生素E含量比值明显升高。
待测样品包括福建、贵州、湖南、河南、云南等省份的6个品种、19个产地的新鲜烟叶样品114份（每个点有5-6个生物学重复）。其中包括84份合格样品（样品在采集、运送及预处理过程中均严格控制在-80℃），24份褐变样品（由于储运过程中液氮不足等原因已完全褐变），6份部分褐变样品。
样品分析步骤如下所述：
1）由大田采摘的新鲜烟叶，于-196℃液氮罐保存运输，液氮冷冻研磨，低温冻干，-80℃冰箱保存待后续进行代谢组学分析；称量100~110 mg冻干后新鲜烟叶粉末于10mL样品瓶，加入3mL超纯水、3mL甲基叔丁基醚，50μL的1mg/mL氘代苯乙酮的内标溶液, 震荡提取2h后，静置10min后取上清液1 mL，经0.45μm滤膜过滤后直接采用GC-MS进行测试分析；
2）GC/MS分析方法的气相色谱参数：色谱柱：DB-5ms (30m×0.25mm×0.25μm) ；色谱柱前接脱活预柱(1m×0.25mm×0.25μm)；载气，He；进样口温度：290℃；进样量：1μL；不分流进样；程序升温：以5℃/min的速度从50℃升至300℃(10min)；
3）GC/MS分析方法的质谱参数：传输线温度 280℃，电离电压：70ev；扫描模式：选择离子模式（SIM）。选择离子如下：氘代苯乙酮（IS）（110），3-己烯-1-醇（67），对二甲苯（91），2,3-辛二酮（99），对薄荷烯（95），柠檬烯（68），苯甲醇（109），苯乙醛（91），4-甲基苯甲醛（119），苯乙醇（91），2,3-二氢-3,5二羟基-6-甲基-4(H)-吡喃-4-酮（144），4-甲基苯乙酮（119），2,3-二氢苯并呋喃（120），3,5-二甲基苯甲醛（133），5-乙酰基甲基-2-糠醛（126），E-5-异丙基-8-甲基-6,8-壬二烯-2-酮（93），1,1,6-三甲基-1,2-二氢萘（157），1,2,3,4-四氢-1,1,6-三甲基萘（159），2,6-二甲基萘（156），十五醛（82）， 3,7,11,15-四甲基-2-十六碳烯（70），新植二烯（95），2,6,10,14-四甲基-2-十六碳烯（70)，植醇(81)，十六酸甲酯（87），7-羟基-6-甲氧基-2H-1-苯并吡喃-2-酮（192），亚油酸甲酯（294），亚麻酸甲酯（296），十八酸甲酯（298），二十七烷（57），二十八烷（57），二十九烷（57），2-甲基-二十九烷（57)，三十烷（57），三十一烷（57），三十二烷（57），三十三烷（57）。
通过测定十五醛、维生素E以及内标氘代苯乙酮的峰面积响应，对新鲜烟叶样品中十五醛和维生素E进行相对定量（分别与内标作峰面积比）：
在上述条件下获得了114份新鲜烟叶中十五醛、维生素E等37种挥发性代谢物的相对含量，发现十五醛与维生素E含量的比值变化显著，详细数据见表1。
表1 实施例1中烟叶样品信息及十五醛与维生素E含量的比值
样品编号 产地 品种 重复数 十五醛/维生素E 是否合格
C23Y 贵州毕节 云97 6 3.9-6.3 不合格
C01K 云南昆明 K326 6 0.20-0.32 合格
C03C 云南曲靖 云87 6 0.10-0.14 合格
C04Y 云南红河 云97 6 0.04-0.09 合格
C05Y 云南普洱 云87 6 0.05-0.08 合格
C06Y 云南大理 云87 6 0.07-0.11 合格
C07 福建龙岩 云87 6 2.5-5.3 不合格
C09Y 贵州黔西南 云97 6 0.04-0.06 合格
C11Z 河南许昌 中烟100 6 0.37-0.71 部分合格
C12C 河南平顶山 中烟100 6 0.14-0.30 合格
C13C 河南南阳 中烟100 6 0.17-0.22 合格
C14C 河南驻马店 中烟100 6 0.16-0.25 合格
C15K 广东韶关 K326 6 0.16-0.29 合格
C17K 湖南郴州 K326 6 0.10-0.21 合格
C24C 贵州黔南 云85 6 4.37-4.78 不合格
C25N 贵州铜仁 南江3号 6 0.04-0.06 合格
C26Y 湖北恩施 云87 6 0.05-0.06 合格
C29C 湖南张家界 K326 6 2.2-5.1 不合格
GK10 贵州遵义 K326 6 0.08-0.11 合格
经过以上实验，发现褐化样品中的十五醛与维生素E含量的比值显著降低。本发明将十五醛与维生素E含量的比值作为区分代谢组学正常样品与变质样品的标准。即待测样品中十五醛和维生素E含量的比值在0.35以下的为合格样品，可用于代谢组学分析，十五醛和维生素E的比值在2以上的为变质的不合格样品，其比值处于0.35与2之间的为部分合格样品。

Claims (2)

1.一种基于挥发性代谢物的烟草代谢组学中新鲜烟叶样品质量的判别方法，其特征在于：采用气相色谱串联质谱对新鲜烟叶样品中十五醛和维生素E含量进行相对定量分析，计算其比值，对代谢组学研究中的新鲜烟叶样品质量进行判别；具体方法如下：
1）称量100~110 mg冻干后新鲜烟叶粉末置于离心管中，加入3mL超纯水、3mL甲基叔丁基醚、以及50μL的1mg/mL氘代苯乙酮的内标溶液, 震荡提取2h后，静置10min后取上清液1mL，经0.45μm滤膜过滤后直接采用GC-MS进行测试分析；分析步骤如下：GC-MS分析数据可定性新鲜烟叶中的十五醛和维生素E，通过测定十五醛、维生素E以及内标氘代苯乙酮的峰面积响应，对新鲜烟叶样品中十五醛和维生素E进行相对定量，将十五醛和维生素E相对定量的结果求比值，并作为区分代谢组学合格样品及变质的不合格样品的标准，即待测样品中十五醛和维生素E含量的比值在0.35以下的为合格样品，可用于代谢组学分析，十五醛和维生素E的比值在2以上的为变质的不合格样品，其比值处于0.35与2之间的为部分合格样品；
2）GC/MS分析方法的气相色谱参数：色谱柱：DB-5ms，规格为30m×0.25mm×0.25μm ；色谱柱前接脱活预柱，规格为1m×0.25mm×0.25μm；载气：He；进样口温度：290℃；进样量：1μL；不分流进样；程序升温：以5℃/min的速度从50℃升至300℃(10min)；
3）GC/MS分析方法的质谱参数：传输线温度 280℃，电离电压：70ev；扫描模式：选择离子模式（SIM）；选择离子如下：氘代苯乙酮（IS）（110），3-己烯-1-醇（67），对二甲苯（91），2,3-辛二酮（99），对薄荷烯（95），柠檬烯（68），苯甲醇（109），苯乙醛（91），4-甲基苯甲醛（119），苯乙醇（91），2,3-二氢-3,5二羟基-6-甲基-4(H)-吡喃-4-酮（144），4-甲基苯乙酮（119），2,3-二氢苯并呋喃（120），3,5-二甲基苯甲醛（133），5-乙酰基甲基-2-糠醛（126），E-5-异丙基-8-甲基-6,8-壬二烯-2-酮（93），1,1,6-三甲基-1,2-二氢萘（157），1,2,3,4-四氢-1,1,6-三甲基萘（159），2,6-二甲基萘（156），十五醛（82），3,7,11,15-四甲基-2-十六碳烯（70），新植二烯（95），2,6,10,14-四甲基-2-十六碳烯（70)，植醇(81)，十六酸甲酯（87），7-羟基-6-甲氧基-2H-1-苯并吡喃-2-酮（192），亚油酸甲酯（294），亚麻酸甲酯（296），十八酸甲酯（298），二十七烷（57），二十八烷（57），二十九烷（57），2-甲基-二十九烷（57)，三十烷（57），三十一烷（57），三十二烷（57），三十三烷（57）。
2.根据权利要求1所述判别方法，其特征在于：所述冻干后新鲜烟叶粉末为大田采摘的新鲜烟叶，经-196℃液氮罐保存运输，液氮冷冻研磨并冻干后，在-80℃冰箱保存待用的烟叶末。
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