CN108645922A

CN108645922A - 一种烟草基因编辑素材中多酚类物质的测定方法

Info

Publication number: CN108645922A
Application number: CN201810146522.0A
Authority: CN
Inventors: 李雪梅; 李晶; 王晋; 黄海涛; 刘欣; 许�永; 孔维松; 杨光宇; 张涛; 曾婉俐; 向海英; 许力; 蒋佳芮
Original assignee: China Tobacco Yunnan Industrial Co Ltd
Current assignee: China Tobacco Yunnan Industrial Co Ltd
Priority date: 2018-02-12
Filing date: 2018-02-12
Publication date: 2018-10-12

Abstract

本发明公开了一种烟草基因编辑素材中多酚类物质的测定方法，使用以下装置：样品萃取瓶，包括：外套管(1)、内套管(2)、导液管(4)、筛板；样品萃取架(5)；样品收集架(6)；转抽(7)和下压板(8)。步骤为：①萃取烟草粉末；②过滤；③收集样品滤液；④使用高效液相色谱法进行测定。本发明的测定方法可用于检测烟草基因编辑素材中多酚类物质的含量，具有前处理简单方便、定量准确、重复性好的优点。

Description

一种烟草基因编辑素材中多酚类物质的测定方法

技术领域

本发明属于分析化学技术领域，具体涉及一种烟草基因编辑素材中多酚类物质的测定方法。

背景技术

多酚类物质是烟草中重要次生代谢产物，烟草中的多酚主要包含咖啡单宁，香豆素，黄酮，等结构类型，主要化合物包括绿原酸、莨菪葶、芦丁。它们对于烟草及烟叶的生长发育发挥着重要作用。研究结果表明：一方面，多酚也是影响烟草品质的重要成分，对烟叶色泽、烟气香吃味和烟气生理强度等方面起着重要作用。另一方面，多酚是卷烟烟气中简单酚的重要前体化合物，对卷烟烟气有害成分释放量有显著影响。因此准确烟草中的多酚类化合物对烟草质量评价和卷烟降焦减害均具有重要意义。

目前，烟草中的多酚测定已有较多研究报道，方法涉及分光光度法、气相色谱法(GC)或(GCMS)、高效液相色谱法、化学发光检测法、毛细管电泳(CE)检测法等。其中高效液相色谱法是最常用的方法，目前的烟草行业标准YC/T202-2006采用高效液相色谱法测定多酚。但色谱分析时间长，每个样品分析周期长，每个样品需要40min以上。

随着烟草行业烟草基因编辑工厂化育种工作的启动，通过基因编辑将产生数万个素材。要对这些海量的素材进行快速化学分析评价评价，现有标准方法很难满足需求。因此，亟待发明一种能快速处理海量基因编辑素材中多酚类物质的高通量检测方法。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种测定烟草基因编辑素材中多酚类物质的方法，为海量筛选评价提供方法依托和高通量处理技术。

本发明的目的还在于提供一种集提取、固相萃取净化、过滤和滤液收集为一体的前处理装置，可有效实现烟草基因编辑素材中多酚类物质的高通量分析测定。

本发明的目的是通过以下技术方案予以实现的。

一种烟草基因编辑素材中多酚类物质的测定方法，使用以下装置：

样品萃取瓶，包括：外套管1，其底部密封且为平底，其口部有一密封圈11；内套管2，其外径与所述外套管1的内径相适配，其的长度大于所述外套管1的长度；导液管4，位于所述内套管2内，其下端有一扩张口与所述内套管2的下端内壁密封固定连接，其与所述内套管2上端口固定连接形成受压面21，其上部伸出所述内套管2外部，并回弯向下；筛板3，位于所述内套管2的下端开口内，为一个或多个；样品萃取架5，其内有若干样品萃取瓶放置孔51，用于放置所述样品萃取瓶；样品收集架6，其内有若干样品瓶放置孔61和若干废液收集瓶放置孔62，用于放置样品瓶610和废液收集瓶620；转抽7，位于所述样品收集架6中心部；所述样品收集架6和所述样品萃取架5可分别围绕所述转抽7旋转；下压板8，其表面伸出有若干下压头81；

该方法包括以下步骤：

①烟草样品粉碎，过40目筛；准确称取0.25g(精确至0.1mg)的烟草粉末样品于外套管中，加入25mL的萃取剂，插入内套管并放置在所述样品萃取架5上进行超声萃取35min；

②利用转轴进行固定，使所述导液管的管口对准废液收集瓶620，下压内套管的受压面21并使萃取溶液通过过滤筛板(3)过滤后进入导液管中，并从中流出，最初滤液2-3mL进入废液收集瓶620中；

③以转轴为中心，转动样品萃取架，使所述导液管的向下回弯管口对准所述样品瓶610瓶口，继续下压内套管的受压面21，将1-1.5mL样品滤液转移到样品瓶610中，冷却至室温得到待分析的样品滤液；

④使用高效液相色谱分析进行测定，采用峰面积法进行定量，对比样品烟草基因编辑素材中多酚类物质的的峰面积与标准溶液工作曲线的峰面积法，即可确烟草基因编辑素材中多酚类物质的含量。根据样品中多酚类物质的含量进行对比，结合基因编辑位点，考察烟草基因功能对代谢物的影响规律。

优选地，所测定的多酚类物质为：5-O-咖啡酰奎宁酸，绿原酸，4-O-咖啡酰奎尼酸，咖啡酸，东莨菪素，芦丁，山柰酚-3-芸香糖甙，槲皮素。

优选地，步骤①所述的萃取试剂为80v/v％的甲醇水溶液。

优选地，步骤②所述得到筛板3的孔径为0.45μm；所述筛板3为两块，两块筛板之间填充有固相萃取填料。

优选地，所述固相萃取填料的粒径30-50μm，装填量为0.5g。

优选地，步骤④所述的高效液相色谱为：色谱柱：Eclipse XDB-C18RRLC柱(50×4.6mm，1.8μm)；流速：2.0mL/min；柱温：30℃，进样量：5.0μL；流动相：A为0.1v/v％甲酸水溶液；B为色谱纯乙腈水溶液，梯度洗脱；检测时间：6min；检测波长：345nm。

优选地，所述梯度洗脱条件为：0-4.5min，10v/v％乙腈水溶液递增到80v/v％，保留0.5min；5.5-6.0min，恢复到初始条件10v/v％乙腈水溶液。

本发明的方法使用的样品萃取瓶集萃取、过滤、转移为一体，样品在外套管1中萃取结束后；在受压面21处用力下压内套管2，萃取液通过筛板3过滤后进入到导液管4中，并从导液管4的回弯向下口流出进入样品瓶中，得到样品滤液并进行色谱分析。此过程样品的萃取、过滤、转移为一体，避免了操作所带来的实验误差。

外套管1口部装有一个密封圈11，用于萃取时固定内套管2，以防止萃取液溅出以及样品过滤时缓冲。

在本发明中，导液管4直径优选为1-2mm。

使用本发明装置的多个样品萃取瓶操作过程如下：把若干样品萃取瓶(如八个)放入样品萃取架5的萃取瓶放置孔51中，分别放入样品进行萃取操作；开始收集的部分溶液(如2ml)丢弃，因此开始先分别把导液管4的向下回弯对准样品收集架6上的废液收集瓶620的口部，把下压板8盖上，使下压头81分别对准受压面21，废液收集瓶620里的液体达到要求后，旋转样品萃取架5或样品收集架6，使导液管4的向下回弯对准样品瓶610的口部，继续向下压下压板8，八个样品萃取瓶中的液体样品分别通过各自的筛板3过滤后进入各自的导液管4中，再进入样品瓶610中，继续下压所述下压板8使内套管2下压到外套管1的底部，则所有样品萃取瓶中的液体通过各自的导液管4分别都转移到样品瓶610中，完成样品转移操作。样品瓶610中的样品可分别用于分析。

本发明的有益效果为：

(1)本发明使用的装置集提取、固相萃取净化、过滤、滤液收集为一体，样品的前处理过程中不需要转移样品就可以直接萃取、过滤并收集得到待分析样品，有效避免了操作所带来的实验误差。提供了一种测定烟草基因编辑素材中多酚类物质的高通量分析方法，适用于大批量样品的准确测试；简单、方便、萃取效果好、样品处理通量高、定量准确、重复性好、检出限低等优点。

(2)本发明的测定方法样品萃取效果和精密度均比传统方法有较大提高，分析结果与标准方法测定的结果相符合。具有定量准确、重复性好、检出限低等优点，适用于大批量样品的准确测试。该测定方法样品分析效率比传统方法有较大提高，可为烟草基因编辑素材中多酚类物质的检测提供准确可靠的方法，海量筛选和评价以及烟草基因功能探索研究提供有效的技术支持。

附图说明

图1为本发明的外套管示意图；

图2为本发明的内套管示意图；

图3为本发明的萃取混合时内套管插入外套管口部示意图；

图4为本发明的萃取液过滤、转移时内套管插入外套管内部示意图；

图5为本发明的样品萃取架和样品收集架示意图；

图6为本发明的一个样品萃取瓶放置在样品萃取架上和样品收集瓶放置在样品收集架上时样品转移步骤的示意图；

图7为本发明的透明下压板示意图；

图8为多酚类物质标准溶液色谱图；

图9为样品溶液中多酚类物质色谱图。

附图说明：1-外套管；2-内套管；21-受压面；3-筛板；4-导液管；5-样品萃取架；51-样品萃取瓶放置孔；6-样品收集架；61-样品瓶放置孔；62-废液收集瓶放置孔；610-样品收集瓶；620-废液收集瓶；7-转轴；8-下压板；81-下压头；82-把手；11-密封圈；12-样品。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的技术方案进行详细地说明，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过购买获得的常规产品。

实施例1：测定烟草叶片A中基因编辑素材中多酚类物质的方法，包括如下步骤：

①样品前处理：随机选取基因编辑育种工厂中烟草叶片A，烘干粉碎过40目筛。准确称取0.25g(精确至0.1mg)烟草样品于外套管中，加入50mL的80v/v％甲醇水溶液，随后，利用密封圈将内套管卡在外套管的口部；按上述步骤平行处理八个样品。然后将八个样品萃取管放置在样品萃取架上进行超声萃取35min。待萃取完全后，利用转轴进行固定，使各自的导液管的回弯向下口对准废液收集瓶620，然后使用下压板8，使下压头81分别对准受压面21，施加向下的力下压下压板8，使八个样品萃取溶液分别通过各自的过滤筛板进入导液管4中，并从导液管4里流出，最初滤液2mL进入废液收集瓶620；然后以转轴为中心，转动样品萃取架5，使，使各自的导液管的回弯向下口对准样品收集瓶610，继续下压过滤内套管，将过滤的溶液转移1.5mL到样品瓶中；得到八个供超高效液相色谱分析的样品。用紫外检测法定量测定烟草样品中的多酚类物质。采用峰面积法进行定量，通过样品中多酚类物质的峰面积与标准溶液色谱图对比，即可确定烟草叶片A的八个样品中基因编辑素材的多酚类物质的含量。

②液相色谱分析：色谱柱：Eclipse XDB-C18RRLC柱(50×4.6mm，1.8μm)；流速：2.0mL/min；柱温：30℃；进样量：5.0μL；流动相：A为0.1v/v％甲酸水溶液；B为色谱纯乙腈溶液；梯度洗脱：0-4.5min，10v/v％乙腈溶液递增为80v/v％，保留0.5min；5.5-6.0min，恢复到初始条件10v/v％乙腈溶液；检测时间：6min；检测波长：345nm。

得到的结果为：A烟草基因编辑素材中5-O-咖啡酰奎宁酸：6.28mg/g；绿原酸：14.33mg/g；4-O-咖啡酰奎尼酸：4.16mg/g；咖啡酸：1.08mg/g；东莨菪素：0.526mg/g；芦丁：9.35mg/g；山柰酚-3-芸香糖甙：1.28mg/g；槲皮素：

0.459mg/g。如图9所示。

实施例2：以五个品种烟叶为考察对象，测定其烟叶中多酚类物质的方法，五个烟叶样品为：烤烟、白肋烟、香料烟、津巴布韦烟草、某卷烟烟叶。步骤如下：

①样品前处理：将烟草叶样品烘干粉碎过40目筛。准确称取0.25g(精确至0.1mg)烟草样品于外套管中，加入50mL的80v/v％甲醇水溶液，随后，利用密封圈将内套管卡在外套管的口部；按上述步骤平行处理五个样品。然后将五个样品萃取管放置在样品萃取架上进行超声萃取35min。待萃取完全后，利用转轴进行固定，使各自的导液管的回弯向下口对准废液收集瓶620，然后使用下压板8，使下压头81分别对准受压面21，施加向下的力下压下压板8，使五个样品萃取溶液分别通过各自的过滤筛板进入导液管4中，并从导液管4里流出，最初滤液2mL进入废液收集瓶620；然后以转轴为中心，转动样品萃取架5，使各自的导液管的回弯向下口对准样品收集瓶610，继续下压过滤内套管，将过滤的溶液转移1.5mL到样品瓶中；得到五个供超高效液相色谱分析的样品。用紫外检测法定量测定烟草样品中的多酚类物质。采用峰面积法进行定量，通过样品中多酚类物质的峰面积与标准溶液色谱图对比，即可确定五个品种烟叶的基因编辑素材样品中的多酚类物质的含量。

五个烟叶样品检测结果见表1。

表1烟叶样品中多酚类物质检测结果

Claims

1.一种烟草基因编辑素材中多酚类物质的测定方法，其特征在于，使用以下装置：

样品萃取瓶，包括：外套管(1)，其底部密封且为平底，其口部有一密封圈(11)；内套管(2)，其外径与所述外套管(1)的内径相适配，其的长度大于所述外套管(1)的长度；导液管(4)，位于所述内套管(2)内，其下端有一扩张口与所述内套管(2)的下端内壁密封固定连接，其与所述内套管(2)上端口固定连接形成受压面(21)，其上部伸出所述内套管(2)外部，并回弯向下；筛板(3)，位于所述内套管(2)的下端开口内，为一个或多个；样品萃取架(5)，其内有若干样品萃取瓶放置孔(51)，用于放置所述样品萃取瓶；样品收集架(6)，其内有若干样品瓶放置孔(61)和若干废液收集瓶放置孔(62)，用于放置样品瓶(610)和废液收集瓶(620)；转抽(7)，位于所述样品收集架(6)中心部；所述样品收集架(6)和所述样品萃取架(5)可分别围绕所述转抽(7)旋转；下压板(8)，其表面伸出有若干下压头(81)；

该方法包括以下步骤：

①准确称取0.25g的烟草粉末样品于外套管中，加入25mL的萃取剂，插入内套管并放置在所述样品萃取架(5)上进行超声萃取35min；

②利用转轴进行固定，使所述导液管的管口对准废液收集瓶(620)，下压内套管的受压面(21)并使萃取溶液通过过滤筛板(3)过滤后进入导液管中，并从中流出的最初滤液2-3mL进入废液收集瓶(620)中；

③以转轴为中心，转动样品萃取架，使所述导液管的向下回弯管口对准所述样品瓶(610)瓶口，继续下压内套管的受压面(21)，将1-1.5mL样品滤液转移到样品瓶(610)中，冷却至室温得到待分析的样品滤液；

④使用高效液相色谱分析进行测定，采用峰面积法进行定量，对比样品烟草基因编辑素材中多酚类物质的的峰面积和标准溶液工作曲线，即可确烟草基因编辑素材中多酚类物质的含量。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所测定的多酚类物质为：5-O-咖啡酰奎宁酸，绿原酸，4-O-咖啡酰奎尼酸，咖啡酸，东莨菪素，芦丁，山柰酚-3-芸香糖甙，槲皮素。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤①所述的萃取试剂为80v/v％的甲醇水溶液。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤②所述得到筛板(3)的孔径为0.45μm；所述筛板(3)为两块，两块筛板之间填充有固相萃取填料。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述固相萃取填料的粒径30-50μm，装填量为0.5g。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤④所述的高效液相色谱为：色谱柱：Eclipse XDB-C18 RRLC柱(50×4.6mm，1.8μm)；流速：2.0mL/min；柱温：30℃，进样量：5.0μL；流动相：A为0.1v/v％甲酸水溶液；B为色谱纯乙腈水溶液，梯度洗脱；检测时间：6min；检测波长：345nm。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述梯度洗脱条件为：0-4.5min，10v/v％乙腈水溶液递增到80v/v％，保留0.5min；5.5-6.0min，恢复到初始条件10v/v％乙腈水溶液。