CN112595786A - 酒醅中挥发性风味物质的定量检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及酒醅中挥发性风味物质的定量检测方法，属于酒醅风味分析技术领域。本发明提供了酒醅中挥发性风味物质的定量检测方法，采用顶空进样‑气相色谱‑质谱联用进行检测，并且在顶空进样前对酒醅进行如下预处理：向酒醅中加入稳定同位素内标，然后用乙醇水溶液萃取待检测的目标物质，收集萃取液。本发明方法克服了以往的酒醅定量分析方法存在的诸多不足，如蒸馏效率不可控、操作步骤繁杂、有机溶剂污染、检测不准确等问题，适用于酒醅中易挥发风味化合物的定量分析，为酒醅的质量控制提供了新方法，对提升白酒的品质有重要的意义。

Description

酒醅中挥发性风味物质的定量检测方法

技术领域

本发明涉及酒醅中挥发性风味物质的定量检测方法，属于酒醅风味分析技术领域。

背景技术

酒醅又称糟醅，是固态发酵法酿造白酒时，原料经酿酒微生物混合发酵而成的物料。酒醅中有大量的易挥发风味物质，如乙酸乙酯、丁酸乙酯、己酸乙酯、正丁醇、异戊醇等；这些风味物质通过蒸馏成为白酒酒体的主要呈香呈味成分，直接影响着白酒的风格与品质。

在目前己报道的研究中，酒醅中易挥发风味物质的分析技术主要分为以下三类：

一是直接蒸馏法，该方法通过利用小规格的蒸馏器对小质量的酒醅直接蒸馏获得蒸馏液进行分析，并以此计算酒醅中的易挥发风味物质含量。如《酿酒科技》期刊文章“浓香型白酒窖内参数变化规律及相关性研究(III)：风味物质”(2012年)和《食品与发酵工艺》期刊文章“清香小曲白酒新工艺中微生物及环境因子对酒体风味变化的影响”(2019年)均采用了此法。虽然这种技术能模拟大生产中白酒的蒸馏操作，但是，各风味化合物在小规模操作下的蒸馏、精馏的效率等和实际生产规模情况不同，同时无法评估蒸馏过程中化合物的损失。因此，该方法测定的数据不能真实反映酒醅自身含有的风味物质的量比情况。

二是直接萃取法，这类方法一般利用水或有机溶剂萃取酒醅中的挥发性风味物质并结合不同的风味分析技术进行分析。例如中国专利申请号201410090158.2、专利名称为“一种快速简便提取酒醅中挥发性风味物质的方法”，先将酒醅用超纯水浸泡、超声萃取，离心得到上清液；然后，在上清液中添加有机溶剂进行液液萃取，并将有机相进行分析。该方法仅采用了半定量法，并没有进行绝对定量；而且液液萃取法会将酒醅中的色素、小分子糖、氨基酸等物质带入到有机相中，进样后色素等焦化将污染色谱柱且进样口高温下产生较多焦糊味物质，进而影响分析结果。另外，在《食品科学》期刊文章“古井贡酒酒醅挥发性香气成分的GC/MS与GC/O分析”(2016年)中，作者采用了溶剂辅助风味蒸发法(SAFE)结合气相色谱-质谱联用技术对酒醅进行分析，并运用内标法绘制标准曲线进行定量。该方法虽然规避掉色素等不挥发物对色谱分析的影响，但操作步骤十分繁杂、萃取时间长、劳动强度大、有机溶剂用量大、环境污染大、对实验人员伤害大，因而不适合对大量样品的萃取分析。同时，该方法选择的内标物与目标分析物的物理、化学性质并非完全一致，在校正萃取过程中的损失时，势必会造成偏差，进而导致定量结果不准确。

三是顶空固相微萃取法，这类方法一般采用不同极性的萃取材料，在密闭的装置中萃取由样品中挥发出的风味物质。如《酿酒》期刊文章“应用HS-SPME技术测定固态发酵浓香型酒醅微量成分”(2008年)和《食品科学》期刊文章“酒醅微量挥发性成分的HS-SPME和GC-MS分析”(2013年)中均使用了该方法，在酒醅中检测出了多种挥发性物质。另外，在《食品与发酵工业》期刊文章“五粮浓香型发酵酒醅与窖泥的相关性研究”(2019年)中，通过添加内标物进行了半定量分析。虽然上述方法具有处理简单、样品量小、无需有机溶剂、无色素污染、可用于大批量样品的分析等优点，但依然存在着吸附材料选择性的问题，以及吸附容量小、萃取头易饱和、风味物质竞争性吸附等缺点无法克服，并不适用于酒醅的易挥发风味物质的定量分析。

因此，建立一种快速、简便、准确地定量酒醅中易挥发风味化合物的方法，对于白酒的质量控制具有重要意义。

发明内容

本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明的目的在于提供酒醅中挥发性风味物质的定量检测方法。

本发明提供了酒醅中挥发性风味物质的定量检测方法，采用顶空进样-气相色谱-质谱联用进行检测，并且在顶空进样前对酒醅进行如下预处理：向酒醅中加入稳定同位素内标，然后用乙醇水溶液萃取待检测的目标物质，收集萃取液；其中，所述顶空进样的条件为：150～250rpm的转速下50～60℃平衡10～20min，用加热到70～90℃的气密性注射器吸取顶空样品进样；所述气相色谱以聚乙二醇为固定相。

其中，顶空进样技术的原理是将待测样品置入一密闭的容器中，通过加热升温使挥发性组分从样品基体中挥发出来，在气液(或气固)两相中达到平衡，直接抽取顶部气体进行色谱分析，从而检验样品中挥发性组分的成分和含量。相较于顶空固相微萃取技术而言，顶空进样技术没有吸附材料选择性的问题，以及吸附容量小、萃取头易饱和、风味物质竞争性吸附、色素污染等缺点。

稳定同位素稀释法以目标分析物的氘标记类似物(同位素)作为内标物。由于分析物与同位素的物理与化学性质都是一致的，因此能够很好地校正处理过程中物质损失，有助于规避各化合物在萃取或分析过程中由于萃取效率、挥发效率不同以及校正偏差等因素而造成的误差。

进一步地，用5～10％v/v的乙醇水溶液萃取。

优选地，用10％v/v的乙醇水溶液萃取。

进一步地，所述顶空进样的条件为：250rpm的转速下60℃平衡10min，用加热到80℃的气密性注射器吸取顶空样品进样。

进一步地，所述气相色谱满足以下至少一项：

色谱柱为HP-INNOWAX；

进样口温度为230℃；

柱箱升温程序为：40℃保持5min，再以4℃/min升至160℃保持1min，然后以10℃/min升至230℃保持3min。

进一步地，所述质谱采用EI电离源，电子能量70eV，离子源温度230℃，四级杆温度150℃，接口温度250℃。

进一步地，所述的酒醅为浓香型白酒或酱香型白酒的酒醅。

优选地，所述的酒醅为五粮浓香型白酒的酒醅。

进一步地，所述的挥发性风味物质选自乙酸乙酯、丙酸乙酯、2-甲基丙酸乙酯、丁酸乙酯、3-甲基丁酸乙酯、戊酸乙酯、己酸乙酯、2-甲基丙醇、正丁醇、3-甲基丁醇、正戊醇、正己醇中至少一种。

进一步地，乙酸乙酯的对应稳定同位素内标为乙酸乙酯-d3；丙酸乙酯的对应稳定同位素内标为乙酸乙酯-d3；2-甲基丙酸乙酯的对应稳定同位素内标为丁酸乙酯-4，4，4-d3；丁酸乙酯的对应稳定同位素内标为丁酸乙酯-4，4，4-d3；3-甲基丁酸乙酯的对应稳定同位素内标为3-甲基丁酸乙酯-d3；戊酸乙酯的对应稳定同位素内标为3-甲基丁酸乙酯-d3；己酸乙酯的对应稳定同位素内标为己酸乙酯-d11；2-甲基丙醇的对应稳定同位素内标为丁醇-d2；正丁醇的对应稳定同位素内标为丁醇-d2；3-甲基丁醇的对应稳定同位素内标为3-甲基丁醇-1，1-d2；正戊醇的对应稳定同位素内标为戊醇-5，5，5-d3；正己醇的对应稳定同位素内标为己醇-1，1-d2。

进一步地，所述的定量检测方法包括如下步骤：取酒醅，预处理，然后进样于顶空进样-气相色谱-质谱联用仪，获得挥发性风味物质的响应值，再根据样品中目标物质与对应稳定同位素内标的响应比，对照标准曲线计算得到酒醅中挥发性风味物质的含量。

进一步地，所述的标准曲线由下述方法得到：

a、将挥发性风味物质的标准品稀释成不同浓度梯度的标样溶液；

b、选择对应稳定同位素内标，配制成稳定同位素内标溶液；

c、制备模拟酒醅，然后分成若干份，分别加入不同浓度梯度的标样溶液，以及稳定同位素内标溶液；

d、萃取，然后进样于顶空进样-气相色谱-质谱联用仪，以标准品与稳定同位素内标的响应比为纵坐标，标准品与稳定同位素内标的浓度比为横坐标，绘制标准曲线。

优选地，所述的模拟酒醅由下述方法制备得到：

Ⅰ、将糠壳与五粮粉分别用甲醇浸泡，倒掉甲醇，将糠壳与五粮粉烘干备用，所述五粮粉按以下重量百分比混合得到：高粱36％、大米22％、糯米18％、小麦16％、玉米8％；

Ⅱ、将糠壳、五粮粉和水混匀后灭菌，待温度降到室温，再加入水、乙醇和乳酸，混匀，即可。

本发明提供的酒醅中挥发性风味物质的定量检测方法，利用顶空进样-气相色谱-质谱联用技术结合稳定同位素稀释法对风味物质进行了定量分析，能快速并准确地定量白酒酒醅中至少12种易挥发风味化合物，各化合物的线性关系良好，R²>0.997，定量限低于1mg/L，相对标准偏差小于9％，回收率在86％-106％之间。本发明方法克服了以往的酒醅定量分析方法存在的诸多不足，如蒸馏效率不可控、操作步骤繁杂、有机溶剂污染、检测不准确等问题，适用于酒醅中易挥发风味化合物的定量分析，为酒醅的质量控制提供了新技术，对提升白酒的品质有重要的意义。

附图说明

图1为实施例1中发酵期1天酒醅的色谱图；

图2为实施例1中发酵期3天酒醅的色谱图；

图3为实施例1中发酵期6天酒醅的色谱图；

图4为实施例1中发酵期10天酒醅的色谱图；

图5为实施例1中发酵期15天酒醅的色谱图；

图6为实施例1中发酵期30天酒醅的色谱图；

图7为实施例2中浓香型白酒出窖酒醅的色谱图；

图8为实施例2中酱香型白酒出窖酒醅的色谱图。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

主要仪器：多功能前处理平台：PAL RTC Series II，瑞士CTC；气相色谱-质谱联用仪：7890B-5977B,美国安捷伦；电子天平：UX820S分析天平(精度0.01g)，日本岛津；色谱柱：HP-INNOWax(60m×0.32mm×0.25mm)，美国安捷伦；灭菌锅：立式压力蒸汽灭菌器，上海博讯。

主要试剂与材料：乙酸乙酯、丁酸乙酯、己酸乙酯、正丁醇：购于美国西格玛奥德里齐公司；丙酸乙酯、2-甲基丙酸乙酯、3-甲基丁酸乙酯、戊酸乙酯、2-甲基丙醇、3-甲基丁醇、正戊醇、正己醇：购于日本梯希爱公司；所有稳定同位素均购自加拿大CDN公司；色谱级乙醇：购自美国西格玛奥德里齐公司；实验室专用水∶超纯水(Mi1li-Q系统，Mi1lipore，Badford，MA，USA)煮沸5-10分钟冷却。酒醅、糠壳、五粮粉均来自五粮液股份有限公司。

实施例1发酵过程中白酒酒醅易挥发风味物质含量的测定

1、绘制标准曲线

(1)模拟酒醅的制备

先将糠壳与五粮粉(高粱36％、大米22％、糯米18％、小麦16％、玉米8％，按上述重量配比混匀后粉碎)分别用甲醇超声浸泡30min，倒掉甲醇，将糠壳与五粮粉烘干备用。将250g糠壳、150g五粮粉和600g超纯水加入烧杯中混匀后放入灭菌锅115℃灭菌10min，之后待温度降到室温，再加入600g蒸馏水、40mL乙醇和36g乳酸，混匀待用。

(2)配制混合标准品

将12种易挥发风味物质的标准品(具体种类见表1)用色谱级乙醇配制成一定浓度的储备液，然后将储备液稀释成不同浓度梯度的混合标样溶液。

(3)稳定同位素内标物的选择与配制

本发明定量方法主要针对酒醅中含量较高的12种易挥发风味物质。为保证定量方法的准确性，选择了这些物质对应的稳定同位素作为内标，没有稳定同位素的物质采用结构性质相似的物质作为内标，具体内标选择情况见表1。将选定的稳定同位素内标用色谱级乙醇分别配制为浓度约20000mg/L的储备液，再将各内标物混合，稀释至每种内标的含量均为1000mg/L，作为混合内标使用。

表1目标化合物与稳定同位素内标对应表

(4)标准曲线的绘制

准确称取模拟酒醅5.0-25.0g若干份，分别加入200-500μL提前配制好的不同浓度梯度的混合标样溶液，并混匀。在各个浓度梯度的模拟酒醅中分别加入200-500ul混合稳定同位素内标溶液，再加入25-100mL 10％乙醇水溶液，密封，萃取，采用顶空进样-气相色谱-质谱联用技术进行检测。

萃取：室温下在摇床中以180rpm萃取20min后，萃取液用尼龙膜过滤(0.2um)，收集滤液备用。

顶空进样：吸取1.0mL滤液，装入20mL顶空瓶中，拧紧瓶盖(隔垫为PTFE/硅胶)，用带有顶空模块的多功能自动进样器进行萃取；顶空条件为250rpm的转速下60℃平衡10min，用加热到80℃的2.5mL气密性注射器吸取顶空样品0.5mL进样。

气相色谱条件：载气为He(99.999％)，流速1mL/min；色谱柱为HP-INNOWAX(60m*0.32mm*0.25μm)；进样口温度为230℃；分流进样，分流比为5：1；柱箱升温程序为40℃保持5min，再以4℃/min升至160℃保持1min，然后以10℃/min升至230℃并保持3min。

质谱条件：EI电离源，电子能量70eV，离子源温度230℃，四级杆温度150℃，接口温度250℃，采用全扫描模式，扫描范围(m/z)35.00-350.00。

白酒酒醅中易挥发风味物质的定性：通过化合物与标准品的保留时间与NIST14数据库提供的标准质谱图对照，利用匹配度、特征离子以及保留时间进行定性分析。

以标准品与稳定同位素内标的响应比为纵坐标，标准品与稳定同位素内标的浓度比为横坐标，绘制标准曲线，各项参数见表2。

表2白酒酒醅易挥发风味物质定量方法的线性参数及定量限

2、发酵过程中白酒酒醅易挥发风味物质含量的测定

不同发酵期的五粮浓香型白酒酒醅(发酵期1天、3天、6天、10天、15天、30天)，各准确称取5.0-25.0g到250mL三角瓶中，并加入200-500μL稳定同位素混合内标(各物质浓度均为1000mg/L)，再加入100mL 10％乙醇水溶液，盖上瓶盖后放上摇床，以180rpm在室温下萃取20min，用一次性过滤器过滤(0.2um，尼龙膜)后备用。对不同发酵期酒醅的萃取液进行测试，检测条件同上，分别得到6个发酵期酒醅中易挥发风味化合物的响应值。根据样品中化合物与对应稳定同位素内标的响应比，对照标准曲线计算6个不同发酵期酒醅中易挥发风味化合物的含量，详见表3。6个不同发酵期酒醅的色谱图见图1-图6。

表3不同发酵期的酒醅中易挥发风味物质的含量

注：-表示低于定量限。

实施例2白酒出窖酒醅易挥发风味物质含量的测定

浓香型白酒窖池和酱香型白酒窖池分别2口，每口窖池各取一个上层与下层糟。每个糟醅各准确称取5.0-25.0g到250mL三角瓶中，并加入200-500μL稳定同位素混合内标(各物质浓度均为1000mg/L)，再加入100mL 10％乙醇水溶液，盖上瓶盖后放上摇床，以180rpm在室温下萃取20min，用一次性过滤器过滤(0.2um，尼龙膜)后备用。对白酒出窖酒醅的萃取液进行测试，检测条件同实施例1，分别得到出窖酒醅中易挥发风味化合物的响应值。根据样品中化合物与对应稳定同位素内标的响应比，对照标准曲线计算酒醅中易挥发风味化合物的含量，详见表4。浓香型与酱香型白酒出窖酒醅的色谱图见图7-图8。

表4浓香型与酱香型白酒出窖酒醅易挥发风味物质的含量单位：mg/kg

注：-表示低于定量限。

实施例3回收率与精密度测定

为了验证定量检测结果的可靠性，进行了回收率与精密度的测定。

1、回收率的测定

选择发酵期30天的浓香型酒醅(由实施例1制备)为试样进行测定，定量其易挥发风味化合物的含量(重复测定3次)。在25g酒醅中分别加入两种不同浓度的标准物混合液，并对两种加标试样进行测定(重复3次)。回收率通过以下公式计算：加标回收率＝(加标试样测定值－试样测定值)÷加标量×100％。具体情况详见表5。

表5白酒酒醅易挥发风味化合物定量方法的回收率

2、精密度的测定

选择已发酵结束的浓香型白酒中上层次酒醅进行易挥发风味化合物分析，重复测定5次，根据其测定结果计算相对标准偏差。具体情况详见表6。

表6白酒酒醅易挥发化合物定量方法的相对标准偏差(RSD)

需要说明的是，本说明书中描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例以及不同实施例的特征进行结合和组合。

Claims (10)

1.酒醅中挥发性风味物质的定量检测方法，其特征是：采用顶空进样-气相色谱-质谱联用进行检测，并且在顶空进样前对酒醅进行如下预处理：向酒醅中加入稳定同位素内标，然后用乙醇水溶液萃取待检测的目标物质，收集萃取液；其中，所述顶空进样的条件为：150～250rpm的转速下50～60℃平衡10～20min，用加热到70～90℃的气密性注射器吸取顶空样品进样；所述气相色谱以聚乙二醇为固定相。

2.如权利要求1所述的定量检测方法，其特征是：用5～10％v/v的乙醇水溶液萃取；优选地，用10％v/v的乙醇水溶液萃取。

3.如权利要求1所述的定量检测方法，其特征是：所述顶空进样的条件为：250rpm的转速下60℃平衡10min，用加热到80℃的气密性注射器吸取顶空样品进样。

4.如权利要求1所述的定量检测方法，其特征是：所述气相色谱满足以下至少一项：

色谱柱为HP-INNOWAX；

进样口温度为230℃；

柱箱升温程序为：40℃保持5min，再以4℃/min升至160℃保持1min，然后以10℃/min升至230℃保持3min。

5.如权利要求1所述的定量检测方法，其特征是：所述质谱采用EI电离源，电子能量70eV，离子源温度230℃，四级杆温度150℃，接口温度250℃。

6.如权利要求1所述的定量检测方法，其特征是：所述的酒醅为浓香型白酒或酱香型白酒的酒醅；优选地，所述的酒醅为五粮浓香型白酒的酒醅。

7.如权利要求1所述的定量检测方法，其特征是：所述的挥发性风味物质选自乙酸乙酯、丙酸乙酯、2-甲基丙酸乙酯、丁酸乙酯、3-甲基丁酸乙酯、戊酸乙酯、己酸乙酯、2-甲基丙醇、正丁醇、3-甲基丁醇、正戊醇、正己醇中至少一种。

8.如权利要求1或7所述的定量检测方法，其特征是：乙酸乙酯的对应稳定同位素内标为乙酸乙酯-d3；丙酸乙酯的对应稳定同位素内标为乙酸乙酯-d3；2-甲基丙酸乙酯的对应稳定同位素内标为丁酸乙酯-4，4，4-d3；丁酸乙酯的对应稳定同位素内标为丁酸乙酯-4，4，4-d3；3-甲基丁酸乙酯的对应稳定同位素内标为3-甲基丁酸乙酯-d3；戊酸乙酯的对应稳定同位素内标为3-甲基丁酸乙酯-d3；己酸乙酯的对应稳定同位素内标为己酸乙酯-d11；2-甲基丙醇的对应稳定同位素内标为丁醇-d2；正丁醇的对应稳定同位素内标为丁醇-d2；3-甲基丁醇的对应稳定同位素内标为3-甲基丁醇-1，1-d2；正戊醇的对应稳定同位素内标为戊醇-5，5，5-d3；正己醇的对应稳定同位素内标为己醇-1，1-d2。

9.如权利要求1～8任意一项所述的定量检测方法，其特征是：包括如下步骤：取酒醅，预处理，然后进样于顶空进样-气相色谱-质谱联用仪，获得挥发性风味物质的响应值，再根据样品中目标物质与对应稳定同位素内标的响应比，对照标准曲线计算得到酒醅中挥发性风味物质的含量。

10.如权利要求9所述的定量检测方法，其特征是：所述的标准曲线由下述方法得到：

a、将挥发性风味物质的标准品稀释成不同浓度梯度的标样溶液；

b、选择对应稳定同位素内标，配制成稳定同位素内标溶液；

c、制备模拟酒醅，然后分成若干份，分别加入不同浓度梯度的标样溶液，以及稳定同位素内标溶液；

d、萃取，然后进样于顶空进样-气相色谱-质谱联用仪，以标准品与稳定同位素内标的响应比为纵坐标，标准品与稳定同位素内标的浓度比为横坐标，绘制标准曲线；

优选地，所述的模拟酒醅由下述方法制备得到：

Ⅰ、将糠壳与五粮粉分别用甲醇浸泡，倒掉甲醇，将糠壳与五粮粉烘干备用，所述五粮粉按以下重量百分比混合得到：高粱36％、大米22％、糯米18％、小麦16％、玉米8％；

Ⅱ、将糠壳、五粮粉和水混匀后灭菌，待温度降到室温，再加入水、乙醇和乳酸，混匀，即可。

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