CN110031533B

CN110031533B - 固相萃取与毛细管电泳技术联合分离检测桑叶中多酚类物质的方法

Info

Publication number: CN110031533B
Application number: CN201910405041.1A
Authority: CN
Inventors: 冯军; 黄文艺; 程昊; 李利军; 孔红星; 李彦青; 唐婷范; 李晓慧
Original assignee: Guangxi University of Science and Technology
Current assignee: Guangxi University of Science and Technology
Priority date: 2019-05-16
Filing date: 2019-05-16
Publication date: 2021-02-02
Anticipated expiration: 2039-05-16
Also published as: CN110031533A

Abstract

本发明涉及一种固相萃取与毛细管电泳技术联合分离检测桑叶中多酚类物质的方法，该方法以甲基丙烯酸丁酯为单体，乙二醇二甲基丙烯酸为交联剂，正丙醇、1,4‑丁二醇作为致孔剂，偶氮二异丁腈为引发剂，采用热聚合的方式合成了poly（BMA‑co‑EDMA）整体柱，并以该整体柱作为固相萃取柱，与毛细管电泳联用，建立了整体柱固相萃取‑毛细管电泳联用分析桑叶中芦丁、绿原酸、槲皮素的方法。与纯CE法相比，本方法进一步缩短了分析周期（仅需8 min左右），预处理过程操简单。同时，样品基底的除杂完全，也提高了待测样品与相邻杂质峰的分离度，基线平直，具有更宽的线性范围，定量分析也更为准确。

Description

固相萃取与毛细管电泳技术联合分离检测桑叶中多酚类物质的方法

技术领域

本发明涉及一种桑叶中多酚类物质的检测方法，特别涉及一种固相萃取与毛细管电泳技术联合分离检测桑叶中多酚类物质的方法。

背景技术

桑叶为桑科植物桑树的叶，既是食品又是药品，桑叶味甘、苦，性寒，具有润燥清肺、疏风散热、养肝明目等功效。桑叶含有多种多酚类物质，如芦丁、绿原酸、槲皮素（化学结构式如下）等。多酚类物质是植物中重要的次级代谢产物，已有研究表明，多酚类物质具有抗氧化、清除自由基、预防心血管疾病、抗癌、抗炎症和抗血小板凝聚等功能，因此，对桑叶中多酚类物质进行质量控制与分离分析具有重要现实意义。

芦丁、绿原酸、槲皮素的化学结构式分别如下：

由于桑叶内的成分多而复杂，多酚类物质含量较低，且多酚类物质组成复杂，结构不稳定，易氧化分解，与生物碱、多糖等生物大分子发生结合，还能与蛋白质通过共价键发生不可逆结合，干扰较多，影响检测，因此，样品预处理尤其重要。目前，桑叶中多酚类物质的分离检测方法主要有高效液相色谱法（HPLC）、毛细管电泳法（CE）等，HPLC法分析多酚类物质多采用梯度洗脱，但分析时间较长且耗费有机试剂；苑广信等人用CE法分离测定了桑叶中的多酚类物质，分析较为快速，待测绿原酸附近虽已基本达到基线分离，但由于样品基底复杂引起的基线抬高以及紧随绿原酸之后的杂质峰仍对待测物质的准确定量造成一定程度的影响。

固相萃取是近年来发展起来的一种新型预处理技术，具有除杂、富集、操作简单等优点。已有报道采用固相萃取预处理的方式对植物多酚类物质进行分离分析，但其采用固相萃取柱为C18填充柱，为填充型固相萃取柱，预处理过程略复杂。除此之外，C18填充柱制备过程复杂，需要丰富的填柱经验和娴熟的烧塞技术，且为一次性使用，成本较高。与C18填充柱相比，聚合物整体柱(monolithic column) 采用原位热聚合的方式制备，不需特殊填充设备，制备过程简单、内部结构均匀、通透性和重现性好，连续多孔，可多次重复性使用，成本低廉，并可根据待测样品的性质选择不同功能的单体等优点，是分离科学领域一个新发展方向，目前已在生物、医药、食品等领域得到广泛应用。

目前未见有采用固相萃取整体柱与毛细管电泳技术联合分离检测桑叶中多酚类物质的文献报道。

发明内容

本发明要解决的技术问题是：提供一种固相萃取与毛细管电泳技术联合分离检测桑叶中多酚类物质的方法，该方法采用甲基丙烯酸丁酯为单体、乙二醇二甲基丙烯酸酯为交联剂合成了poly（BMA-co-EDMA）整体柱，将其用作桑叶中芦丁、绿原酸、槲皮素等多酚物质的固相萃取柱，并采用毛细管电泳进行分离分析，该方法简便、快速、灵敏。

解决上述技术问题的技术方案是：一种固相萃取与毛细管电泳技术联合分离检测桑叶中多酚类物质的方法，包括以下步骤：

（1）样品的制备：称取干燥桑叶粉末置于索氏提取器中，用乙醚连续脱脂7～9小时，原料干燥桑叶与乙醚的质量体积比为：1g∶140～160mL，脱脂完成后在室温下冷却使残余的乙醚挥发完全；然后向得到的桑叶粉末中加入甲醇，原料干燥桑叶与甲醇的质量体积比为：1g∶20～40mL，密封超声处理20～40 min后得提取液，连续提取2次后，合并两次提取液，置于旋转蒸发器中挥去甲醇，用体积分数20～30%乙醇定容到规定体积；

（2）整体柱的制备：将单体BMA、交联剂EDMA、致孔剂正丙醇和1，4-丁二醇按照质量比为：（17～19）: （11～13）:（52～54）:（16～18）配比，再加入总质量0.5～1.5%wt的引发剂AIBN，在室温下超声15～25 min混合均匀，通氮气10～20 min 除去氧气后得预聚液，用MTMS与体积分数50%γ-MAPS体积比为6:1的混合溶液95～105 μL，对移液枪头内表面进行硅烷化修饰，取预聚液至移液枪头中，两端封口，置于恒温水浴中58～62℃，反应18～22 h；反应结束后得固相萃取整体柱，分别以甲醇和水冲洗固相萃取柱，除去未反应的单体和致孔剂，然后至于恒温干燥箱58～62℃，干燥至恒重，得到poly（BMA-co-EDMA）整体柱；

（3）固相萃取：将步骤（2）制备的整体柱安装在5 mL注射器上，用5 mL甲醇，以0.5mL/min的流速活化poly（BMA-co-EDMA）整体柱，然后取2 mL步骤（1）制备的样品，经滤膜过滤后移至固相萃取柱，用0.5 mL pH 3.0磷酸缓冲液进行预洗脱，再以0.5 mL乙腈作为洗脱液对目标物进行洗脱，收集洗脱液，氮气吹干，用0.4～0.6mL甲醇溶解，滤膜过滤后取滤液；

（4）毛细管电泳分析：采用毛细管电泳法分析步骤（3）得到的滤液中芦丁、绿原酸和槲皮素的含量，毛细管电泳分析的条件是：Agilent高效毛细管电泳熔融石英毛细管，毛细管总长度65 cm，有效长度56 cm，内径75 μm，电泳缓冲溶液为pH 8.5、内加5 mmol/L的十二烷基硫酸钠的15 mmol/L的硼砂溶液，分离高压20 kV，紫外检测波长210 nm。

步骤（3）中所述滤膜为0.45 μm滤膜。

本发明以甲基丙烯酸丁酯（BMA）为单体，乙二醇二甲基丙烯酸（EDMA）为交联剂，正丙醇、1,4-丁二醇作为致孔剂，偶氮二异丁腈（AIBN）为引发剂，采用热聚合的方式合成了poly（BMA-co-EDMA）整体柱，并以该整体柱作为固相萃取柱，与毛细管电泳联用，建立了多酚类物质富集、纯化，分离分析的方法。本发明在前述单纯采用CE法分离测定桑叶中的多酚类物质方法的研究基础上，通过制备固相萃取整体柱，对桑叶提取物进行固相萃取处理，建立了桑叶中多酚类物质的整体柱固相萃取-CE联用分离检测的方法。与纯CE法相比，本方法进一步缩短了分析周期（仅需8 min左右），预处理过程操简单。同时，样品基底的除杂完全，也提高了待测样品与相邻杂质峰的分离度，基线平直，具有更宽的线性范围，定量分析也更为准确。

本发明使用原位聚合法制备了固相萃取整体柱，并与毛细管电泳联用，建立了整体柱固相萃取-毛细管电泳联用分析桑叶中芦丁、绿原酸、槲皮素的方法。与C18填充柱存在的制备复杂、一次性使用导致成本过高的固有缺点相比，该整体柱制备简单，通透性好，预处理简便，柱效高，可重复多次使用，能有效萃取桑叶中的芦丁、绿原酸、槲皮素，该方法线性范围为10 160 μg/mL，相关系数分别为0.9995、0.9985、0.9955，芦丁、绿原酸、槲皮素的检出限分别为4.65μg/mL、1.12μg/mL、3.49 μg/mL，精密度相对标准偏差分别为2.38%、0.98%、2.76%，平均回收率分别为94.69%、98.90%、101.88%。RSD为1.19% ~ 3.39%。该方法简单、高效、灵敏、成本低，适用于桑叶中芦丁等3种多酚类物质的分离分析，拓展了整体柱在中草药有效成分分离分析中的应用范围。

附图说明

图1为BMA单体和poly（BMA-co-EDMA）整体柱的红外谱图，其中（a）BMA单体；（b）poly（BMA-co-EDMA）整体柱。

图2为不同单体、交联剂总量与致孔剂比例的整体柱SEM图。其中，（a）单体、交联剂总量与致孔剂质量比4:6；（b）单体、交联剂总量与致孔剂质量比3:7；（c）单体、交联剂总量与致孔剂质量比2:8。

图3为不同单体、交联剂总量与致孔剂比例的整体柱电泳谱图。其中，（a）单体、交联剂总量与致孔剂质量比4:6；（b）单体、交联剂总量与致孔剂质量比3:7；（c）单体、交联剂总量与致孔剂质量比2:8。

图4为不同正丙醇与1,4-丁二醇比例的整体柱SEM图。其中，（a）正丙醇与1,4-丁二醇的质量比70:30；（b）正丙醇与1,4-丁二醇的质量比76:24；（c）正丙醇与1,4-丁二醇的质量比80:20。

图5为采用不同淋洗液得到的待测组分的电泳谱图；其中，（a）采用的淋洗液为pH3.0磷酸盐；（b）采用的淋洗液为15%甲醇。

图6为采用不同洗脱液得到的待测组分的电泳谱图；其中，（a）未经整体柱固相萃取的桑叶提取原液；（b）采用的洗脱液为甲醇；（c）采用的洗脱液为乙腈。图中1表示芦丁，2表示绿原酸，3表示槲皮素。

图7为经过固相萃取和未经过固相萃取的样品电泳谱图；其中，（a）未经整体柱固相萃取的样品；（b）经整体柱固相萃取的样品。

具体实施方式

实施例1：一种固相萃取与毛细管电泳技术联合分离检测桑叶中多酚类物质的方法，包括以下步骤：

（1）样品的制备：称取干燥桑叶粉末1.000 g，置于索氏提取器中，用150 mL的乙醚连续脱脂8小时，脱脂完成后在室温下冷却10 min，使残余的乙醚挥发完全。然后将得到的粉末倒入100 mL烧杯中加入30 mL甲醇，封口超声30 min后得提取液，连续提取2次后，合并两次提取液，置于旋转蒸发器中挥去甲醇，用体积分数25%乙醇定容到50 mL容量瓶中，检测前经0.45 μm滤膜过滤。

（2）整体柱的制备：将单体BMA、交联剂EDMA、致孔剂正丙醇和1，4-丁二醇按照质量比为：18:12:53:17配比，再加入引发剂AIBN（1%wt总质量），在室温下超声20min混合均匀，通氮气10 min 除去氧气后得预聚液，用MTMS（甲基三甲氧基硅烷）与体积分数50%γ-MAPS（3- (异丁烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷）体积比为6:1的混合溶液100 μL对移液枪头内表面进行硅烷化修饰，取预聚液至移液枪头中，两端封口，置于恒温水浴中60℃，反应20 h；反应结束后得固相萃取整体柱，分别以甲醇和水冲洗固相萃取柱，除去未反应的单体和致孔剂，然后至于恒温干燥箱60℃，干燥至恒重，得到poly（BMA-co-EDMA）整体柱。

（3）固相萃取：将步骤（2）制备的整体柱安装在5 mL注射器上，用5 mL甲醇，以0.5mL/min的流速活化poly（BMA-co-EDMA）固相萃取柱，然后取2 mL步骤（1）制备的样品，经0.45 μm滤膜过滤后移至固相萃取柱，用0.5 mL pH 3.0磷酸缓冲液进行预洗脱，再以0.5mL乙腈作为洗脱液对目标物进行洗脱，收集洗脱液，氮气吹干，用0.5 mL甲醇溶解，0.45 μm滤膜过滤后取滤液。

本发明制备的整体柱表征及工艺条件的优化过程

1、（BMA-co-EDMA）整体柱的表征

在BMA的红外谱图中，1637 cm^-1处为C=C伸缩振动产生（图1a），对比poly（BMA-co-EDMA）整体柱的红外谱图（图1b），其双键特征吸收峰消失，说明单体参与了聚合反应。

2、（BMA-co-EDMA）整体柱聚合条件的优化

整体柱的渗透性、稳定性、重复性等性质受到聚合反应中各组分比例的影响，为了制备内部结构及孔径均匀、柱通透性良好、柱效高的poly（BMA-co-EDMA）整体柱。本发明考察了单体及致孔剂之间的比例对整体柱萃取效率的影响。

（1）单体与致孔剂比例的优化

按设计比例改变单体、交联剂总量与致孔剂的质量比；单体、交联剂总量与致孔剂的质量比分别为4:6、3:7、2:8。

取按实施例1所述条件在移液枪头外以同样的比例平行制备的整体柱材料在SEM下进行表征。图2为poly（BMA-co-EDMA）整体柱的SEM表征图，从图中可以看出，随着单体比例减小、致孔剂比例增大，聚合物孔径和粒径大小增大，结构疏松，硬度降低。当致孔剂含量为70%时，整体柱硬度合适，孔径均匀，疏松多孔（图2b），对芦丁、绿原酸、槲皮素均有较好的分离效果（图3b）。综合考虑，选取单体、交联剂总量与致孔剂的比例为3:7的整体柱。

（2）致孔剂比例的优化

在单体、交联剂总量与致孔剂的比例为3:7基础上继续优化致孔剂中正丙醇与1,4-丁二醇的比例，正丙醇与1,4-丁二醇的质量比例分别为70:30、76:24、80:20。

图4为poly（BMA-co-EDMA）整体柱的SEM表征图，从图中可以看出，随着正丙醇比例的增大，1,4-丁二醇的比例减小，聚合物孔径会有所增大。当正丙醇与1,4-丁二醇的比例为76:24时，聚合物整体柱孔径及颗粒大小均匀（图4b）。最终确定所选用整体柱单体、交联剂总量与致孔剂的比例为3:7，致孔剂正丙醇与1,4-丁二醇的比例为76:24。

3、 poly（BMA-co-EDMA）整体柱固相萃取条件优化

通常多酚类物质的预处理主要采用C18固相萃取柱，由于多酚类物质具有一定的极性，本发明制备的poly（BMA-co-EDMA）整体柱骨架表面的丁基具有疏水性，可用于固相萃取桑叶中的多酚类物质。为了获得最佳的萃取率，实验考察了淋洗液种类、淋洗流速和体积、洗脱液对萃取效率的影响。

（1）淋洗液的选择

选择合适的淋洗液对样品进行预洗脱，不仅能除去保留在固相萃取柱上的干扰物，而且不会对目标物产生影响。取制备好的固相萃取整体柱，按照“实施例1步骤（3）”方法进行预处理，分别考察了pH 3.0磷酸缓冲液（图5a）和15%甲醇溶液（图5b）的预洗脱能力。结果显示15%甲醇虽然除杂效果较好，但同时将部分待测组分洗脱下来，从而导致待测组分浓度变低，峰面积变小，富集效果变弱；而pH 3.0磷酸盐缓冲溶液在去除了杂质的同时最大程度保留了待测组分。因此本发明最终选择pH 3.0磷酸盐缓冲液作为淋洗液。

（2）洗脱液的选择

根据多酚类物质与整体柱的极性差异，本发明对甲醇和乙腈的洗脱能力进行了考察。与未经整体柱固相萃取的提取原液相比（图6a），在采用甲醇作为洗脱液时，有较好的洗脱能力，能够除去大部分杂质并保留桑叶中3种多酚类物质，且对多酚具有富集能力，但是仍存在少许杂质对待测3种多酚类物质产生干扰（图6b）。而在采用乙腈作为洗脱液时，基本能够除去所有干扰杂质而只对桑叶多酚进行保留吸附，峰形较好（图6c）。综合考虑，采用乙腈作为多酚类物质的洗脱溶液。

（3）淋洗流速、体积的优化

淋洗液的流速及流量是的一个重要参数，可以影响桑叶多酚的吸附效率和除杂效果。当流速过快及流量过大时，会造成桑叶多酚吸附率的降低，而且很容易冲断整体柱；流速过慢及流量过小时，达不到很好的除杂效果。为了获得更好的除杂效率,最终决定以0.1mL/min的流速，0.5 mL的体积进行预洗脱除杂。

综上所述，poly（BMA-co-EDMA）整体柱萃取的最优条件为：淋洗液为pH 3.0磷酸盐缓冲液，淋洗流速为0.1 mL/min，体积为0.5 mL；洗脱液为乙腈。

本发明方法验证

1.线性关系

标准溶液的配制：精密称取芦丁、绿原酸、槲皮素对照品各25.00 mg，用甲醇溶解，定容至25 mL容量瓶中，摇匀，即得1 mg/ml对照溶液，按照梯度分别稀释至浓度为10 μg/mL、 20 μg/mL 、40 μg/mL 、80 μg/mL、160 μg/mL的工作对照品。以上所有对照品溶液均在4℃下避光保存。

取配制好的各浓度分别为10 μg/mL、20 μg/mL、40μg/mL、80μg/mL、160μg/mL的芦丁、绿原酸、槲皮素对照品溶液，按照“实施例1步骤（4）毛细管电泳条件”项下的色谱条件进行分析，以质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线。如表1所示，芦丁、绿原酸、槲皮素在10-160 μg/mL范围内线性关系良好，相关系数（r）在0.9955-0.9995之间，检出限（LODs，S/N=3）分别为4.65、1.12、3.49μg/mL。

表1芦丁、绿原酸、槲皮素的线性范围、回归方程、相关系数、检出限

2. 精密度

分别取50 μg/mL的芦丁、绿原酸、槲皮素对照品溶液，连续进样六次，结果显示，芦丁、绿原酸、槲皮素的相对标准偏差值分别为2.38%、0.98%、2.76%。表明仪器精密度良好。

3.样品分析

将桑叶提取物按照按照“实施例1步骤（3）固相萃取方法”方法，用poly（BMA-co-EDMA）整体柱萃取，在最优毛细管电泳条件下进行分离测定，经过整体柱固相萃取后（图7b），芦丁、绿原酸、槲皮素得到明显富集、纯化，杂质峰明显减少，说明poly（BMA-co-EDMA）整体柱对桑叶中的多酚类物质有较好的富集、纯化作用。

将经过固相萃取的样品溶液，各进样三次，取峰面积平均值代入表1回归方程，测得桑叶中芦丁、绿原酸、槲皮素的含量分别为37.12 μg/mL、60.20 μg/mL、21.49 μg/mL。

4.回收率

对经过预处理的样品中的芦丁、绿原酸、槲皮素进行加标回收率测定，测得结果如表2所示，芦丁、的回收率均良好，在94.69% ~ 101.88%之间，RSD为1.19% ~ 3.39%，表明该方法具有较好的准确度和重现性，适合桑叶中多酚类物质的分离检测。

表2 桑叶中芦丁、绿原酸、槲皮素加标回收率（n=3）

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Claims

1.一种固相萃取与毛细管电泳技术联合分离检测桑叶中多酚类物质的方法，其特征在于：包括以下步骤：

（3）固相萃取：将步骤（2）制备的整体柱安装在5 mL注射器上，用5 mL甲醇，以0.5 mL/min的流速活化poly（BMA-co-EDMA）整体柱，然后取2 mL步骤（1）制备的样品，经滤膜过滤后移至固相萃取柱，用0.5 mL pH 3.0磷酸缓冲液进行预洗脱，再以0.5 mL乙腈作为洗脱液对目标物进行洗脱，收集洗脱液，氮气吹干，用0.4～0.6mL甲醇溶解，滤膜过滤后取滤液；

2.根据权利要求1所述固相萃取与毛细管电泳技术联合分离检测桑叶中多酚类物质的方法，其特征在于：步骤（3）中所述滤膜为0.45 μm滤膜。