CN104215494B

CN104215494B - 一种利用花粉作为固相萃取剂的样品前处理方法

Info

Publication number: CN104215494B
Application number: CN201410508905.XA
Authority: CN
Inventors: 冯钰锜; 卢倩; 余琼卫
Original assignee: Wuhan University WHU
Current assignee: Wuhan University WHU
Priority date: 2014-09-26
Filing date: 2014-09-26
Publication date: 2016-06-08
Anticipated expiration: 2034-09-26
Also published as: CN104215494A

Abstract

本发明涉及一种采用天然材料花粉作为固相萃取吸附剂的样品前处理方法。该方法首先通过极性溶剂索氏提取清洗，然后干燥，即得到花粉材料，该材料的清洗方法简单，安全易实施，原料便宜易得。利用该制备方法得到的材料重现性好，其作为固相萃取的填料用于植物、食品、环境和生物样品中极性化合物或含π电子化合物的分离和富集，具有除杂效果好，回收率高，稳定性好等特点。

Description

一种利用花粉作为固相萃取剂的样品前处理方法

技术领域

本发明属于分析化学技术领域，涉及一种采用天然产物花粉作为固相萃取的吸附介质的样品前处理方法。

背景技术

固相萃取(solidphaseextraction，固相萃取)是近年来发展迅速的样品前处理方法，其原理是基于待测物在液相溶剂和固相吸附剂之间的分配不同来进行保留和洗脱的。相比于传统的液液萃取，固相萃取具有简单、省时、不易乳化、有机溶剂消耗量低等优点，并同时能满足高回收率和高灵敏度的分析要求，因而被广泛应用于复杂基体中痕量分析物的萃取检测。对于固相萃取来说，吸附剂的选择是关键，然而大多数吸附剂的合成与制备过程较长，操作繁琐，变相增加了整个样品前处理的时间。

随着人们对绿色分析化学重视程度的提高，天然吸附剂显示出广阔的应用前景。与传统的合成吸附剂相比，天然吸附剂具有毒性小、来源广、成本低和处理简单等独特优点。

花粉是植物的雄性繁殖细胞，体积较小，粒径一般在10-100μm。花粉由花粉壁和原生质组成，花粉壁也分为外壁和内壁，外壁的主要成分是孢粉素。孢粉素是一种难分解、耐高温的物质，稳定性高，具有抗强酸、碱的特性，不溶于有机酸、无机酸、无机盐、脂溶剂等，它使花粉外壁变得非常牢固,保护花粉营养物质不受外界干扰。目前已有大量文献报道孢粉素的分子结构，由红外光谱、拉曼光谱等实验数据表明，花粉外壁含有极性羟基和疏水性芳香基等功能团，可以与分析物发生疏水作用、π-π作用、亲水作用和氢键作用等，因此可作为理想的固相萃取萃取材料。

发明内容

本发明针对上述问题，采用简单的清洗步骤，首次将天然产物花粉直接用作固相萃取的填料用于萃取分析。

本发明提供的技术方案具体如下：

一种利用花粉作为固相萃取剂的样品前处理方法，包括以下步骤：首先将经过清洗的花粉装入带有筛板的固相萃取空柱管中，不断敲打使填料填充均匀，上端盖上筛板压紧；然后用有机溶剂活化固相萃取柱体，然后在重力作用下使样品溶液流过固相萃取柱，接着加入清洗液洗去基体杂质，最后使用洗脱液将分析物洗脱收集到离心管中。

所述的有机溶剂为丙酮、正己烷、乙腈中的一种。

所述花粉的清洗方式包括以下步骤：将粒径为50μm的未破壁花粉置于索氏提取器中，然后加入极性有机溶剂，加热回流清洗，待花粉表面的杂质去除后，60℃真空干燥即可得到花粉固相萃取吸附剂。

清洗花粉所用的极性有机溶剂为甲醇、异丙醇、乙腈、丙酮中的一种。

所述的花粉为天然花粉。

花粉作为固相萃取吸附剂在样品中痕量化合物的富集和净化中的应用。

本发明采用花粉作为固相萃取的吸附剂：由于花粉的外壁相当稳定,具有耐高温，抗强酸、强碱的特性,以及不溶于有机酸、无机酸、无机盐、脂溶剂等性质，且花粉外壁富含极性羟基功能团，具有亲水性，能够与极性化合物如农药、生物碱、抗氧化剂等产生亲水作用、氢键作用等，因此花粉分离介质能应用于植物中激素分析、蔬果中农残分析及食品中抗氧化剂含量检测等；花粉外壁含有疏水性芳香基团，可应用于环境水样中有机污染物如农药、多环芳烃和多氯联苯等物质的分析检测。

本方法采用真空泵提供负压来驱动样品溶液，在进行萃取之前，首先用有机溶剂(如丙酮、正己烷、乙腈等)活化固相萃取柱体，然后在重力作用下使样品溶液流过固相萃取柱，接着采用适量体积清洗液洗去基体杂质，最后使用合适的洗脱液将分析物洗脱收集到离心管中，并将其在氮气下浓缩至干，加入一定的溶液重新溶解残渣后进入仪器进行定量分析。

本发明具有以下优点和有益效果：

(1)本发明花粉的清洗方法简单，安全易实施，原料便宜易得。

(2)本发明环境友好、方法简单、经济实惠，选用的天然材料性能稳定，可直接作为固相萃取的填料，用于复杂的植物、食品、环境和生物样品中化合物的萃取分析。

(3)本发明的花粉固相萃取剂重现性好，用于植物、食品、环境和生物样品中极性化合物或含π电子化合物的分离和富集，具有除杂效果好，回收率高，稳定性好等特点。

(4)本发明成功地应用于蔬果中植物生长调节剂的分析检测，花生油中白藜芦醇的萃取分析，环境水样中杀虫剂的含量测定等领域。

附图说明

图1为本方法选用花粉的扫描电镜图。

图2为本方法应用于花生油中白藜芦醇的萃取分析，在6种花生油中检测到的白藜芦醇。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明做进一步详细的描述，其具体实施方式可从以下实施例中得到进一步理解，但本发明的实施方式不限于此。

首先对花粉进行清洗处理：首先购买粒径适宜(约50μm)的未破壁花粉，然后将其置于索氏提取器中，然后加入极性有机溶剂，如甲醇、异丙醇、乙腈、丙酮等，加热回流清洗。待花粉表面的色素、油脂等杂质去除后，60℃真空干燥即可得到花粉固相萃取吸附剂；

实施例1：花粉应用于蔬果中植物生长调节剂的分析检测

八种常见的蔬果(黄瓜、豆芽、茄子、西红柿、西瓜、桃子、苹果和雪梨)，分别称取10g已经均质的蔬果样品于50mL塑料离心管中，加入15mL含1％乙酸的乙腈溶液，加入1.5g乙酸钠、6g硫酸镁、10g氯化钠，漩涡混合提取5min，以9000r/min离心10min，取上清液待测。

准确称取0.4g花粉于3mL带有筛板的固相萃取空柱管中，不断敲打使其填充均匀，上端盖上筛板压紧；在真空泵负压下，将2mL乙腈/水(90/10，v/v)溶液和2mL乙腈依次通过该固相萃取萃取柱，流速小于1mL/min；接着将上述1mL蔬果乙腈提取液加入固相萃取柱，使其在重力作用下缓慢流过萃取柱；然后加入1mL乙腈作为清洗液，保持流速小于1mL/min通过萃取柱，以去除吸附在柱上的残余色素，并在真空泵负压下将清洗液抽干；最后加入1.5mL乙腈/水/甲酸(70/28/2，v/v/v)溶液作为洗脱液，保持其流速小于1mL/min通过萃取柱并在真空泵负压下将洗脱液抽干，收集洗脱物于离心管中，置于40℃氮吹下浓缩至干，用100uL纯水溶解残渣，取2uL进入超高效液相色谱-串联质谱(UHPLC-MS/MS)。

液相色谱条件：C18色谱柱(100mm×3.0mmi.d.,1.7μm)；流动相A：含0.1％甲酸的水溶液，流动相B：乙腈；进样量2uL；流速：0.5mL/min；柱温：40℃。梯度洗脱程序(以下百分数均为体积百分数)：1min5％B，15min5-70％B，4min70-95％B，3min95-5％B和2min5％B。

质谱条件：离子源：电喷雾离子源(ESI)；扫描方式：多反应监测(MRM)；5500V(ESI+)和-4500V(ESI-)；雾化器压力(GS1)：40psi；气帘气电压(CUR)：35psi；辅助气压力(GS2)：55psi；离子源温度(TEM)：600℃；CAD：Medium；扫描时间：0.1s。

检测结果：对八种蔬果的加标回收率为80.5-117.3％，RSD≤15.0％。

花粉应用于蔬果中植物生长调节剂检测的加标回收率(％),相对标准偏差(RSD％,n＝3)和实际样品残留量(μg·kg^-1)，检测结果见以下表格。

其中：*表示实验所用三种有机样品由作者种植，未添加任何植物生长调节剂，以排除花粉假阳性现象；Nd表示未检出植物生长调节剂。

实施例2：花粉应用于花生油中白藜芦醇的萃取分析

分别称取2g六种常见的花生油于10mL容量瓶中，加入正己烷稀释至刻度线，以待用。

准确称取0.3g花粉于3mL带有筛板的固相萃取空柱管中，不断敲打使其填充均匀，上端盖上筛板压紧；在真空泵负压下，将3mL丙酮和2mL正己烷依次通过该固相萃取萃取柱，流速小于1mL/min；接着将2mL上述上样液加入固相萃取柱，使其在重力作用下缓慢流过萃取柱；然后加入3mL正己烷/异丙醇(80/12，v/v)溶液作为清洗液，保持流速小于1mL/min通过萃取柱，以去除吸附在柱上的残余基质，并在真空泵负压下将清洗液抽干；最后加入1.5mL异丙醇作为洗脱液，保持其流速小于1mL/min通过萃取柱并在真空泵负压下将洗脱液抽干，收集洗脱物于离心管中，置于35℃氮吹下浓缩至干，用200uL色谱纯异丙醇溶解残渣，取10uL进入高效液相色谱紫外检测仪(HPLC-UV)分析。

采用HPLC-UV进行定量检测，分析柱为C18柱(150mm×4.6mmi.d.,5μm)；流动相条件为A：含0.2％乙酸的水溶液，流动相B：乙腈，流动相为A/B(70/30，v/v)，流速为1mL/min；柱温为40℃；检测器波长为306nm。

检测结果：对六种花生油的加标回收率为70.8％至94.9％，RSD≤2.2％。附图2为在花生油中检测到的白藜芦醇。

实施例3：花粉应用于环境水样中杀虫剂的含量测定

五种环境水样(江、河、湖、自来水和农田水)，经滤膜过滤沉淀物以待用。

准确称取0.3g花粉于3mL带有筛板的固相萃取空柱管中，不断敲打使其填充均匀，上端盖上筛板压紧；在真空泵负压下，将3mL丙酮和2mL纯水依次通过该固相萃取萃取柱，流速小于1mL/min；接着将10mL上述水样加入固相萃取柱，保持流速小于1mL/min流过萃取柱；然后加入5mL纯水作为清洗液，保持流速小于1mL/min通过萃取柱，以去除吸附在柱上的残余基质，并在真空泵负压下将清洗液抽干；最后加入1mL丙酮作为洗脱液，保持其流速小于1mL/min通过萃取柱并在真空泵负压下将洗脱液抽干，收集洗脱物于离心管中，置于35℃氮吹下浓缩至干，用200uL色谱纯丙酮溶解残渣，取1uL进入气相色谱-串联质谱(GC-MS)分析。

色谱条件：HP-5MS毛细管柱(30m×0.25mm×0.25μm)；进样口温度:250℃；无分流进样，瞬间不分流时间：1min，进样量1.0μL；载气(99.999％的高纯氦)流量1mL/min。升温程序：初始温度150℃，保持1min，以7℃/min升温至240℃，保持1min，再以10℃/min升温至280℃，保持3min，最后以20℃/min升温至300℃，保持5min。

质谱条件：电子轰击源(ElectronImpact,EI)，电子能量为70eV，离子源温度250℃，接口温度300℃。选取SIM模式检测。

检测结果：对五种的加标回收率为63.2％至128.6％，RSD≤13.8％。

实施例4：花粉应用于血清样品中磷酸化多肽的预富集

取5μL血清样品用1％三氟乙酸(TFA)-50％乙腈(ACN)稀释至50μL，以待用。

称取100mg花粉于10mL20mMTi(SO₄)₂溶液中，浸泡12h，得到Ti⁴⁺固定花粉，经去离子水清洗后，置于60℃真空干燥箱中烘干待用。

将3μLTi⁴⁺固定花粉悬浮液(50mg/mL)加入到50μL稀释的血清样品中(含1％TFA-50％ACN，室温下涡旋10min后，用50μL1％TFA-50％ACN溶液清洗一次，再用50μL50％ACN溶液清洗一次，然后用50μL氨水(5％，v/v)将磷酸化多肽解吸下来。在整个操作过程中，材料都是通过离心作用从混合体系中分离出来。解吸液经真空离心浓缩仪抽干后，加入2μL基质溶液(20mg/mL2,5-DHB于50％ACN，1％H₃PO₄的水溶液中)溶解多肽。混合均匀后，取1μL样品点在MALDI靶上用于MALDI-TOFMS分析。

质谱条件：MALDIMS分析时采用波长为337nm的氮气激光器，其脉冲宽度为3ns；采用20kV的加速电压，在正离子反射模式下进行检测。每张谱图是500次激光扫描的平均结果。

检测结果：血清样品经稀释后，未经富集直接分析时，在谱图中观察不到磷酸化多肽的信号峰；而经过Ti⁴⁺固定花粉材料富集后，可以清晰地看到磷酸化多肽的峰，材料具有较好的特异性。

Claims

1.一种利用花粉作为固相萃取剂的样品前处理方法，其特征在于，包括以下步骤：首先将经过清洗的花粉装入带有筛板的固相萃取空柱管中，不断敲打使填料填充均匀，上端盖上筛板压紧；然后用有机溶剂活化固相萃取柱体，然后在重力作用下使样品溶液流过固相萃取柱，接着加入清洗液洗去基体杂质，最后使用洗脱液将分析物洗脱收集到离心管中；

所述的有机溶剂为丙酮、正己烷、乙腈中的一种；

2.根据权利要求1所述的样品前处理方法，其特征在于：所述的极性有机溶剂为甲醇、异丙醇、乙腈、丙酮中的一种。

3.根据权利要求2所述的样品前处理方法，其特征在于：所述的花粉为天然花粉。