CN102590412A - 一种检测新鲜烟叶中次生代谢物的衍生化gc-ms方法 - Google Patents

一种检测新鲜烟叶中次生代谢物的衍生化gc-ms方法 Download PDF

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一种检测新鲜烟叶中次生代谢物的衍生化GC-MS方法，其特征是：快速采集新鲜烟叶并用液氮现场进行速冻，采用冷冻干燥方法除去水分后对烟叶进行粉碎，用溶剂超声提取烟粉中次生代谢物，对提取液上清液进行干燥，然后对干燥后提取物进行肟化反应、硅烷衍生化反应，最后采用GC-MS进行分析。本发明的突出优点在于：一是发展了适用于新鲜烟叶中次生代谢物的提取方法。由于烟叶面积较大，次生代谢物在整个烟叶分布并不均匀，不适合采用打孔取样技术采用。而本发明的烟叶采集及提取方法可以真实反应所在采集周期、采集部位烟叶的代谢物组成。二是可以同时检测新鲜烟叶中糖类、氨基酸类、有机酸类、萜醇类等大部分重要的烟草代谢物，具有高通量检测特性。

Description

一种检测新鲜烟叶中次生代谢物的衍生化GC-MS方法
 
技术领域
本发明涉及一种检测新鲜烟叶中次生代谢物的衍生化GC-MS方法，利用该方法可以测定处于不同生长时期时烟叶中的糖、氨基酸、有机酸、酚、萜醇等多种次生代谢物质，是一种高通量测定方法。
 
背景技术
烟草作为重要的模式作物及经济作物，人们对其化学组成有了很多了解。但是，大多数研究仅限于对调制后烟叶的了解，而人们对于新鲜烟叶，包括不同生长周期、不同部位烟叶的化学组成了解仍旧十分有限。次生代谢物主要是指分子量在1000以下的小分子代谢物，与植物基体抗性、信号传导、生长发育、植物的花色、香气等现象相关。因此，了解不同时期、处于不同生长周期的烟叶的代谢物组成及含量本身具有重大意义，而且是开展基因组学、蛋白质组学、转录组学研究的化学平台。
 尽管近几年国内外已经开始开展关于烟叶次生代谢物的研究工作，但是数量有限，且大都研究针对调制后烟叶。调制过程中，烟叶化学成分不断发生化学变化，而且不同类型烟叶调制方法不同，难以进行控制。因此，分析调制后烟叶的次生代谢物并不能反应烟株的真实代谢过程。而建立一种检测新鲜烟叶中次生代谢物的方法是十分必要的。衍生化GC-MS方法可以同时检测烟叶中有机酸、氨基酸、胺、酚、醇、糖等大多数代谢物，具有高通量特征，而且目前还无采用衍生化GC-MS测定新鲜烟叶中代谢物的相关报道。
 
发明内容
本发明的目的正是针对上述现有技术状况而专门提供一种检测新鲜烟叶中次生代谢物的衍生化GC-MS方法。利用该方法可以测定处于不同生长时期时烟叶中的糖、氨基酸、有机酸、酚、萜醇等多种次生代谢物质，是一种高通量测定方法。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：
一种检测新鲜烟叶中次生代谢物的衍生化GC-MS方法：快速采集新鲜烟叶并用液氮现场进行速冻，采用冷冻干燥方法除去水分后对烟叶进行粉碎，用溶剂超声提取烟粉中次生代谢物，对提取液上清液进行干燥，然后对干燥后提取物进行肟化反应、硅烷衍生化反应，最后采用GC-MS进行分析。
具体步骤如下：
(1) 烟叶的采集、处理、干燥、粉碎：快速采摘烟株指定部位烟叶，用液氮迅速冷冻以终止生命过程，冷冻干燥24h以除去烟叶水分，干燥过的烟叶粉碎至40-60目，放于-20℃冰箱保存；
(2) 烟叶中次生代谢物的萃取：称量10-30mg粉碎后的烟叶于1.5ml离心管中，加入内标溶液，用甲醇-氯仿-水萃取溶剂超声提取，超声萃取后离心，取上清液并用氮吹仪吹干；
(3)肟化反应：向吹干的提取液基质中加入甲氧胺盐酸盐溶液，斡旋震荡后在30-40℃下反应70-100min；此步骤的目的是对糖等化合物的醛基进行肟化反应以防止其成环，从而减少其异构体，便于定量比较。
(4)硅烷化衍生反应：在步骤（3）之后，向离心管中加入N-甲基-N-三甲基硅烷基三氟乙酰胺（MSTFA），斡旋震荡后在30-40℃下衍生 25-35min；
(5) 检测：采用GC-MS进行检测分析。色谱条件如下：
色谱柱： DB-5ms (30m×0.25mm×0.25μm)； 载气，He；流速：1.0ml/min；进样口温度：290℃；进样量：1μL；分流比为10:1；升温程序：                                               
Figure 2012100156576100002DEST_PATH_IMAGE002
60℃保持4min，然后以5℃/min的升温速度升到310℃，保持10 min，
MS参数：采用全扫描模式；采集质量数范围：40-510。
所述内标溶液为用萃取溶剂配制的氘代十六烷酸溶液。
所述萃取溶剂甲醇-氯仿-水的配比为5∶2∶2。
所用甲氧胺盐酸盐溶液浓度为20-40mg/ml，配置在吡啶溶液中，加入量为30-70μl；反应采用水浴或摇床（空气加热）进行控温。
衍生化试剂三甲基硅烷基三氟乙酰胺的加入量为30-120μl，反应采用水浴或摇床进行控温。
在步骤（1）的处理过程中要迅速去处烟叶主脉，用锡箔纸包裹叶片部分，标记后放入液氮中终止烟叶生命过程，并放于-80℃低温冰箱冷冻保存，在烟叶从冰箱取出至冷冻干燥开始之前，必须用干冰包埋，进行转移。
本发明的突出优点之一是发展了适用于新鲜烟叶中次生代谢物的提取方法。由于烟叶面积较大，次生代谢物在整个烟叶分布并不均匀，不适合采用打孔取样技术采用。而本发明的烟叶采集及提取方法可以真实反应所在采集周期、采集部位烟叶的代谢物组成。本发明的另一优点是可以同时检测新鲜烟叶中糖类、氨基酸类、有机酸类、萜醇类等大部分重要的烟草代谢物，具有高通量检测特性。
 
附图说明
图1为本发明的检测步骤流程图。
图2为本发明所得GC-MS的全扫描色谱图。
 
具体实施方式
本发明以下结合实施例（附图）做进一步描述，但并不限制本发明。
实施例1：
采集实验室6片旺长期烟株的新鲜烟叶（红花大金元品种），快速去除主干并用锡箔纸包裹，用液氮速冻。从液氮取出锡箔纸包，轻轻拍碎，立即用冷冻干燥机冷冻24小时取出水分，并磨碎至40-60目。称取10mg烟粉于1.5ml离心管，加入200μl氘代十六烷酸内标溶液，1.0ml的5：2：2的甲醇-水-氯仿溶液，超声提取30min，10000r/min下离心10min, 取200μl上清液于另一1.5ml离心管，40℃下用氮吹仪吹干。加入30μl的浓度为20mg/ml的甲氧胺盐酸盐溶液（配于吡啶中），斡旋震荡1min后在37℃水浴中保持90min，再加入30μl 的TFMSA，斡旋震荡1min后在37℃水浴中保持90min，用GC-MS检测。
色谱条件如下：
色谱柱： DB-5ms (30m×0.25mm×0.25μm)； 载气，He；流速：1.0ml/min；进样口温度：290℃；进样量：1μL；分流比为10:1；升温程序：60℃保持4min，然后以5℃/min的升温速度升到310℃，保持10 min。
MS参数：采用全扫描模式；采集质量数范围：40-510。
全扫描色谱图如图2所示。
 在连续10日，每日进行重复实验。随机选取20个样品峰，计算10次实验中色谱峰的面积，并计算10次实验各色谱峰“峰面积/内标面积”值（S/S内）的相对标准偏差（RSD，%）和保留时间的相对标准偏差，列于表1。其中，S/S内的RSD<0.03%, 保留时间RSD<8.9%, 证明该方法具有较好的重现性。
 
                表1 
Figure 2012100156576100002DEST_PATH_IMAGE004
实施例2：
方法回收率考察：采集贵州遵义地区品种为nc297的3片成熟期烟叶，快速去除主干并用锡箔纸包裹，用液氮速冻。将锡箔纸包从液氮中取出，包埋在干冰中，航空快递至实验室，放于-80度冰箱。从冰箱中取出锡箔纸包，轻轻拍碎，立即用冷冻干燥机冷冻24小时取出水分，并磨碎至40-60目。称取20mg烟粉于1.5ml离心管，加入200μl氘代十六烷酸内标溶液，1.0 ml的5：2：2的甲醇-水-氯仿溶液，100μl的混合标准品溶液（各标准品加入浓度为20μg/ml、100μg/ml、200μg/ml三个量级，见表2），超声提取30min，10000r/min下离心10min, 取0.4ml上清液转移到5ml离心管中，40℃下用氮吹仪吹干。加入40μl的浓度为20mg/ml的甲氧胺盐酸盐溶液（配于吡啶中），在37℃用摇床震荡反应90min，再加入70μl TFMSA，在37℃用摇床震荡衍生30min，用GC-MS检测。色谱条件如实施例1.
   测定的各化合物回收率如表2所示，对有机酸、氨基酸、糖类等典型代谢化合物，在加入浓度为20μg/ml、100μg/ml、200μg/ml下，回收率在72.4%-121.8%之间。
 
                                  表2  
Figure 2012100156576100002DEST_PATH_IMAGE006

Claims (7)

1.一种检测新鲜烟叶中次生代谢物的衍生化GC-MS方法，其特征在于：快速采集新鲜烟叶并用液氮现场进行速冻，采用冷冻干燥方法除去水分后对烟叶进行粉碎，用溶剂超声提取烟粉中次生代谢物，对提取液上清液进行干燥，然后对干燥后提取物进行肟化反应、硅烷衍生化反应，最后采用GC-MS进行分析。
2.根据权利要求1所述的检测新鲜烟叶中次生代谢物的衍生化GC-MS方法，其特征在于：具体步骤如下：
(1) 烟叶的采集、处理、干燥、粉碎：快速采摘烟株指定部位烟叶，用液氮迅速冷冻以终止生命过程，冷冻干燥24h以除去烟叶水分，干燥过的烟叶粉碎至40-60目，放于-20℃冰箱保存；
(2) 烟叶中次生代谢物的萃取：称量10-30mg粉碎后的烟叶于1.5ml离心管中，加入内标溶液，用甲醇-氯仿-水萃取溶剂超声提取，超声萃取后离心，取上清液并用氮吹仪吹干；
(3)肟化反应：向吹干的提取液基质中加入甲氧胺盐酸盐溶液，斡旋震荡后在30-40℃下反应70-100min；
(4)硅烷化衍生反应：在步骤（3）之后，向离心管中加入N-甲基-N-三甲基硅烷基三氟乙酰胺（MSTFA），斡旋震荡后在30-40℃下衍生 25-35min；
(5) 检测：采用GC-MS进行检测分析；
 色谱条件如下：
色谱柱： DB-5ms (30m×0.25mm×0.25μm)； 载气，He；流速：1.0ml/min；进样口温度：290℃；进样量：1μL；分流比为10:1；升温程序：                                                60℃保持4min，然后以5℃/min的升温速度升到310℃，保持10 min；
MS参数：采用全扫描模式；采集质量数范围：40-510。
3.根据权利要求2所述的检测新鲜烟叶中次生代谢物的衍生化GC-MS方法，其特征在于：内标溶液为用萃取溶剂配制的氘代十六烷酸溶液。
4.根据权利要求2或3所述的检测新鲜烟叶中次生代谢物的衍生化GC-MS方法，其特征在于：所述萃取溶剂甲醇-氯仿-水的配比为5∶2∶2。
5.根据权利要求2所述的检测新鲜烟叶中次生代谢物的衍生化GC-MS方法，其特征在于：所用甲氧胺盐酸盐溶液浓度为20-40mg/ml，配置在吡啶溶液中，加入量为30-70μl；反应采用水浴或摇床空气加热进行控温。
6.根据权利要求2所述的检测新鲜烟叶中次生代谢物的衍生化GC-MS方法，其特征在于：衍生化试剂三甲基硅烷基三氟乙酰胺的加入量为30-120μl，反应采用水浴或摇床进行控温。
7.根据权利要求2所述的检测新鲜烟叶中次生代谢物的衍生化GC-MS方法，其特征在于：在步骤（1）的处理过程中要迅速去处烟叶主脉，用锡箔纸包裹叶片部分，标记后放入液氮中终止烟叶生命过程，并放于-80℃低温冰箱冷冻保存，在烟叶从冰箱取出至冷冻干燥开始之前，必须用干冰包埋，进行转移。
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