CN109709198A

CN109709198A - 一种毛细管电泳的在线富集方法

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Publication number: CN109709198A
Application number: CN201811635477.1A
Authority: CN
Inventors: 曹君; 王秋燕; 董雪漫; 胡雨涵; 杨娟; 董新; 张芹
Original assignee: Hangzhou Normal University
Current assignee: Hangzhou Normal University
Priority date: 2018-12-29
Filing date: 2018-12-29
Publication date: 2019-05-03
Anticipated expiration: 2038-12-29
Also published as: CN109709198B

Abstract

本发明涉及天然药物提取技术领域，针对目前碘化物在线富集可持续操作时间有限的问题，公开了一种毛细管电泳的在线富集方法。该方法包括样品的处理和利用在线固相萃取‑毛细管电泳程序进行富集。该方法首次采用离子液体作为洗脱溶剂应用在在线固相萃取毛细管电泳的富集的技术中，并且应用在天然产物提取富集领域。经过富集方法处理之后，仪器的灵敏度大大提高，每种样品的检测限均比传统方法大大降低。本发明采用的离子液体，以及固相萃取中所用的吸附剂，大大减少了有机溶剂的使用，显著降低了提取过程中的污染与危害，改善了提取效果与提取效率，并且该方法简单，应用范围广泛，易于使用，富集效果显著。

Description

一种毛细管电泳的在线富集方法

技术领域

本发明涉及天然药物提取技术领域，尤其涉及一种毛细管电泳的在线富集方法。

背景技术

为了提高毛细管电泳的灵敏性，一种通过在线固相萃取-毛细管电泳连用的方法被提出。在这种方法中，将由实验室自制的小段裸熔石英毛细管内含有固相萃取吸附剂的分析物浓缩器插入毛细管的入口部分，将分析的化合物加载到固相萃取的吸附剂上，然后进行分析物的洗脱和分离。为了最大限度地减少因使用筛板构建分析物浓缩器时造成的电渗流干扰、电流不稳定和迁移时间的不可再现性问题，这种构建装置已发展为不使用两块筛板来固定吸附剂材料，而是要求进行固相萃取吸附剂的粒径比两端的毛细管的直径大。这种改善后的分析方法克服了分析复杂样品基质时毛细管电泳的低灵敏度问题，此外，在高压条件下的大样品加载也有效地避免了分析物的损失。整个在线固相萃取过程实现了一个消耗少量试剂的集成自动化模型，目前，这种富集方法已用于分析酸性抗生素，生物碱和生物样品等，而几乎没有用这种方法分析含有特定官能团的化合物。此外，一些传统的有机溶剂通常用于洗脱加载在集中器上的分析物，然而，由于它具有高挥发性和低粘度，可持续操作时间有限，导致少量分析物被提取，因此方法灵敏度低，因此开发一种新的绿色高效洗脱溶剂是有意义的。

离子液体由离子组成，与传统有机溶剂相比，已被广泛宣传为“绿色溶剂”，离子液体具有导电性高，电化学窗口大的优点，对许多无机和有机物质具有良好的溶解性及化学稳定性，能够很好的避免挥发性有机化合物的环境污染问题，且可循环使用。这些优异的性能使得离子液体在化学合成，萃取方法和电化学反应等方面得到大量得应用。在分析化学中，一些萃取技术如微萃取，微波辅助萃取等有使用离子液体作为萃取溶剂，在分离技术方面，气相色谱，液相色谱和毛细管电泳中也有应用离子液体的报告。在在线固相萃取-毛细管电泳连用中的应用离子液体还尚未报道，这在提高毛细管电泳的灵敏度，增强富集效果等方面有很大的潜力。

有机碘是人体碘化物的重要形式。它对于甲状腺激素的合成和神经系统的发育是必不可少的。此外，它在维持人体甲状腺的正常功能，代谢平衡和细胞增殖和分化中也起着重要作用。碘化物浓度相对较低，物理化学性质极为相似，使得不同碘化物的分析有一定的难度。目前，瞬态等速电泳，电感耦合等离子体质谱分光光度法，原子吸收光谱被用于测定碘化物。这些分析方法存在有一些限制：原子吸收光谱和色谱分析方法需要昂贵的设备，而且样品的分析需要很长时间。碘化物富集方法，如，使用在线样品处理柱测定碘化物及表面活性剂涂覆的多壁碳纳米管作为毛细管电泳检测碘化物的假固定相等，这些富集技术相对复杂且多灵敏度低。使用在线固相萃取毛细管电泳的方法测量碘化物3,5-二碘-L-甲状腺素(T₂)，3,5-二碘-L-酪氨酸(MIT)和L-酪氨酸(DIT)(化学结构式见图1)富集技术尚未使用。

中国专利申请公开号为CN102121919A的专利，公开了一种灵敏检测多种样品中三聚氰胺的毛细管电泳在线富集方法。该方法通过两种在线富集技术(阳离子耗尽进样和胶束扫集)联用测定三聚氰胺，使三聚氰胺的富集灵敏度与普通的区带毛细管电泳相比提高了2600倍，检出限降低为1.8μg/kg。该方法采用低电渗流下的电动进样，对进入毛细管中的样品有选择性，受样品基质影响小，不需要如液相色谱等方法中复杂的样品预处理过程，适用于多种样品中三聚氰胺的检测；灵敏度高，比已有的液相色谱、荧光光谱法的检出限降低两到三个数量级，使用的空心毛细管柱价格便宜，分析成本低。然而，该方法可持续操作时间有限，浪费水资源。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种毛细管电泳的在线富集方法。该方法涉及二种中药提取富集方法，具体地说，它主要是涉及离子液体的使用和通过在线固相萃取-毛细管电泳联用的方法提取、富集中药海藻和海带中的有效成分。即本发明提供了一种新方法，该方法将离子液与在线固相萃取和毛细管电泳巧妙结合起来，即提高了毛细管电泳的灵敏性又能快速有效地富集天然产物中的有效成分。

本发明的具体技术方案为：一种毛细管电泳的在线富集方法，包括以下步骤：

(1)样品处理：将TBAH和水加入粉碎后的海带和海藻干燥品中，用氮气流纯化后，立即盖上盖子，混匀后超声提取，然后加入蒸馏水并调节pH得到混合样品溶液，离心、过滤；

(2)在线固相萃取-毛细管电泳程序：(A)定期用甲醇和硼砂缓冲液对嵌入固相萃取装置的毛细管进行冲洗；(B)样品加载；(C)用注射缓冲液清洁毛细管；(D)用洗脱溶剂洗脱加载到浓缩器中的化合物；(E)引入缓冲液推动洗脱塞；(F)分离。

本发明的目的在于探寻一种对比较以往富集方法更加快速高效便捷无毒害的技术，用于提取富集天然产物中的活性成分。发明要点在于将固相萃取和毛细管电泳及离子液相结合提取含有相似官能团的化合物，充分发挥该富集方法的优点，用这一组合技术提取富集天然产物中的有效成分，可以取得前所未有、立竿见影的效果。本发明提供了一种以离子液作为洗脱溶剂以进行在线洗脱加载在毛细管电泳中固相萃取吸附剂中的分析物富集技术，用于富集海带和海藻中碘化物。具体包括：自制裸熔石英毛细管中嵌入固相萃取装置，将制备成海藻和海带的样品稀释液进行在线固相萃取和毛细管电泳的进样程序，使得被分析物加载在装置的吸附剂上，以离子液体代替有机溶剂洗脱加载在固相萃取吸附剂上的分析物进行富集。

本发明的毛细管电泳的在线富集方法的整个在线固相萃取-毛细管电泳程序就如图3所示，该在线富集方法的富集环节创意新颖，思路巧妙。首次采用离子液体作为洗脱溶剂应用在在线固相萃取毛细管电泳的富集的技术中，并且应用在天然产物提取富集领域。经过富集方法处理之后，仪器的灵敏度大大提高，每种样品的检测限均比传统方法大大降低，使得在测定3,5-二碘-L-甲状腺素，3,5-二碘-L-酪氨酸和L-酪氨酸类碘化物成分更加精确有效。在标准品中的应用中本发明技术的富集倍数高达299～2500倍。本发明采用的离子液体，以及固相萃取中所用的吸附剂，不仅廉价易得，而且它们均具备一系列优异突出的物理化学性质：化学稳定性和热稳定性良好，对人体无毒、不污染环境，不易燃。本发明提供的实验富集效果显著，且操作环境安全，操作步骤简洁明了。

作为优选，步骤(1)中，所述混合样品溶液的PH为2.1～9.0。

样品的PH会极大地影响目标化合物的不同电离度和其吸附剂中的保留能力，另外，在不同PH下，碘化物会以带电或中性形式的状态存在。用1M NaOH或1M HCL调制碘化物混合溶液的pH在2.1至9.0的范围。所述调节pH所用溶剂为0.8～1.2M的NaOH溶液或0.8～1.2M的HCl溶液。

作为优选，步骤(2)中，所述洗脱溶剂为甲醇、乙腈、乙醇、氯仿、乙酸乙酯、乙腈/水溶液、[BMIM]PF₆溶液和[EPy][BF₄]溶液中的至少一种。洗脱溶剂需要能够将集中目标碘化物全部洗脱，需要具有较高的目标碘化物洗脱效率，能够完全洗脱保留在Oasis HLB吸附剂上的目标碘化物。

作为优选，所述乙腈/水溶液中乙腈和水的体积比为5:44～46；[BMIM]PF₆溶液的浓度为4.9～5.1mM，[EPy][BF₄]溶液的浓度为5～15mM。

作为优选，步骤(2)中，所述洗脱溶剂的洗脱时间为30～80s。

目标分析物遵循在线固相萃取-毛细管电泳步骤被加载到吸附剂上后，不仅需要考察所选的洗脱溶剂是否适合，而且还要考虑所选洗脱溶剂的洗脱时间。洗脱时间的过短，洗脱溶剂无法完全推动洗脱塞通过吸附剂，自然也无法完全洗脱分析物，洗脱时间过长，又会造成时间和试剂的浪费。因此，使用较少量的洗脱溶剂和较短的洗脱时间获得更好的洗脱能力是最好的。

作为优选，步骤(2)中，所述所选样品加载时间为10～50min。增加样品加载时间是提高检测灵敏度和获得较低检测限最简单的方法。

作为优选，海带和海藻干燥品与TBAH和水的质量体积比为1g:1g:18～22mL:28～32mL，TBAH的浓度为8～12wt％。

作为优选，步骤(1)中，所述粉碎后的海带和海藻干燥品的粒径为100～120目；氮气流纯化时间为4～6min，超声提取温度为38～42℃，超声提取时间为3.5～4.5h；加入蒸馏水直至溶液体积达到24～26ml，离心转速为10000～15000rpm，离心时间为3～8min，过滤器孔径为0.15～0.45μm。

作为优选，步骤(2)中，所述(A)中，定期为每一天和分离期间，冲洗压力为900～950mbar，用甲醇冲洗2～4min后用4.5～5.5mM的硼砂缓冲液冲洗3～5min；(B)中，样品加载pH为压力为900～950mbar；(C)中，注射缓冲液的压力为900～950mbar，清洁时间为1～3min；(D)中，洗脱压力为48～52mbar，洗脱时间为30～80s；(E)中，在48～52mbar下引入缓冲液140～160s来推动洗脱塞；(F)中，分离压力为24.5～25.5KV。

作为优选，所述在线富集方法需要先构建分析物集中器，构建方法为：将内径145～155μm，外径355～365μm的裸熔石英毛细管进行1.8～2.2mm的切割，然后，将引入0.98～1.02mm裸熔石英毛细管至长1.48～1.52cm内径0.299～0.301mm的铁氟龙套管中；将内径48～52μm的7.48～7.52cm长的裸露的熔融石英毛细管推入铁氟龙管的另一端，直到连接到集中器的入口端，然后使用注射器将内径48～52μm长7.48～7.52cm的裸熔石英毛细管的另一端与真空泵连接，之后将集中器未连接毛细管的一端放入装有平均粒径为58～62μm的Oasis HLB吸附剂的小瓶中，将吸附剂装载入浓缩器中，然后，用内径48～52μm长67.45～67.55cm的分离毛细管推动集中器直到浓缩器位于铁氟龙套管的中间位置，整个构建过程在显微镜下完成，最后，检测集中器装置的流动性能。

为了使在线固相萃取-毛细管电泳方法有较好的实验性能及对所选择的分析物的灵敏度和分离效率获得最佳响应，对不同参数的考察及作为固相萃取阶段吸附剂的选择至关重要，Oasis HLB吸附剂由于其含有亲水-亲脂-平衡聚合物的特性，可被用来用于分析酸性，中性和碱性化合物。故而，它被选择作为固相萃取的吸附剂。

与现有技术对比，本发明的有益效果是：本发明的毛细管电泳的在线富集方法富集环节创意新颖，思路巧妙。首次采用离子液体作为洗脱溶剂应用在在线固相萃取毛细管电泳的富集的技术中，并且应用在天然产物提取富集领域。经过富集方法处理之后，仪器的灵敏度大大提高，每种样品的检测限均比传统方法大大降低，使得在测定3,5-二碘-L-甲状腺素，3,5-二碘-L-酪氨酸和L-酪氨酸类碘化物成分更加精确有效。在标准品中的应用中本发明技术的富集倍数高达299～2500倍。本发明采用的离子液体，以及固相萃取中所用的吸附剂，不仅廉价易得，而且它们均具备一系列优异突出的物理化学性质：化学稳定性和热稳定性良好，对人体无毒、不污染环境，不易燃。本发明提供的实验富集效果显著，且操作环境安全，操作步骤简洁明了。

附图说明

图1为本发明的一种毛细管电泳的在线富集方法富集的碘化物T₂、MIT、DIT的化学结构；

图2为本发明的一种毛细管电泳的在线富集方法中构建的包含有固相萃取吸附剂的集中器的示意图；

图3为本发明的一种毛细管电泳的在线富集方法的工艺图，从(A)到(F)为分析物遵循在线固相萃取毛细管电泳的方法从预浓缩到分离所的不同步骤：(A)该分析装置在压力930mbar下用甲醇冲洗3min，缓冲液冲洗4min；(B)将样品在pH为4.8的条件下在930mbar下加载30min；(C)引入缓冲液2min到毛细管；(D)10mM的[EPy][BF4]作为洗脱溶剂，洗脱60s；(E)在50mbar下引入缓冲液150s推动洗脱塞；(F)最后，在25KV的分离压力下分离；

图4为本发明的一种毛细管电泳的在线富集方法中洗脱溶剂对富集碘化物T₂、MIT和DIT的影响(a.MeOH，b.CAN，c.Ethanol，d.5mM[BMIM]PF₆，e.5mM[EPy][BF₄]，f.10mM[EPy][BF₄])，标准品混合物含有1μg/mL的T₂，2μg/ml的MIT和1μg/mL的DIT；

图5为本发明的一种毛细管电泳的在线富集方法中洗脱溶剂对富集碘化物MIT和DIT的影响(a.MeOH，b.CAN，c.Ethanol，d.5mM[BMIM]PF₆，e.5mM[EPy][BF₄]，f.10mM[EPy][BF₄])，2μg/ml的MIT和1μg/mL的DIT；

图6为本发明的一种毛细管电泳的在线富集方法中洗脱时间对富集碘化物的影响；

图7为本发明的一种毛细管电泳的在线富集方法中样品pH对富集碘化物的影响；

图8为本发明的一种毛细管电泳的在线富集方法中样品加载时间对富集碘化物T₂、MIT和DIT的影响；

图9为本发明的一种毛细管电泳的在线富集方法中样品加载时间对富集碘化物MIT和DIT的影响；

图10为本发明的一种毛细管电泳的在线富集方法中浓度为20μg/mL的碘化物标准品溶液在50mbar下流体动力学注入5s后获得的电泳图，峰值指定：(1)T₂；(2)MIT；(3)DIT；

图11为本发明的一种毛细管电泳的在线富集方法中碘化物标准品溶液0.02μg/mL的T₂，MIT和DIT浓度分别为0.1μg/mL，在优化条件(洗脱溶剂：10mM[EPy][BF₄]；洗脱时间：60s；pH为4.8；样品加载时间：30min)下进行分析的电泳图，峰值指定：(1)T₂；(2)MIT；(3)DIT；

图12为本发明的一种毛细管电泳的在线富集方法中优化条件(洗脱溶剂：10mM[EPy][BF₄]；洗脱时间：60s；pH为4.8；样品加载时间：30min)下T₂浓度为1μg/mL，MIT为2μg/mL，DIT浓度为1μg/mL的电泳图，峰值指定：(1)T₂；(2)MIT；(3)DIT；

图13为本发明的一种毛细管电泳的在线富集方法中在最佳在线固相萃取-毛细管电泳条件下获得的电泳图，(A)在930mbar下加载30min的空白海带样品，(B)加入浓度为0.5μg/mL的T₂，MIT和DIT在930mbar下加载30min的样品图，峰值指定：(1)T₂；(2)MIT；(3)DIT；

图14为本发明的一种毛细管电泳的在线富集方法中在最佳在线固相萃取-毛细管电泳条件下获得的电泳图，(A)在930mbar下加载30min的空白海藻样品，(B)加入浓度为0.5μg/mL的T₂，1μg/mL的MIT和DIT在930mbar下加载30min的海藻样品图，峰值指定：(1)T₂；(2)MIT；(3)DIT。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的描述。在本发明中所涉及的装置、连接结构和方法，若无特指，均为本领域公知的装置、连接结构和方法。

碘化物对照品溶液的制备方法为：分别取T₂、MIT和DIT对照品适量，精密称定，分别置于棕色量瓶中，分别加水制成每1mL含1000μg的对照品溶液。

分析物集中器的构建：首先，将内径为150μm、外径为360μm的裸熔石英毛细管进行2mm的切割，然后，将1mm裸熔石英毛细管引入到长1.5cm内径为0.300mm的铁氟龙套管中。然后，将内径为50μm、长为7.5cm的裸露的熔融石英毛细管推入铁氟龙管的另一端，直到连接到集中器的入口端，然后使用注射器将内径为50μm、长7.5cm裸熔石英毛细管的另一端与真空泵连接，之后将集中器未连接毛细管的一端放入装有平均粒径为60μm的Oasis HLB吸附剂的小瓶中，将吸附剂装载入浓缩器中。然后，用内径为50μm、长为67.5cm的分离毛细管推动集中器直到浓缩器位于铁氟龙套管的中间位置。整个构建过程在显微镜下完成。最后，检测集中器装置的流动性能。设计简图见图2。

实施例1-1

一种毛细管电泳的在线富集方法，包括以下步骤：

(1)样品处理：将TBAH和水加入粉碎后粒径为100目的海带和海藻干燥品中，海带和海藻干燥品与TBAH和水的质量体积比为1g:1g:20mL:30mL，TBAH的浓度为10wt％；用氮气流纯化5min后，立即盖上盖子，混匀后在40℃下超声提取4h，然后加入蒸馏水直至溶液体积达到25ml，调节pH为4.8，得到混合样品溶液，13000rpm离心5min、用孔径为0.22μm的过滤器过滤；

(2)在线固相萃取-毛细管电泳程序：(A)每一天和分离期间，用甲醇对嵌入固相萃取装置的毛细管冲洗3min后用5mM的硼砂缓冲液冲洗4min；(B)样品在pH为4.8、压力为930mbar条件下加载30min；(C)在930mbar下，用注射缓冲液清洁毛细管2min；(D)用浓度为10mM[EPy][BF₄]在50mbar条件下洗脱加载到浓缩器中的化合物60s；(E)在50mbar下引入缓冲液150s来推动洗脱塞；(F)在25KV的分离压力下分离。

实施例1-2

实施例1-2与实施例1-1的不同之处在于：步骤(2)中，程序(D)，用甲醇在50mbar条件下洗脱加载到浓缩器中的化合物60s。其他均与实施例1-1相同。

实施例1-3

实施例1-3与实施例1-1的不同之处在于：步骤(2)中，程序(D)，用乙腈在50mbar条件下洗脱加载到浓缩器中的化合物60s。其他均与实施例1-1相同。

实施例1-4

实施例1-4与实施例1-1的不同之处在于：步骤(2)中，程序(D)，用乙醇在50mbar条件下洗脱加载到浓缩器中的化合物60s。其他均与实施例1-1相同。

实施例1-5

实施例1-5与实施例1-1的不同之处在于：步骤(2)中，程序(D)，用氯仿在50mbar条件下洗脱加载到浓缩器中的化合物60s。其他均与实施例1-1相同。

实施例1-6

实施例1-6与实施例1-1的不同之处在于：步骤(2)中，程序(D)，用乙酸乙酯在50mbar条件下洗脱加载到浓缩器中的化合物60s。其他均与实施例1-1相同。

实施例1-7

实施例1-7与实施例1-1的不同之处在于：步骤(2)中，程序(D)，用体积比为1:9的乙腈/水溶液在50mbar条件下洗脱加载到浓缩器中的化合物60s。其他均与实施例1-1相同。

实施例1-8

实施例1-8与实施例1-1的不同之处在于：步骤(2)中，程序(D)，用浓度为5mM[BMIM]PF₆溶液在50mbar条件下洗脱加载到浓缩器中的化合物60s。

实施例1-9

实施例1-9与实施例1-1的不同之处在于：步骤(2)中，程序(D)，用浓度为5mM[EPy][BF₄]溶液在50mbar条件下洗脱加载到浓缩器中的化合物60s。

图4所示为使用不同的洗脱溶剂对应的T₂、MIT和DIT的峰面积、图5所示为使用不同的洗脱溶剂对应的MIT和DIT的峰面积。结果表明，使用氯仿，乙酸乙酯作为洗脱溶剂未能洗脱目标分析物，当用体积比为1:9的乙腈/水溶液为洗脱溶剂时，仅能洗脱MIT和DIT两种物质。对于甲醇，乙腈、乙醇、5mM的[BMIM]PF₆溶液，5mM的[EPy][BF₄]溶液和10mM的[EPy][BF₄]溶液作为该项实施的洗脱溶剂时，相比较而言，由于[EPy][BF₄]具有高电导率和良好的溶解性，能够形成多相体系，适用于分离和洗脱溶剂，使其获得了较高的碘化物分析物的洗脱效率，能够完全洗脱保留在Oasis HLB吸附剂上的碘物质。最后，选择10mM的[EPy][BF₄]作为洗脱溶剂。

实施例2-1

一种毛细管电泳的在线富集方法，包括以下步骤：

(2)在线固相萃取-毛细管电泳程序：(A)每一天和分离期间，用甲醇对嵌入固相萃取装置的毛细管冲洗3min后用5mM的硼砂缓冲液冲洗4min；(B)样品在pH为4.8、压力为930mbar条件下加载30min；(C)在930mbar下，用注射缓冲液清洁毛细管2min；(D)用浓度为10mM的[EPy][BF₄]溶液在50mbar条件下洗脱加载到浓缩器中的化合物30s；(E)在50mbar下引入缓冲液150s来推动洗脱塞；(F)在25KV的分离压力下分离。

实施例2-2

实施例2-2与实施例2-1的不同之处在于：步骤(2)中，程序(D)，用浓度为10mM[EPy][BF₄]在50mbar条件下洗脱加载到浓缩器中的化合物40s。其他均与实施例2-1相同。

实施例2-3

实施例2-3与实施例2-1的不同之处在于：步骤(2)中，程序(D)，用浓度为10mM[EPy][BF₄]在50mbar条件下洗脱加载到浓缩器中的化合物50s。其他均与实施例2-1相同。

实施例2-4

实施例2-4与实施例2-1的不同之处在于：步骤(2)中，程序(D)，用浓度为10mM[EPy][BF₄]在50mbar条件下洗脱加载到浓缩器中的化合物60s。其他均与实施例2-1相同。

实施例2-5

实施例2-5与实施例2-1的不同之处在于：步骤(2)中，程序(D)，用浓度为10mM[EPy][BF₄]在50mbar条件下洗脱加载到浓缩器中的化合物70s。其他均与实施例2-1相同。

实施例2-6

实施例2-6与实施例2-1的不同之处在于：步骤(2)中，程序(D)，用浓度为10mM[EPy][BF₄]在50mbar条件下洗脱加载到浓缩器中的化合物80s。其他均与实施例2-1相同。

目标分析物遵循在线固相萃取-毛细管电泳步骤被加载到吸附剂上后，不仅需要考察所选的洗脱溶剂是否适合，而且还要考虑所选洗脱溶剂的洗脱时间。洗脱时间的过短，洗脱溶剂无法完全推动洗脱塞通过吸附剂，自然也无法完全洗脱分析物，洗脱时间过长，又会造成时间和试剂的浪费。因此，使用较少量的洗脱溶剂和较短的洗脱时间获得更好的洗脱能力是最好的。当所用洗脱溶剂洗脱时间为30s时，三种被分析的碘化物未能从吸附剂中洗脱，这可以归因于为洗脱时间太短推动化合物通过集中器装置。图6显示了当用浓度为10mM的[EPy][BF₄]作为洗脱溶剂，并且洗脱时间范围为40s至80s时目标化合物的峰高变化。结果表明，随着洗脱时间的增加，DIT的峰高基本保持不变，当洗脱时间为60s时，T₂和MIT的洗脱效率最佳。超过60s时，可能由于洗脱塞在分离毛细管内存在较低电导率的原因，导致目标分析物的洗脱效率教差。最后，选择60秒作为最佳洗脱时间。

实施例3-1

一种毛细管电泳的在线富集方法，包括以下步骤：

(1)样品处理：将TBAH和水加入粉碎后粒径为100目的海带和海藻干燥品中，海带和海藻干燥品与TBAH和水的质量体积比为1g:1g:20mL:30mL，TBAH的浓度为10wt％；用氮气流纯化5min后，立即盖上盖子，混匀后在40℃下超声提取4h，然后加入蒸馏水直至溶液体积达到25ml，调节pH为2.1，得到混合样品溶液，13000rpm离心5min、用孔径为0.22μm的过滤器过滤；

(2)在线固相萃取-毛细管电泳程序：(A)每一天和分离期间，用甲醇对嵌入固相萃取装置的毛细管冲洗3min后用5mM的硼砂缓冲液冲洗4min；(B)样品在pH为2.1、压力为930mbar条件下加载30min；(C)在930mbar下，用注射缓冲液清洁毛细管2min；(D)用浓度为10mM的[EPy][BF₄]溶液在50mbar条件下洗脱加载到浓缩器中的化合物60s；(E)在50mbar下引入缓冲液150s来推动洗脱塞；(F)在25KV的分离压力下分离。

实施例3-2

实施例3-2与实施例3-1的不同之处在于：步骤(1)中，调节pH为3.0得到混合样品溶液；步骤(2)中，程序(B)，样品在pH为3.0、压力为930mbar条件下加载30min。其他均与实施例3-1相同。

实施例3-3

实施例3-3与实施例3-1的不同之处在于：步骤(1)中，调节pH为4.8得到混合样品溶液；步骤(2)中，程序(B)，样品在pH为4.8、压力为930mbar条件下加载30min。其他均与实施例3-1相同。

实施例3-4

实施例3-4与实施例3-1的不同之处在于：步骤(1)中，调节pH为7.5得到混合样品溶液；步骤(2)中，程序(B)，样品在pH为7.5、压力为930mbar条件下加载30min。其他均与实施例3-1相同。

实施例3-5

实施例3-5与实施例3-1的不同之处在于：步骤(1)中，调节pH为9.0得到混合样品溶液；步骤(2)中，程序(B)，样品在pH为9.0、压力为930mbar条件下加载30min。其他均与实施例3-1相同。

样品的PH会极大地影响目标化合物的不同电离度和其吸附剂中的保留能力，另外，在不同PH下，碘化物会以带电或中性形式的状态存在。在不同pH下测试的分析物的峰高响应显示在图7中。观察到T₂和MIT响应在pH 4.8下最高，这推测在此PH条件下分析物呈现非阴离子形式并且与吸附剂表面有疏水相互作用。另外，当样品的pH为7.5时，观察到MIT在集中器上的保留能力较低。然而，当分析物的pH为9.0时，MIT的响应增加，这被认为是由于在该pH下三种有类似官能团的碘化物与吸附剂的相互作用引起的。考虑到这些因素，pH4.8作为最后的选择。

实施例4-1

一种毛细管电泳的在线富集方法，包括以下步骤：

(1)样品处理：将TBAH和水加入粉碎后粒径为110目的海带和海藻干燥品中，海带和海藻干燥品与TBAH和水的质量体积比为1g:1g:18mL:28mL，TBAH的浓度为12wt％；用氮气流纯化6min后，立即盖上盖子，混匀后在38℃下超声提取4.5h，然后加入蒸馏水直至溶液体积达到24ml，调节pH为4.8得到混合样品溶液，15000rpm离心3min、用孔径为0.45μm的过滤器过滤；

(2)在线固相萃取-毛细管电泳程序：(A)每一天和分离期间，用甲醇对嵌入固相萃取装置的毛细管冲洗4min后用5.5mM的硼砂缓冲液冲洗3min；(B)样品在pH为4.8、压力为900mbar条件下加载10min；(C)在900mbar下，用注射缓冲液清洁毛细管3min；(D)用10mM的[EPy][BF₄]溶液在52mbar条件下洗脱加载到浓缩器中的化合物60s；(E)在52mbar下引入缓冲液160s来推动洗脱塞；(F)在25.5KV的分离压力下分离。

实施例4-2

实施例4-2与实施例4-1的不同之处在于：步骤(2)中，程序(B)，样品在pH为4.8、压力为900mbar条件下加载20min。其他均与实施例4-1相同。

实施例4-3

实施例4-3与实施例4-1的不同之处在于：步骤(2)中，程序(B)，样品在pH为4.8、压力为900mbar条件下加载30min。其他均与实施例4-1相同。

实施例4-4

实施例4-4与实施例4-1的不同之处在于：步骤(2)中，程序(B)，样品在pH为4.8、压力为900mbar条件下加载40min。其他均与实施例4-1相同。

实施例4-5

实施例4-5与实施例4-1的不同之处在于：步骤(2)中，程序(B)，样品在pH为4.8、压力为900mbar条件下加载50min。其他均与实施例4-1相同。

从图8和图9可以看出，当样品进样时间为30min时，T₂和MIT峰面积响应最佳，此外，当加载时间超过30min时，这两种分析物的峰面积变化不大，这表明吸附剂达到T₂和MIT的最大保留能力。然而，对于DIT的情况，DIT的峰面积随样品加载时间而增加，这可以解释为DIT与吸附剂的相互作用和DIT对吸附剂的保留容量高于其他两种碘化物。除此之外，考虑到过量的样品注入会延长分析时间。综合分析，选择30min作为样品加载时间的最佳值。

对本发明的毛细管电泳的在线富集方法的柱内柱间精密度、灵敏度增强因子(SEF)和加样回收率进行验证。验证方法和验证结果如下：

(a)柱内柱间精密度准确称取三个碘化物的对照品于干净的离心管中，分别加入纯水与之混合，超声溶解。然后用氢氧化钠或者盐酸调节样品的pH至4.8。最后，将样品通过0.22μm的尼龙滤膜进行过滤，将配制好的不同浓度的样品溶液转移到毛细管电泳的进样瓶中，依照在线固相萃取-毛细管电泳的程序对样品进行分离检测。同一根构建好的包含集中器的毛细管对同一混合标准品连续进样3次。三根构建好的包含集中器的毛细管对同一混合标准品连续进样。

(b)灵敏度增强因子(SEF)

根据等式(1)计算SEF值。SEF高度＝SEF_height＝(h prec)f/hHD((1)其中h prec是使用在线固相萃取-毛细管电泳的方法富集后分析物的峰高，hHD是在50mbar下正常流体水动力注入5秒后非富集的分析物的峰高，f是稀释因子。在我们的实验中，MIT、DIT和T₂的SEF达到了299、903和2500。图10～12显示了富集前后获得的特异性电泳图。

柱内、柱间精密度实验结果汇总如下表1：表1日内、日间精密度

表1

(c)加样回收率样品的处理：将海带和海藻干燥品粉碎并过100目筛，然后将每个样品称重0.25g到25ml锥形瓶中，然后加入5mL浓度为10％的TBAH和7.5mL蒸馏水。然后，用氮气流纯化5min。纯化完成后，立即盖上盖子，溶液均匀混合。将混合溶液用超声波在40℃下提取4小时，再加入蒸馏水直至溶液体积达到25ml，13000rpm离心5min以除去杂质。最后，用0.22μm的尼龙过滤器过滤。

图13A为在最优的条件下空白海带样品的色谱图，图13B为加标后最优的条件下海带样品的色谱图。图14A为在最优的条件下空白海藻样品的色谱图，图14B为加标后最优的条件下海藻样品的色谱图。

取3,5-二碘-L-甲状腺素，3,5-二碘-L-酪氨酸和L-酪氨酸的对照品适量，精密称定，分别置于棕色量瓶中，分别加水制成每1mL含1000μg的对照品溶液。将制得的对照品溶液配置成一系列不同浓度的混合对照品溶液，按同样的条件用在线固相萃取-用毛细管电泳的方法检测，获得混合对照品溶液的色谱图，以对照品的浓度为横坐标，对应色谱图中色谱峰的峰面积为纵坐标，分别制作这3种标准品的标准曲线。根据丹参提取液或丹参注射液色谱图中各色谱峰的峰面积和各个成分的标准曲线，依据标准曲线计算样品的回收率。

3种成分的标准曲线、检测限、定量限及两个样品的回收率如下表2所示：

表2

结果表明，本发明方法的回收率高，检测限低。

以上所述，仅是发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制，凡是根据本发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效结构变换，均仍属于本发明技术方案的保护范围。

Claims

1.一种毛细管电泳的在线富集方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）样品处理：将TBAH和水加入粉碎后的海带和海藻干燥品中，用氮气流纯化后，立即盖上盖子，混匀后超声提取，然后加入蒸馏水并调节pH得到混合样品溶液，离心、过滤；

（2）在线固相萃取-毛细管电泳程序：（A）定期用甲醇和硼砂缓冲液对嵌入固相萃取装置的毛细管进行冲洗；（B）样品加载；（C）用注射缓冲液清洁毛细管；（D）用洗脱溶剂洗脱加载到浓缩器中的化合物；（E）引入缓冲液推动洗脱塞；（F）分离。

2.如权利要求1所述的一种毛细管电泳的在线富集方法，其特征在于：步骤（1）中，所述混合样品溶液的PH为2.1~9.0。

3.如权利要求1所述的一种毛细管电泳的在线富集方法，其特征在于：步骤（2）中，所述洗脱溶剂为甲醇、乙腈、乙醇、氯仿、乙酸乙酯、乙腈/水、[BMIM] PF₆和[EPy] [BF₄]中的至少一种。

4.如权利要求3所述的一种毛细管电泳的在线富集方法，其特征在于：所述乙腈 /水中乙腈和水的体积比为5:44~46；[BMIM] PF₆的浓度为4.9~5.1mM，[EPy] [BF₄]的浓度为5~15mM。

5.如权利要求1所述的一种毛细管电泳的在线富集方法，其特征在于：步骤（2）中，所述洗脱溶剂的洗脱时间为30~80s。

6.如权利要求1所述的一种毛细管电泳的在线富集方法，其特征在于：步骤（2）中，所述所选样品加载时间为10~50min。

7.如权利要求1所述的一种毛细管电泳的在线富集方法，其特征在于：步骤（1）中，所述海带和海藻干燥品与TBAH和水的质量体积比为1g:1g:18~22mL :28~32mL，TBAH的浓度为8~12wt％。

8.如权利要求1所述的一种毛细管电泳的在线富集方法，其特征在于：步骤（1）中，所述粉碎后的海带和海藻干燥品的粒径为100~120目；氮气流纯化时间为4~6min，超声提取温度为38~42℃，超声提取时间为3.5~4.5h；加入蒸馏水直至溶液体积达到24~26ml，离心转速为10000~15000 rpm，离心时间为3~8min，过滤器孔径为0.15~0.45μm。

9.如权利要求1所述的一种毛细管电泳的在线富集方法，其特征在于：步骤（2）中，所述（A）中，定期为每一天和分离期间，冲洗压力为900~950 mbar，用甲醇冲洗2~4min后用4.5~5.5mM的硼砂缓冲液冲洗3~5min；（B）中，样品加载pH为压力为900~950mbar；（C）中，注射缓冲液的压力为900~950mbar，清洁时间为1~3min；（D）中，洗脱压力为48~52 mbar，洗脱时间为30~80s；（E）中，在48~52 mbar下引入缓冲液140~160s来推动洗脱塞；（F）中，分离压力为24.5~25.5KV。

10.如权利要求1所述的一种毛细管电泳的在线富集方法，其特征在于：所述在线富集方法需要先构建分析物集中器，构建方法为：将内径145~155μm，外径355~365μm的裸熔石英毛细管进行1.8~2.2mm的切割，然后，将引入0.98~1.02mm裸熔石英毛细管至长1.48~1.52cm内径0.299~0.301mm的铁氟龙套管中；将内径48~52μm的7.48~7.52cm长的裸露的熔融石英毛细管推入铁氟龙管的另一端，直到连接到集中器的入口端，然后使用注射器将内径48~52μm 长7.48~7.52cm的裸熔石英毛细管的另一端与真空泵连接，之后将集中器未连接毛细管的一端放入装有平均粒径为58~62μm 的Oasis HLB吸附剂的小瓶中，将吸附剂装载入浓缩器中，然后，用内径48~52μm 长67.45~67.55cm的分离毛细管推动集中器直到浓缩器位于铁氟龙套管的中间位置，整个构建过程在显微镜下完成，最后，检测集中器装置的流动性能。