CN101893615A - 一种中国白酒中非糠壳带来的土霉异味化合物土臭素的测定方法 - Google Patents

一种中国白酒中非糠壳带来的土霉异味化合物土臭素的测定方法 Download PDF

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Abstract

一种中国白酒中非糠壳带来的土霉异味化合物土臭素的测定方法，属于酒风味研究领域。本发明运用顶空固相微萃取(HS-SPME)和气相色谱-质谱(GC-MS)联用技术，建立了快速定量白酒中一种较为常见的土霉异味化合物土臭素(geosmin，简写为GSM)的方法。优化了这些异味物质在白酒中萃取条件，以得到最佳萃取条件。最佳的萃取条件为：将白酒的酒精度稀释到3％-12％vol，采用顶空方式(HS-SPME)，在40-60℃下恒温萃取30-45分钟。该方法在检测范围内有很好的线性关系(R2＞0.99)。该土霉异味化合物土臭素的检测限(LOD)低于相应化合物的阈值。结果表明本发明方法是一种具有很好的选择性和灵敏性的定量方法，适合白酒中具有较低阈值的异味化合物的研究。

Description

一种中国白酒中非糠壳带来的土霉异味化合物土臭素的测定方法 
技术领域
一种中国白酒中非糠壳带来的土霉异味化合物土臭素的测定方法，具体涉及应用顶空固相微萃取与气相色谱-质谱联用技术发现和检测白酒中常见的非糠壳带来的土霉异味化合物土臭素的方法，属于酒风味研究领域。 
背景技术
由于白酒生产为开放式混菌发酵，在发酵过程中由于污染杂菌，管理不善等原因往往会产生异味。白酒中常见的异味有霉味、蘑菇味、臭味、酸味等。Darriet等人研究发现葡萄酒中土腥味主要由geosmin产生(Identification andQuantification of Geosmin，an Earthy Odorant Contaminating Wines，J.Agric.FoodChem.2000，48，4835-4838)。Geosmin译为土臭素、土臭味素或土味素。相关资料见：http://www.hudong.com/wiki/％E5％9C％9F％E8％87％AD％E7％B4％A0
La Guerche等人研究腐烂酿酒葡萄中的异味，发现主要有1-octen-3-one，1-octen-3-ol等产生的蘑菇味和2-Methylisobomeol，土臭素产生的土腥味。这些物质可以通过发酵传递到葡萄酒中。在我国白酒中也已经检测到土臭素，该重要异味化合物的感官特征描述为：土霉或糠嗅味(土霉异味)。但经过对清蒸前后的糠壳风味进行验证，该化合物并非白酒界传统认为的来自糠壳中的异味物质。由于它们具有极低的风味阈值，可在较低浓度下对白酒的风味造成较大的破坏，近年来，越来越受到人们的重视。 
发明内容
白酒中土霉异味化合物含量甚微，大多是在几十个ng/L到几十个μg/L，其定性定量检测存在一定困难。固相微萃取(SPME)集采样、萃取、浓缩于一身。该方法由最初主要用于水中污染物的检测，逐渐应用到食品风味分析中，如蔬菜、水果、果汁、乳制品等的风味分析。Setkova L等人也运用该法分析冰葡萄酒中的香气物质。SPME在白酒中微量成分分析中也有较多运用。Fan和Qian应用HS-SPME方法分析中国白酒的风味成分，认为该HS-SPME法适用于白酒风味成分的检测。 
(1)解决的技术问题 
本发明的目的在于提供一种利用顶空固相微萃取与气相色谱-质谱联用技术发现和测定白酒中土霉异味化合物土臭素的方法，以对中国各种香型的白酒进行土霉异味物质的定性定量分析。 
(2)本发明的技术方案：一种中国白酒中非糠壳带来的土霉异味化合物geosmin的测定方法，该土霉异味化合物geosmin的感官特征描述为：土霉或糠嗅味，即称之为土霉异味；测定方法包含待测白酒酒样稀释，用顶空固相微萃 取技术富集白酒中土霉异味化合物geosmin，再用气相色谱-质谱对白酒中土霉异味化合物geosmin进行定性定量分析；待测的土霉异味化合物为geosmin(简写为GSM)。 
(1)酒样稀释：用双蒸水将待测白酒酒样稀释到最终酒精含量为3％-12％vol；(2)顶空固相微萃取：取稀释到3％-12％vol的目标白酒酒样50mL，加入500μL内标储备液；吸取已加内标的稀释后的白酒酒样8mL放入20mL顶空瓶中，并加入3g NaCl，旋紧瓶盖，用装有50/30μm DVB/CAR/PDMS萃取头的固相微萃取自动进样器对装入顶空瓶中的酒样中风味成分进行萃取，于40-60℃恒温搅拌萃取30-45分钟； 
(3)气相色谱-质谱联用：萃取完毕后将萃取头取出，插入气相色谱进样口250℃热解吸5分钟，毛细管柱CP-Wax，60m×0.25mmi.d.×0.25μm，进样口和检测器温度均为250℃，载气为He，流速2mL/分钟；不分流；检测时的升温程序为：50℃恒温2分钟，以6℃/分钟的速度升温至230℃，保持15分钟；MS条件：EI电离源，电子能量70eV，离子源温度230℃，扫描范围35.00～350.00amu，得到被测白酒酒样的总离子流图谱； 
(4)土霉异味化合物的定性分析：通过比对土霉异味未知化合物与geosmin标准品在极性柱和非极性柱中的保留指数，NIST 05 a.L Database(AgilentTechnologies Inc.)、AMDIS、Wiley 275.L database三种图谱库中标准离子碎片图谱比对，及直接添加geosmin标准品到被测白酒酒样中比较GC-MS峰值变化，综合考察确认检测土霉异味化合物geosmin； 
(5)土霉异味化合物geosmin的定量分析： 
内标溶液的配制：准确称取0.01g L-(-)-薄荷醇(L-(-)-menthol)标准品用色谱纯乙醇定容配制于100mL容量瓶中作为内标储备液。 
模拟白酒的配制：采用煮沸冷却后超纯水(Milli-Q系统，Millipore，Badford，MA，USA)配制的3％-12％vol乙醇水溶液，作为模拟白酒； 
混合标准溶液的配制：准确称取0.1g geosmin的标准品用色谱纯乙醇定容配制于10mL容量瓶中，再吸取此溶液加入到模拟白酒中配制成0.02-3.00μg/L浓度梯度的混合标准溶液，每一浓度梯度的混合标准溶液中均加入10μL内标储备液，依次对每一浓度梯度的混合标准溶液进行顶空固相微萃取：准确吸取已加内标的8mL配制好的混合标准溶液于15mL顶空瓶中，加入3g NaCl，旋紧瓶盖，于40-60℃恒温萃取30-45分钟； 
以土霉异味化合物geosmin与内标物峰面积之比为纵坐标，geosmin浓度为横坐标绘制标准曲线； 
酒样测定：取稀释到3％-12％vol的目标白酒酒样50mL，加入10μL内标储备液，将该溶液进行顶空固相微萃取，气相色谱-质谱进行定量分析，比照标准 曲线测定被测白酒酒样中土霉异味化合物geosmin含量。 
土霉异味化合物geosmin在所测范围内具有良好的线性关系，其线性相关系数R2均大于0.99。 
土霉异味化合物geosmin检测限小于10ng/L；3次重复测定4种分别属于老白干香型，凤香型，酱香型，清香型的白酒酒样(酒样1，酒样2，酒样3，酒样5)中土霉异味化合物的相对标准偏差小于12％，测定4种白酒中的土霉异味化合物的回收率为82％-115％。 
主要试剂与材料： 
geosmin和L-(-)-薄荷醇(L-(-)-menthol)，乙醇(色谱纯)均购于美国Sigma公司；NaCl(分析纯)购于上海国药集团。 
白酒样品：以六种不同香型的白酒为研究对象，分别编号为酒样1(老白干香型)，酒样2(凤香型)，酒样3(酱香型)，酒样4(兼香型)，酒样5(清香型)，酒样6(浓香型)。 
主要仪器： 
微萃取头：加拿大Supelco公司 
固相微萃取自动进样器(MPS 2)：德国Gerstel公司 
气相色谱质谱联用仪：GC 6890-MS 5975：美国Agilent公司 
回收率测定：将含有土霉异味化合物的9个浓度梯度的混合标准溶液加入到3％-12％vol乙醇水溶液及6种不同香型的白酒中测定加标回收率，每个酒样平行3次。 
酒样测定：本发明选取了6种不同香型的白酒为目标酒样，将白酒稀释到3％-12％vol，加入内标使内标的最终浓度为5μg/L，按上述方法测定其中土霉异味化合物geosmin含量。表3列出了所测酒样中土霉异味化合物geosmin的含量。 
(3)有益效果 
本发明经过对SPME的萃取方式，萃取酒度，萃取温度，萃取时间优化，建立了顶空固相微萃取技术(HS-SPME)结合气相色谱-质谱(GC-MS)的geosmin定性定量测定方法。该方法具有灵敏、快速、简便的优点。能够对白酒中含量在ng/L或μg/L级别的geosmin微量异味成分进行准确定量。 
附图说明
图1不同萃取方式对萃取效果的影响，HS表示顶空萃取，DI表示浸入萃取。 
图2不同酒精含量对萃取效果的影响。 
图3不同萃取温度对萃取效果的影响。 
图4不同萃取时间对萃取效果的影响。 
图5添加geosmin标准品前后的MS图谱重叠比较。 
具体实施方式
实施例1 
固相微萃取条件的优化： 
选取DVB/CAR/PDMS作为萃取头，并比较了两种SPME萃取方式——浸入和顶空对本研究所分析化合物的萃取效果。结果显示，顶空萃取方式有更好的萃取效果。并且，采用顶空方式萃取可以避免萃取头和样品液体的接触，从而减少样品对涂层的破坏作用，延长萃取头的使用寿命。 
萃取温度对吸附采样的影响具有双面性：一方面，温度升高时较多的分析物会从基质中逸出进入液上空间，从而有利于顶空固相微萃取；另一方面，温度升高也会降低萃取头吸附分析组分的能力，使得吸附量下降。本发明比较了30℃，40℃，50℃，60℃，70℃，80℃的萃取效果，结果表明40-60℃时吸附效果最佳。 
固相微萃取过程是被分析物在样品基质和萃取头涂层间的一个富集平衡的过程，一旦达到平衡，被分析物在两相间的浓度达到恒定。本发明比较了30分钟，45分钟，60分钟，75分钟和90分钟的萃取效果，结果表明萃取时间为30-45分钟时达到萃取平衡。 
此外，乙醇的浓度高低会直接影响萃取头对挥发性物质的吸附效果。随着酒精度的增高，萃取的效果会降低，甚至有可能产生萃取头对挥发性物质和乙醇的竞争性吸附。由于白酒的酒精度较高，直接萃取可能不利于酒中香味成分的富集。将待分析酒样稀释的目的是降低酒精的浓度，使目的物更容易从液相散发到气相中，进而有利于顶空方式的萃取。但是，随着酒精度的降低，酒中含有微量风味成分的浓度也会降低，甚至无法检测，所以需选择合适的稀释度。基于以上原因，将白酒样品稀释到不同酒精度数，从中找到合适于SPME萃取目的化合物的合适的稀释度。由图2可知，geosmin在酒精含量为3％-12％vol时萃取效果最佳(图2中的检测点为5％vol、10％vol两个点)。 
综合所有优化试验的结果，最终白酒稀释为3％-12％vol，将SPME条件定为顶空方式，40-60℃下，恒温搅拌吸附30-45分钟，结果见图1，图2，图3和图4。 
实施例2 
方法的评价： 
该方法对于每种物质有很宽的线性范围，并且在线性范围内有很好的线性关系(R2＞0.99)，说明该方法的适用范围较广。以信噪比等于3为标准，计算每种被分析物的检测限(LOD)，参照表1中各物质的阈值可知，各物质的检测限低于该物质在白酒中的阈值。满足对于一些低阈值，低含量的物质的定量检测。见表1。 
表1定量方法的线性及检测限 
  物质名称   R2   n  线性范围(μg/L)   线性方程  LOD(ng/L)
  geosmin   0.9997   6  0.02-3.00   y＝0.2125+0.0059  6.91
另外，在不同香型白酒及模拟酒中添加相近浓度的geosmin标准品，计算该浓度下的回收率和相对标准偏差(RSD)。由表2可知，该方法对于每种检测物质都有很好的准确性和精确性，完全能够满足分析的要求。 
表2各酒样及模拟酒中各物质回收率及精密度(n＝3)计算 
Figure BSA00000173430500051
酒样4和酒样3是同一香型、不同品牌的酒样，酒样6和酒样5是同一香型、不同品牌的酒样，所以酒样4、酒样6的数据略。 
实施例3 
实际酒样的测定： 
本发明选取了分别属于酱香型，浓香型，清香酒型，兼香型的酒样1，酒样2，酒样3，酒样4，酒样5，酒样6为目标酒样，将这6种白酒稀释到3％-12％vol，取50mL，加入10μL内标，按上述方法测定其中土霉异味化合物geosmin含量。表3列出了所测酒样中土霉异味化合物geosmin的含量。 
表3各香型白酒中geosmin的含量 
Figure BSA00000173430500052
ND：未检测到。 

Claims (3)

1.一种中国白酒中非糠壳带来的土霉异味化合物土臭素的测定方法，其特征在于该土霉异味化合物土臭素的感官特征描述为：土霉或糠嗅味，即称之为土霉异味；测定方法包含待测白酒酒样稀释，用顶空固相微萃取技术富集白酒中土霉异味化合物土臭素，再用气相色谱-质谱对白酒中土霉异味化合物土臭素进行定性定量分析；
(1)酒样稀释：用双蒸水将待测白酒酒样稀释到最终酒精含量为3％-12％vol；
(2)顶空固相微萃取：取稀释到3％-12％vol的目标白酒酒样50mL，加入500μL内标储备液；吸取已加内标的稀释后的白酒酒样8mL放入20mL顶空瓶中，并加入3g NaCl，旋紧瓶盖，用装有50/30μm DVB/CAR/PDMS萃取头的固相微萃取自动进样器对装入顶空瓶中的酒样中风味成分进行萃取，于40-60℃恒温搅拌萃取30-45分钟；
(3)气相色谱-质谱联用：萃取完毕后将萃取头取出，插入气相色谱进样口250℃热解吸5分钟，毛细管柱CP-Wax，60m×0.25mm i.d.×0.25μm，进样口和检测器温度均为250℃，载气为He，流速2mL/分钟；不分流；检测时的升温程序为：50℃恒温2分钟，以6℃/分钟的速度升温至230℃，保持15分钟；MS条件：EI电离源，电子能量70eV，离子源温度230℃，扫描范围35.00～350.00amu，得到被测白酒酒样的总离子流图谱；
(4)土霉异味化合物的定性分析：通过比对土霉异味未知化合物与土臭素标准品在极性柱和非极性柱中的保留指数，NIST 05a.L Database、AMDIS、Wiley275.L database三种图谱库中标准离子碎片图谱比对，及直接添加土臭素标准品到被测白酒酒样中比较GC-MS峰值变化，综合考察确认检测土霉异味化合物土臭素；
(5)土霉异味化合物土臭素的定量分析：
内标溶液的配制：准确称取0.01g L-(-)-薄荷醇标准品用色谱纯乙醇定容配制于100mL容量瓶中作为内标储备液；
模拟白酒的配制：采用煮沸冷却后超纯水配制的3％-12％vol乙醇水溶液，作为模拟白酒；
混合标准溶液的配制：准确称取0.1g土臭素的标准品用色谱纯乙醇定容配制于10mL容量瓶中，再吸取此溶液加入到模拟白酒中配制成0.02-3.00μg/L浓度梯度的混合标准溶液，每一浓度梯度的混合标准溶液中均加入10μL内标储备液，依次对每一浓度梯度的混合标准溶液进行顶空固相微萃取：准确吸取已加内标的8mL配制好的混合标准溶液于15mL顶空瓶中，加入3g NaCl，旋紧瓶盖， 于40-60℃恒温萃取30-45分钟；
以土霉异味化合物土臭素与内标物峰面积之比为纵坐标，土臭素浓度为横坐标绘制标准曲线；
酒样测定：取稀释到3％-12％vol的目标白酒酒样50mL，加入10μL内标储备液，将该溶液进行顶空固相微萃取，气相色谱-质谱进行定量分析，比照标准曲线测定被测白酒酒样中土霉异味化合物土臭素含量。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于土霉异味化合物土臭素在所测范围内具有良好的线性关系，其线性相关系数R2均大于0.99。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于土霉异味化合物土臭素检测限小于10ng/L；3次重复测定4种分别属于老白干香型，凤香型，酱香型，清香型的白酒酒样中土霉异味化合物的相对标准偏差小于12％，测定4种白酒中的土霉异味化合物的回收率为82％-115％。 
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