CN103030678B

CN103030678B - 一种利用丙二酰基人参皂苷制备人参稀有皂苷的方法

Info

Publication number: CN103030678B
Application number: CN201210565188.5A
Authority: CN
Inventors: 刘志; 孙光芝; 阮长春
Original assignee: Jilin Agricultural University
Current assignee: Jilin Agricultural University
Priority date: 2012-12-24
Filing date: 2012-12-24
Publication date: 2015-02-18
Anticipated expiration: 2032-12-24
Also published as: CN103030678A

Abstract

本发明提供了一种利用丙二酰基人参皂苷制备人参稀有皂苷的方法，将鲜人参粉碎，室温下用乙醇超声提取，减压回收溶剂，浓缩为水溶液，水溶液用正丁醇萃取，萃取后的水层放到高压锅中蒸煮，取出蒸煮过的水层上大孔树脂柱，用乙醇洗脱，回收乙醇后，得到稀有人参皂苷20R-Rg₃、20S-Rg₃、Rg₅和Rk1。此方法最大限度地将丙二酰基人参皂苷转化成药用价值极高的人参稀有皂苷，具有操作简单、快速、成本低廉、转化率高，为人参稀有皂苷工业化生产、新药制备提供方法保证。

Description

一种利用丙二酰基人参皂苷制备人参稀有皂苷的方法

技术领域

本发明涉及人参皂苷制备方法，公开了一种用丙二酰基人参皂苷制备人参稀有皂苷20R-Rg₃、20S-Rg₃、Rk1和Rg₅的方法，属于中医药有效成分提取分离技术领域。

背景技术

本发明涉及的丙二酰基人参皂苷（Malonyl-ginsenosides）是人参中的天然原苷，又叫丙二酸单酰基人参皂苷，也被称为酸性皂苷，主要包括丙二酰基人参皂苷-Rb₁、-Rb₂、-Rc和 -Rd。1983年，Kitagawa 等首次报道了从日本产生晒参中分离出4种丙二酰基人参皂苷；周雨等（1998）从西洋参中分离出了丙二酰基人参皂苷Rb₁；孙光芝等（2007）从国产鲜人参中分离鉴定了5种丙二酰基人参皂苷（M-Rb₁, M-Rb₂, M-Rc, M-Rd, M-NR₄）, 其中M-NR₄是首次获得的新化合物。Chuang等（1995）报道了不同人参制品中丙二酰基人参皂苷的含量占人参总皂苷含量的35-60%。Kite 等（2003）采用液质联用分析了人参、西洋参和三七中丙二酰基人参皂苷，认为丙二酰基人参皂苷各单体成分在这些药材中的比例不同，可以作为化学特征用来区分这些药材。然而由于丙二酰基人参皂苷极易溶于水，不溶于乙醇，难容于正丁醇、氯仿等，在人参皂苷工业化生产中多数随水杂而流失，造成植物资源的巨大浪费。

人参皂苷按照苷元的结构不同分为二醇型人参皂苷(PPD)、三醇型人参皂苷(PPT)和齐墩果酸型人参皂苷。PPD 和PPT 型人参皂苷都属于达玛烷型四环三萜类化合物,在人参皂苷中占大多数。稀有人参皂苷,如人参皂苷Rg₃、F₂、compound K、Rh₂、Rh₃等，在人参中微量存在或不存在。最新药理学研究表明, 这些稀有人参皂苷具有多种生理活性，其中抗癌活性非常显著。

目前人参的加工品主要有生晒参、红参和黑参，研究表明在鲜人参和生晒参中有大量的丙二酰基人参皂苷的存在；而红参在加工的过程中需要在95-100℃下蒸煮2-3小时，黑参需要在98℃下蒸煮9次，每次3小时，由于丙二酰基人参皂苷分子中酰基键不稳定，在加热条件下会发生水解反应脱去丙二酰基，生成相应的中性人参皂苷（由丙二酰基人参皂苷-Rb₁、-Rb₂、-Rc、-Rd转化成人参皂苷-Rb₁、-Rb₂、-Rc、-Rd），所以在红参和黑参中没有丙二酰基人参皂苷。Sun等（2009）报道了采用HPLC-ELSD同时检测生嗮参、红参和黑参中19种皂苷的方法,结果显示在红参中仅有少量的稀有皂苷的存在，而黑参由于蒸煮9次，中性皂苷也发生了大量的转化，产生了许多稀有人参皂苷如Rh₄、Rg₃、 Rg₅、 F4、 Rg₆、 Rk3、 Rs₃、 Rs₄等。为了获得更多的人参稀有皂苷的转化率，许多研究采用更高的温度蒸煮人参。Sun等（2011）报道了使用高压锅120℃下蒸煮人参、西洋参和三七4小时，结果这些药材中的中性人参皂苷大部分转化成稀有皂苷，转化途径为二醇型皂苷Rb₁、Rb₂、Rc和 Rd 转化成Rg₃,Rg₃再转化成Rh₂、Rg₅和Rk1。三醇型皂苷Rg₁、Re、Rf 和Rg₂转化成Rh₁，Rh₁再转化成Rk3和Rh₄。然而丙二酰基人参皂苷在高温蒸煮下是如何变化的未见文献报道。

发明内容

本发明公开一种从丙二酰基人参皂苷制备人参稀有皂苷20R-Rg₃、20S-Rg₃、Rg₅和Rk1的方法，可以最大限度的利用丙二酰基人参皂苷，解决了现有制备工艺产品流失大的缺点。

本发明的技术解决方案包括以下步骤：

将(原皮)鲜人参和西洋参为原料，粉碎，用60-90%的乙醇（投药量于乙醇用量之比为1/10-1/20）在室温下超声提取2-6次，每次20-60分钟，将提取液在40℃条件下减压回收溶剂，浓缩为水溶液，水溶液用正丁醇萃取3-6次，水层放到高压锅中110-150℃蒸煮10-40分钟，取出蒸煮过的水层上大孔树脂柱D₁₀₁，先用水洗五个柱体积，再用50-90%乙醇洗脱，回收乙醇后，得到稀有人参皂苷20R-Rg₃、20S-Rg₃、Rg₅和Rk1混合物。

本发明产品可以制成片剂、胶囊剂、粉剂或注射剂等药物学上的任何剂型，用于治疗癌症,肿瘤，糖尿病，高血脂症，心肌或脑缺血，机体免疫功能受损，以及消化系统等疾病。

本发明的积极效果在于：采用新方法对丙二酰基人参皂苷进行了全转化，既M- Rb₁、M- Rb₂、 M-Rc、M-Rd转化成20R-Rg₃、20S-Rg₃、Rg₅和Rk1。充分利用了人参资源，最大限度地提取、富集人参稀有皂苷，达到简单、快速、低成本富集的目的，为工业化生产、新药制备提供方法保证。

为了进一步说明本发明方法中丙二酰基人参皂苷转化成稀有人参皂苷的途径和转化率，以下采用高效液相色谱法对转化过程和转化产物进行了定量分析实验。

1 实验材料和试剂

鲜人参采自抚松县，经吉林农业大学中药材学院郑毅男教授鉴定。色谱级乙腈（美国Fisher公司），其他试剂为分析纯。酸性皂苷标准品M-Rb₁、M-Rb₂、M-Rc和M-Rd（为自制，经IR、MS、NMR鉴定， HPLC测定其纯度在99 %以上）；人参皂苷 Rb₁、Rb₂、Rc、Rd、20R-Rg₃、20S-Rg₃、Rg₅和Rk1标准品（中国药品生物制品检验所）。

2 实验方法

2.1 标准品溶液的配置：精密称取人参单体皂苷M-Rb₁、M-Rb₂、M-Rc、M-Rd、Rb₁、Rb₂、Rc、Rd、20R-Rg₃、20S-Rg₃、Rg₅和Rk1标准品各适量，用30%乙腈定容,得到浓度分别为1.000 mg/mL混和标准品储备液，摇匀，即得，4 ℃下低温储藏。

2.2 待测试样品的制备：鲜人参根粉碎，精密称取10 g，用80%乙醇200 mL超声提取3次，每次30 min, 40 ℃下浓缩提取液至20 mL，然后用正丁醇萃取4次，水层放于高压锅120℃下蒸煮30 min。将蒸煮后的水层浓缩至干，用30%乙腈溶解，定容至100 mL量瓶中，摇匀放置，用前以0.25μm的滤膜过滤，作为供试品溶液。另取一份已知含量的人参中性皂苷（Rb₁、Rb₂、Rc、Rd）粉末0.5g,溶于20 mL蒸馏水中，在同样条件下蒸煮，蒸后取出定容至100 mL量瓶中，摇匀放置，用前以0.25μm的滤膜过滤。

2.3色谱条件：色谱柱COSMOSIL 5C18-MS（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈(A)和0.05 mol/L磷酸二氢钾溶液(B)；洗脱梯度为：0-30 min, 26%(A); 30-35 min，26%-32%(A); 35-50 min, 32%-50% (A); 50-80 min, 50%-80%(A)。柱温：25 ℃；检测波长：203 nm；流速：1.5 mL/min；进样量：20μL；分析时间：80 min。

2.4 标准曲线的绘制：分别吸取上述对照品母液10，20，40，80，160，320，640 μL，分别置于1 mL量瓶中，加30%乙腈稀释至刻度，制备成不同浓度的系列对照品溶液，分别精密吸取系列对照品溶液各20μL进样。以色谱峰面积(Y)为纵坐标，浓度(X)为横坐标。线性回归得标准曲线。

3 实验结果

结果表明丙二酰基人参皂苷在蒸煮后全部转化成了稀有皂苷20R-Rg₃、20S-Rg₃、Rg₅和Rk1（见附图1和附图2），转化率达到了100%，4种稀有皂苷20R-Rg₃、20S-Rg₃、Rg₅和Rk1的含量明显增加（见表1）。而中性皂苷在蒸煮前后并未发生转化，这与其蒸煮时间较短有关，文献报道中性皂苷在蒸煮4小时后发生转化，说明丙二酰基人参皂苷更加不稳定，转化所需时

表1. 丙二酰基人参皂苷提取液蒸煮前后HPLC-UV比较分析结果（%）

样品

MRb₁

MRc

MRb₂

MRd

S-Rg3

R-Rg3

Rg5

Rk1

蒸煮后

N.D.

0.259

0.204

0.331

0.384

蒸煮前

0.554

0.297

0.335

0.151

N.D.

注：N.D.:未检测到

间更短。根据以上结果可以推断出丙二酰基人参皂苷的转化途径为：由M-Rb₁、M-Rb₂、M-Rc、 M-Rd直接转化成20R-Rg₃和20S-Rg₃，再由20R-Rg₃和20S-Rg₃转化成Rg₅和Rk1（见图3）。

附图说明

图1：丙二酰基人参皂苷经正丁醇萃取后的HPLC 图

图2：丙二酰基人参皂苷经蒸煮后的HPLC图

图3：丙二酰基人参皂苷转化成稀有皂苷的途径

图4：人参皂苷20R-Rg₃、20S-Rg₃、Rg₅和Rk1的制备方法流程图

具体实施方式

通过以下实施例进一步举例描述本发明，并不以任何方式限制本发明，在不背离本发明的技术解决方案的前提下，对本发明所作的本领域普通技术人员容易实现的任何改动或改变都将落入本发明的权利要求范围之内。

实施例1

将(原皮)鲜人参为原料，粉碎，用80%的乙醇（投药量于乙醇用量之比为1/10）在室温下超声提取5次，每次20分钟，将提取液在40℃条件下减压回收溶剂，浓缩为水溶液，水溶液用正丁醇萃取3次，水层放到高压锅中150℃蒸煮10分钟，取出蒸煮过的水层上大孔树脂柱D₁₀₁，先用水洗五个柱体积，再用90%乙醇洗脱，回收乙醇后，得到稀有人参皂苷20R-Rg₃、20S-Rg₃、Rg₅和Rk1混合物。

实施例2

将(原皮)鲜人参为原料，粉碎，用70%的乙醇（投药量于乙醇用量之比为1/20）在室温下超声提取3次，每次30分钟，将提取液在40℃条件下减压回收溶剂，浓缩为水溶液，水溶液用正丁醇萃取4次，水层放到高压锅中120℃蒸煮30分钟，取出蒸煮过的水层上大孔树脂柱D₁₀₁，先用水洗五个柱体积，再用60%乙醇洗脱，回收乙醇后，得到稀有人参皂苷20R-Rg₃、20S-Rg₃、Rg₅和Rk1混合物。

实施例3

将(原皮)鲜人参为原料，粉碎，用60%的乙醇（投药量于乙醇用量之比为1/15）在室温下超声提取2次，每次50分钟，将提取液在40℃条件下减压回收溶剂，浓缩为水溶液，水溶液用正丁醇萃取6次，水层放到高压锅中110℃蒸煮40分钟，取出蒸煮过的水层上大孔树脂柱D₁₀₁，先用水洗五个柱体积，再用80%乙醇洗脱，回收乙醇后，得到稀有人参皂苷20R-Rg₃、20S-Rg₃、Rg₅和Rk1混合物。

实施例4

将(原皮)西洋参为原料，粉碎，用90%的乙醇（投药量于乙醇用量之比为1/12）在室温下超声提取6次，每次20分钟，将提取液在40℃条件下减压回收溶剂，浓缩为水溶液，水溶液用正丁醇萃取5次，水层放到高压锅中120℃蒸煮30分钟，取出蒸煮过的水层上大孔树脂柱D₁₀₁，先用水洗五个柱体积，再用80%乙醇洗脱，回收乙醇后，得到稀有人参皂苷20R-Rg₃、20S-Rg₃、Rg₅和Rk1混合物。

实施例5

将(原皮)西洋参为原料，粉碎，用75%的乙醇（投药量于乙醇用量之比为1/18）在室温下超声提取4次，每次30分钟，将提取液在40℃条件下减压回收溶剂，浓缩为水溶液，水溶液用正丁醇萃取3次，水层放到高压锅中140℃蒸煮20分钟，取出蒸煮过的水层上大孔树脂柱D₁₀₁，先用水洗五个柱体积，再用70%乙醇洗脱，回收乙醇后，得到稀有人参皂苷20R-Rg₃、20S-Rg₃、Rg₅和Rk1混合物。

实施例6

将(原皮)西洋参为原料，粉碎，用60%的乙醇（投药量于乙醇用量之比为1/20）在室温下超声提取2次，每次60分钟，将提取液在40℃条件下减压回收溶剂，浓缩为水溶液，水溶液用正丁醇萃取5次，水层放到高压锅中110℃蒸煮40分钟，取出蒸煮过的水层上大孔树脂柱D₁₀₁，先用水洗五个柱体积，再用50%乙醇洗脱，回收乙醇后，得到稀有人参皂苷20R-Rg₃、20S-Rg₃、Rg₅和Rk1混合物。

Claims

1.一种利用丙二酰基人参皂苷制备人参稀有皂苷的方法，包括以下步骤：

以鲜人参或西洋参为原料，粉碎，用10-20倍量60-90%的乙醇，在室温下超声提取2-6次，每次20-60分钟，将提取液在40℃条件下减压回收溶剂，浓缩为水溶液，水溶液用正丁醇萃取3-6次，萃取后的水层放到高压锅中110-150℃下蒸煮10-40分钟，取出蒸煮过的水层上大孔树脂柱D₁₀₁，先用水洗五个柱体积，再用50-90%乙醇洗脱，回收乙醇后，得到稀有人参皂苷20R-Rg₃、20S-Rg₃、Rg₅和Rk1。

2.根据权利要求1所述的制备人参稀有皂苷的方法，其特征在于：高压锅蒸煮温度为120℃，时间为30分钟。

3.根据权利要求1所述的制备人参稀有皂苷的方法，其特征在于：将鲜人参或西洋参粉碎，室温下用80%乙醇超声提取3次，减压回收溶剂，浓缩为水溶液，水溶液用正丁醇萃取4次，萃取后的水层放到高压锅中蒸煮。