CN110133158A - 一种酒蒸黄连的hplc指纹图谱检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种酒蒸黄连的HPLC指纹图谱，它是采用高效液相色谱法检测，包括如下步骤：1)参照物溶液的制备；2)供试品溶液的制备；3)分别吸取参照物溶液和供试品溶液注入液相色谱仪，记录色谱图。本发明酒蒸黄连的HPLC指纹图谱检测方法，建立的指纹图谱具有很强的特异性，特征峰的规律性强，一致性较好，可作为酒蒸黄连的质量评价方法，同时也可用于酒蒸黄连中格兰地新、非洲防己碱、表小檗碱、盐酸药根碱、盐酸黄连碱、盐酸巴马汀、盐酸小襞碱和/或小檗红碱的含量测定，并能有效鉴别酒蒸黄连。
Description
技术领域
本发明具体涉及一种酒蒸黄连的HPLC指纹图谱检测方法。
背景技术
中药(TCM)是在中医理论指导下生产的药物，其是许多化学物质的集合，并且在这些组分中的一种或多种中有效。因此，用现有的质量评价方法难以真实地反映中药的多效性和完整性，难以准确反映中药的内部综合质量。因此，多组分同时测定的质量控制模型已成为未来中药质量控制的关键。多指标成分的定量分析是中药质量控制的最直接方法，可以揭示化学成分含量的变化，是中药质量控制的关键环节。
在中国药典中，黄连是Coptis chinensis Franch,Coptis deltoideaC.Y.Chenget Hsiao,or Coptisteeta Wall.的干燥根茎。黄连在我国用药历史悠久，味连是目前的主流品种。在中医理论中，黄连具有“清热燥湿、泻火解毒”的功能。目前，现代药理研究表明，黄连可用于治疗腹泻、黄疸、高热、头晕、烦躁不安、失眠、心悸不安等。酒蒸黄连是黄连的炮制加工产品，对治疗糖尿病有很好的效果。
近年来，有文献表明，小檗红碱在黄连酒蒸过程中可产生，是小檗碱的代谢产物，具有多种生物活性，如降血糖作用，抗肿瘤作用，抗炎作用等。研究表明，酒蒸黄连能够改善3T3-L1脂肪细胞的胰岛素抵抗，增强脂肪细胞吸收葡萄糖的能力，并利用其在体外提高细胞水平的胰岛素抵抗。
降血糖药有益于改善糖尿病患者的症状，表明小檗碱是酒蒸黄连的活性成分之一，有抗糖尿病活性。然而，到目前为止，酒蒸黄连的质量控制体仍然缺乏，酒蒸黄连未被纳入2015年版中国药典，极少的文献研究它的含量测定。因此，为酒蒸黄连建立全面的质量控制方法非常重要。
目前HPLC-ELSD、HPLC和UPLC-PAD可用于黄连的质量控制。在2015版《中国药典》和《香港中药材标准》中，分别采用4和2个化学组分对黄连质量进行控制。目前，酒蒸黄连的质量控制是建立在黄连的基础上，对酒蒸黄连缺乏专属性研究。此外，同时测定酒蒸黄连中的格兰地新、非洲防己碱、表小檗碱、盐酸药根碱、盐酸黄连碱、小檗红碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱尚无报道。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供了一种酒蒸黄连的HPLC指纹图谱检测方法，它是采用高效液相色谱法检测，其操作步骤如下：
1)参照物溶液的制备：取生物碱类对照品，加甲醇溶解，即得；
2)供试品溶液的制备：取待测样品，加甲醇-盐酸提取，过滤，取滤液，加甲醇稀释2-5倍，即得；
3)分别吸取参照物溶液和供试品溶液注入液相色谱仪，色谱条件如下：
色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相：以乙腈为流动相A，以0.1％三氟乙酸溶液为流动相B梯度洗脱；梯度洗脱程序如下：
。
进一步地，步骤1)所述生物碱类对照品为格兰地新、非洲防己碱、表小檗碱、盐酸药根碱、盐酸黄连碱、盐酸巴马汀、盐酸小襞碱和/或小檗红碱。
更进一步地，所述格兰地新、非洲防己碱、表小檗碱、盐酸药根碱、盐酸黄连碱、小檗红碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱在参照物溶液中浓度分别为1.36μg/ml，7.12μg/ml,0.643μg/ml,4.176μg/ml,18.33μg/ml,0.515μg/ml,15.708μg/ml和58.32μg/ml。
进一步地，步骤2)所述待测样品与甲醇-盐酸的质量体积比为0.2g：50ml；所述滤液加甲醇稀释5倍。
进一步地，步骤2)所述甲醇-盐酸的体积比为100：1。
进一步地，步骤2)所述加甲醇稀释5倍。
进一步地，步骤2)所述提取为超声提取，时间30min，功率250W，频
率40kHz。
进一步地，步骤3)所述的分别注入液相色谱仪的参照物溶液和供试品溶液量为10μl。
进一步地，步骤3)所述色谱条件的波长为346nm，柱温为25℃，流动相流速为1.00ml/min，理论板数不低于6000。
进一步地，步骤3)所述十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱为Welch规格为：250mm×4.6mm，5μm。
进一步地，所述检测方法得到的特征图谱中应呈现13个特征峰，与格兰地新参照物相应的峰为峰4，与非洲防己碱参照物相应的峰为峰7，与表小檗碱参照物相应的峰为峰8，与盐酸药根碱参照物相应的峰为峰9，与盐酸黄连碱参照物相应的峰为峰10，与小檗红碱参照物相应的峰为峰11，与盐酸巴马汀参照物相应的峰为峰12，与盐酸小檗碱参照物相应的峰为峰13。
更进一步地，所述供试品为酒蒸黄连，其通过特征图谱计算的盐酸小檗碱含量大于7％，盐酸黄连碱的含量大于2％。
本发明酒蒸黄连的HPLC指纹图谱检测方法，建立的指纹图谱具有很强的特异性，特征峰的规律性强，一致性较好，可作为酒蒸黄连的质量评价方法，同时也可用于酒蒸黄连中格兰地新、非洲防己碱、表小檗碱、盐酸药根碱、盐酸黄连碱、盐酸巴马汀、盐酸小襞碱和/或小檗红碱的含量测定，并能有效鉴别酒蒸黄连。
本发明酒蒸黄连的HPLC指纹图谱检测方法，相对于现有技术中酒蒸黄连的HPLC检测方法，具备以下优势：
1.流动相配制简单快捷，在不调整流动相pH值的情况下，就能使流动相pH值范围达到理想状态，即能完成对成分的分离，又不损伤色谱柱；
2.通过改变流动相及其比例，使酒蒸黄连中更多特征成分的色谱峰被分离，尤其是小檗红碱，且分离度更高，拖尾因子等参数也能达到标准，使更多色谱峰被指认确定。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1黄连与酒蒸黄连图(A原植物(黄连)，B原药材，C黄连，D酒蒸黄连)
图2酒蒸黄连高效液相色谱图(混合对照品(A)、样品(B)和空白溶液(C)；图中各标号表示4：格兰地新、7：非洲防己碱、8：表小檗碱、9：盐酸药根碱、10：盐酸黄连碱、11：小檗红碱、12：盐酸巴马汀、13：盐酸小檗碱)
图3酒蒸黄连(S1-S10)的指纹图谱
具体实施方式
1、材料、试剂与仪器
1.1实验仪器
高效液相色谱仪：岛津LC-2030C 3D系列高效液相色谱仪；
电子天平：FA1204C电子天平(上海越平科学仪器有限公司)；
超声波清洗器：PS-80超声波清洗机(深圳市洁康洗净电器有限公司)；
色谱柱：Welch(250mm×4.6mm，5m)
1.2试剂及试药
格兰地新对照品(含量≥98％，批号：MUST-17110502)，非洲防己碱对照品(含量≥98％，批号：MUST-17031901)，表小檗碱对照品(含量≥98％，批号：MUST-072011)，盐酸药根碱对照品(含量≥98％，批号：MUST-17110702)，盐酸黄连碱对照品(含量≥98％，批号：MUST-17061705)，盐酸巴马汀对照品(含量≥98％，批号：MUST-17022604)，盐酸小襞碱对照品(含量≥98％，批号：MUST-17110105)购买于成都曼思特生物科技有限公司；小檗红碱对照品(含量≥98％，批号：16121302)购买于成都普菲德生物技术有限公司。Fisher色谱乙腈(色谱纯)、水(up水)，甲醇、盐酸、三氟乙酸等为分析纯。
由雅安联成迅康提供5批酒蒸黄连样品(S1-S5)，另外5批酒蒸黄连(S6-S10)在成都中医药大学实验室(国家中医药研究实验室)加工，从成都荷花池药材市场获得黄连样品，由卢先明教授鉴定。样品信息详见表1。与黄连相比，酒蒸黄连的颜色为棕棕色至深棕色，外观粗糙，有细小的纤维根。详见图1。
表1 10批酒蒸黄连样品信息
实施例1本发明酒蒸黄连指纹图谱检测方法
1)参照物溶液的制备：
分别精密称取对照品格兰地新、非洲防己碱、表小檗碱、盐酸药根碱、盐酸黄连碱、小檗红碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱，置于25mL容量瓶中，用甲醇溶解，得到格兰地新、非洲防己碱、表小檗碱、盐酸药根碱、盐酸黄连碱、小檗红碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱浓度分别为1.36,7.12,0.643,4.176,18.33,0.515,15.708和58.32μg/ml的混合对照品溶液；
2)供试品溶液的制备：
精密称定酒蒸黄连的粉末(过二号筛)0.2g，置具塞锥形瓶中，分别精密加入甲醇-盐酸(100:1)的混合溶液50ml，密塞，称定重量，超声处理(功率250W，频率40kHz)30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液2ml，置10ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，取续滤液，即得；
3)特征图谱的测定
分别精密吸取参照物溶液和供试品溶液10μl，注入液相色谱仪，得到色谱图；
色谱条件如下：
检测波长：346nm；
色谱柱：Welch(250mm×4.6mm，5μm)；
流动相:乙腈(A)和0.1％三氟乙酸(B)，其中A(乙腈)的梯度变化为：0-30min，15-20％；30-50min，20-25％；50-60min，25-35％；60-70min，35％；
柱温为25℃；
流速为1.00ml/min；
4)分析特征图谱
酒蒸黄连特征图谱中呈现13个特征峰，与格兰地新参照物相应的峰为峰4，与非洲防己碱参照物相应的峰为峰7，与表小檗碱参照物相应的峰为峰8，与盐酸药根碱参照物相应的峰为峰9，与盐酸黄连碱参照物相应的峰为峰10，与小檗红碱参照物相应的峰为峰11，与盐酸巴马汀参照物相应的峰为峰12，与盐酸小檗碱参照物相应的峰为峰13。
实施例2本发明酒蒸黄连中成分含量检测
1)参照物溶液的制备：
分别精密称取对照品格兰地新、非洲防己碱、表小檗碱、盐酸药根碱、盐酸黄连碱、小檗红碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱，置于25mL容量瓶中，用甲醇溶解，得到格兰地新、非洲防己碱、表小檗碱、盐酸药根碱、盐酸黄连碱、小檗红碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱浓度分别为1.36,7.12,0.643,4.176,18.33,0.515,15.708和58.32μg/ml的混合对照品溶液；
2)供试品溶液的制备：
精密称定酒蒸黄连的粉末(过二号筛)0.2g，置具塞锥形瓶中，分别精密加入甲醇-盐酸(100:1)的混合溶液50ml，密塞，称定重量，超声处理(功率250W，频率40kHz)30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液2ml，置10ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，取续滤液，即得；
3)特征图谱的测定
分别精密吸取参照物溶液和供试品溶液10μl，注入液相色谱仪，得到色谱图；
色谱条件如下：
检测波长：346nm；
色谱柱：Welch(250mm×4.6mm，5μm)；
流动相:乙腈(A)和0.1％三氟乙酸(B)，其中A(乙腈)的梯度变化为：0-30min，15-20％；30-50min，20-25％；50-60min，25-35％；60-70min，35％；
柱温为25℃；
流速为1.00ml/min；
4)采用外标法计算酒蒸黄连中格兰地新、非洲防己碱、表小檗碱、盐酸药根碱、盐酸黄连碱、小檗红碱、盐酸巴马汀和盐酸小檗碱的含量。
以下通过试验例具体说明本发明的有益效果：
试验例1
1、仪器和色谱条件
色谱柱为Welch(250mm×4.6mm，5μm)；柱温25℃；流动相由A(乙腈)和B(0.1％三氟乙酸)(v/v)组成，其中A(乙腈)的梯度变化为：0-30min，15-20％；30-50min，20-25％；50-60min，25-35％；60-70min，35％；流速为1mL/min，进样量为10μl，检测波长为346nm。
在上述色谱条件下，样品溶液和对照品溶液的色谱峰具有相同的保留时间。格兰地新、非洲防己碱、表小檗碱、盐酸药根碱、盐酸黄连碱、小檗红碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱色谱峰的分离度均大于1.5，理论板数大于60000，空白对照表明该方法具有良好的特异性。混合对照品、样品和空白对照的高效液相色谱图如图2所示。
2、样品制备
精密称定酒蒸黄连的粉末(过二号筛)，置具塞锥形瓶中，分别精密加入甲醇-盐酸(100:1)的混合溶液50ml，密塞，称定重量，超声处理(功率250W，频率40kHz)30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液2ml，置10ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，取续滤液，即得。
3、标准溶液的制备
分别精密称取对照品格兰地新、非洲防己碱、表小檗碱、盐酸药根碱、盐酸黄连碱、小檗红碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱适量，置于25mL容量瓶中，用甲醇溶解，得到格兰地新、非洲防己碱、表小檗碱、盐酸药根碱、盐酸黄连碱、小檗红碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱浓度分别为1.36,7.12,0.643,4.176,18.33,0.515,15.708and 58.32μg/ml的混合对照品溶液。
4、方法学考察
4.1、线性关系考察
精密称取格兰地新、非洲防己碱、表小檗碱、盐酸药根碱、盐酸黄连碱、小檗红碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱适量对照品适量，置25ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，制成对照品溶液。精密吸取溶液2、4、6、8、10、20μl注入液相色谱仪。计算回归方程。检测限(LOD)和定量限(LOQ)是信噪比为3：1和10：1时的相应质量。
4.2、精密度考察
精密吸取对照品溶液10μl，按上述色谱条件，连续进样6次，分别测定峰面积，计算RSD值。
4.3、重复性考察
取同一批酒蒸黄连6份，按供试品溶液制备方法制备，精密吸取供试品溶液10μl，注入液相色谱仪，记录色谱峰面积，计算RSD值。
4.4、稳定性考察
取同一份酒蒸黄连供试品溶液，按上述色谱条件，分别在不同时间(0,2,4,6,8,10,12,16和24h)精密吸取供试品溶10μl，注入液相色谱仪，记录色谱峰面积。计算RSD值。
4.5、加样回收率试验
取已知含量的供试品6份，每份取样约0.1g，精密称定，分别加入上述已配制好的混合对照品溶液，浓度分别为0.2125,0.6675,0.150,0.475,2.225,0.08125,2.025和2.625mg/mL，按“供试品溶制备”项下的方法制成供试品溶液，精密吸取供试品溶液10μl，注入液相色谱仪，测定，计算回收率。回收率计算公式如下：
4.6、结果和讨论
为了寻求更加高效的提取方式，以相应参照物含量为指标，考察了不同的提取方式，包括提取方法(超声提取和回流提取)、提取溶剂(甲醇、甲醇-盐酸(100:1)、甲醇-盐酸(100:3)、70％甲醇、70％甲醇-盐酸(100：1)。研究并优化了溶剂剂量(30、50、70mL)和提取时间(15、30、45min)。
最后，选择50mL甲醇-盐酸(100:1)超声提取30分钟的样品提取方法作为最佳提取参数。此外，研究了不同类型的色谱柱，结果表明采用Welch(250mm×4.6mm，5μm)时，所得色谱曲线基线平稳，分离良好，保留时间适中，选择Welch(250mm×4.6mm，5m)进行分离。以乙腈-0.1％三氟乙酸水溶液为最佳洗脱液，采用梯度洗脱，色谱曲线基线良好，具有较好的分离度。
8种化合物的线性结果如表2所示，具有良好的线性关系(R2>0.9993)。LOD和LOQ值分别为0.03～0.54ng和0.11～1.90ng。
表2酒蒸黄连中8种化合物的线性关系、检出限和定量限
精密度实验中，各组分峰面积的RSD值在0.88～1.51％之间，表明该仪器具有较高的精密度。
重复性试验中，各组分的相对标准偏差小于2.98％，表明该方法具有良好的重复性。
稳定性试验中，各组分的RSD值分别为1.12％、1.06％、1.09％、1.25％、1.13％、1.93％、1.18％和0.99％，表明各组分在24小时内稳定。
各组分回收率在96.97～103.01％之间，RSD为0.92～2.88％。结果表明各检测指标回收率良好。如表3所示。
表3 加样回收结果
根据10批酒蒸黄连样品的色谱图进行分析，结果表明酒蒸黄连共有13个特征峰(图3)，通过与对照品的比较确定了8个峰。峰4为格兰地新、峰7-13分别为非洲防己碱、表小檗碱、盐酸药根碱、盐酸黄连碱、小檗红碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱。上述特征峰的规律性较强，一致性较好，可作为酒蒸黄连的质量评价方法。所建立的指纹图谱具有很强的特异性，能用于酒蒸黄连的鉴别。
根据HPLC-PDA测定结果，10批酒蒸黄连样品的8种组分的定量结果如表4所示。在酒蒸黄连中，盐酸小檗碱和盐酸黄连碱的含量是最高的两种成分，平均含量分别为7.69％和2.46％，加工过程可能引起其它生物碱含量的变化。
表4 10批酒蒸黄连中的各组分的含量
从指纹图谱和多组分含量测定的角度分析酒蒸黄连，建立同时测定酒蒸黄连中8个组分的方法，方法简单，重现性好。该法为酒蒸黄连的质量标准提供参考，为后续的研究奠定了基础。
综上，本发明酒蒸黄连的HPLC指纹图谱检测方法，建立的指纹图谱具有很强的特异性，特征峰的规律性强，一致性较好，可作为酒蒸黄连的质量评价方法，同时也可用于酒蒸黄连中格兰地新、非洲防己碱、表小檗碱、盐酸药根碱、盐酸黄连碱、盐酸巴马汀、盐酸小襞碱和/或小檗红碱的含量测定，并能有效鉴别酒蒸黄连。
Claims (11)
1.一种酒蒸黄连的HPLC指纹图谱检测方法，其特征在于：它是采用高效液相色谱法检测，其操作步骤如下：
1)参照物溶液的制备：取生物碱类对照品，加甲醇溶解，即得；
2)供试品溶液的制备：取待测样品，加甲醇-盐酸提取，过滤，取滤液，加甲醇稀释2-5倍，即得；
3)分别吸取参照物溶液和供试品溶液注入液相色谱仪，色谱条件如下：
色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相：以乙腈为流动相A，以0.1％三氟乙酸溶液为流动相B梯度洗脱；梯度洗脱程序如下：
。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤1)所述生物碱类对照品为格兰地新、非洲防己碱、表小檗碱、盐酸药根碱、盐酸黄连碱、盐酸巴马汀、盐酸小襞碱和/或小檗红碱。
3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于：所述格兰地新、非洲防己碱、表小檗碱、盐酸药根碱、盐酸黄连碱、小檗红碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱在参照物溶液中浓度分别为1.36μg/ml，7.12μg/ml,0.643μg/ml,4.176μg/ml,18.33μg/ml,0.515μg/ml,15.708μg/ml和58.32μg/ml。
4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤2)所述待测样品与甲醇-盐酸的质量体积比为0.2g：50ml；所述滤液加甲醇稀释5倍。
5.根据权利要求1或4所述的检测方法，其特征在于：步骤2)所述甲醇-盐酸的体积比为100：1；所述加甲醇稀释5倍。
6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤2)所述提取为超声提取，时间30min，功率250W，频率40kHz。
7.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤3)所述的分别注入液相色谱仪的参照物溶液和供试品溶液量为10μl。
8.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤3)所述色谱条件的波长为346nm，柱温为25℃，流动相流速为1.00ml/min，理论板数不低于6000。
9.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤3)所述十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱为WelchXB-C18，规格为：250mm×4.6mm，5μm。
10.根据权利要求1～9任意一项所述的检测方法，其特征在于：所述供试品为酒蒸黄连，其特征图谱中应呈现13个特征峰，与格兰地新参照物相应的峰为峰4，与非洲防己碱参照物相应的峰为峰7，与表小檗碱参照物相应的峰为峰8，与盐酸药根碱参照物相应的峰为峰9，与盐酸黄连碱参照物相应的峰为峰10，与小檗红碱参照物相应的峰为峰11，与盐酸巴马汀参照物相应的峰为峰12，与盐酸小檗碱参照物相应的峰为峰13。
11.根据权利要求10所述的检测方法，其特征在于：所述供试品为酒蒸黄连，其通过特征图谱计算的盐酸小檗碱含量大于7％，盐酸黄连碱的含量大于2％。
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