CN107037160A - 烟叶中氨基酸的测定方法 - Google Patents

烟叶中氨基酸的测定方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种烟叶中氨基酸的测定方法，包括以下步骤：按YC/T 31‑1996的要求处理烟叶，准确称量烟末，加入内标溶液和盐酸溶液，然后超声萃取，接着离心后所得的上清液用0.45μm水相滤膜过滤，得到萃取液；将萃取液置于色谱瓶中，用氮气吹干，加入衍生试剂MTBSTFA和催化剂乙腈，然后涡旋，接着用微波处理1～4min，得到样品溶液；采用GC‑MS对样品溶液进行检测，通过内标定量法检测氨基酸的含量。采用微波衍生，在保证灵敏度、回收率的条件下，简化了处理步骤，大大降低了衍生时间。

Description

烟叶中氨基酸的测定方法
技术领域
本发明涉及一种烟叶中氨基酸的测定方法。
背景技术
氨基酸是合成蛋白质的原料，不仅参与烟株内碳、氮代谢，从而影响烟株内含氮化合物和其它化学物质的形成，而且与烟叶调制、陈化、燃吸过程中所发生的复杂生物化学变化关系密切。因此，氨基酸对烟叶品质的影响非常复杂，影响的结果最终可以从烟叶色泽、香味和抽吸感觉反映出来。
MTBSTFA常用于氨基酸的硅烷化衍生反应，生成的产物稳定，适于质谱分析。在质谱检测中，该衍生物很容易失去叔丁基形成较强的(M-57)+离子，有利于作为质谱分析的母离子。
在衍生氨基酸、糖类和脂肪酸类化合物时，微波衍生与传统加热衍生相比反应时间显著缩短，峰度比更好，因此干扰更小。
发明内容
本发明的目的是提供一种烟叶中氨基酸的测定方法。
为了达到上述的技术效果，本发明采取以下技术方案：
一种烟叶中氨基酸的测定方法，包括以下步骤：
步骤A：按YC/T 31-1996的要求处理烟叶，准确称量烟末，加入内标溶液和盐酸溶液，然后超声萃取，接着离心后所得的上清液用0.45μm水相滤膜过滤，得到萃取液；
步骤B：将萃取液置于色谱瓶中，用氮气吹干，加入衍生试剂MTBSTFA和催化剂乙腈，然后涡旋，接着用微波处理1～4min，得到样品溶液；
步骤C：采用GC-MS对样品溶液进行检测，通过内标定量法检测氨基酸的含量。
进一步的技术方案是，所述的内标溶液为浓度为0.4092mg/mL的正缬氨酸溶液，其配制方法如下：称取正缬氨酸0.1023g，用0.1mol/L的盐酸定容至250mL。
进一步的技术方案是，每克烟末中加入40mL浓度为0.1mol/L的盐酸溶液和100μL浓度为0.4092mg/mL的内标溶液。
进一步的技术方案是，所述的萃取的时间为10～50min。
进一步的技术方案是，所述的步骤B中萃取液的体积为100μL，衍生试剂和催化剂的体积分别为50μL。
进一步的技术方案是，所述的微波的功率为70～700w。
进一步的技术方案是，所述的步骤C中GC-MS检测的条件如下：
色谱柱：Elite-5Ms，30m×0.25mm×0.25μm；
进样口温度：260℃；
进样量：1μL；
载气：氦气，纯度≥99.999％；不分流；流速：1.5mL/min；
升温程序：初始温度80℃，保持1min，80℃/min的速率至150℃，保持5min；7℃/min的速率至240℃，保持1min；20℃/min的速率至280℃，保持3min；其质谱分析条件为传输线温度为：260℃；
电离EI能量为70eV；离子源温度为：230℃；
溶剂延迟时间6min，选择离子扫描模式SIM分段扫描，以特征离子进行定量分析。
进一步的技术方案是，所述的步骤C中标准溶液中含丙氨酸ALA，甘氨酸GLY，缬氨酸VAL，亮氨酸LEU，异亮氨酸ILE，脯氨酸PRO，蛋氨酸MET，苯丙氨酸PHE，色氨酸TRP标准物，溶剂为0.1mol/L的盐酸溶液；各级标准溶液的浓度为0.010μg/mL，0.1μg/mL，0.20μg/mL，1μg/mL，2.0μg/mL，10μg/mL，20μg/mL。
进一步的技术方案是，所述的测定方法为各级标准溶液用GC-MS分析，将标准溶液中氨基酸的含量与内标溶液的含量之比对色谱图中氨基酸峰面积与内标峰面积的比值作图，得到标准曲线；将相同条件下测得的样品溶液中各氨基酸和内标的色谱峰面积比，代入标准曲线，求得烟叶中各氨基酸的含量。
本方法采用的气相色谱质谱联用检测，气质联用通过选择离子定量，灵敏高、干扰小，不需要更多的前处理步骤，而液相色谱加入缓冲溶液和去除过量的衍生试剂都是为了获得更好的峰形准确定量，减少干扰。
本发明与现有技术相比，具有以下的有益效果：
本发明的烟叶中氨基酸的测定方法，可快速准确测定烟叶中氨基酸的含量，针对萃取和衍生的条件，优化了样品前处理方法，并将方法用于实际烟草样品的测定。采用微波衍生，在保证灵敏度、回收率的条件下，简化了处理步骤，大大降低了衍生时间。
具体实施方式
下面结合本发明的实施例对本发明作进一步的阐述和说明。
一、仪器与试剂
试剂：9种氨基酸单标(丙氨酸ALA，甘氨酸GLY，缬氨酸VAL，亮氨酸LEU，异亮氨酸ILE，脯氨酸PRO，蛋氨酸MET，苯丙氨酸PHE，色氨酸TRP)购自北京世纪奥科生物技术有限公司，内标L-正缬氨酸(99％，购自阿拉丁试剂)，37％的浓盐酸(分析纯，购自成都市科龙化工试剂厂)，异丙醇(99.5％，购自阿拉丁试剂)衍生试剂MTBSTFA(N-叔丁基二甲基甲硅烷基-N-甲基三氟乙酰胺，97％，购自阿拉丁试剂)，乙腈(色谱纯，99.9％，购自赛默飞世尔FisherScientific)。
仪器：PE Clarus 600Gas Chromatography，PE Clarus SQ 8T MassSpectrometer，IKA MS1Minishaker(涡旋器)，美的家用微波炉，Sigma 3K15离心机。
二、内标溶液的配制
称取正缬氨酸0.1023g，用0.1mol/L的盐酸定容至250mL，得到浓度为0.4092mg/mL的正缬氨酸溶液作为内标溶液。
三、准备标准溶液
(1)母液：称取各种氨基酸0.0050g，用0.1mol/L的盐酸定容至50mL，得到各种氨基酸浓度为0.1mg/mL母液。
(2)标准溶液
STD6：取2mL母液(0.1mg/mL)于10mL容量瓶中，用0.1mol/L盐酸定容，得浓度为20μg/mL的溶液。
STD5：取1mL母液(0.1mg/mL)于10mL容量瓶中，用0.1mol/L盐酸定容，得浓度为10μg/mL的溶液。
STD4：取0.20ml母液(0.1mg/mL)于10mL容量瓶中，用0.1mol/L盐酸定容，得浓度为2.0μg/mL的溶液。
STD3：取1ml母液(0.1mg/mL)于100mL容量瓶中，用0.1mol/L盐酸定容，得浓度为1μg/mL的溶液。
STD2：取0.20ml母液(0.1mg/mL)于100mL容量瓶中，用0.1mol/L盐酸定容，得浓度为0.20μg/mL的溶液。
STD1：取1ml STD5(10μg/mL)于100mL容量瓶中，用0.1mol/L盐酸定容，得浓度为0.1μg/mL的溶液。
STD0：取1ml STD3(1μg/mL)于100mL容量瓶中，用0.1mol/L盐酸定容，得浓度为0.01μg/mL的溶液。
实施例1：
样品处理：
(1)按照YC/T 31-1996的要求处理烟叶；
(2)准确称取烟末1g(精确到0.0001g)，加入40mL浓度为0.1mol/L的盐酸溶液和100μL内标溶液，超声萃取40min，接着在转速11000rpm下离心10min所得的上清液用0.45μm水相滤膜过滤，得到萃取液；
(3)取100μL萃取液置于色谱瓶中，用氮气吹干，加入50μL衍生试剂MTBSTFA和50μL催化剂乙腈，然后涡旋1min，接着在功率为70w的微波(低火)下处理1～4min，得到样品溶液。
测定方法：
各级浓度的标准溶液用GC-MS分析，将标准溶液中9种氨基酸的含量与内标量之比对色谱图中氨基酸峰面积与内标峰面积的比值作图，得到标准曲线；将相同条件下测得的样品溶液中各氨基酸和内标的色谱峰面积比，代入标准曲线，求得烟叶中各氨基酸的含量见表2。
色谱条件：
色谱柱：Elite-5Ms(30m×0.25mm×0.25μm)；
进样口温度：260℃；
进样量：1μL；载气：氦气，纯度≥99.999％；不分流；流速：1.5mL/min；
升温程序：初始温度80℃，保持1min，80℃/min的速率至150℃，保持5min；7℃/min的速率至240℃，保持1min；20℃/min的速率至280℃，保持3min。其质谱分析条件为传输线温度为：260℃；
电离EI能量为70eV；离子源温度为：230℃；
溶剂延迟时间6min，选择离子扫描模式SIM分段扫描，以特征离子进行定量分析，目标物和内标的保留时间和质谱参数见表1。
表1：氨基酸及内标名称、保留时间和定量离子
氨基酸 简称 保留时间(min) 定量离子 辅助定量离子
丙氨酸 ALA 7.12 158 232，260
甘氨酸 GLY 7.67 218 246
缬氨酸 VAL 9.51 186 260，288
正缬氨酸 L-VAL 9.72 186 260,288
亮氨酸 LEU 10.29 200 274，302
异亮氨酸 ILE 10.89 200 274，302
脯氨酸 PRO 11.57 184 258，286
蛋氨酸 MET 14.83 218 292，320
苯丙氨酸 PHE 16.57 302 234，336
色氨酸 TRP 23.07 302 375
实施例2：
样品处理：
(1)按照YC/T 31-1996的要求处理烟叶；
(2)准确称取烟末1g(精确到0.0001g)，加入40mL浓度为0.1mol/L的盐酸溶液和100μL内标溶液，超声萃取40min，接着在转速11000rpm下离心10min所得的上清液用0.45μm水相滤膜过滤，得到萃取液；
(3)取100μL萃取液置于色谱瓶中，用氮气吹干，加入50μL衍生试剂MTBSTFA和50μL催化剂乙腈，然后涡旋1min，接着在功率为210w的微波(中低火)下处理1～4min，得到样品溶液。
测定方法：采用实施例1的测定方法分析样品溶液。烟叶中各氨基酸的含量见表2。
表2：实施例1和2的烟叶样品中各氨基酸含量的检测结果
实施例3：
样品处理：
(1)按照YC/T 31-1996的要求处理烟叶；
(2)准确称取烟末1g(精确到0.0001g)，加入40mL浓度为0.1mol/L的盐酸溶液和100μL内标溶液，超声萃取40min，接着在转速11000rpm下离心10min所得的上清液用0.45μm水相滤膜过滤，得到萃取液；
(3)取100μL萃取液置于色谱瓶中，用氮气吹干，加入50μL衍生试剂MTBSTFA和50μL催化剂乙腈，然后涡旋1min，接着在功率为350w的微波(中火)下处理1～4min，得到样品溶液。
测定方法：采用实施例1的测定方法分析样品溶液。烟叶中各氨基酸的含量见表3。
实施例4：
样品处理：
(1)按照YC/T 31-1996的要求处理烟叶；
(2)准确称取烟末1g(精确到0.0001g)，加入40mL浓度为0.1mol/L的盐酸溶液和100μL内标溶液，超声萃取40min，接着在转速11000rpm下离心10min所得的上清液用0.45μm水相滤膜过滤，得到萃取液；
(3)取100μL萃取液置于色谱瓶中，用氮气吹干，加入50μL衍生试剂MTBSTFA和50μL催化剂乙腈，然后涡旋，接着在功率为490w的微波(中高火)下处理1～4min，得到样品溶液。
测定方法：采用实施例1的测定方法分析样品溶液。烟叶中各氨基酸的含量见表3。
表3：实施例3和4的烟叶样品中各氨基酸含量的检测结果
由表2和表3可知，当其他实验条件相同，微波衍生的功率和时间对衍生效果影响显著，除了ILE和TRP，其他氨基酸的衍生效果均在中低火衍生时达到最好，当微波功率增加至中火和中高火后，氨基酸的测定值显著降低，可能是由于温度过高破坏了衍生物的稳定性。中低火衍生1min时VAL的效果最好，中低火衍生2min中时ALA的效果最好，中低火衍生3min时PRO、MET、PHE效果最好，中低火衍生4min中时GLY和ILE效果最好，且除了ILE和TRP，其他氨基酸在中低火衍生3min时与其他效果最好的测定值误差均小于5％。因此选择中低火衍生3min作为最佳衍生条件。
实施例5：
样品处理：
(1)按照YC/T 31-1996的要求处理烟叶；
(2)准确称取烟末1g(精确到0.0001g)，加入40mL盐酸和异丙醇的混合溶液，异丙醇的体积分数分别为0％、20％、40％、60％、80％、100％，超声萃取40min，接着在转速11000rpm下离心10min所得的上清液用0.45μm水相滤膜过滤，得到萃取液；
(3)取100μL萃取液置于色谱瓶中，用氮气吹干，加入50μL衍生试剂MTBSTFA和50μL催化剂乙腈，然后涡旋，接着在功率为210w的微波(中低火)下处理3min，得到样品溶液。
测定方法：采用实施例1的测定方法分析样品溶液。烟叶中各氨基酸的含量见表4。
表4：实施例5的烟叶样品中各氨基酸含量的检测结果
氨基酸 0％ 20％ 40％ 60％ 80％ 100％
ALA 0.0564 0.0875 0.1516 0.1795 0.1330 0.0150
GLY 0.0063 0.0044 0.0089 0.0301 0.0262 0.0086
VAL 0.0581 0.0525 0.0362 0.0337 0.0309 0.0080
LEU 0.0110 0.0089 0.0073 0.0068 0.0071 0.0024
ILE 0.0067 0.0045 0.0037 0.0040 0.0046 0.0021
PRO 4.5411 2.4001 1.9596 1.8036 2.0895 1.1912
MET 0.0022 0.0029 0.0027 0.0037 0.0031 0.0003
PHE 0.2004 0.1623 0.1367 0.1191 0.1045 0.0175
TRP 0.0278 0.0465 0.0554 0.0777 0.0742 0.0253
由表4可知，当混合溶液中异丙醇的体积分数分别为0％、20％、40％、60％、80％、100％时，测得的VAL、LEU、ILE、PRO、PHE含量最大值均出现在异丙醇体积分数为0％时，而ALA、GLY、MET、TRP的含量最大值出现在异丙醇体积分数为60％时。这可能是由于异丙醇可以降低烟末中无机盐的共萃取从而使衍生效果较好，但是随着异丙醇体积分数的增加，氨基酸在萃取液中的溶解度会降低，因此衍生效果反而不好。综合考虑选择异丙醇体积分数0％为最佳萃取液，即用0.1moL/L的盐酸溶液做萃取液，而不用盐酸和异丙醇的混合液。
实施例6：
样品处理：
(1)按照YC/T 31-1996的要求处理烟叶；
(2)准确称取烟末1g(精确到0.0001g)，加入40mL浓度为0.1mol/L的盐酸溶液和100μL内标溶液，分别超声萃取10min、15min、20min、30min、40min、50min，接着在转速11000rpm下离心10min所得的上清液用0.45μm水相滤膜过滤，得到萃取液；
(3)取100μL萃取液置于色谱瓶中，用氮气吹干，加入50μL衍生试剂MTBSTFA和50μL催化剂乙腈，然后涡旋，接着在功率为210w的微波(中低火)下处理3min，得到样品溶液。
测定方法：采用实施例1的测定方法分析样品溶液。烟叶中各氨基酸的含量见表5。
表5：实施例6的烟叶样品中各氨基酸含量的检测结果
由表5可知，当超声萃取时间分别为10min、15min、20min、30min、40min、50min时，氨基酸的含量随超声时间的增加而增大，当超声时间为40min和50min时基本达到最大值，综合考虑选择最佳超声时间为40min。
本方法检出限和定量限：
最小浓度的标准溶液平行测定10次，计算标准偏差，3倍的标准偏差为检出限，10倍的标准偏差为定量限，氨基酸的检出限和定量限分别为0.0012mg/g～0.4218mg/g和0.0039mg/g～1.4061mg/g。
本发明方法的重复性和加标回收率：
在空白样品中加入各氨基酸的标准溶液，然后进行前处理和GC-MS分析，并按照加标量和测定值计算其回收率，结果见表6。
将平衡好的牌号B的卷烟按照实施例1～6确定的最佳条件进行测定，平行5次，相对标准偏差见表6。
由表6可以看出，氨基酸的回收率在78.68％～100.00％，除ILE外平均相对标准偏差(RSD)均小于10％，说明本发明方法的回收率高，重复性好。
各氨基酸的定量曲线、线性范围、检出限、定量限如表6所示。
表6：各氨基酸的定量曲线、检出限、定量限、回收率和重复性(n＝5)
注：线性方程中X表示氨基酸和内标的浓度之比，Y表示氨基酸和内标的峰面积之比
尽管这里参照本发明的解释性实施例对本发明进行了描述，上述实施例仅为本发明较佳的实施方式，本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，应该理解，本领域技术人员可以设计出很多其他的修改和实施方式，这些修改和实施方式将落在本申请公开的原则范围和精神之内。

Claims (9)

1.一种烟叶中氨基酸的测定方法，其特征在于包括以下步骤：
步骤A：按YC/T 31-1996的要求处理烟叶，准确称量烟末，加入内标溶液、盐酸溶液，然后超声萃取，接着离心后所得的上清液用0.45μm水相滤膜过滤，得到萃取液；
步骤B：将萃取液置于色谱瓶中，用氮气吹干，加入衍生试剂MTBSTFA和催化剂乙腈，然后涡旋，用微波处理1～4min，得到样品溶液；
步骤C：采用GC-MS对样品溶液进行检测，通过内标定量法检测氨基酸的含量。
2.根据权利要求1所述的烟叶中氨基酸的测定方法，其特征在于所述的内标溶液为浓度为0.4092mg/mL的正缬氨酸溶液，其配制方法如下：称取正缬氨酸0.1023g，用0.1mol/L的盐酸定容至250mL。
3.根据权利要求1所述的烟叶中氨基酸的测定方法，其特征在于每克烟末中加入40mL浓度为0.1mol/L的盐酸溶液和100μL浓度为0.4092mg/mL的内标溶液。
4.根据权利要求1所述的烟叶中氨基酸的测定方法，其特征在于所述的萃取的时间为10～50min。
5.根据权利要求1所述的烟叶中氨基酸的测定方法，其特征在于所述的步骤B中萃取液的体积为100μL，衍生试剂和催化剂的体积分别为50μL。
6.根据权利要求1所述的烟叶中氨基酸的测定方法，其特征在于所述的微波的功率为70～700w。
7.根据权利要求1所述的烟叶中氨基酸的测定方法，其特征在于所述的步骤C中GC-MS检测的条件如下：
色谱柱：Elite-5Ms，30m×0.25mm×0.25μm；
进样口温度：260℃；
进样量：1μL；
载气：氦气，纯度≥99.999％；不分流；流速：1.5mL/min；
升温程序：初始温度80℃，保持1min，80℃/min的速率至150℃，保持5min；7℃/min的速率至240℃，保持1min；20℃/min的速率至280℃，保持3min；其质谱分析条件为传输线温度为：260℃；
电离EI能量为70eV；离子源温度为：230℃；
溶剂延迟时间6min，选择离子扫描模式SIM分段扫描，以特征离子进行定量分析。
8.根据权利要求1所述的烟叶中氨基酸的测定方法，其特征在于所述的步骤C中标准溶液中含丙氨酸，甘氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，脯氨酸，蛋氨酸，苯丙氨酸，色氨酸标准物，溶剂为0.1mol/L的盐酸溶液；各级标准溶液的浓度为0.010μg/mL，0.1μg/mL，0.20μg/mL，1μg/mL，2.0μg/mL，10μg/mL，20μg/mL。
9.根据权利要求8所述的烟叶中氨基酸的测定方法，其特征在于所述的测定方法为各级标准溶液用GC-MS分析，将标准溶液中氨基酸的含量与内标溶液的含量之比对色谱图中氨基酸峰面积与内标峰面积的比值作图，得到标准曲线；将相同条件下测得的样品溶液中各氨基酸和内标的色谱峰面积比，代入标准曲线，求得烟叶中各氨基酸的含量。
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