CN115047097A - 窖泥中微量成分萃取定量方法 - Google Patents

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Abstract

窖泥中微量成分萃取定量方法，利用固液萃取技术，筛选合适的溶剂萃取窖泥中微量成分并对萃取微量成分进行定量分析，本方法选择乙醇作为萃取剂，确定摇床震荡和超声相结合的方法，采用具塞三角瓶可以有效减少微量成分挥发，通过萃取剂预先添加标样的手段，有效保证了定量的准确度。本方法分析过程相对简单，可重复项强，可操作性强，成本较低，可以有对窖泥中微量成分进行有效量化，摆脱以往凭感觉判断窖泥好坏的弊端。

Description

窖泥中微量成分萃取定量方法
技术领域
本发明涉及白酒窖池窖泥成分分析技术领域，具体涉及一种窖泥中微量成 分萃取定量方法。
背景技术
窖池是白酒生产过程中，集糖化、酒化、酯化等多种反应于一体的酿酒容器。 俗话说“老窖出好酒”，在白酒生产实践中，往往发现靠近窖底、窖壁的糟醅， 其酒浓郁芳香，其根本原因在于窖泥中与生香有关的功能菌群的代谢作用。窖 池本身就是多种微生物的载体，随着发酵长期连续的进行，窖泥中的功能微生 物不断地得到驯化和富集，最终形成其特有的微生物群落。因此，窖泥中微量 成分的种类和数量对白酒风味物质的形成有着重要的影响。窖泥中含有的微量 成分包括酚类物质或微生物菌群例如乳酸菌、芽孢杆菌、甲烷菌等，这些物质 对人工窖泥的开发、窖泥的质量控制以及白酒风味物质的形成都具有重要的意 义。
目前对窖泥中微量成分定量检测仍然属于空白领域，现有技术和方法都无法 对窖泥中微量成分进行定量测定。
发明内容
本发明针对现有技术存在的不足，提供了一种窖泥中微量成分萃取定量方 法。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种窖泥中微量成分萃取定量方法，利用固液萃取技术，筛选合适的溶剂萃 取窖泥中微量成分并对萃取微量成分进行定量分析，具体按如下步骤进行：
(1)标准曲线的制备：针对窖泥中的微量成分进行气质联用仪技术定量， 根据拷贝数与CT值构建的标准曲线；
(2)萃取：称取窖泥，加入萃取剂乙醇和内标溶液放置摇床上，220转/分， 震荡30分钟，静止足够时间待形成上清液，医用针管吸取2毫升左右，过0.45 微米有机系滤膜，得测试样品；
(3)气相色谱-质谱联用：将获得的样品才用液体直接进样的方式检测，获得 定量数值；
气相色谱条件为：
色谱柱为DB-WAX毛细管柱60m×0.25mm×0.25μm；
进样口温度230～250℃，质谱检测器温度230℃，载气He，流速0.8～ 1mL/min，不分流进样；
程序升温条件为初始柱温40℃，以4～5℃/min上升至180℃，保持2～4min, 然后以5～6℃/min升温到230℃，保持5～15min；
质谱条件为：
气相色谱与质谱接口温度为230℃；
电离方式为电子轰击源EI；
监测方式为选择性离子扫描模式SIM，电离能量70eV；
溶剂延迟为2.0～2.5min；
(4)标准曲线的建立
a、配制标准物质储备液：称取白酒中各种微量成分化合物标准品，分别用 无水乙醇配制成1～2mg/L的单标储备液，采用棕色储液瓶于4℃冰箱中避光保 存；
b、配制混合标准储备液：吸取各种微量化合物的单标储备液0.5mL混合， 然后采用色谱纯无水乙醇定容至50mL棕色容量瓶，获得混合标准储备液，于 4℃冰箱中避光保存；
c、配制混合标准使用液：分别吸取混合标准储备液0.05mL、0.1mL、0.2mL、 0.5mL、1mL至50mL棕色容量瓶中，加入乙醇，然后用超纯水定容，配制成 乙醇体积浓度为10％～15％的标准系列溶液；
d、对各混合标准使用液按步骤(2)、(3)进行处理，以各微量化合物标准品与 内标物特征离子峰的峰面积之比为横坐标，以各种微量类化合物标准品与内标 物的浓度之比为纵坐标绘制标准曲线；
(5)检测：将待测窖泥按步骤(2)进行萃取，然后按照步骤(3)气相色谱-质谱联 用进行定性定量分析，窖泥中各种微量成分含量(mg/克)＝色谱测定数值×100 (溶剂)÷10(窖泥)÷(1-水分含量)。
上述窖泥和萃取剂乙醇按照质量比1：10的比例添加。
本发明根据白酒发酵窖泥特性，选择乙醇作为萃取剂，确定摇床震荡和超声 相结合的方法，采用具塞三角瓶作为萃取容器可以有效减少微量成分挥发，通 过萃取剂预先添加标样的手段，有效保证了定量的准确度，本方法相对简单， 可重复项强，可操作性强，成本较低。可以有对窖泥中微量成分进行有效量化， 摆脱以往凭感觉判断窖泥好坏的弊端。
具体实施方式
一种窖泥中微量成分萃取定量方法，利用固液萃取技术，筛选合适的溶剂萃 取窖泥中微量成分并对萃取微量成分进行定量分析，具体按如下步骤进行：
(1)标准曲线的制备：针对窖泥中的微量成分进行气质联用仪技术定量， 根据拷贝数与CT值构建的标准曲线；
(2)萃取：称取窖泥，加入萃取剂乙醇和内标溶液放置摇床上，220转/分， 震荡30分钟，静止足够时间待形成上清液，医用针管吸取2毫升左右，过0.45 微米有机系滤膜，得测试样品，窖泥和萃取剂乙醇按照质量比1：10的比例添 加；
(3)气相色谱-质谱联用：将获得的样品才用液体直接进样的方式检测，获得 定量数值；
气相色谱条件为：
色谱柱为DB-WAX毛细管柱60m×0.25mm×0.25μm；
进样口温度230～250℃，质谱检测器温度230℃，载气He，流速0.8～ 1mL/min，不分流进样；
程序升温条件为初始柱温40℃，以4～5℃/min上升至180℃，保持2～4min, 然后以5～6℃/min升温到230℃，保持5～15min；
质谱条件为：
气相色谱与质谱接口温度为230℃；
电离方式为电子轰击源EI；
监测方式为选择性离子扫描模式SIM，电离能量70eV；
溶剂延迟为2.0～2.5min；
(4)标准曲线的建立
a、配制单标储备液：称取白酒中各种微量成分化合物标准品，分别用无水 乙醇配制成1～2mg/L的单标储备液，采用棕色储液瓶于4℃冰箱中避光保存；
b、配制混合标准储备液：吸取各种微量化合物的单标储备液0.5mL混合， 然后采用色谱纯无水乙醇定容至50mL棕色容量瓶，获得混合标准储备液，于 4℃冰箱中避光保存；
c、配制混合标准使用液：分别吸取混合标准储备液0.05mL、0.1mL、0.2mL、 0.5mL、1mL至50mL棕色容量瓶中，加入乙醇，然后用超纯水定容，配制成 乙醇体积浓度为10％～15％的标准系列溶液；
d、对各混合标准使用液按步骤(2)、(3)进行处理，以各微量化合物标准品与 内标物特征离子峰的峰面积之比为横坐标，以各种微量类化合物品与内标物 的浓度之比为纵坐标绘制标准曲线；
(5)检测：将待测窖泥按步骤(2)进行萃取，然后按照步骤(3)气相色谱-质谱联 用进行定性定量分析，窖泥中各种微量成分含量(mg/克)＝色谱测定数值×100 (溶剂)÷10(窖泥)÷(1-水分含量)。
本发明对萃取溶剂选择，本方法通过对比验证，选择乙醇作为萃取剂。萃取 方法的选择，通过验证确定摇床震荡和超声相结合的方法。萃取容器选择，具 塞三角瓶可以有效减少微量成分挥发。定量方法的确定，本方法通过萃取剂预 先添加标样的手段，有效保证了定量的准确度。
以下是本发明方法工艺条件确定论证过程：
1.1不同重量窖泥萃取验证结果选择合理的窖泥溶剂比例
分别用5克，10克，20克(窖泥质量选取根据溶剂的量和便于后期成分计 算因素考虑)分别震荡30分钟，静止足够时间待形成上清液，医用针管吸取 2毫升左右，过0.45微米有机系滤膜，得测试样品3个；将上述处理样超声 波2分钟，得测试样品3个。
表1不同重量窖泥萃取数据(单位mg/L以下相同)
Figure BDA0003654582250000041
表2不同窖泥重量萃取比较
Figure BDA0003654582250000051
1.2不同溶剂对窖泥成分萃取情况对比，选择适合的萃取溶剂
取10克窖泥，100毫升不同溶剂，4毫升乙酸正丁酯内标，分别加入250 毫升具塞三角瓶中，放置摇床上，220转/分，分别震荡2分钟，静止足够时间 待形成上清液，医用针管吸取2毫升左右，过0.45微米有机系滤膜，得测试样 品；我们选取己烷、乙醚、丙酮、乙醇4种萃取剂，重复上面程序依次震荡4 分钟；6分钟；8分钟；10分钟；20分钟；30分钟；上述4种溶剂共计28个样 品，加上本底合计32个样品。
对窖泥微量成分萃取效果乙醇﹥丙酮﹥乙醚﹥己烷。这和他们几个极性大小 排序相同。
表3乙醇窖泥萃取结果
乙醇萃取 2分钟 4分钟 6分钟 8分钟 10分钟 20分钟 30分钟
正丙醇 4.98 5.44 6.11 6.13 6.27 6.46 6.39
丁醇 3.33 4.88 5.52 5.76 5.98 5.93 6.49
己酸乙酯 5.5 9.4 11.2 11.8 12.6 13.2 14.1
己醇 2.11 3.32 3.79 3.99 4.27 4.4 4.7
乙酸 37.24 61.11 71.38 74.42 78.48 86.26 93.25
丙酸 2.33 4.2 4.28 4.76 4.69 4.31 4.97
异丁酸 0.57 0.78 0.03 1.07 1.19 1.12 1.23
丁酸 14.67 27.25 32.99 35.83 39.95 40.13 45.93
戊酸 3.09 5.17 6.35 6.48 7.2 7.35 8.26
己酸 31.77 53.94 72.3 76.6 84.39 84.81 95.69
表4丙酮窖泥萃取结果
丙酮萃取 2分钟 4分钟 6分钟 8分钟 10分钟 20分钟 30分钟
正丙醇 1.6 1.69 1.74 1.8 1.89 1.99 2.04
丁醇 3.93 4.16 4.46 4.61 4.7 5.09 5.31
己酸乙酯 7.86 8.7 9.17 9.56 9.87 11.02 11.71
己醇 2.82 3.18 3.29 3.39 3.53 3.89 4.05
乙酸 40.5 43.91 45.3 46.87 45.09 53.02 53.96
丙酸 1.83 2.96 2.89 2.76 3.06 3.01 4.03
异丁酸 0.59 0.8 0.75 0.07 0.82 0.95 1.04
丁酸 19.02 26.77 29.61 30.8 33.36 37 40.02
戊酸 3.57 5.33 5.94 6.2 6.56 7.42 7.8
己酸 44.89 65.03 70.58 75.72 77.27 88.34 93.4
表5己烷窖泥萃取结果
己烷萃取 2分钟 4分钟 6分钟 8分钟 10分钟 20分钟 30分钟
正丙醇 0.43 0.41 0.32 0.5 0.52 0.63 0.63
丁醇 1.5 1.81 1.89 2.34 2.26 2.82 3.06
己酸乙酯 2.78 4.2 5.33 5.84 6.46 8.21 9.61
己醇 1.3 1.8 2 2.17 2.28 2.74 3.11
乙酸 0.98 1.08 1.58 1.15 1.58 1.57 1.49
丙酸 0.16 0.07 0.2 0.22 0.15 0.14 0.16
丁酸 4.53 3.24 3.12 3.07 3.42 3.35 3.21
戊酸 1.32 0.85 0.98 1.12 1.1 1.28 1.32
己酸 21.47 19.63 20.95 22.53 22.9 27.71 29.74
表6乙醚窖泥萃取结果
乙醚萃取 2分钟 4分钟 6分钟 8分钟 10分钟 20分钟 30分钟
正丙醇 0.88 1.15 1.29 1.24 1.35 1.46 1.55
丁醇 1.81 2.22 2.64 2.87 3.09 3.42 3.59
己酸乙酯 1.9 2.67 3.18 3.65 4.11 5.13 5.76
己醇 0.98 1.32 1.59 1.73 1.98 2.17 2.35
乙酸 10.54 12.18 12.81 10.34 9.37 9.95 14.34
丙酸 1.79 2.09 1.98 2.05 2.26 2.79 3.11
丁酸 8.99 11.87 15.59 16.42 16.85 20.75 22.44
戊酸 1.04 2.02 2.43 2.73 2.64 3.37 3.91
己酸 11.48 17.14 22.64 26.06 27.98 35.87 41.69
1.3蒸干窖泥萃取结果，证明通过高温烘干并不能去除窖泥中微量成分
称取窖泥样品10克，放置在玻璃称量皿中，110度烘箱内烘6小时加入250 毫升具塞三角瓶中，加入100毫升乙醇，4毫升乙酸正丁酯内标，放置摇床 上，220转/分，分别震荡30分钟，静止足够时间待形成上清液，医用针管吸 取2毫升左右，过0.45微米有机系滤膜，得测试样品；
蒸干的窖泥中是否还含有微量成分，我们测试的结果是含有，而且量不少。 这应该和自由水、结合水是同样的道理，加热蒸干并不能彻底去掉残留在里 面的微量成分。
表7蒸干窖泥乙醇萃取数据
干窖泥萃取 1 2 3 4
正丙醇 2.21 2.98 2.63 2.05
丁醇 0.87 0.91 0.81 0.82
己醇 0.36 0.44 0.34 0.37
乙酸 48.2 53.08 47.37 53.3
丙酸 2.01 2.17 1.79 2.17
异丁酸 0.54 0.57 0.48 0.52
丁酸 23.81 24.06 18.86 23.44
戊酸 5.24 4.88 4.14 5.12
己酸 68.97 63.09 52.42 68.17
1.4超声时间对萃取影响结果，增加超声时间可以一定程度上提高萃取效果 称取10克窖泥，加入250毫升具塞三角瓶中，加入100毫升乙醇，4毫升乙 酸正丁酯内标放置摇床上，220转/分，分别震荡30分钟，超声波处理，分别 超声1分钟；2分钟；4分钟；6分钟；8分钟；10分钟，静止足够时间待形 成上清液，医用针管吸取2毫升左右，过0.45微米有机系滤膜，分别得5个 测试样品。
摇床震荡和超声目的都是将泥块破碎，增大泥土颗粒和溶剂的接触面 积，通过实验如果单独超声的话对窖泥粉碎效果有限，两者结合，效果非常 好。根据表8数据可以看出超声时间越长，萃取的微量成分越多，但不可能 一直超声下去，要根据实际情况确定超声时间。
表8摇床震荡后不同超声时间萃取数据
超声时间 1 2 4 6 8 10
正丙醇 5.43 5.73 5.52 5.89 5.91 6.15
丁醇 15.56 5.74 6 5.5 5.23 5.43
己酸乙酯 20.27 20.6 20.64 21.24 22.35 23.02
己醇 3.45 3.62 3.7 3.93 4.15 4.37
乙酸 71.54 77.13 81.13 83.42 85.62 90.84
丁酸 12.84 27.4 30.9 35.15 38.22 39.66
己酸 56.9 70.7 75.32 80.41 82.44 83.76
1.5窖泥和发泥红土添加回收结果，证明对于发泥红土来说，萃取效果比较好， 加标样品萃取回收率较好
称取窖泥10克，3份，其中一份不添加，另两份添加一定量的乙酸、己酸、 丁醇，分别加入100毫升乙醇，4毫升乙酸正丁酯内标放置摇床上，220转/分， 分别震荡30分钟，静止足够时间待形成上清液，医用针管吸取2毫升左右，过 0.45微米有机系滤膜，得测试样品；将发泥红土干燥粉粹，分别称取6.53克烘 干样品2份放置于250毫升具塞三角瓶中，加入3.47毫升水分，然后加入乙酸、 己酸、丁醇，充分混合用，静置2小时，对照只加入等同乙酸、己酸、丁醇和 3.47毫升水分，分别加入100毫升乙醇，4毫升乙酸正丁酯内标放置摇床上，220 转/分，分别震荡30分钟，静止足够时间待形成上清液，医用针管吸取2毫升左 右，过0.45微米有机系滤膜，得测试样品
窖泥和发泥红土分别添加微量成分萃取回收，一方面为了验证窖泥在短时间 内吸附酸、醇、酯等微量成分的能力。另一方面验证干燥的红土对不同微量成 分的吸附能力。选取了3种成分，1种醇类丁醇，2种酸类乙酸和己酸，其中 窖泥中丁醇、乙酸、己酸添加量都在5毫克，干燥红土添加量如泥土空白。
通过检测，窖泥中添加微量成分基本全部萃出，几乎没有损失。发泥红土 中丁醇损失较小，乙酸和己酸都损失一半以上，这里应该从醇类和酸类极性分 析，极性大的微量成分更容易吸附在泥土上，泥土对中性或极性小的微量成分 吸附能力要小。
窖泥加标和发泥红土加标检测结果的不同可以从土壤黏性角度分析，干燥 的红土水分含量极低，添加水分、有机物后相互作用粘度提高，形成颗粒细腻 可塑性粘质土壤。黏质土是指含沙量少，颗粒细腻，渗水速度慢，保水性好， 通气性能差的土壤。粘质土塑性指数大于10，且粒径大于0.075mm的颗粒总量 不超过全部体积50％的土。窖泥可以看做一种黏质土壤，其、窖泥对其中水分 和有机质都有一定吸附性。黏质土壤达到饱和或平衡后，对水分和有机物的吸 附能力会减弱。利用黏质土壤的理论可以解释窖泥和发泥红土对添加有机标样 吸附能力的不同。
表9窖泥和泥土加标测试数据
Figure BDA0003654582250000091
2方法具体操作及数据处理说明
通过实验确定极性较强的无水乙醇是比较适合的窖泥萃取剂，100毫升乙 醇萃取10克窖泥是比较适合的萃取比例。摇床震荡和超声波超声都是为了更好 的破碎窖泥，形成窖泥颗粒增大和溶剂的接触面积，更有效的萃取窖泥中有机 成分。通过发泥红土内标添加实验，验证了有机溶剂并不能将窖泥中有机成分 完全萃取出来。另外，对于窖泥样品的选择，由于窖泥属于固体范畴，其均一 性远远差于液体，所以尽量选择细腻无明显固块的样品，可以选择几个点同时 做平行，求平均值来减少误差。
利用我们实验参数来测定窖泥中微量成分含量公式如下：
窖泥中各种微量成分含量(mg/克)＝色谱测定数值×100(溶剂)÷10(窖 泥)÷(1-水分含量)
根据古贝春窖泥水分检测数据来看，窖池中窖泥水分数值一般在31％-37％较 小的范围内浮动，这样可以不折算干窖泥微量成分含量，不考虑水分因素可以 以取样窖泥微量成分含量进行比较。
窖泥中微量成分能够有效的定量，关键点是在萃取溶剂中直接加入内标。这样 将复杂问题简单化，起着事半功倍的效果。采用无水乙醇作为萃取剂，采用1：10的比例，即100毫升乙醇中加入10克窖泥，摇床震荡破碎窖泥，一般不超 过30分钟，辅助超声设备，尽量控制在10分钟以内，静止待产生澄清层，吸 取合适的乙醇，0.45微米有机滤膜过滤，气质色谱检测，可以有效定量检测窖 泥浸出微量成分。

Claims (2)

1.一种窖泥中微量成分萃取定量方法，其特征是利用固液萃取技术，筛选合适的溶剂萃取窖泥中微量成分并对萃取微量成分进行定量分析，具体按如下步骤进行：
（1）标准曲线的制备：针对窖泥中的微量成分进行气质联用仪技术定量，根据拷贝数与CT值构建的标准曲线；
（2）萃取：称取窖泥，加入萃取剂乙醇和内标溶液放置摇床上，220转/分，震荡30分钟，静止足够时间待形成上清液，医用针管吸取2毫升左右，过0.45微米有机系滤膜，得测试样品；
(3)气相色谱-质谱联用：将获得的样品才用液体直接进样的方式检测，获得定量数值；
气相色谱条件为：
色谱柱为DB-WAX毛细管柱60m×0.25mm×0.25μm；
进样口温度230～250℃，质谱检测器温度230℃，载气He，流速0.8～1mL/min， 不分流进样；
程序升温条件为初始柱温40℃，以4～5℃/min上升至180℃，保持2～4min,然后 以5～6℃/min升温到230℃，保持5～15min；
质谱条件为：
气相色谱与质谱接口温度为230℃；
电离方式为电子轰击源EI；
监测方式为选择性离子扫描模式SIM，电离能量70eV；
溶剂延迟为2.0～2.5min；
(4)标准曲线的建立
a、配制标准物质储备液：称取白酒中各种微量成分化合物标准品，分别用无水乙醇配制成1～2mg/L的 单标储备液，采用棕色储液瓶于4℃冰箱中避光保存；
b、配制混合标准储备液：吸取各种微量化合物的单标储备液0.5mL混合，然后采用色谱纯 无水乙醇定容至50mL棕色容量瓶，获得混合标准储备液，于4℃冰箱中避光保存；
c、配制混合标准使用液：分别吸取混合标准储备液0.05mL、0.1mL、0.2mL、0.5mL、 1mL至50mL棕色容量瓶中，加入乙醇，然后用超纯水定容，配制成乙醇体积浓度为10％～15％的标准系列溶液；
d、对各混合标准使用液按步骤(2)、(3)进行处理，以各微量化合物标准品与内标物特征离子峰的峰面积之比为横坐标，以各种微量类化合物标准品与内标物的浓度之比为纵坐标绘制 标准曲线；
(5)检测：将待测窖泥按步骤(2)进行萃取，然后按照步骤(3)气相色谱-质谱联用进行定性定量分析，窖泥中各种微量成分含量（mg/克）＝色谱测定数值×100（溶剂）÷10（窖泥）÷（1-水分含量）。
2.根据权利要求1所述的窖泥中微量成分萃取定量方法，其特征是窖泥和萃取剂乙醇按照质量比1：10的比例添加。
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