CN110320311A - 一种杜仲壮骨丸的质量检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种杜仲壮骨丸的质量检测方法。所述杜仲壮骨丸由杜仲、人参、三七、细辛、川芎、当归、秦艽、独活、白术、桑枝、木瓜、续断、附片、黄芪、防风、乌梢蛇、金铁锁、狗骨胶、石楠藤、淫羊藿、大血藤、威灵仙和肿节风。提供的质量检测方法包括鉴别方法和含量测定方法;鉴别方法包括对黄芪、淫羊藿、三七、人参或肿节风的薄层鉴别检测;含量测定方法包括对马兜铃酸I、马兜铃内酰胺‑I或淫羊藿苷的含量测定。所述质量检测方法准确,灵敏度高,重复性好,结果可靠,能有效控制该产品的质量,确保药物临床药效的特点。
Description
技术领域
本发明涉及一种杜仲壮骨丸的质量控制,属于药品技术的领域。
背景技术
杜仲壮骨丸,通过将人参、细辛、乌梢蛇、金铁锁、狗骨胶、三七及部分当归、川芎、独活、秦艽、白术干燥,粉碎成细粉,备用;将杜仲、桑枝、淫羊藿、木瓜、续断、石楠藤、附片、黄芪、大血藤、防风、威灵仙、肿节风以及剩余的当归、川芎、独活、秦艽、白术加水提取,过滤,滤液浓缩成浸膏。将上述浸膏、药粉及适量辅料混匀,干燥,包衣,制成丸,即得。
本品为黑色糖衣浓缩水丸,除去糖衣后显棕褐色;气香,味微苦。功能与主治:益气健脾,养肝壮腰,活血通络,强筋健骨,祛风除湿。用于治疗风湿痹痛,筋骨无力,屈伸不利,步履艰难,腰膝疼痛,畏寒喜温等症。为了更好控制杜仲壮骨丸的质量,确保临床药效,本发明提供了一种杜仲壮骨丸的质量检测方法。
发明内容
本发明的目的在于,提供一种杜仲壮骨丸的质量检测方法。本发明具有准确,灵敏度高,重复性好,结果可靠,能有效控制该产品的质量,确保药物临床药效的特点。
本发明的技术方案:一种杜仲壮骨丸的质量检测方法,所述杜仲壮骨丸按照重量份计,由杜仲81份、人参32.4份、三七32.4份、细辛16.2份、川芎48.6份、当归48.6份、秦艽64.8份、独活48.6份、白术64.8份、桑枝81.0份、木瓜48.6份、续断48.6份、附片32.4份、黄芪81份、防风48.6份、乌梢蛇13.5份、金铁锁16.2份、狗骨胶13份、石楠藤81份、淫羊藿81份、大血藤54份、威灵仙48.6份和肿节风81份按照下述方法制备而成:根据配方将人参、细辛、乌梢蛇、金铁锁、狗骨胶、三七及部分当归、川芎、独活、秦艽、白术干燥,粉碎成细粉,得药粉备用;将杜仲、桑枝、淫羊藿、木瓜、续断、石楠藤、附片、黄芪、大血藤、防风、威灵仙、肿节风以及剩余的当归、川芎、独活、秦艽、白术加水提取,过滤,滤液浓缩成浸膏;将上述浸膏、药粉及适量辅料混匀,干燥,包衣,制成2500丸,即得;所述杜仲壮骨丸的质量检测方法包括鉴别方法和含量测定方法;所述鉴别方法包括对黄芪、淫羊藿、三七、人参或肿节风的薄层鉴别检测;所述含量测定方法包括对马兜铃酸I、马兜铃内酰胺-I或淫羊藿苷的含量测定。
前述的杜仲壮骨丸的质量检测方法中,按照重量份计,所述杜仲壮骨丸用法与用量:用酒或温开水送服,成人一次8~12粒,12~13岁服6~8粒,8~10岁服4~6粒,一日3次;规格:每丸重0.19g。
前述的杜仲壮骨丸的质量检测方法中,所述黄芪的鉴别方法为:取本品40丸,研细,取7g,加乙醇40-60ml,加热回流20-40min,滤过,滤液蒸干,残渣加水30ml使溶解,用乙醚洗涤2-3次,每次20ml,弃去乙醚液,取水溶液,用水饱和的正丁醇振摇提取2-4次,每次20ml,合并正丁醇液,用正丁醇饱和的水溶液洗涤2-4次,每次20ml,取正丁醇溶液,蒸干,残渣加甲醇5ml使溶解,溶液加于中性氧化铝柱100-120目、5g、内径1.5cm上,先用甲醇30-50ml洗涤,弃去洗涤液,用30-50%甲醇40-60ml洗脱,收集洗脱液至水浴上蒸干,残渣加甲醇1ml使溶解,作为供试品溶液;另取黄芪对照药材1g,同法制成对照药材溶液;照中国药典薄层色谱法试验,吸取上述2种溶液各15μl,分别点于同一硅胶G薄层板上,以三氯甲烷-甲醇-水=7-13:2-4:0.1-0.6为展开剂,展开,取出,晾干,喷以10%硫酸乙醇溶液,在100-110℃加热2-5分钟,置365nm紫外灯下检视,供试品色谱中,在与对照药材色谱相应的位置上,显相同颜色的荧光斑点。
前述的杜仲壮骨丸的质量检测方法中,所述黄芪的鉴别方法为:取本品40丸,研细,取7g,加乙醇50ml,加热回流30min,滤过,滤液蒸干,残渣加水30ml使溶解,用乙醚洗涤2次,每次20ml,弃去乙醚液,取水溶液,用水饱和的正丁醇振摇提取3次,每次20ml,合并正丁醇液,用正丁醇饱和的水溶液洗涤3次,每次20ml,取正丁醇溶液,蒸干,残渣加甲醇5ml使溶解,溶液加于中性氧化铝柱100-120目、5g、内径1.5cm上,先用甲醇40ml洗涤,弃去洗涤液,用40%甲醇50ml洗脱,收集洗脱液至水浴上蒸干,残渣加甲醇1ml使溶解,作为供试品溶液;另取黄芪对照药材1g,同法制成对照药材溶液;照中国药典薄层色谱法试验,吸取上述2种溶液各15μl,分别点于同一硅胶G薄层板上,以三氯甲烷-甲醇-水=10:3:0.3为展开剂,展开,取出,晾干,喷以10%硫酸乙醇溶液,在105℃加热2-5分钟,置365nm紫外灯下检视,供试品色谱中,在与对照药材色谱相应的位置上,显相同颜色的荧光斑点。
前述的杜仲壮骨丸的质量检测方法中,所述淫羊藿的鉴别方法为:取本品40丸,研细,取7g,加乙醇40-60ml,50-70℃温浸20-40分钟,滤过,蒸干,残渣加甲醇1ml使溶解,作为供试品溶液;另取淫羊藿对照药材1g,同法制成对照药材溶液,即得;取淫羊藿苷对照品适量,精密称定,加甲醇制成每1ml含1mg的对照品溶液;照中国药典薄层色谱法试验,吸取上述3种溶液各15μl,分别点于同一硅胶H薄层板上,以乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水=7-13:0.5-1.5:0.5-1.5:0.5-1.5为展开剂,展开,取出,晾干,喷以3%三氯化铝溶液,在100-120℃加热2-5分钟,置365nm紫外灯下检视;供试品色谱中,在与对照药材色谱相应的位置上,显相同颜色的荧光斑点。
前述的杜仲壮骨丸的质量检测方法中,所述淫羊藿的鉴别方法为:取本品40丸,研细,取7g,加乙醇50ml,60℃温浸30分钟,滤过,蒸干,残渣加甲醇1ml使溶解,作为供试品溶液;另取淫羊藿对照药材1g,同法制成对照药材溶液,即得;取淫羊藿苷对照品适量,精密称定,加甲醇制成每1ml含1mg的对照品溶液;照中国药典薄层色谱法试验,吸取上述3种溶液各15μl,分别点于同一硅胶H薄层板上,以乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水=10:1:1:1为展开剂,展开,取出,晾干,喷以3%三氯化铝溶液,在105℃加热2-5分钟,置365nm紫外灯下检视;供试品色谱中,在与对照药材色谱相应的位置上,显相同颜色的荧光斑点。
前述的杜仲壮骨丸的质量检测方法中,所述三七、人参的鉴别方法为:取本品40丸,研细,取7g,加甲醇40-60ml,加热回流提取20-40min,滤过,滤液蒸干,残渣加水10-20ml使溶解,用三氯甲烷洗涤2-3次,每次10ml,弃去三氯甲烷液,用水饱和的正丁醇振摇提取2-3次,每次10ml,合并正丁醇液,用0.5-1.5%氢氧化钠溶液洗涤2-3次,每次10ml,再用正丁醇饱和的水洗至中性,取正丁醇液,蒸干,残渣加甲醇1ml使溶解,作为供试品溶液;另取三七、人参对照药材各1g,同法制成对照药材溶液;取人参皂苷Rb1,人参皂苷Re,人参皂苷Rg1、三七皂苷R1对照品,加甲醇制成每1ml各含0.5mg的混合溶液,作为对照品溶液;照中国药典薄层色谱法试验,吸取上述4种溶液各5μl,分别点于同一硅胶G薄层板上,以三氯甲烷-甲醇-水=8-12:2-5:0.2-1为展开剂,展开,取出,晾干,喷以10%硫酸乙醇溶液,在100-110℃加热2-5分钟,置365nm紫外灯下检视;供试品色谱中,在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上,显相同颜色的荧光斑点。
前述的杜仲壮骨丸的质量检测方法中,所述三七、人参的鉴别方法为:取本品40丸,研细,取7g,加甲醇50ml,加热回流提取30min,滤过,滤液蒸干,残渣加水15ml使溶解,用三氯甲烷洗涤2次,每次10ml,弃去三氯甲烷液,用水饱和的正丁醇振摇提取2次,每次10ml,合并正丁醇液,用1%氢氧化钠溶液洗涤2次,每次10ml,再用正丁醇饱和的水洗至中性,取正丁醇液,蒸干,残渣加甲醇1ml使溶解,作为供试品溶液;另取三七、人参对照药材各1g,同法制成对照药材溶液;取人参皂苷Rb1,人参皂苷Re,人参皂苷Rg1、三七皂苷R1对照品,加甲醇制成每1ml各含0.5mg的混合溶液,作为对照品溶液;照中国药典薄层色谱法试验,吸取上述4种溶液各5μl,分别点于同一硅胶G薄层板上,以三氯甲烷-甲醇-水=10:4:0.6为展开剂,展开,取出,晾干,喷以10%硫酸乙醇溶液,在105℃加热2-5分钟,置365nm紫外灯下检视;供试品色谱中,在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上,显相同颜色的荧光斑点。
前述的杜仲壮骨丸的质量检测方法中,所述肿节风的鉴别方法为:取本品40丸,研细,取7g,加石油醚:乙醚=1:1混合溶剂30ml,超声1-2h,过滤,滤渣用5-15ml乙醚洗涤,挥干滤渣表面溶剂,加50-70%甲醇60-80ml,超声20-40min,过滤,滤渣用5-15ml乙酸乙酯洗涤,蒸干滤液,残渣加30-50ml水溶解,用三氯甲烷提取2-3次,每次10-20ml,收集三氯甲烷层,蒸干,残渣加1ml甲醇溶解,作为供试品;取肿节风对照药材1g,同法制得对照药材溶液;取异嗪皮啶对照品,加甲醇制成每1ml含0.1mg的溶液,作为对照品溶液;照中国药典薄层色谱法试验,吸取上述3种溶液各15μl,分别点于同一硅胶G薄层板上,以甲苯-乙酸乙酯-甲酸=6-12:3-5:0.5-1.5为展开剂,展开,取出,晾干,置365nm紫外灯下检视;供试品色谱中,在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上,显相同颜色的荧光斑点。
前述的杜仲壮骨丸的质量检测方法中,所述肿节风的鉴别方法为:取本品40丸,研细,取7g,加石油醚:乙醚=1:1混合溶剂30ml,超声1h,过滤,滤渣用10ml乙醚洗涤,挥干滤渣表面溶剂,加60%甲醇70ml,超声30min,过滤,滤渣用10ml乙酸乙酯洗涤,蒸干滤液,残渣加40ml水溶解,用三氯甲烷提取2次,每次15ml,收集三氯甲烷层,蒸干,残渣加1ml甲醇溶解,作为供试品;取肿节风对照药材1g,同法制得对照药材溶液;取异嗪皮啶对照品,加甲醇制成每1ml含0.1mg的溶液,作为对照品溶液;照中国药典薄层色谱法试验,吸取上述3种溶液各15μl,分别点于同一硅胶G薄层板上,以甲苯-乙酸乙酯-甲酸=9:4:1为展开剂,展开,取出,晾干,置365nm紫外灯下检视;供试品色谱中,在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上,显相同颜色的荧光斑点。
检查:应符合丸剂项下(《中国药典》2015年版四部通则0108)有关的各项规定。
前述的杜仲壮骨丸的质量检测方法中,所述马兜铃酸I、马兜铃内酰胺-I的含量检测方法为:照中国药典高效液相色谱法测定:
色谱条件与系统适用性试验:以碳十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;流动相:以乙腈为流动相A,1%乙酸-0.02%三乙胺水溶液为流动相B;检测波长:316nm;流速:0.6-1ml/min;柱温:25-35℃,流动相梯度洗脱见下表:
对照品溶液的制备:
马兜铃酸I:精密称取马兜玲酸I对照品2-3mg,加甲醇溶解并制成每1ml中含马兜玲酸I 0.002mg的对照品溶液,摇匀,即得;
马兜铃内酰胺-I:精密称取马兜铃内酰胺I对照品2-3mg,加甲醇溶解并制成每1ml中含马兜铃内酰胺I 0.0426mg,摇匀,即得;
供试品溶液的制备:取本品40丸,除去包衣,研细,取2.0g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加70%甲醇40-60ml,称定重量,超声提取30-50分钟,放冷,再称定重量,用70%甲醇溶剂补足减失的重量,摇匀,滤过,取续滤液,即得;
测定法:分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl,注入液相色谱仪,测定,即得。
前述的杜仲壮骨丸的质量检测方法中,所述马兜铃酸I、马兜铃内酰胺-I的含量检测方法为:照中国药典通则0512高效液相色谱法测定:
色谱条件与系统适用性试验:以碳十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;流动相:以乙腈为流动相A,1%乙酸-0.02%三乙胺水溶液为流动相B;检测波长:316nm;流速:0.8ml/min;柱温:30℃,流动相梯度洗脱见下表:
对照品溶液的制备:
马兜铃酸I:精密称取马兜玲酸I对照品2.3mg,加甲醇溶解并制成每1ml中含马兜玲酸I 0.002mg的对照品溶液,摇匀,即得;
马兜铃内酰胺-I:精密称取马兜铃内酰胺I对照品2.13mg,加甲醇溶解并制成每1ml中含马兜铃内酰胺I 0.0426mg,摇匀,即得;
供试品溶液的制备:取本品40丸,除去包衣,研细,取2.0g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加70%甲醇50ml,称定重量,超声提取40分钟,放冷,再称定重量,用70%甲醇溶剂补足减失的重量,摇匀,滤过,取续滤液,即得;
测定法:分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl,注入液相色谱仪,测定,即得。
本品不得检出马兜铃酸I、马兜铃内酰胺-I。
前述的杜仲壮骨丸的质量检测方法中,所述淫羊藿苷的含量检测方法为:照中国药典高效液相色谱法测定:
色谱条件与系统适用性试验:以碳十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;乙腈-水=25-30:70-75为流动相;检测波长为270nm,理论塔板数按淫羊藿苷峰计算大于5000;
对照品溶液的制备:取淫羊藿苷对照品适量,精密称定,加甲醇制成每1ml含18μg的溶液,即得;
供试品溶液的制备:取本品40丸,除去包衣,研细,取2g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入甲醇20-30ml,称定重量,超声处理25-35分钟,放冷,再称定重量,用甲醇补足减失的重量,摇匀,滤过,取续滤液,即得;
测定法:分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl,注入液相色谱仪,测定,即得。
前述的杜仲壮骨丸的质量检测方法中,所述淫羊藿苷的含量检测方法为:照中国药典通则0512高效液相色谱法测定:
色谱条件与系统适用性试验:以碳十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;乙腈-水=28:72为流动相;检测波长为270nm,理论塔板数按淫羊藿苷峰计算大于5000;
对照品溶液的制备:取淫羊藿苷对照品适量,精密称定,加甲醇制成每1ml含18μg的溶液,即得;
供试品溶液的制备:取本品40丸,除去包衣,研细,取2g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入甲醇25ml,称定重量,超声处理30分钟,放冷,再称定重量,用甲醇补足减失的重量,摇匀,滤过,取续滤液,即得;
测定法:分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl,注入液相色谱仪,测定,即得。
本品每1g含淫羊藿以淫羊藿苷(C33H40O15)计,不得少于0.14mg。
前述的杜仲壮骨丸的质量检测方法中,所述杜仲壮骨丸的质量检测方法包括鉴别方法和含量测定方法;所述鉴别方法包括对黄芪、淫羊藿、三七、人参或肿节风的薄层鉴别检测;所述含量测定方法包括对马兜铃酸I、马兜铃内酰胺-I或淫羊藿苷的含量测定,具体如下所示:
性状:本品为黑色糖衣浓缩水丸,除去糖衣后显棕褐色;气香,味微苦;
鉴别:(1)黄芪的鉴别方法为:取本品40丸,研细,取7g,加乙醇50ml,加热回流30min,滤过,滤液蒸干,残渣加水30ml使溶解,用乙醚洗涤2次,每次20ml,弃去乙醚液,取水溶液,用水饱和的正丁醇振摇提取3次,每次20ml,合并正丁醇液,用正丁醇饱和的水溶液洗涤3次,每次20ml,取正丁醇溶液,蒸干,残渣加甲醇5ml使溶解,溶液加于中性氧化铝柱100-120目、5g、内径1.5cm上,先用甲醇40ml洗涤,弃去洗涤液,用40%甲醇50ml洗脱,收集洗脱液至水浴上蒸干,残渣加甲醇1ml使溶解,作为供试品溶液;另取黄芪对照药材1g,同法制成对照药材溶液;照中国药典通薄层色谱法试验,吸取上述2种溶液各15μl,分别点于同一硅胶G薄层板上,以三氯甲烷-甲醇-水=10:3:0.3为展开剂,展开,取出,晾干,喷以10%硫酸乙醇溶液,在105℃加热2-5分钟,置365nm紫外灯下检视,供试品色谱中,在与对照药材色谱相应的位置上,显相同颜色的荧光斑点;
(2)淫羊藿的鉴别方法为:取本品40丸,研细,取7g,加乙醇50ml,60℃温浸30分钟,滤过,蒸干,残渣加甲醇1ml使溶解,作为供试品溶液;另取淫羊藿对照药材1g,同法制成对照药材溶液,即得;取淫羊藿苷对照品适量,精密称定,加甲醇制成每1ml含1mg的对照品溶液;照中国药典薄层色谱法试验,吸取上述3种溶液各15μl,分别点于同一硅胶H薄层板上,以乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水=10:1:1:1为展开剂,展开,取出,晾干,喷以3%三氯化铝溶液,在105℃加热2-5分钟,置365nm紫外灯下检视;供试品色谱中,在与对照药材色谱相应的位置上,显相同颜色的荧光斑点;
(3)三七、人参的鉴别方法为:取本品40丸,研细,取7g,加甲醇50ml,加热回流提取30min,滤过,滤液蒸干,残渣加水15ml使溶解,用三氯甲烷洗涤2次,每次10ml,弃去三氯甲烷液,用水饱和的正丁醇振摇提取2次,每次10ml,合并正丁醇液,用1%氢氧化钠溶液洗涤2次,每次10ml,再用正丁醇饱和的水洗至中性,取正丁醇液,蒸干,残渣加甲醇1ml使溶解,作为供试品溶液;另取三七、人参对照药材各1g,同法制成对照药材溶液;取人参皂苷Rb1,人参皂苷Re,人参皂苷Rg1、三七皂苷R1对照品,加甲醇制成每1ml各含0.5mg的混合溶液,作为对照品溶液;照中国药典薄层色谱法试验,吸取上述4种溶液各5μl,分别点于同一硅胶G薄层板上,以三氯甲烷-甲醇-水=10:4:0.6为展开剂,展开,取出,晾干,喷以10%硫酸乙醇溶液,在105℃加热2-5分钟,置365nm紫外灯下检视;供试品色谱中,在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上,显相同颜色的荧光斑点;
(4)肿节风的鉴别方法为:取本品40丸,研细,取7g,加石油醚:乙醚=1:1混合溶剂30ml,超声1h,过滤,滤渣用10ml乙醚洗涤,挥干滤渣表面溶剂,加60%甲醇70ml,超声30min,过滤,滤渣用10ml乙酸乙酯洗涤,蒸干滤液,残渣加40ml水溶解,用三氯甲烷提取2次,每次15ml,收集三氯甲烷层,蒸干,残渣加1ml甲醇溶解,作为供试品;取肿节风对照药材1g,同法制得对照药材溶液;取异嗪皮啶对照品,加甲醇制成每1ml含0.1mg的溶液,作为对照品溶液;照中国药典薄层色谱法试验,吸取上述3种溶液各15μl,分别点于同一硅胶G薄层板上,以甲苯-乙酸乙酯-甲酸=9:4:1为展开剂,展开,取出,晾干,置365nm紫外灯下检视;供试品色谱中,在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上,显相同颜色的荧光斑点;
检查:符合中国药典丸剂项下的各项规定;
含量测定:(5)马兜铃酸I、马兜铃内酰胺-I的含量检测方法为:照中国药典通则0512高效液相色谱法测定:
色谱条件与系统适用性试验:以碳十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;流动相:以乙腈为流动相A,1%乙酸-0.02%三乙胺水溶液为流动相B;检测波长:316nm;流速:0.8ml/min;柱温:30℃,流动相梯度洗脱见下表:
对照品溶液的制备:
马兜铃酸I:精密称取马兜玲酸I对照品2.3mg,加甲醇溶解并制成每1ml中含马兜玲酸I 0.002mg的对照品溶液,摇匀,即得;
马兜铃内酰胺-I:精密称取马兜铃内酰胺I对照品2.13mg,加甲醇溶解并制成每1ml中含马兜铃内酰胺I 0.0426mg,摇匀,即得;
供试品溶液的制备:取本品40丸,除去包衣,研细,取2.0g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加70%甲醇50ml,称定重量,超声提取40分钟,放冷,再称定重量,用70%甲醇溶剂补足减失的重量,摇匀,滤过,取续滤液,即得;
测定法:分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl,注入液相色谱仪,测定,即得;
(6)淫羊藿苷的含量检测方法为:照中国药典高效液相色谱法测定:
色谱条件与系统适用性试验:以碳十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;乙腈-水=28:72为流动相;检测波长为270nm,理论塔板数按淫羊藿苷峰计算大于5000;
对照品溶液的制备:取淫羊藿苷对照品适量,精密称定,加甲醇制成每1ml含18μg的溶液,即得;
供试品溶液的制备:取本品40丸,除去包衣,研细,取2g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入甲醇25ml,称定重量,超声处理30分钟,放冷,再称定重量,用甲醇补足减失的重量,摇匀,滤过,取续滤液,即得;
测定法:分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl,注入液相色谱仪,测定,即得。
发明人进行了大量的实验,以下是本发明所述质量检测方法的研究
实验例:质量检测方法方法研究
1名称
杜仲壮骨丸
2杜仲壮骨丸
按照本发明所述方法自制
3性状
本品为黑色糖衣浓缩水丸,除去糖衣后显棕褐色;气香,味微苦
4功能与主治
益气健脾,养肝壮腰,活血通络,强筋健骨,祛风除湿。用于治疗风湿痹痛,筋骨无力,屈伸不利,步履艰难,腰膝疼痛,畏寒喜温等症。
5薄层鉴别
5.1仪器及试药 ZF-20D紫外分析仪;硅胶G板(100*100mm,批号:20100321;100*200mm;批号:20100317,厂家:青岛海洋化工厂)、硅胶H板(100*100mm,批号:20100503;100*200mm;批号:20100417,厂家:青岛海洋化工厂)、硅胶G薄层板(自制);硅胶H薄层板(自制)。
无水乙醇(批号:20100705;厂家:国药集团化学试剂有限公司)、乙酸乙酯(批号:1100101;厂家:上海博化有限公司)、正丁醇(批号:1007101;厂家:上海博化有限公司)、甲醇(批号:20100901;厂家:国药集团化学试剂有限公司)、硫酸(批号:20090201;厂家:重庆川东化工有限公司)、丁酮(批号:20100825;厂家:天津市科密欧化学试剂有限公司)、三氯甲烷(批号:0907142;厂家:西陇科学股份有限公司)、氢氧化钠(批号:2010051;厂家:重庆川东化工有限公司)、乙醚(批号:20101125;厂家:国药集团化学试剂有限公司)、甲苯(批号:20101225;厂家:国药集团化学试剂有限公司)、甲酸批号:S189K040)、中性氧化铝(批号:20080822;厂家:天津市科密欧化学试剂有限公司)、娃哈哈饮用水。
自制薄层板:取硅胶G 1份,与0.5%的CMC-Na水溶液3份混合均匀,铺板,晾干,在105℃干燥30分钟,取出,放入干燥器中,备用。取硅胶H 1份,与1%的CMC-Na水溶液3份混合均匀,铺板,晾干,在105℃干燥30分钟,取出,放入干燥器中,备用。
杜仲壮骨丸(批号:20110101、20110102、20110103)、黄芪阴性样品(批号:20110208)、黄芪对照药材(批号:121462-201004)、淫羊藿对照药材(批号:121632-201002)、淫羊藿阴性样品(批号:20110205)、三七皂苷R1(批号:110745-200918)、人参皂苷Rg1(批号:110702-200929)、人参皂苷Rb1(批号:110704-200824)、人参皂苷Re(批号:110745-201025)、三七对照药材(批号:120941-200405)、人参对照药材(批号:120917-200910)、三七、人参阴性样品(批号:200206)、异嗪吡啶对照品(批号:110837-201007)、肿节风对照药材(批号:121048-200504)、肿节风阴性样品(批号:20110105)、杜仲对照药材(批号:121202-200502)、白术(批号:120925-200708)、川芎(批号:120918-200809)、防风(批号:120947-200809)、独活(批号:120940-2000809)。以上对照药材及对照品均购至中国药品生物制品鉴定所;三氯甲烷、正丁醇、二氯甲烷、丙酮、乙酸乙酯、甲酸、甲醇、乙醇等均为分析纯。
5.2鉴别
5.2.1杜仲药材的薄层色谱鉴别
条件(1):取本品40丸,研细,取7g,加乙醚40ml,加热回流30min,滤过,滤液蒸干,残渣加乙醇30ml回流,滤过,滤液浓缩至3ml,作为供试品溶液。取缺杜仲阴性样品,同法制得阴性供试品。取杜仲对照药材1g,同法制得对照药材溶液。照薄层色谱法(附录ⅥB)试验,吸取上述3种溶液各5μl,分别点于同一硅胶G薄层板上,以三氯甲烷-丙酮-甲醇-乙酸(6:2:2:1)为展开剂,展开,取出,晾干,置于紫外365nm下观察。供试品色谱中,在与对照药材色谱和阴性样品色谱相应位置上,显相同颜色的斑点,无专属性,故不作为薄层色谱条件。
条件(2):取本品40丸,研细,取7g,加水25ml超声溶解,过滤,滤液加乙酸乙酯提取3次,每次25ml,合并乙酸乙酯液,水浴蒸干,残渣加1ml甲醇使溶解,作为供试品溶液。取缺杜仲阴性样品,同法制得阴性供试品。取杜仲对照药材1g,同法制得对照药材溶液。照薄层色谱法(附录ⅥB)试验,吸取上述3种溶液各20μl,分别点于同一硅胶G薄层板上,以石油醚-氯仿-乙酸乙酯-甲酸(4:3:3:1)为展开剂,展开,取出,晾干,置于紫外365nm下观察。供试品色谱中,在与对照药材色谱和阴性样品色谱相应位置上,显相同颜色的斑点。无专属性,故不作为薄层色谱条件。
条件(3):取本品40丸,研细,取7g,加氯仿50ml,加热回流2h,放冷,挥去氯仿,残渣加甲醇60ml,加热回流2h,将甲醇提取液浓缩至1ml,作为供试品溶液。取缺杜仲阴性样品,同法制得阴性供试品。取杜仲对照药材1g,同法制得对照药材溶液。照薄层色谱法(附录ⅥB)试验,吸取上述3种溶液各20μl,分别点于同一硅胶G薄层板上,以氯仿-乙酸乙酯-水-乙酸(5:3:0.5:1)为展开剂,展开,取出,晾干,喷10%的硫酸乙醇溶液,105℃加热至斑点显色清晰,于日光下检视。对照药材色谱显示紫色斑点,供试品溶液和阴性样品色谱相应位置上,无斑点。无专属性,故不作为薄层色谱条件。
条件(4):取本品40丸,研细,取7g,加水25ml超声使溶解,滤过,滤液加乙酸乙酯提取3次,每次25ml,合并乙酸乙酯,水浴蒸干,残渣加1ml使溶解,作为供试品溶液。取缺杜仲阴性样品,同法制得阴性供试品。取杜仲对照药材2g,加水煎煮3次,分别2、1、0.5小时,合并煎液,滤过,浓缩至30ml,加乙酸乙酯提取3次,每次25ml,合并乙酸乙酯液,挥杆,残渣加1ml甲醇溶解,作为对照药材供试品溶液。照薄层色谱法(附录ⅥB)试验,吸取上述3种溶液各20μl,分别点于同一硅胶G薄层板上,以石油醚-氯仿-乙酸乙酯-甲酸(4:3:3:1)为展开剂,展开,取出,晾干,置紫外灯365nm下检视。供试品色谱中,在与对照药材色谱和阴性样品色谱相应位置上,显相同颜色的斑点。无专属性,故不作为薄层色谱条件。
条件(5):聚酰胺薄层法
微乳层析液的制备:取十二烷基硫酸钠6.7g溶解于75g水,分别加入表面活性剂(司班80)1g,油相(正辛烷2.5g),正丁醇15.8g在磁力恒温搅拌器上搅拌均匀,放置24h,即为展开剂。加甲醇10ml,超声提取30min,滤过,取续滤液既得供试品溶液。取缺杜仲阴性样品7g,同法制得阴性供试品。取杜仲对照药材1g,同法制得对照药材供试品溶液。吸取上述三种溶液20μl,分别点于同一聚酰胺薄膜上,以微乳液:甲酸:丙酮=9:3:1供试品色谱中,在与对照药材色谱和阴性样品色谱相应位置上,显相同颜色的斑点。无专属性,故不作为薄层色谱条件。
条件(6):取本品40丸,除去包衣,研细,取7g,加甲醇50ml,加热回流1小时,滤过,滤液蒸干,残渣加水5ml溶解,通过D101型大孔吸附树脂(柱内径1.7cm,高15cm)以20%乙醇100ml洗脱,弃去洗脱液,再加40%乙醇100洗脱,收集40%乙醇洗脱液,再加0.3g活性炭吸附,过滤,滤液蒸干,残渣加甲醇使溶解,作为供试品溶液。取缺杜仲阴性样品,同法制得阴性供试品。取杜仲对照药材1g,同法制得对照药材溶液。取京尼平苷酸对照品,加甲醇制得1mg/ml的对照品溶液。照薄层色谱法(附录ⅥB)试验,吸取上述3种溶液各5μl,分别点于同一硅胶G薄层板上,以二氯甲烷-甲醇-甲酸(8:2:0.3)为展开剂,展开,取出,晾干,喷以10%香草醛的硫酸乙醇溶液,在105℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中,在与对照药材色谱相应位置上,显相同颜色的斑点,且斑点分离度高、显色清晰,阴性对照品溶液无干扰。试验过程中,该条件受温度、湿度等因素影响较大,重现性较差,综合以上研究结果,故不列入质量标准正文。
如图1杜仲薄层色谱图所示;图1中1为杜仲对照药材,2为对照品溶液3为供试品,4为阴性对照。
5.2.2黄芪药材的薄层色谱鉴别
5.2.2.1供试品溶液的制备
条件(1):取本品40丸,研细,取7g,加乙醇50ml,加热回流30min,滤过,滤液蒸干,残渣加水30ml溶解,用乙醚振摇提取2次,每次20ml,取水溶液,继续用水饱和的正丁醇振摇提取3次,每次20ml,用正丁醇饱和的水溶液洗涤3次,每次20ml,取正丁醇溶液,蒸干,残渣加甲醇1ml使溶解,作为供试品溶液;取缺黄芪的阴性样品,同法制得阴性供试品溶液;取黄芪对照药材1g,同法制得对照药材溶液;另取黄芪甲苷对照品,同法制成每1ml含1mg的对照品溶液。
条件(2):取本品40丸,研细,取7g,加乙醇50ml,加热回流30min,滤过,滤液蒸干,残渣加水30ml溶解,用乙醚振摇提取2次,每次20ml,取水溶液,继续用水饱和的正丁醇振摇提取3次,每次20ml,用正丁醇饱和的水溶液洗涤3次,每次20ml,取正丁醇溶液,蒸干,残渣加甲醇5ml使溶解,加在中性氧化铝柱(100~120目,5g,内径1.5cm)上,先用甲醇40ml洗涤,弃去洗涤液,继续用40%甲醇50ml洗脱,收集洗脱液至水浴上蒸干,残渣用甲醇1ml使溶解,作为供试品溶液;取缺黄芪的阴性样品,同法制得阴性供试品溶液;取黄芪对照药材1g,同法制得对照药材溶液;另取黄芪甲苷对照品,同法制成每1ml含1mg的对照品溶液。
5.2.2.2薄层色谱层析
条件:照薄层色谱法《中国药典》2010版(附录ⅥB)试验,吸取上述3种溶液各5μl,分别点于同一硅胶G薄层板上(10×10㎝),以三氯甲烷-甲醇-水(13:7:2)、三氯甲烷-甲醇-水(13:5:1)、三氯甲烷-甲醇-水(10:5:1)、三氯甲烷-甲醇-水(10:3:0.3)为展开剂,展开,取出,晾干,喷以10%硫酸乙醇溶液,在105℃加热2-5分钟,置紫外光灯(365nm)下检视。
实验结果表明:样品过中性氧化铝柱后,斑点富集度高、色带影响小,展开剂为三氯甲烷-甲醇-水(10:3:0.3)时,与对照药材色谱相应的位置上均显相同颜色的荧光斑点,且斑点分离度高、显色清晰,阴性对照品溶液无干扰,故列入质量标准正文。见图2黄芪甲苷对照品的黄芪薄层色谱图,图2中1,2为黄芪甲苷对照品,3,4为条件1供试品;5,6为条件2供试品;图3条件2下样品和阴性对照薄层图的黄芪薄层色谱图,图3中1为黄芪对照药材,2,3,4为供试品溶液,5为阴性对照。
5.2.2.3耐用性
1、不同湿度的比较
取条件(2)供试品溶液和阴性样品溶液,在温度25℃时,分别在湿度35%和75%条件下进行展开。结果见(图4、5),图4和图5中,1为黄芪对照药材,2,3,4为供试品溶液,5为阴性对照。
2、不同温度的比较
取条件(2)供试品溶液和阴性样品溶液,在湿度为75%时,分别在4℃、10℃和40℃的温度环境下进行展开。结果见(图6、7、8),图6、7、8中1为黄芪对照药材;2,3,4为供试品溶液;5为阴性对照。
3、自制薄层板
取条件(2)供试品溶液和阴性样品溶液,在自制薄层板点样,温度40℃、湿度75%进行展开。结果见(图9),图9中1为黄芪对照药材;2,3,4为供试品溶液;5为阴性对照。
5.2.3淫羊藿药材的薄层色谱鉴别
5.2.3.1供试品的制备
条件1:取本品40丸,研细,取6g,加三氯甲烷50ml,加热回流1h,放置至室温,滤过,残渣用三氯甲烷洗涤2次,每次5ml,挥干残渣表面试剂,加乙酸乙酯10ml超声处理15min,滤过,滤液蒸干,残渣加水溶解,过聚酰胺(14~30目,5g,17mm)柱,先用100ml水洗脱,弃去水洗脱液,加乙醇100ml洗脱,收集乙醇洗脱液,挥干,残渣加1ml甲醇溶解。即得供试品溶液。
条件2:取本品40丸,研细,取6g,加乙醇50ml,水浴60℃温浸30min,滤过,滤液挥干,残渣加1ml甲醇溶解。即得供试品溶液。
对照药材溶液的制备:取淫羊藿对照药材1g,同供试品制备方法制备得对照药材溶液。
阴性对照溶液的制备:取缺淫羊藿的阴性样品5g,同供试品溶液制备方法制备阴性对照溶液。
对照品溶液的制备:取淫羊藿苷对照品适量,精密称定,加甲醇制成每1ml含1mg的对照品溶液。
5.2.3.2薄层色谱层析
条件1:照薄层色谱法(《中国药典》2010年版附录ⅥB)试验,吸取上述3种溶液各5μl,分别点于同一硅胶G薄层板上,以甲醇-丁酮-三氯甲烷-水(4:6:6:1)为展开剂,展开,取出,晾干,喷以3%三氯化铝溶液,在105℃加热2-5分钟,置365nm紫外灯下检视。
条件2:照薄层色谱法(《中国药典》2010年版附录ⅥB)试验,吸取上述3种溶液各5μl,分别点于同一硅胶H薄层板上,以乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水(10:1:1:1)为展开剂,展开,取出,晾干,喷以3%三氯化铝溶液,在105℃加热2-5分钟,置365nm紫外灯下检视。
阴性对照溶液制备:取淫羊藿阴性样品7g,按照供试品的制备同法制得。
实验结果表明:制备条件1薄层色谱层析条件1下,供试品色谱中,斑点分离不清晰,阴性干扰大,制备条件2薄层色谱层析条件2下,供试品色谱中,在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上,显相同颜色的荧光斑点。斑点分离度高、显色清晰,阴性对照品溶液无干扰,故选择其列入质量标准正文。
见图10在制备条件1、薄层层析条件1的淫羊藿薄层色谱图,图10中1为淫羊藿苷对照品;2为淫羊藿对照药材;3,4,5为杜仲壮骨丸供试液;6为缺淫羊藿阴性对照。见图11在制备条件2、薄层层析条件2的淫羊藿薄层色谱图,图11中1为淫羊藿苷对照品;2,5为淫羊藿对照药材;3,6为杜仲壮骨丸供试品;4,7为缺淫羊藿阴性对照。
5.2.3.3耐用性
1、不同湿度的比较
在温度25℃时,分别在湿度35%和75%条件下进行展开。结果见(图12、13)。图12为不同湿度的比较中温度25℃、湿度35%淫羊藿薄层色谱图;图13为不同湿度的比较中温度25℃、湿度75%淫羊藿薄层色谱图;图12、13中1为淫羊藿苷对照品;2,3,4为杜仲壮骨丸供试品;5为淫羊藿对照药材;6为缺淫羊藿阴性对照。
2、不同温度的比较
在湿度75%时,分别在4℃、10℃和40℃的温度环境下进行展开。结果见(图14、15、16)。图14为不同温度的比较中温度4℃、湿度75%淫羊藿薄层色谱图;图15为不同温度的比较中温度10℃、湿度75%淫羊藿薄层色谱图;图16不同温度的比较中温度40℃、湿度75%淫羊藿薄层色谱图。图14、15、16中1为淫羊藿苷对照品;2,3,4为杜仲壮骨丸供试品;5为淫羊藿对照药材;6为缺淫羊藿阴性对照。
3、自制薄层板
见图17自制薄层板温度25℃、湿度75%淫羊藿薄层色谱图,图17中1为淫羊藿苷对照品;2,3,4为杜仲壮骨丸供试品;5为淫羊藿对照药材;6为缺淫羊藿阴性对照。
5.2.4三七、人参药材的薄层色谱鉴别
5.2.2.1供试品溶液的制备
取本品40丸,研细,取7g,加甲醇50ml,加热回流提取30min,滤过,滤液蒸干,残渣加水15ml溶解,用三氯甲烷振摇提取2次,每次10ml,弃去三氯甲烷液,用饱和的正丁醇振摇提取2次,每次10ml,合并正丁醇提取液,用1%氢氧化钠溶液洗涤2次,每次10ml,弃去氢氧化钠液,再用正丁醇饱和的水洗至中性,取正丁醇液,蒸干,残渣加甲醇1ml使溶解,作为供试品溶液。
对照药材溶液的制备:取三七、人参对照药材各1g,同法制得对照药材溶液。
对照品溶液的制备:取人参皂苷Rb1,人参皂苷Re,人参皂苷Rg1、三七皂苷R1对照品适量,精密称定,加甲醇制成每1ml各含0.5mg的混合溶液,作为对照品溶液。
阴性对照溶液的制备:取缺三七、人参药材的阴性样品7g,同供试品溶液制备方法制备阴性对照溶液。
5.2.4.2薄层色谱层析
条件:照薄层色谱法(《中国药典》2010年版附录ⅥB)试验,吸取上述4种溶液各5μl,分别点于同一硅胶G薄层板上,以三氯甲烷-甲醇-水(13:7:2)10℃以下放置的下层溶液为展开剂,展开,取出,晾干,喷以10%硫酸乙醇溶液,在105℃加热2-5分钟,置紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中,在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上,显相同颜色的荧光斑点。斑点分离度高、显色清晰,阴性对照品溶液无干扰,故选择其列入质量标准正文。见图18三七、人参薄层色谱图,图18中1为人参皂苷Rb1、Re、Rg1、三七皂苷R1对照品;2为三七对照药材;3为人参对照药材;4,5,6为杜仲壮骨丸供试品;7为缺三七、人参阴性对照图。
5.2.4.3耐用性
1、不同湿度的比较
温度25℃时,分别在湿度35%和75%条件下进行展开。结果见(图19、20)。图19为温度25℃、湿度35%的三七、人参薄层色谱图;图20为温度25℃、湿度75%的三七、人参薄层色谱图。图19、20中的1为混合对照品;2为三七对照药材;3为人参对照药材;4,5,6为杜仲壮骨丸供试品对照;7为缺三七、人参阴性样品。
2、不同温度的比较
湿度75%时,分别在4℃、10℃和40℃的温度环境下进行展开。结果见(图21、22、23)。图21为温度4℃、湿度75%的三七、人参薄层色谱图;图22为温度10℃、湿度75%的三七、人参薄层色谱图;图23为温度40℃、湿度75%的三七、人参薄层色谱图。图21、22、23中的1为混合对照品;2为三七对照药材;3为人参对照药材;4,5,6为杜仲壮骨丸供试品对照;7为缺三七、人参阴性样品。
3、自制薄层板
见图24自制薄层板在温度25℃、湿度75%的三七、人参薄层色谱图,图24中的1为混合对照品;2为三七对照药材;3为人参对照药材;4,5,6为杜仲壮骨丸供试品对照;7为缺三七、人参阴性样品。
5.2.5肿节风药材的薄层色谱鉴别
5.2.5.1供试品溶液制备
条件1:去本品40丸,研细,取7g,加水20ml超声30分钟,滤过,滤液加乙酸乙酯振摇提取2次,每次20ml,合并乙酸乙酸液,蒸干,残渣加甲醇1ml使溶解,即得。
条件2:取本品40丸,研细,取7g,加乙酸乙酯20ml超声30分钟,滤过,滤液蒸干,残渣加甲醇1ml使溶解,即得。
条件3:取本品40丸,研细,取7g,加甲醇50ml超声30分钟,滤过,滤液蒸干,残渣加水40ml使溶解,加三氯甲烷提取2次,每次15ml,合并三氯甲烷溶液,挥干,残渣加1ml甲醇溶解,即得。
条件4:取本品40丸,研细,取7g,加60%甲醇50ml超声30分钟,滤过,滤液蒸干,残渣加水40ml使溶解,加三氯甲烷提取2次,每次15ml,合并三氯甲烷溶液,挥干,残渣加1ml甲醇溶解,即得。
条件5:取本品40丸,研细,取7g,加70%乙醇50ml超声30分钟,滤过,滤液蒸干,残渣加水40ml使溶解,加三氯甲烷提取2次,每次15ml,合并三氯甲烷溶液,挥干,残渣加1ml甲醇溶解,即得。
条件6:取本品40丸,研细,取7g,加石油醚:乙醚(1:1)混合溶剂30ml,超声1h,过滤,滤渣用10ml乙醚洗涤,挥干滤渣表面溶剂,加60%甲醇70ml,超声30min,过滤,滤渣用10ml乙酸乙酯洗涤,蒸干滤液,残渣加40ml水溶解,用三氯甲烷提取2次,每次15ml,收集三氯甲烷层,蒸干,残渣加1ml甲醇溶解,即得。
对照药材溶液制备:取肿节风对照药材1g,同法制备对照药材溶液。
阴性供试品溶液制备:取缺肿节风的阴性样品7g,照供试品溶液制法制备阴性对照溶液。
对照品溶液制备:取异嗪皮啶对照品,加甲醇制成每1ml含0.1mg的溶液。
5.2.5.2薄层色谱层析
条件:照薄层色谱法(《中国药典》2010年版一部附录ⅥB)试验,吸取上述4种溶液各10μl,分别点于同一硅胶G薄层板上(10×20㎝),以环己烷-乙酸乙酯-甲酸(8:5:1)、甲苯-乙酸乙酯-甲酸(9:4:1)、甲苯-乙酸乙酯-甲酸(9:5:1)、甲苯-乙酸乙酯-甲酸(8:5:1)为展开剂,展开,取出,晾干,置紫外光灯(365nm)下检视。
结果表明,在供试品制备条件6,展开剂为甲苯-乙酸乙酯-甲酸(9:4:1)时,供试品色谱中,在与对照药材色谱、对照品色谱相应的位置上,显相同颜色的斑点,且斑点分离度高、显色清晰,阴性对照无干扰,但是该方法重复性查,综合考虑,选择列入质量标准正文。见图25肿节风薄层色谱图,图25中的1为异嗪皮啶对照品;2,3,4为杜仲壮骨丸供试品溶液;5为肿节风对照药材;6为缺肿节风阴性对照。
5.2.5.3耐用性
1、不同湿度的比较
温度25℃时,分别在湿度35%和75%条件下进行展开。结果见(图26、27)。图26为温度25℃、湿度35%的肿节风薄层色谱图;图27为温度25℃、湿度75%的肿节风薄层色谱图。图26、27中1为异嗪吡啶对照品;2,3,4为杜仲壮骨丸供试品;5为肿节风对照药材;6为缺肿节风阴性对照。
2、不同温度的比较
湿度75%时,分别在4℃、10℃和40℃的温度环境下进行展开。结果见(图28、29、30)。图28为温度4℃、湿度75%的肿节风薄层色谱图;图29为温度10℃、湿度75%的肿节风薄层色谱图;图30为温度40℃、湿度75%的肿节风薄层色谱图。图28、29、30中的1为异嗪吡啶对照品;2,3,4为杜仲壮骨丸供试品;5为肿节风对照药材;6为缺肿节风阴性对照。
3、自制薄层板
图31为自制薄层板在温度25℃、湿度75%的肿节风薄层色谱图;图31中1为异嗪吡啶对照品;2,3,4为杜仲壮骨丸供试品;5为肿节风对照药材;6为缺肿节风阴性对照。
5.2.6独活药材的薄层色谱鉴别
取本品40丸,研细,取6g,加乙醚20ml,浸渍过夜,过滤,滤液蒸干,加氯仿1ml溶解残渣,作为供试品溶液。取缺独活药材的阴性样品,同法制得阴性供试品。取独活对照药材0.5g,同法制得对照药材溶液。照薄层色谱法(《中国药典》2010年版一部附录ⅥB)实验,吸取上述3种溶液各10μl,分别点于同一硅胶G薄层板上,以正己烷-苯-乙酸乙酯(2:1:1)为展开剂,展开,取出,晾干,喷以10%硫酸乙醇,105℃加热2-5分钟,置紫外365nm下观察。供试品色谱中,与对照药材色谱相应位置上,显不同颜色的斑点,与阴性对照相应位置上,显相同颜色斑点,无专属性,故不列入质量标准正文。
5.2.7防风药材的薄层色谱鉴别
取本品40丸,研细,取6g,加丙酮20ml,超声20min,过滤,滤液蒸干,加甲醇1ml溶解残渣,作为供试品溶液。取缺防风药材的阴性样品,同法制得阴性供试品。取防风对照药材0.5g,同法制得对照药材溶液。照薄层色谱法(《中国药典》2010年版一部附录ⅥB实验,吸取上述3种溶液各10μl,分别点于同一硅胶G薄层板上,以氯仿:甲醇(3:1)为展开剂,展开,取出,晾干,喷以10%硫酸乙醇,105℃加热2-5分钟,置紫外254nm下观察。供试品色谱中,与对照药材色谱、阴性对照色谱相应位置上,显相同颜色的斑点,无专属性,故不列入质量标准正文。
5.2.8白术药材的薄层色谱鉴别
取本品40丸,研细,取6g,加石油醚20ml,超声20min,滤过,滤液蒸干,加石油醚1ml溶解残渣,作为供试品溶液。取缺白术药材的阴性样品,同法制得阴性供试品。取白术对照药材0.5g,同法制得对照药材溶液。照薄层色谱法(《中国药典》2010年版一部附录ⅥB)实验,吸取上述3种溶液各10μl,分别点于同一硅胶G薄层板上,以石油醚-丙酮(10:1)为展开剂,展开,取出,晾干,喷以10%硫酸乙醇,105℃加热2-5分钟,置紫外365nm下观察。供试品色谱中,在与对照药材色谱、阴性对照色谱相应位置上,显相同颜色的斑点,无专属性,故不列入质量标准正文。
5.2.9川芎药材的薄层色谱鉴别
取本品40丸,研细,取6g,加乙醚20ml,超声20min,过滤,滤液蒸干,加乙酸乙酯1ml溶解残渣,作为供试品溶液。取缺川芎药材的阴性样品,同法制得阴性供试品。取川芎对照药材0.5g,同法制得对照药材溶液。照薄层色谱法(《中国药典》2010年版一部附录ⅥB)实验,吸取上述3种溶液各10μl,分别点于同一硅胶G薄层板上,以正己烷:乙酸乙酯(9:2)为展开剂,展开,取出,晾干,喷以5%三氯化铝乙醇液后,置紫外365nm下观察。供试品色谱中,与对照药材色谱、阴性对照色谱相应位置上,显相同颜色的斑点,无专属性,故不列入质量标准正文。
6含量测定
本品由24味药组成,具有益气健脾,养肝壮腰,活血通络,强筋健骨,祛风除湿。淫羊藿为处方君药,收载于《中国药典》2010年版一部[1],采用高效液相色谱法测定淫羊藿苷的含量,由于淫羊藿苷为君药的有效成份,具有补肾壮阳、抗衰老、增强免疫功能及骨代谢等作用,与处方功效相一致,故以其为指标进行含量测定,能较好的控制该丸剂的质量,因此采用高效液相法测定其含量,并进行了方法学研究。同时对替代药材肿节风也进行了含量测定研究,结果如下。
仪器岛津LC-20A高效液相色谱仪;LCsolution色谱工作站;美国Waters液相色谱仪,包括515型双泵、2478紫外检测器、柱温箱、威玛龙工作站;超声波清洗机(500W,53KHz;上海科导超声仪器有限公司)。
试药乙腈为色谱纯;乙醇、甲醇为分析纯;水为娃哈哈纯净水;淫羊藿苷对照品(中国食品药品检定研究院,批号:110737-200415,供含量测定)。
6.1肿节风的含量测定
6.1.1色谱条件 色谱柱:迪马钻石C18柱(250×4.6mm,5μm);流动相:乙腈-0.1%(20:80);检测波长:342nm;流速:1.0ml/min;柱温:30℃。
6.1.2检测波长的选择
参照《中国药典》2010年版肿节风含量测定项下方法,选择检测波长为342nm。
6.1.3对照品储备液的制备
精密称取异嗪皮啶对照品、迷迭香酸对照品适量,加甲醇溶解,制得异嗪皮啶对照品浓度为0.1661mg/ml、迷迭香酸对照品浓度为0.1672mg/ml。
6.1.4供试品溶液的制备 因杜仲壮骨丸制备工艺中,肿节风采用水煎法提取,故异嗪皮啶和迷迭香酸已游离出来,因此,只需用一定溶剂溶解即可。为保证提取效率,选择超声提取方法,故初步拟定制备方法为:取本品40丸(批号:20110101),除去包衣,研细,取2g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入甲醇25ml,称定重量,超声处理30分钟,放冷,再称定重量,用甲醇补足减失的重量,摇匀,滤过,取续滤液,即得。
6.1.5阴性供试品溶液的制备 取缺肿节风药材的制剂,按6.3.4法制备。
6.1.6实验结果 对照品溶液色谱图中,异嗪皮啶和迷迭香酸分别在16.5分钟和31.8分钟出峰,供试品溶液色谱图中在相同保留时间有对应,但阴性供试品溶液色谱图中,16.5分钟处有相同出峰,31.8分钟处无出峰(见图6),表明杜仲壮骨丸中可能其他药材含有异嗪皮啶或者与其结构相似的化合物,通过对处方中其他药材化学成分的文献检索,现有研究报道中,没有关于含有异嗪皮啶的报道。由于(1)处方药味较多,难以做阴性对照;(2)在不除去阴性干扰条件下,经计算异唪皮啶含量为0.08mg/g(低于1/万),其真实含量更小,不易准确测量;(3)异嗪皮啶、迷迭香酸的作用与杜仲壮骨丸的功能主治无相关性,为一般指标成分;(4)异嗪皮啶微溶于水,以其为指标难以评价工艺中水提部分的质量;(5)供试品中迷迭香酸虽能测出,但其含量为0.07mg/g(低于1/万),也不易准确测量;(6)肿节风在处方中为使药,综上所述,肿节风中的异嗪皮啶迷迭香酸的含量测定无法准确、有效地控制杜仲壮骨丸的质量,故其含量测定方法不列入正文。
6.2淫羊藿苷含量测定
6.2.1色谱条件
色谱柱:迪马钻石C18柱(250×4.6mm,5μm)、Lichrospher C18(250×4.6mm,5μm)、GL Sciences Inertsil○r ODS-3柱(250×4.6mm,5μm);流动相:乙腈-水(28:72);检测波长:270nm;流速:1.0ml/min;柱温:室温。
6.2.2检测波长的选择
参照《中国药典》2010年版淫羊藿含量测定项下淫羊藿苷测定方法,检测波长为270nm,故按法定标准选择270nm为检测波长。
6.2.3系统适用性试验
分别取淫羊藿苷对照品溶液、供试品溶液及缺淫羊藿药材阴性供试品溶液、空白溶剂注入液相色谱仪,记录色谱图(见图7)。从图中可见,淫羊藿苷的保留时间tR约为16分钟,阴性样品在此处无峰,即本试验条件下淫羊藿苷与其他组分分离完全,分离度大于1.5,根据耐用性试验结果,理论塔板数以淫羊藿苷峰计,应不低于5000。
6.2.4线性关系考察
6.2.4.1对照品储备液的制备
精密称取淫羊藿苷对照品15.60mg,置25ml量瓶中,加甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀,即得每1ml中含淫羊藿苷0.624mg。
6.2.4.2标准曲线的绘制 精密吸取上述对照品储备液5ml置50ml量瓶中,用甲醇稀释至刻度,摇匀,得浓度为62.4μg/ml的对照品溶液,再分别精密吸收1ml、2ml、3ml、4ml、5ml、6ml于10ml量瓶中,用甲醇稀释至刻度,摇匀,得浓度为6.24、12.48、18.72、24.96、31.20、37.44μg/ml的对照品溶液,分别精密吸取10μl,注入液相色谱仪,记录色谱,以峰面积A对进样量C(ng)进行线性回归,得线性回归方程:C=4.695×10-4A+1.500(r=0.99998),线性范围:62.4ng~374.4ng。结果见表1。
表1淫羊藿苷线性关系考察
6.2.5供试品溶液的制备
6.2.5.1供试品淫羊藿苷提取方法的选择 选择回流提取、超声提取方法考察提取效率。取本品40丸(批号:20110101),除去包衣,研细,取2.0g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入甲醇25ml,称定重量,分别采用回流提取和超声提取30分钟,放冷,再称定重量,用甲醇补足减失的重量,摇匀,滤过,取续滤液,分别注入液相色谱仪10μl,结果表明,两种方法提取率基本一致,故选择操作简便的超声提取为供试品提取方法,结果见表2。
表2不同提取方法的结果比较
6.2.5.2供试品淫羊藿苷提取溶剂的选择 可选择不同浓度的乙醇、甲醇为提取溶剂,考察溶剂对淫羊藿苷提取效率。取本品40丸(批号:20110101),精密称定,研细,取2.0g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入不同溶剂25ml,称定重量,超声提取30分钟,放冷,再称定重量,用相同溶剂补足减失的重量,摇匀,滤过,取续滤液,分别注入液相色谱仪10μl,结果见表3。
表3不同提取溶剂的结果比较
结果表明:50%甲醇溶液提取效率最高,故选稀甲醇为提取溶剂。
6.2.5.3超声处理时间考察 取本品40丸(批号:20110101),精密称定,研细,取约3.0g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入不同溶剂25ml,称定重量,超声处理10、20、30、40分钟,放冷,再称定重量,用甲醇补足减失的重量,摇匀,滤过,取续滤液,分别注入液相色谱仪10μl,考察不同提取时间对结果的影响,结果见表4。
表4不同超声处理时间的结果比较
结果表明:提取30和40分钟的方法结果基本一致,故采用超声处理30分钟。
6.2.5.4供试品溶液的制备 取本品40丸,除去包衣,研细,取2.0g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入甲醇25ml,称定重量,超声处理30分钟,放冷,再称定重量,用甲醇补足减失的重量,摇匀,滤过,取续滤液,即得。
6.2.5.5阴性供试品溶液的制备 取缺淫羊藿药材的制剂,按供试品溶液的制备方法制备。
6.2.6精密度试验 精密吸取对照品溶液(18.72μg/ml)10μl,重复进样5次,记录色谱图,结果见表5。
表5精密度实验结果
结果表明,仪器精密度良好。
6.2.7重复性试验 精密称取同一批号(批号:20110101)供试品,按供试品溶液的制备方法,制备3个不同浓度(80%、100%、120%)供试品溶液各3份,分别注入色谱仪10μl,记录色谱图,计算(结果见表6),平均含量0.1955mg/g,RSD=1.42%。
表6供试品中淫羊藿苷重复性试验
结果表明,重复性良好。
6.2.8中间精密度 用同一批号(批号:20110101)样品,由另一操作者按供试品溶液的制备处理,供试品溶液注入另一型号液相色谱仪10μl,记录色谱,结果见表7。
表7供试品中淫羊藿苷中间精密度试验
结果表明,与重复性含量结果基本一致,说明不同分析人员、不同仪器不影响该方法的测量结果。
6.2.9稳定性试验 精密称取同一批号(批号:20110101)供试品,按供试品溶液的制备方法制备供试品溶液1份,在规定的时间内注入液相色谱仪10μl,记录色谱图,结果见表8。
表8供试品中淫羊藿苷稳定性试验
结果表明,供试品溶液中淫羊藿苷在8小时内的稳定。
6.2.10回收率(准确度)试验 精密称取同一批号(批号:20110101)供试品9份,各1.0g,按3个不同浓度,精密加入淫羊藿苷对照品适量(0.1063mg、1.715mg、2.205mg),照供试品溶液制备方法处理样品,分别进样10μl,记录色谱图,结果见表9。
表9供试品中淫羊藿苷重复性试验
结果表明,该方法加样回收率良好。
6.2.11.1流动相比例考察 用同一批号(批号:20110101)供试品,在已确定流动相乙腈-水(28:72)基础上,略微调整比例后,以考察极性变化是否影响该方法的准确测定,结果见表11。
条件1:乙腈-水(28:72),柱温30℃,流速:1ml/min
条件2:乙腈-水(27:73),柱温30℃,流速:1ml/min
条件3:乙腈-水(29:71),柱温30℃,流速:1ml/min
6.2.11.2不同柱温考察 用同一供试品溶液,在已确定流动相乙腈-水(28:72)基础上,改变柱温,以考察温度的变化是否影响该方法的测定,结果见表10。
条件4:乙腈-水(28:72),柱温25℃,流速:1ml/min
条件5:乙腈-水(28:72),柱温35℃,流速:1ml/min
表10不同色谱条件考察表
结果表明,以上不同色谱条件的改变,不影响含量测定结果(RSD%=1.80%),说明该色谱条件的耐用性较好。
6.2.11.4不同色谱柱考察 用同一供试品溶液,在已确定色谱条件基础上,改用不同类型、规格色谱柱,以考察该方法适用性,结果见表11。
条件6:DiamonsilTM(钻石)C18,250×4.6mm,5μm
条件7:GL Inertsil ODS-SP,250×4.6mm,5μm
条件8:Lichrospher C18,250×4.6mm,5μm
表11不同色谱柱考察表
结果表明,GL Inertsil ODS-SP型色谱柱不能完全分离淫羊藿苷,实际检测样品时,可根据情况选择色谱柱或调整流动相比例,以保证测量的准确性。
6.2.12样品测定 按制剂质量标准(草案)制备供试品溶液和对照品溶液,分别进样,记录色谱图,按下式计算含量(结果见表12):
C对:对照品溶液浓度
V对:对照品进样体积
V样:供试品进样体积
A样:对照品峰面积
A对:供试品峰面积
W样:供试品取样量
表12十批制剂中淫羊藿苷的含量数据
6.2.13样品含量限度
淫羊藿苷 根据10批杜仲壮骨丸样品测定结果,以95%置信区间方法的下限的80%计算,暂定本品每丸含淫羊藿以淫羊藿苷(C33H40O15)计,不得少于0.14mg。每丸制剂中淫羊藿苷含量限度计算如下:淫羊藿苷含量限度=95%置信区间下限×80%=0.1793mg/g×0.80=0.14mg/g。试验表明精密度、重复性、稳定性等均好,故列入标准。
参考文献
[1]贵州省药品监督管理局编.贵州省中药材、民族药材质量标准.贵阳:贵州科技出版社.2003
[2]国家药典委员会编.中华人民共和国药典2010年版一部.北京:中国医药科技出版社.2010
6.3马兜玲酸I和马兜铃内酰胺I的限量检查
6.3.1仪器 岛津LC-20A高效液相色谱仪;Aglilent HPLC;LCsolution色谱工作站;美国Waters液相色谱仪,包括515型双泵、2478紫外检测器、柱温箱、威玛龙工作站;超声波清洗机(500W,40KHz;上海科导超声仪器有限公司)。
6.3.2试药 乙腈为色谱纯;甲醇、乙酸、三乙胺均为分析纯;水为娃哈哈纯净水;马兜玲酸I(中国食品药品检定研究院,批号:110746-201611,供含量测定)和马兜玲内酰胺-I(美国司坦福,批号:PS180605-17)
6.3.3色谱条件
色谱柱:Aglilent C18柱(250×4.6mm,5μm)、C18(250×4.6mm,5μm);流动相:以乙腈为流动相A,1%乙酸-0.02%三乙胺水溶液为流动相B;检测波长:316nm;流速:0.8ml/min;柱温:30℃,流动相梯度洗脱见表13。
表13流动相梯度洗脱表
6.3.2检测波长的选择
参照井山林等人[2]报道的HPLC法测定广防己中马兜玲酸I和马兜铃内酰胺I的含量测定方法,检测波长为316nm,故按法定标准选择316nm为检测波长。
6.3.3系统适用性试验
分别取马兜玲酸I、马兜铃内酰胺I和供试品溶液注入液相色谱仪,记录色谱图。从图中可见,马兜玲酸I的保留时间tR约为34分钟,马兜铃内酰胺I保留时间tR约为31钟,供试品溶中为检出马兜玲酸I和马兜铃内酰胺I。
6.3.4线性关系考察
6.3.4.1对照品储备液的制备
精密称取马兜玲酸I对照品2.3mg,置100ml量瓶中,加甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀,即得每1ml中含马兜玲酸I 0.023mg。
精密称取马兜铃内酰胺I对照品2.13mg,置50ml量瓶中,加甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀,即得每1ml中含马兜铃内酰胺I 0.0426mg。
6.3.4.2标准曲线的绘制
(1)马兜玲酸I标准曲线的绘制
精密吸取上述对照品储备液1μl、3μl、5μl、7μl、10μl和13μl,注入液相色谱仪,记录色谱,以峰面积A对进样量C(μg)进行线性回归,得线性回归方程:C=3×10-6A-3347.5(r=0.9998),线性范围:0.02254μg~0.29302μg。结果见表14。
表14马兜玲酸I线性关系考察
(2)马兜铃内酰胺I标准曲线的绘制
精密吸取上述对照品储备液1μl、3μl、5μl、7μl、10μl和13μl,注入液相色谱仪,记录色谱,以峰面积A对进样量C(μg)进行线性回归,得线性回归方程:C=4×10-6A-4320.5(r=1),线性范围:0.04175μg~0.54275μg。结果见表15。
表15马兜铃内酰胺I线性关系考察
(3)供试品溶液的制备
供试品马兜玲酸I、马兜铃内酰胺I提取溶剂的选择 可选择不同浓度的甲醇为提取溶剂,考察溶剂马兜玲酸I和马兜铃内酰胺I提取效率。取制剂(批号:11118001),精密称定,取约2.0g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入不同溶剂50ml,称定重量,超声提取40分钟,放冷,再称定重量,用相同溶剂补足减失的重量,摇匀,滤过,取续滤液,分别注入液相色谱仪10μl,结果见表16。
表16不同提取溶剂的结果比较表
结果表明:使用不同浓度的甲醇溶液对提取,均未检测出马兜玲酸I、马兜铃内酰胺I。
6.3.5方法验证
6.3.5.1中间精密度 用同一个批号(批号:11118001)样品,由另一操作者按供试品溶液的制备处理,供试品溶液注入另一型号液相色谱仪10μl,记录色谱,均未检出检测出马兜玲酸I和马兜铃内酰胺I。
6.3.5.2重复性试验 精密称取同一批号(批号:11118001)供试品粉各约1g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入70%甲醇25ml,密塞,称定重量,超声处理(功500W,频率40kHz)40分钟,放冷,再称定重量,用70%甲醇补足减失的重量,摇匀,滤过,取续滤液,即得,分别注入色谱仪10μl,记录色谱图,均未检出检测出马兜玲酸I和马兜铃内酰胺I。
表17供试品中马兜玲酸I和马兜铃内酰胺I重复性试验表
6.3.5.3稳定性实验 精密称取同一批号(批号:11118001)供试品,按供试品溶液的制备方法制备供试品溶液1份,在规定的时间内注入液相色谱仪10μl,记录色谱图,马兜玲酸I和马兜铃内酰胺I稳定性试验见表18。
表18供试品马兜玲酸I和马兜铃内酰胺I稳定性试验表
6.3.5.4加样回收率(准确度)实验
(1)马兜玲酸I的加样回收率精密称取同一批号(批号:11118001)供试品6份,各1.0g,精密加入对照品马兜铃酸I 0.09016mg,照供试品的溶液制备方法处理样品,分别进样10μl,记录色谱图,结果见表19。
表19供试品马兜玲酸I的准确度试验表
结果表明,该方法的加样回收率良好。
(2)马兜铃内酰胺I的加样回收率精密称取同一批号(批号:11118001)供试品6份,各1.0g,精密加入对照品马兜铃内酰胺I 0.16699mg,照供试品的溶液制备方法处理样品,分别进样10μl,记录色谱图,结果见表20。
表20供试品马兜铃内酰胺I的准确度试验表
结果表明,该方法的加样回收率良好。
6.3.5.5马兜玲酸I、马兜铃内酰胺I最低检测限的确定
(1)马兜玲酸I最低检测限的确定精密吸取对照品溶液1ml,置100ml容量瓶中,用甲醇稀释,并定容至刻度,摇匀,作为进样对照品溶液(浓度为2.3x10-4mg/ml),结果在5ul进样量下,信噪比为3:1,由此计算马兜玲酸I最低检测限为1.15ng。
(2)马兜铃内酰胺I最低检测限的确定精密吸取对照品溶液0.3ml,置50ml容量瓶中,用甲醇稀释,并定容至刻度,摇匀,作为进样对照品溶液(浓度为2.556x10-4mg/ml),结果在3ul进样量下,信噪比为3:1,由此计算马兜玲酸I最低检测限为0.7669ng。
6.3.5.6耐用性实验
(1)不同柱温的考察用同一供试品溶液,在其他色谱条件不变的情况下,考察柱温的变化是否影响改方法的测定,结果见表21。
条件1:以乙腈为流动相A,1%乙酸-0.02%三乙胺水溶液为流动相B;检测波长:316nm;流速:0.8ml/min;柱温:25℃,流动相梯度洗脱见表21。
表21流动相的梯度洗脱表
条件2:以乙腈为流动相A,1%乙酸-0.02%三乙胺水溶液为流动相B;检测波长:316nm;流速:0.8ml/min;柱温:30℃,流动相梯度洗脱见表22。
表22流动相的梯度洗脱表
条件3:以乙腈为流动相A,1%乙酸-0.02%三乙胺水溶液为流动相B;检测波长:316nm;流速:0.8ml/min;柱温:35℃,流动相梯度洗脱见表23。
表23流动相的梯度洗脱表
表24不同色谱条件考察表
结果:以上不同的色谱条件的改变,在对照品相同出峰位置处制剂均为检测出马兜铃酸I和马兜铃内酰胺I,表明其不影响含量的测定结果,说明该色谱条件的耐用性较好。
(2)不同色谱柱的考察用同一供试品溶液,在其他色谱条件不变的情况下(条件2),改变不同的类型、规格的色谱柱,考擦该方法的适用性,不同色谱柱考擦见表25。
条件4:Aglilent C18柱(250×4.6mm,5μm)
条件5:C18(250×4.6mm,5μm)
表25不同色谱柱考察表
结果:通过对不同的类型、规格的色谱柱考擦,在对照品相同出峰位置处制剂均为检测出马兜铃酸I和马兜铃内酰胺I,表明其不影响含量的测定结果,说明该色谱柱的耐用性较好。
(3)不同类型的分析仪器的考察用同一供试品溶液,在其他色谱条件不变的情况下,对不同类型的分析仪进行考擦,其目的是验证该方法的适用性,不同类型的分析仪器的考擦见表26。
条件9:岛津LC-20A高效液相色谱仪
条件10:Aglilent HPLC
表17不同类型的分析仪器的考擦
结果:在同类型的分析仪器上进行分析,在对照品相同出峰位置处制剂均为检测出马兜铃酸I和马兜铃内酰胺I,表明其不影响含量的测定结果,说明该分析方法的耐用性较好。
6.3.6样品检测
按上述条件,分别测定3批样品,结果见表27。
表27样品测定结果
马兜铃酸-I、马兜铃内酰胺-I的重复性、精密度、稳定性、耐用性等均好,故列入标准。
[1]田婧卓,梁爱华,刘靖,等.从马兜铃酸含量影响因素探讨含马兜铃酸中药的风险控制[J].中国中药杂志,2017,42(24):4679-4686.
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[3]Ng A,Poon SL,Huang MN,et al.Aristolochic acids and theirderivatives are widely implicated in liver cancers in Taiwan and throughoutAsia[J].Science Translational Medicine,2017,9(412):1-12.
6.4乌头单酯型生物碱含量测定
6.4.1仪器与试药
岛津LC-30AD高效液相色谱仪;安捷伦1260高效液相色谱仪;KQ-500V DB型双频数控超声波清洗机(昆山市超声仪器有限公司);色谱柱:迪马钻石C18柱(250×4.6mm,5μm)、Lichrospher C18(250×4.6mm,5μm)、Aglilent C18柱(250×4.6mm,5μm);杜仲壮骨丸(批号:11118001、11118002、11118003)由贵阳德昌祥药业有限公司提供;苯甲酰新乌头原碱(中国食品药品检定研究院,批号:111795-201604)、苯甲酰次乌头原碱(中国食品药品检定研究院,批号:111796-201705)、苯甲酰乌头原碱对照品(中国食品药品检定研究院,批号:111794-201705);试剂:乙腈(色谱纯、分析纯),异丙醇(色谱纯),乙酸乙酯(分析纯),二氯甲烷(分析纯),水(WP-UP-LH-40理化分析性超纯水机),乙酸(分析纯),氨水(分析纯)。
6.4.2测定方法
(1)色谱柱:参照2015版药典一部中附子中乌头单酯型生物碱含量测定选择十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的柱子进行考察。结果表明采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的柱子分离效果较好。
(2)流动相:参考2015年版药典附子标准,经过试验摸索,采用A:乙腈:四氢呋喃=25:15,B:0.1mol/l乙酸铵水溶液(每1000ml含1ml乙酸),梯度洗脱,见下表,流速:0.8ml/min;柱温:30℃,分离效果较好。
(3)检测波长:参照2015年版药典附子中乌头单酯型生物碱含量测定,选择检测波长为230nm。
(4)理论塔板数:参照《中国药典2015版》中附子含量测定选择理论塔板数不少于3000。
6.4.3供试品溶液的制备
取本品40丸,除去包衣,研细,取5g,精密称定,置具塞锥形瓶中,加7ml浓氨润湿,精密加入乙腈50ml,超声处理30分钟,放冷,再称定重量,用乙腈补足减失的重量,摇匀,滤过,滤液挥干,残渣加水-乙腈(1:1)5ml溶解,加在经过活化的阳离子树脂(直径2cm,高7cm,预先用稀盐酸7ml洗脱)上,用10ml乙腈洗脱,弃去洗脱液,再用10ml甲醇洗脱,弃去洗脱液,待上述洗脱液流尽后,放置2分钟,最后用10ml乙腈-氨水(9:1)洗脱,收集洗脱液,挥干溶剂,精密加入异丙醇-乙腈(1:1)混合溶液2ml溶解,滤过,取续滤液,即得。
6.4.4对照品溶液的制备
精密称取苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱、苯甲酰乌头原碱,加异丙醇-二氯甲烷(1:1)混合制成每1ml各含30ug的乌头单酯型生物碱混合对照品,摇匀,即得。
6.4.5方法验证
6.4.5.1线性关系考察
按上述色谱条件,分别精密取乌头单酯型生物碱混合对照品(苯甲酰新乌头原碱148.52ug/ml、苯甲酰乌头原碱210.83ug/ml、苯甲酰次乌头原碱161.35ug/ml)1ml、2ml、3ml、4ml、5ml、6ml于10ml的容量瓶中,加异丙醇-二氯甲烷(1:1)稀释至刻度,分别吸取10ul依次注入液相色谱仪,测定峰面积。以对照品浓度X为横坐标,峰面积Y为纵坐标,进行线性回归计算,绘制工作曲线(图),得出线性回归方程为:苯甲酰新乌头原碱:y=14.69x+7.8067,R2=0.9999;苯甲酰次乌头原碱:y=14.108x+15.413,R2=0.9996;苯甲酰乌头原碱:y=14.32x+21.253,R2=0.9990。结果见图32乌头单酯型生物碱线性方程,乌头单酯型生物碱在0.14852μg-1.2650μg的范围内对照品的进样量与峰面积呈良好的线性关系。见线性色谱图。
表28乌头单酯型生物碱对照品线性关系
6.4.5.2准确度实验
取已测定含量的杜仲壮骨丸(批号:11118001,乌头单酯型生物碱总含量:0.00750%,其中苯甲酰新乌头原碱0.00125%,苯甲酰次乌头原碱0.00237%,苯甲酰乌头原碱0.00388%)约5.0g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入乌头单酯型生物碱混合对照品溶液(苯甲酰新乌头原碱42.166ug/ml、苯甲酰次乌头原碱32.270ug/ml、苯甲酰乌头原碱29.704ug/ml),分别取0.25ml(3组)、0.5ml(3组)、1ml(3组),按供试品溶液制备方法制备样品溶液,并按上述色谱条件测定乌头单酯型生物碱的含量,计算回收率,结果见表29以及准确度色谱图,说明有较好回收率。
表29回收率试验数据(n=9)
6.4.5.3精密度试验
(1)重复性
精密吸取对照品溶液(苯甲酰新乌头原碱29.704μg/ml、苯甲酰乌头原碱42.166μg/ml、苯甲酰次乌头原碱32.270μg/ml)10μl,重复进样5次,记录色谱图,结果见表30。
表30重复性实验结果
(2)重现性
取同一批杜仲壮骨丸(11118001),按照供试品溶液制备方法制备6份,按上述色谱条件测定乌头单酯型生物碱的含量,结果见表31以及重复性色谱图,说明有较好重复性。
表31重复性实验(n=6)
(3)中间精密度
由实验室另一工作人员精密量取同一批样品(11118001),按照上述同样条件进行试验,吸取10ul注入液相色谱仪,记录色谱图,结果见表32及中间精密度色谱图,说明有较好中间精密度。
表32中间精密度试验
6.4.5.4专属性
取杜仲壮骨丸(11118001)以及阴性样品按供试品溶液制备方法制备样品溶液以及阴性样品溶液,按上述色谱条件,分别取对照品溶液、样品溶液、阴性样品溶液10μl注入液相色谱仪,样品溶液色谱在对照品溶液色谱相应的色谱峰,且阴性无干扰,见专属性色谱图。
6.4.5.5范围
按正常样取样量的80%、100%、120%取样测定,考察在高低取样测定的精密度。取杜仲壮骨丸(11118001)在高中低各两份,按供试品溶液制备方法制备,按上述色谱条件测定乌头单酯型生物碱的含量,结果见表33。
表33范围实验(n=6)
6.4.5.6耐用性
(1)样品提取方法的选择
取杜仲壮骨丸(11118001)样品,研细,混合均匀,取2份,,每份约5.0g,精密称定,分别置具塞锥形瓶中,分别加入7ml浓氨试液润湿后,精密加入乙腈50ml,其中一份超声处理30小时,另一份加热回流提取1小时,取出,冷却,用乙腈补足失重,过滤,滤液蒸干。残渣加异丙醇-二氯甲烷(1:1)5ml溶解,得供试品溶液,分别取上述2份溶液各100μl注入液相色谱仪,计算,结果见表34,超声处理与回流提取含量比较,超声提取含量更完全,故选择超声提取。
表34提取方法的选择
(2)柱温的影响
在不改变流动相成分和比例条件下,改变色谱柱温度,考察柱温的影响,结果在所选定的柱温下,样品分离度较好,含量测定结果见表35。
表35不同柱温条件下测定结果
(3)不同品牌柱子的影响
采用不同品牌十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的柱子,分别测定了杜仲壮骨丸(11118001)中乌头单酯型生物碱的总含量,考察不同品牌的色谱柱的影响。色谱图见耐用性色谱图,含量测定结果见表36。结果表明不同品牌十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱对含量测定无影响。
表36不同厂牌的柱子的测定结果
(4)不动流动相比例的影响
在不改变流动相成分条件下,改变流动相比例,考察不同比例流动相的影响,结果在所选定的流动相比例下,样品分离度较好,含量测定结果见表37。
表37不同流动相比例条件下测定结果
(5)样品稳定性试验
取杜仲壮骨丸(11118001),按确定的供试品溶液制备方法制备,按上述色谱条件测定乌头单酯型生物碱的含量,结果见表38。
表38样品稳定性试验
6.4.7样品测定
按上述条件,分别测定3批样品,结果见表39。
表39样品测定结果
本品附片药材为提取物入药,故每1g附片含以总单酯型生物碱计,含量限度应为:处方中附片含量*附片药材限度(苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱总含量)/总制剂重量*100%*0.7=32.4g*0.01%/475g*100%*0.7=0.000477%。单位为百万分之四,含量太小,考虑到仪器灵敏度,故不列入标准。
6.5乌头双酯型生物碱限量检查
6.5.1仪器与试药
岛津LC-30AD高效液相色谱仪;安捷伦1260高效液相色谱仪;KQ-500V DB型双频数控超声波清洗机(昆山市超声仪器有限公司);色谱柱:迪马钻石C18柱(250×4.6mm,5μm)、Lichrospher C18(250×4.6mm,5μm)、Aglilent C18柱(250×4.6mm,5μm);杜仲壮骨丸(批号:11118001、11118002、11118003)由贵阳德昌祥药业有限公司提供;乌头双酯型生物碱(中国食品药品检定研究院,批号:112029-201601);试剂:乙腈(色谱纯、分析纯),异丙醇(分析纯),乙酸乙酯(分析纯),二氯甲烷(分析纯),水(WP-UP-LH-40理化分析性超纯水机),乙酸(分析纯),氨水(分析纯)。
6.5.2测定方法
(1)色谱柱:参照2015版药典一部中附子中乌头双酯型生物碱检查项选择十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的柱子进行考察。结果表明采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的柱子分离效果较好。
(2)流动相:参考2015年版药典附子标准,经过试验摸索,采用A:乙腈:四氢呋喃=25:15,B:0.1mol/l乙酸铵水溶液(每1000ml含1ml乙酸),梯度洗脱,见下表,流速:1.0ml/min;柱温:30℃,分离效果较好。
(3)检测波长:参照2015年版药典附子中乌头双酯型生物碱含量测定,选择检测波长为230nm。
6.5.3供试品溶液的制备
取本品40丸,除去包衣,研细,取5g,精密称定,置具塞锥形瓶中,加7ml浓氨润湿,精密加入乙腈50ml,超声处理30分钟,放冷,再称定重量,用乙腈补足减失的重量,摇匀,滤过,滤液挥干,残渣加水-乙腈(1:1)5ml溶解,加在经过活化的阳离子树脂(直径2cm,高7cm,预先用稀盐酸7ml洗脱)上,用10ml乙腈洗脱,弃去洗脱液,再用10ml甲醇洗脱,弃去洗脱液,待上述洗脱液流尽后,放置2分钟,最后用10ml乙腈-氨水(9:1)洗脱,收集洗脱液,挥干溶剂,精密加入异丙醇-乙腈(1:1)混合溶液2ml溶解,滤过,取续滤液,即得。
6.5.4对照品溶液的制备
精密称取苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱、苯甲酰乌头原碱,加异丙醇-二氯甲烷(1:1)混合制成每1ml各含30ug的乌头单酯型生物碱混合对照品,摇匀,即得。
6.5.5方法验证
6.5.5.1线性关系考察
按上述色谱条件,精密称取乌头双酯型生物碱对照品1.65mg(其中含新乌头碱31.7%、乌头碱31.8%、次乌头碱30.0%),置于10ml容量瓶中,加异丙醇-二氯甲烷(1:1)混合溶液稀释至刻度,制成新乌头碱52.305ug/ml、乌头碱52.470ug/ml、次乌头碱49.500ug/ml。分别精密取上述混合对照品1ml、2ml、3ml、4ml、5ml、6ml于10ml的容量瓶中,加异丙醇-二氯甲烷(1:1)稀释至刻度,分别吸取10ul依次注入液相色谱仪,测定峰面积。以对照品浓度X为横坐标,峰面积Y为纵坐标,进行线性回归计算,绘制工作曲线(图33乌头双酯型生物碱线性方程),得出线性回归方程为:新乌头碱:y=y=12673x+248822,R2=0.9998;次乌头碱:y=y=10539x+199359,R2=0.9998;乌头碱:y=y=11583x+183187,R2=0.9993。结果见图15,新生物碱在5.2305μg-31.3830μg的范围内对照品的进样量与峰面积呈良好的线性关系;次乌头碱在5.2470μg-31.7820μg的范围内对照品的进样量与峰面积呈良好的线性关系;乌头碱在4.9500μg-29.7000μg的范围内对照品的进样量与峰面积呈良好的线性关系。见线性色谱图。
表40乌头双酯型生物碱对照品线性关系
6.5.5.2准确度实验
取已测定含量的杜仲壮骨丸(批号:11118001,乌头双酯型生物碱总含量:未检出)约5.0g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入乌头单酯型生物碱混合对照品溶液(乌头原碱42.166ug/ml、次乌头原碱32.270ug/ml、乌头原碱29.704ug/ml),按供试品溶液制备方法制备样品溶液,并按上述色谱条件测定乌头单酯型生物碱的含量,计算回收率,结果见表41以及准确度色谱图,说明有较好回收率。
表41回收率试验数据(n=6)
6.5.5.3精密度试验
精密吸取对照品溶液(新乌头碱9.51μg/ml、次乌头碱9.00μg/ml、乌头碱9.54μg/ml)20μl,重复进样6次,记录色谱图,结果见表42。
表42精密度实验结果
结果表明,仪器精密度良好。
6.5.5.4重现性试验
取同一批杜仲壮骨丸(11118001),按照供试品溶液制备方法制备6份,按上述色谱条件测定乌头双酯型生物碱的含量,结果见表43以及重复性色谱图,说明有较好重复性。
表43重复性实验(n=6)
6.5.5.5耐用性
(1)样品提取方法的选择
取杜仲壮骨丸(11118001)样品,研细,混合均匀,取2份,,每份约9.0g,精密称定,分别置具塞锥形瓶中,分别加入5ml浓氨试液润湿后,精密加入异丙醇-乙酸乙酯(1:1)50ml,其中一份超声处理30小时,另一份加热回流提取1小时,取出,冷却,用异丙醇-乙酸乙酯(1:1)补足失重,过滤,滤液蒸干。残渣加异丙醇-二氯甲烷(1:1)5ml溶解,得供试品溶液,分别取上述2份溶液各10μl注入液相色谱仪,计算,结果见表44,超声处理与回流提取含量比较,超声提取含量更完全,故选择超声提取。
表44提取方法的选择
(2)柱温的影响
在不改变流动相成分和比例条件下,改变色谱柱温度,考察柱温的影响,结果在所选定的柱温下,含量测定结果见表45。
表45不同柱温条件下测定结果
(3)不同品牌柱子的影响
采用不同品牌十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的柱子,分别测定了杜仲壮骨丸(11118001)中乌头双酯型生物碱的总含量,考察不同品牌的色谱柱的影响。色谱图见耐用性色谱图,含量测定结果见表46。结果表明不同品牌十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱对含量测定无影响。
表46不同厂牌的柱子的测定结果
(4)不动流动相比例的影响
在不改变流动相成分条件下,改变流动相比例,考察不同比例流动相的影响,结果在所选定的流动相比例下,样品分离度较好,含量测定结果见表47。
表47不同流动相比例条件下测定结果
6.5.5.6样品稳定性试验
取杜仲壮骨丸(11118001),按确定的供试品溶液制备方法制备,按上述色谱条件测定乌头双酯型生物碱的含量,结果见表48。
表48样品稳定性试验
6.5.6样品测定
按上述条件,分别测定3批样品,结果见表49。
表49样品测定结果
本品附片药材为提取物入药,故每1g附片含以总单酯型生物碱计,含量限度应为:处方中附片含量*附片药材限度(苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱总含量)/总制剂重量*100%*0.7=32.4g*0.02%/475g*100%*0.7=0.000954%。单位为百万分之九,考虑仪器灵敏度和噪音,故不建议列入标准中。
综上所述:本发明的有益效果在于:本发明提供了一种杜仲壮骨丸的质量检测方法,质量检测方法包括鉴别方法和含量测定方法;鉴别方法包括对黄芪、淫羊藿、三七、人参或肿节风的薄层鉴别检测;含量测定方法包括对马兜铃酸I、马兜铃内酰胺-I或淫羊藿苷的含量测定。所述质量检测方法准确,灵敏度高,重复性好,结果可靠,能有效控制杜仲壮骨丸的质量,既更有利于生产厂家和监督管理部门对产品质量的监测,也可以为医疗部门和患者的治疗提供更好的保障。
附图说明
图1是本发明杜仲药材的薄层色谱鉴别中,杜仲薄层色谱图,其中1为杜仲对照药材,2为对照品溶液,3为供试品,4为阴性对照;
图2是本发明黄芪药材的薄层色谱鉴别中,黄芪甲苷对照品的黄芪薄层色谱图,其中1,2为黄芪甲苷对照品;3,4为条件1供试品;5,6为条件2供试品;
图3是本发明黄芪药材的薄层色谱鉴别中,条件2下样品和阴性对照的黄芪薄层色谱图,其中1为黄芪对照药材;2,3,4为供试品溶液;5为阴性对照;
图4是本发明黄芪药材的薄层色谱鉴别中,温度25℃、湿度35%的黄芪薄层色谱图,其中1为黄芪对照药材;2,3,4为供试品溶液;5为阴性对照;
图5是本发明黄芪药材的薄层色谱鉴别中,温度25℃、湿度75%的黄芪薄层色谱图,其中1为黄芪对照药材;2,3,4为供试品溶液;5为阴性对照;
图6是本发明黄芪药材的薄层色谱鉴别中,温度4℃、湿度75%的黄芪薄层色谱图,其中1为黄芪对照药材;2,3,4为供试品溶液;5为阴性对照;
图7是本发明黄芪药材的薄层色谱鉴别中,温度10℃、湿度75%的黄芪薄层色谱图,其中1为黄芪对照药材;2,3,4为供试品溶液;5为阴性对照;
图8是本发明黄芪药材的薄层色谱鉴别中,温度40℃、湿度75%的黄芪薄层色谱图,其中1为黄芪对照药材;2,3,4为供试品溶液;5为阴性对照;
图9是本发明黄芪药材的薄层色谱鉴别中,自制薄层板在温度40℃、湿度75%的黄芪薄层色谱图,其中1为黄芪对照药材;2,3,4为供试品溶液;5为阴性对照;
图10是本发明淫羊藿药材的薄层色谱鉴别中,在制备条件1、薄层层析条件1的淫羊藿薄层色谱图,其中1为淫羊藿苷对照品;2为淫羊藿对照药材;3,4,5为杜仲壮骨丸供试液;6为缺淫羊藿阴性对照;
图11是本发明淫羊藿药材的薄层色谱鉴别中,在制备条件2、薄层层析条件2的淫羊藿薄层色谱图,其中1为淫羊藿苷对照品;2,5为淫羊藿对照药材;3,6为杜仲壮骨丸供试品;4,7为缺淫羊藿阴性对照;
图12是本发明淫羊藿药材的薄层色谱鉴别中,温度25℃、湿度35%淫羊藿薄层色谱图,其中1为淫羊藿苷对照品;2,3,4为杜仲壮骨丸供试品;5为淫羊藿对照药材;6为缺淫羊藿阴性对照
图13是本发明淫羊藿药材的薄层色谱鉴别中,温度25℃、湿度75%淫羊藿薄层色谱图,其中1为淫羊藿苷对照品;2,3,4为杜仲壮骨丸供试品;5为淫羊藿对照药材;6为缺淫羊藿阴性对照;
图14是本发明淫羊藿药材的薄层色谱鉴别中,温度4℃、湿度75%淫羊藿薄层色谱图,其中1为淫羊藿苷对照品;2,3,4为杜仲壮骨丸供试品;5为淫羊藿对照药材;6为缺淫羊藿阴性对照;
图15是本发明淫羊藿药材的薄层色谱鉴别中,温度10℃、湿度75%淫羊藿薄层色谱图,其中1为淫羊藿苷对照品;2,3,4为杜仲壮骨丸供试品;5为淫羊藿对照药材;6为缺淫羊藿阴性对照;
图16是本发明淫羊藿药材的薄层色谱鉴别中,温度40℃、湿度75%淫羊藿薄层色谱图,其中1为淫羊藿苷对照品;2,3,4为杜仲壮骨丸供试品;5为淫羊藿对照药材;6为缺淫羊藿阴性对照;
图17是本发明淫羊藿药材的薄层色谱鉴别中,自制薄层板在温度25℃、湿度75%淫羊藿薄层色谱图,其中1为淫羊藿苷对照品;2,3,4为杜仲壮骨丸供试品;5为淫羊藿对照药材;6为缺淫羊藿阴性对照;
图18是本发明三七、人参药材的薄层色谱鉴别中,三七、人参薄层色谱图,其中1为人参皂苷Rb1、Re、Rg1、三七皂苷R1对照品;2为三七对照药材;3为人参对照药材;4,5,6为杜仲壮骨丸供试品;7为缺三七、人参阴性对照图;
图19是本发明三七、人参药材的薄层色谱鉴别中,温度25℃、湿度35%的三七、人参薄层色谱图,其中1为混合对照品;2为三七对照药材;3为人参对照药材;4,5,6为杜仲壮骨丸供试品对照;7为缺三七、人参阴性样品;
图20是本发明三七、人参药材的薄层色谱鉴别中,温度25℃、湿度75%的三七、人参薄层色谱图,其中1为混合对照品;2为三七对照药材;3为人参对照药材;4,5,6为杜仲壮骨丸供试品对照;7为缺三七、人参阴性样品;
图21是本发明三七、人参药材的薄层色谱鉴别中,温度4℃、湿度75%的三七、人参薄层色谱图,其中1为混合对照品;2为三七对照药材;3为人参对照药材;4,5,6为杜仲壮骨丸供试品对照;7为缺三七、人参阴性样品;
图22是本发明三七、人参药材的薄层色谱鉴别中,温度10℃、湿度75%的三七、人参薄层色谱图,其中1为混合对照品;2为三七对照药材;3为人参对照药材;4,5,6为杜仲壮骨丸供试品对照;7为缺三七、人参阴性样品;
图23是本发明三七、人参药材的薄层色谱鉴别中,温度40℃、湿度75%的三七、人参薄层色谱图,其中1为混合对照品;2为三七对照药材;3为人参对照药材;4,5,6为杜仲壮骨丸供试品对照;7为缺三七、人参阴性样品;
图24是本发明三七、人参药材的薄层色谱鉴别中,自制薄层板在温度25℃、湿度75%的三七、人参薄层色谱图,其中1为混合对照品;2为三七对照药材;3为人参对照药材;4,5,6为杜仲壮骨丸供试品对照;7为缺三七、人参阴性样品;
图25是本发明肿节风药材的薄层色谱鉴别中,肿节风薄层色谱图,其中1为异嗪皮啶对照品;2,3,4为杜仲壮骨丸供试品溶液;5为肿节风对照药材;6为缺肿节风阴性对照;
图26是本发明肿节风药材的薄层色谱鉴别中,温度25℃、湿度35%的肿节风薄层色谱图,其中1为异嗪吡啶对照品;2,3,4为杜仲壮骨丸供试品;5为肿节风对照药材;6为缺肿节风阴性对照;
图27是本发明肿节风药材的薄层色谱鉴别中,温度25℃、湿度75%的肿节风薄层色谱图,其中1为异嗪吡啶对照品;2,3,4为杜仲壮骨丸供试品;5为肿节风对照药材;6为缺肿节风阴性对照;
图28是本发明肿节风药材的薄层色谱鉴别中,温度4℃、湿度75%的肿节风薄层色谱图,其中1为异嗪吡啶对照品;2,3,4为杜仲壮骨丸供试品;5为肿节风对照药材;6为缺肿节风阴性对照;
图29是本发明肿节风药材的薄层色谱鉴别中,温度10℃、湿度75%的肿节风薄层色谱图,其中1为异嗪吡啶对照品;2,3,4为杜仲壮骨丸供试品;5为肿节风对照药材;6为缺肿节风阴性对照;
图30是本发明肿节风药材的薄层色谱鉴别中,温度40℃、湿度75%的肿节风薄层色谱图,其中1为异嗪吡啶对照品;2,3,4为杜仲壮骨丸供试品;5为肿节风对照药材;6为缺肿节风阴性对照;
图31是本发明肿节风药材的薄层色谱鉴别中,自制薄层板在温度25℃、湿度75%的肿节风薄层色谱图,其中1为异嗪吡啶对照品;2,3,4为杜仲壮骨丸供试品;5为肿节风对照药材;6为缺肿节风阴性对照。
图32是本发明乌头单酯型生物碱含量测定中,乌头单酯型生物碱线性方程;
图33是本发明乌头双酯型生物碱限量检查中,乌头双酯型生物碱线性方程。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明,但并不作为对本发明限制的依据。
实施例1。一种杜仲壮骨丸的质量检测方法;
配方:杜仲壮骨丸,由杜仲81g、人参32.4g、三七32.4g、细辛16.2g、川芎48.6g、当归48.6g、秦艽64.8g、独活48.6g、白术64.8g、桑枝81.0g、木瓜48.6g、续断48.6g、附片32.4g、黄芪81g、防风48.6g、乌梢蛇13.5g、金铁锁16.2g、狗骨胶13g、石楠藤81g、淫羊藿81g、大血藤54g、威灵仙48.6g和肿节风81g;
工艺:根据配方将人参、细辛、乌梢蛇、金铁锁、狗骨胶、三七及部分当归、川芎、独活、秦艽、白术干燥,粉碎成细粉,得药粉备用;将杜仲、桑枝、淫羊藿、木瓜、续断、石楠藤、附片、黄芪、大血藤、防风、威灵仙、肿节风以及剩余的当归、川芎、独活、秦艽、白术加水提取三次,过滤,滤液浓缩成浸膏;将上述浸膏、药粉及适量辅料混匀,干燥,包衣,制成2500丸,即得;
质量检测方法;
性状:本品为黑色糖衣浓缩水丸,除去糖衣后显棕褐色;气香,味微苦;
鉴别:(1)黄芪的鉴别方法为:取本品40丸,研细,取7g,加乙醇40ml,加热回流20min,滤过,滤液蒸干,残渣加水30ml使溶解,用乙醚洗涤2次,每次20ml,弃去乙醚液,取水溶液,用水饱和的正丁醇振摇提取2次,每次20ml,合并正丁醇液,用正丁醇饱和的水溶液洗涤2次,每次20ml,取正丁醇溶液,蒸干,残渣加甲醇5ml使溶解,溶液加于中性氧化铝柱100-120目、5g、内径1.5cm上,先用甲醇30ml洗涤,弃去洗涤液,用30%甲醇40ml洗脱,收集洗脱液至水浴上蒸干,残渣加甲醇1ml使溶解,作为供试品溶液;另取黄芪对照药材1g,同法制成对照药材溶液;照中国药典通则0502薄层色谱法试验,吸取上述2种溶液各15μl,分别点于同一硅胶G薄层板上,以三氯甲烷-甲醇-水=7:2:0.1为展开剂,展开,取出,晾干,喷以10%硫酸乙醇溶液,在100℃加热2-5分钟,置365nm紫外灯下检视,供试品色谱中,在与对照药材色谱相应的位置上,显相同颜色的荧光斑点;
(2)淫羊藿的鉴别方法为:取本品40丸,研细,取7g,加乙醇40ml,50℃温浸20分钟,滤过,蒸干,残渣加甲醇1ml使溶解,作为供试品溶液;另取淫羊藿对照药材1g,同法制成对照药材溶液,即得;取淫羊藿苷对照品适量,精密称定,加甲醇制成每1ml含1mg的对照品溶液;照中国药典通则0502薄层色谱法试验,吸取上述3种溶液各15μl,分别点于同一硅胶H薄层板上,以乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水=7:0.5:0.5:0.5为展开剂,展开,取出,晾干,喷以3%三氯化铝溶液,在100℃加热2-5分钟,置365nm紫外灯下检视;供试品色谱中,在与对照药材色谱相应的位置上,显相同颜色的荧光斑点;
(3)三七、人参的鉴别方法为:取本品40丸,研细,取7g,加甲醇40ml,加热回流提取20min,滤过,滤液蒸干,残渣加水10ml使溶解,用三氯甲烷洗涤2次,每次10ml,弃去三氯甲烷液,用水饱和的正丁醇振摇提取2次,每次10ml,合并正丁醇液,用0.5%氢氧化钠溶液洗涤2次,每次10ml,再用正丁醇饱和的水洗至中性,取正丁醇液,蒸干,残渣加甲醇1ml使溶解,作为供试品溶液;另取三七、人参对照药材各1g,同法制成对照药材溶液;取人参皂苷Rb1,人参皂苷Re,人参皂苷Rg1、三七皂苷R1对照品,加甲醇制成每1ml各含0.5mg的混合溶液,作为对照品溶液;照中国药典通则0502薄层色谱法试验,吸取上述4种溶液各5μl,分别点于同一硅胶G薄层板上,以三氯甲烷-甲醇-水=8:2:0.2为展开剂,展开,取出,晾干,喷以10%硫酸乙醇溶液,在100℃加热2-5分钟,置365nm紫外灯下检视;供试品色谱中,在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上,显相同颜色的荧光斑点;
(4)肿节风的鉴别方法为:取本品40丸,研细,取7g,加石油醚:乙醚=1:1混合溶剂30ml,超声1h,过滤,滤渣用5ml乙醚洗涤,挥干滤渣表面溶剂,加50%甲醇60ml,超声20min,过滤,滤渣用5ml乙酸乙酯洗涤,蒸干滤液,残渣加30ml水溶解,用三氯甲烷提取2次,每次10ml,收集三氯甲烷层,蒸干,残渣加1ml甲醇溶解,作为供试品;取肿节风对照药材1g,同法制得对照药材溶液;取异嗪皮啶对照品,加甲醇制成每1ml含0.1mg的溶液,作为对照品溶液;照中国药典通则0502薄层色谱法试验,吸取上述3种溶液各15μl,分别点于同一硅胶G薄层板上,以甲苯-乙酸乙酯-甲酸=6:3:0.5为展开剂,展开,取出,晾干,置365nm紫外灯下检视;供试品色谱中,在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上,显相同颜色的荧光斑点;
检查:应符合丸剂项下(《中国药典》2015年版四部通则0108)有关的各项规定。
含量测定:(5)马兜铃酸I、马兜铃内酰胺-I的含量检测方法为:照中国药典通则0512高效液相色谱法测定:
色谱条件与系统适用性试验:以碳十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;流动相:以乙腈为流动相A,1%乙酸-0.02%三乙胺水溶液为流动相B;检测波长:316nm;流速:0.6ml/min;柱温:25℃,流动相梯度洗脱见下表:
对照品溶液的制备:
马兜铃酸I:精密称取马兜玲酸I对照品2mg,加甲醇溶解并制成每1ml中含马兜玲酸I 0.002mg的对照品溶液,摇匀,即得;
马兜铃内酰胺-I:精密称取马兜铃内酰胺I对照品2mg,加甲醇溶解并制成每1ml中含马兜铃内酰胺I 0.0426mg,摇匀,即得;
供试品溶液的制备:取本品40丸,除去包衣,研细,取2.0g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加70%甲醇40ml,称定重量,超声提取30分钟,放冷,再称定重量,用70%甲醇溶剂补足减失的重量,摇匀,滤过,取续滤液,即得;
测定法:分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl,注入液相色谱仪,测定,即得。
本品不得检出马兜铃酸I、马兜铃内酰胺-I。
(6)所述淫羊藿苷的含量检测方法为:照中国药典通则0512高效液相色谱法测定:
色谱条件与系统适用性试验:以碳十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;乙腈-水=25:70为流动相;检测波长为270nm,理论塔板数按淫羊藿苷峰计算大于5000;
对照品溶液的制备:取淫羊藿苷对照品适量,精密称定,加甲醇制成每1ml含18μg的溶液,即得;
供试品溶液的制备:取本品40丸,除去包衣,研细,取2g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入甲醇20ml,称定重量,超声处理25分钟,放冷,再称定重量,用甲醇补足减失的重量,摇匀,滤过,取续滤液,即得;
测定法:分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl,注入液相色谱仪,测定,即得。
本品每1g含淫羊藿以淫羊藿苷(C33H40O15)计,不得少于0.14mg。
实施例2。一种杜仲壮骨丸的质量检测方法;
配方:杜仲壮骨丸,由杜仲81g、人参32.4g、三七32.4g、细辛16.2g、川芎48.6g、当归48.6g、秦艽64.8g、独活48.6g、白术64.8g、桑枝81.0g、木瓜48.6g、续断48.6g、附片32.4g、黄芪81g、防风48.6g、乌梢蛇13.5g、金铁锁16.2g、狗骨胶13g、石楠藤81g、淫羊藿81g、大血藤54g、威灵仙48.6g和肿节风81g;
工艺:根据配方将人参、细辛、乌梢蛇、金铁锁、狗骨胶、三七及部分当归、川芎、独活、秦艽、白术干燥,粉碎成细粉,得药粉备用;将杜仲、桑枝、淫羊藿、木瓜、续断、石楠藤、附片、黄芪、大血藤、防风、威灵仙、肿节风以及剩余的当归、川芎、独活、秦艽、白术加水提取三次,过滤,滤液浓缩成浸膏;将上述浸膏、药粉及适量辅料混匀,干燥,包衣,制成2500丸,即得;
质量检测方法;
性状:本品为黑色糖衣浓缩水丸,除去糖衣后显棕褐色;气香,味微苦;鉴别:(1)黄芪的鉴别方法为:取本品40丸,研细,取7g,加乙醇50ml,加热回流30min,滤过,滤液蒸干,残渣加水30ml使溶解,用乙醚洗涤2次,每次20ml,弃去乙醚液,取水溶液,用水饱和的正丁醇振摇提取3次,每次20ml,合并正丁醇液,用正丁醇饱和的水溶液洗涤3次,每次20ml,取正丁醇溶液,蒸干,残渣加甲醇5ml使溶解,溶液加于中性氧化铝柱100-120目、5g、内径1.5cm上,先用甲醇40ml洗涤,弃去洗涤液,用40%甲醇50ml洗脱,收集洗脱液至水浴上蒸干,残渣加甲醇1ml使溶解,作为供试品溶液;另取黄芪对照药材1g,同法制成对照药材溶液;照中国药典通则0502薄层色谱法试验,吸取上述2种溶液各15μl,分别点于同一硅胶G薄层板上,以三氯甲烷-甲醇-水=10:3:0.3为展开剂,展开,取出,晾干,喷以10%硫酸乙醇溶液,在105℃加热2-5分钟,置365nm紫外灯下检视,供试品色谱中,在与对照药材色谱相应的位置上,显相同颜色的荧光斑点;
(2)淫羊藿的鉴别方法为:取本品40丸,研细,取7g,加乙醇50ml,60℃温浸30分钟,滤过,蒸干,残渣加甲醇1ml使溶解,作为供试品溶液;另取淫羊藿对照药材1g,同法制成对照药材溶液,即得;取淫羊藿苷对照品适量,精密称定,加甲醇制成每1ml含1mg的对照品溶液;照中国药典通则0502薄层色谱法试验,吸取上述3种溶液各15μl,分别点于同一硅胶H薄层板上,以乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水=10:1:1:1为展开剂,展开,取出,晾干,喷以3%三氯化铝溶液,在105℃加热2-5分钟,置365nm紫外灯下检视;供试品色谱中,在与对照药材色谱相应的位置上,显相同颜色的荧光斑点;
(3)三七、人参的鉴别方法为:取本品40丸,研细,取7g,加甲醇50ml,加热回流提取30min,滤过,滤液蒸干,残渣加水15ml使溶解,用三氯甲烷洗涤2次,每次10ml,弃去三氯甲烷液,用水饱和的正丁醇振摇提取2次,每次10ml,合并正丁醇液,用1%氢氧化钠溶液洗涤2次,每次10ml,再用正丁醇饱和的水洗至中性,取正丁醇液,蒸干,残渣加甲醇1ml使溶解,作为供试品溶液;另取三七、人参对照药材各1g,同法制成对照药材溶液;取人参皂苷Rb1,人参皂苷Re,人参皂苷Rg1、三七皂苷R1对照品,加甲醇制成每1ml各含0.5mg的混合溶液,作为对照品溶液;照中国药典通则0502薄层色谱法试验,吸取上述4种溶液各5μl,分别点于同一硅胶G薄层板上,以三氯甲烷-甲醇-水=10:4:0.6为展开剂,展开,取出,晾干,喷以10%硫酸乙醇溶液,在105℃加热2-5分钟,置365nm紫外灯下检视;供试品色谱中,在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上,显相同颜色的荧光斑点;
(4)肿节风的鉴别方法为:取本品40丸,研细,取7g,加石油醚:乙醚=1:1混合溶剂30ml,超声1h,过滤,滤渣用10ml乙醚洗涤,挥干滤渣表面溶剂,加60%甲醇70ml,超声30min,过滤,滤渣用10ml乙酸乙酯洗涤,蒸干滤液,残渣加40ml水溶解,用三氯甲烷提取2次,每次15ml,收集三氯甲烷层,蒸干,残渣加1ml甲醇溶解,作为供试品;取肿节风对照药材1g,同法制得对照药材溶液;取异嗪皮啶对照品,加甲醇制成每1ml含0.1mg的溶液,作为对照品溶液;照中国药典通则0502薄层色谱法试验,吸取上述3种溶液各15μl,分别点于同一硅胶G薄层板上,以甲苯-乙酸乙酯-甲酸=9:4:1为展开剂,展开,取出,晾干,置365nm紫外灯下检视;供试品色谱中,在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上,显相同颜色的荧光斑点;
检查:应符合丸剂项下(《中国药典》2015年版四部通则0108)有关的各项规定。
含量测定:(5)马兜铃酸I、马兜铃内酰胺-I的含量检测方法为:照中国药典通则0512高效液相色谱法测定:
色谱条件与系统适用性试验:以碳十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;流动相:以乙腈为流动相A,1%乙酸-0.02%三乙胺水溶液为流动相B;检测波长:316nm;流速:0.8ml/min;柱温:30℃,流动相梯度洗脱见下表:
对照品溶液的制备:
马兜铃酸I:精密称取马兜玲酸I对照品2.3mg,加甲醇溶解并制成每1ml中含马兜玲酸I 0.002mg的对照品溶液,摇匀,即得;
马兜铃内酰胺-I:精密称取马兜铃内酰胺I对照品2.13mg,加甲醇溶解并制成每1ml中含马兜铃内酰胺I 0.0426mg,摇匀,即得;
供试品溶液的制备:取本品40丸,除去包衣,研细,取2.0g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加70%甲醇50ml,称定重量,超声提取40分钟,放冷,再称定重量,用70%甲醇溶剂补足减失的重量,摇匀,滤过,取续滤液,即得;
测定法:分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl,注入液相色谱仪,测定,即得。
本品不得检出马兜铃酸I、马兜铃内酰胺-I。
(6)淫羊藿苷的含量检测方法为:照中国药典通则0512高效液相色谱法测定:
色谱条件与系统适用性试验:以碳十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;乙腈-水=28:72为流动相;检测波长为270nm,理论塔板数按淫羊藿苷峰计算大于5000;
对照品溶液的制备:取淫羊藿苷对照品适量,精密称定,加甲醇制成每1ml含18μg的溶液,即得;
供试品溶液的制备:取本品40丸,除去包衣,研细,取2g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入甲醇25ml,称定重量,超声处理30分钟,放冷,再称定重量,用甲醇补足减失的重量,摇匀,滤过,取续滤液,即得;
测定法:分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl,注入液相色谱仪,测定,即得。
本品每1g含淫羊藿以淫羊藿苷(C33H40O15)计,不得少于0.14mg。
实施例3。一种杜仲壮骨丸的质量检测方法;
配方:杜仲壮骨丸,由杜仲81g、人参32.4g、三七32.4g、细辛16.2g、川芎48.6g、当归48.6g、秦艽64.8g、独活48.6g、白术64.8g、桑枝81.0g、木瓜48.6g、续断48.6g、附片32.4g、黄芪81g、防风48.6g、乌梢蛇13.5g、金铁锁16.2g、狗骨胶13g、石楠藤81g、淫羊藿81g、大血藤54g、威灵仙48.6g和肿节风81g;
工艺:根据配方将人参、细辛、乌梢蛇、金铁锁、狗骨胶、三七及部分当归、川芎、独活、秦艽、白术干燥,粉碎成细粉,得药粉备用;将杜仲、桑枝、淫羊藿、木瓜、续断、石楠藤、附片、黄芪、大血藤、防风、威灵仙、肿节风以及剩余的当归、川芎、独活、秦艽、白术加水提取三次,过滤,滤液浓缩成浸膏;将上述浸膏、药粉及适量辅料混匀,干燥,包衣,制成2500丸,即得;
质量检测方法;
性状:本品为黑色糖衣浓缩水丸,除去糖衣后显棕褐色;气香,味微苦;
鉴别:(1)黄芪的鉴别方法为:取本品40丸,研细,取7g,加乙醇60ml,加热回流40min,滤过,滤液蒸干,残渣加水30ml使溶解,用乙醚洗涤3次,每次20ml,弃去乙醚液,取水溶液,用水饱和的正丁醇振摇提取4次,每次20ml,合并正丁醇液,用正丁醇饱和的水溶液洗涤4次,每次20ml,取正丁醇溶液,蒸干,残渣加甲醇5ml使溶解,溶液加于中性氧化铝柱100-120目、5g、内径1.5cm上,先用甲醇50ml洗涤,弃去洗涤液,用50%甲醇60ml洗脱,收集洗脱液至水浴上蒸干,残渣加甲醇1ml使溶解,作为供试品溶液;另取黄芪对照药材1g,同法制成对照药材溶液;照中国药典通则0502薄层色谱法试验,吸取上述2种溶液各15μl,分别点于同一硅胶G薄层板上,以三氯甲烷-甲醇-水=13:4:0.6为展开剂,展开,取出,晾干,喷以10%硫酸乙醇溶液,在110℃加热2-5分钟,置365nm紫外灯下检视,供试品色谱中,在与对照药材色谱相应的位置上,显相同颜色的荧光斑点。
(2)淫羊藿的鉴别方法为:取本品40丸,研细,取7g,加乙醇60ml,70℃温浸40分钟,滤过,蒸干,残渣加甲醇1ml使溶解,作为供试品溶液;另取淫羊藿对照药材1g,同法制成对照药材溶液,即得;取淫羊藿苷对照品适量,精密称定,加甲醇制成每1ml含1mg的对照品溶液;照中国药典通则0502薄层色谱法试验,吸取上述3种溶液各15μl,分别点于同一硅胶H薄层板上,以乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水=13:1.5:1.5:1.5为展开剂,展开,取出,晾干,喷以3%三氯化铝溶液,在120℃加热2-5分钟,置365nm紫外灯下检视;供试品色谱中,在与对照药材色谱相应的位置上,显相同颜色的荧光斑点。
(3)三七、人参的鉴别方法为:取本品40丸,研细,取7g,加甲醇60ml,加热回流提取40min,滤过,滤液蒸干,残渣加水20ml使溶解,用三氯甲烷洗涤3次,每次10ml,弃去三氯甲烷液,用水饱和的正丁醇振摇提取3次,每次10ml,合并正丁醇液,用1.5%氢氧化钠溶液洗涤3次,每次10ml,再用正丁醇饱和的水洗至中性,取正丁醇液,蒸干,残渣加甲醇1ml使溶解,作为供试品溶液;另取三七、人参对照药材各1g,同法制成对照药材溶液;取人参皂苷Rb1,人参皂苷Re,人参皂苷Rg1、三七皂苷R1对照品,加甲醇制成每1ml各含0.5mg的混合溶液,作为对照品溶液;照中国药典通则0502薄层色谱法试验,吸取上述4种溶液各5μl,分别点于同一硅胶G薄层板上,以三氯甲烷-甲醇-水=12:5:1为展开剂,展开,取出,晾干,喷以10%硫酸乙醇溶液,在110℃加热2-5分钟,置365nm紫外灯下检视;供试品色谱中,在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上,显相同颜色的荧光斑点。
(4)肿节风的鉴别方法为:取本品40丸,研细,取7g,加石油醚:乙醚=1:1混合溶剂30ml,超声2h,过滤,滤渣用15ml乙醚洗涤,挥干滤渣表面溶剂,加70%甲醇80ml,超声40min,过滤,滤渣用15ml乙酸乙酯洗涤,蒸干滤液,残渣加50ml水溶解,用三氯甲烷提取3次,每次20ml,收集三氯甲烷层,蒸干,残渣加1ml甲醇溶解,作为供试品;取肿节风对照药材1g,同法制得对照药材溶液;取异嗪皮啶对照品,加甲醇制成每1ml含0.1mg的溶液,作为对照品溶液;照中国药典通则0502薄层色谱法试验,吸取上述3种溶液各15μl,分别点于同一硅胶G薄层板上,以甲苯-乙酸乙酯-甲酸=12:5:1.5为展开剂,展开,取出,晾干,置365nm紫外灯下检视;供试品色谱中,在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上,显相同颜色的荧光斑点。
检查:应符合丸剂项下(《中国药典》2015年版四部通则0108)有关的各项规定。
含量测定:(5)马兜铃酸I、马兜铃内酰胺-I的含量检测方法为:照中国药典通则0512高效液相色谱法测定:
色谱条件与系统适用性试验:以碳十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;流动相:以乙腈为流动相A,1%乙酸-0.02%三乙胺水溶液为流动相B;检测波长:316nm;流速:1ml/min;柱温:35℃,流动相梯度洗脱见下表:
对照品溶液的制备:
马兜铃酸I:精密称取马兜玲酸I对照品3mg,加甲醇溶解并制成每1ml中含马兜玲酸I 0.002mg的对照品溶液,摇匀,即得;
马兜铃内酰胺-I:精密称取马兜铃内酰胺I对照品3mg,加甲醇溶解并制成每1ml中含马兜铃内酰胺I 0.0426mg,摇匀,即得;
供试品溶液的制备:取本品40丸,除去包衣,研细,取2.0g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加70%甲醇60ml,称定重量,超声提取50分钟,放冷,再称定重量,用70%甲醇溶剂补足减失的重量,摇匀,滤过,取续滤液,即得;
测定法:分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl,注入液相色谱仪,测定,即得。
本品不得检出马兜铃酸I、马兜铃内酰胺-I。
(6)淫羊藿苷的含量检测方法为:照中国药典通则0512高效液相色谱法测定:
色谱条件与系统适用性试验:以碳十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;乙腈-水=30:75为流动相;检测波长为270nm,理论塔板数按淫羊藿苷峰计算大于5000;
对照品溶液的制备:取淫羊藿苷对照品适量,精密称定,加甲醇制成每1ml含18μg的溶液,即得;
供试品溶液的制备:取本品40丸,除去包衣,研细,取2g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入甲醇30ml,称定重量,超声处理35分钟,放冷,再称定重量,用甲醇补足减失的重量,摇匀,滤过,取续滤液,即得;
测定法:分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl,注入液相色谱仪,测定,即得。
本品每1g含淫羊藿以淫羊藿苷(C33H40O15)计,不得少于0.14mg。
Claims (8)
1.一种杜仲壮骨丸的质量检测方法,所述杜仲壮骨丸按照重量份计,由杜仲81份、人参32.4份、三七32.4份、细辛16.2份、川芎48.6份、当归48.6份、秦艽64.8份、独活48.6份、白术64.8份、桑枝81.0份、木瓜48.6份、续断48.6份、附片32.4份、黄芪81份、防风48.6份、乌梢蛇13.5份、金铁锁16.2份、狗骨胶13份、石楠藤81份、淫羊藿81份、大血藤54份、威灵仙48.6份和肿节风81份按照下述方法制备而成:根据配方将人参、细辛、乌梢蛇、金铁锁、狗骨胶、三七及部分当归、川芎、独活、秦艽、白术干燥,粉碎成细粉,得药粉备用;将杜仲、桑枝、淫羊藿、木瓜、续断、石楠藤、附片、黄芪、大血藤、防风、威灵仙、肿节风以及剩余的当归、川芎、独活、秦艽、白术加水提取,过滤,滤液浓缩成浸膏;将上述浸膏、药粉及适量辅料混匀,干燥,包衣,即得;其特征在于:所述杜仲壮骨丸的质量检测方法包括鉴别方法和含量测定方法;所述鉴别方法包括对黄芪、淫羊藿、三七、人参或肿节风的薄层鉴别检测;所述含量测定方法包括对马兜铃酸I、马兜铃内酰胺-I或淫羊藿苷的含量测定。
2.根据权利要求1所述的杜仲壮骨丸的质量检测方法,其特征在于:所述黄芪的鉴别方法为:取本品40丸,研细,取7g,加乙醇40-60ml,加热回流20-40min,滤过,滤液蒸干,残渣加水30ml使溶解,用乙醚洗涤2-3次,每次20ml,弃去乙醚液,取水溶液,用水饱和的正丁醇振摇提取2-4次,每次20ml,合并正丁醇液,用正丁醇饱和的水溶液洗涤2-4次,每次20ml,取正丁醇溶液,蒸干,残渣加甲醇5ml使溶解,溶液加于中性氧化铝柱100-120目、5g、内径1.5cm上,先用甲醇30-50ml洗涤,弃去洗涤液,用30-50%甲醇40-60ml洗脱,收集洗脱液至水浴上蒸干,残渣加甲醇1ml使溶解,作为供试品溶液;另取黄芪对照药材1g,同法制成对照药材溶液;照中国药典薄层色谱法试验,吸取上述2种溶液各15μl,分别点于同一硅胶G薄层板上,以三氯甲烷-甲醇-水=7-13:2-4:0.1-0.6为展开剂,展开,取出,晾干,喷以10%硫酸乙醇溶液,在100-110℃加热2-5分钟,置365nm紫外灯下检视,供试品色谱中,在与对照药材色谱相应的位置上,显相同颜色的荧光斑点。
3.根据权利要求1所述的杜仲壮骨丸的质量检测方法,其特征在于:所述淫羊藿的鉴别方法为:取本品40丸,研细,取7g,加乙醇40-60ml,50-70℃温浸20-40分钟,滤过,蒸干,残渣加甲醇1ml使溶解,作为供试品溶液;另取淫羊藿对照药材1g,同法制成对照药材溶液,即得;取淫羊藿苷对照品适量,精密称定,加甲醇制成每1ml含1mg的对照品溶液;照中国药典通则0502薄层色谱法试验,吸取上述3种溶液各15μl,分别点于同一硅胶H薄层板上,以乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水=7-13:0.5-1.5:0.5-1.5:0.5-1.5为展开剂,展开,取出,晾干,喷以3%三氯化铝溶液,在100-120℃加热2-5分钟,置365nm紫外灯下检视;供试品色谱中,在与对照药材色谱相应的位置上,显相同颜色的荧光斑点。
4.根据权利要求1所述的杜仲壮骨丸的质量检测方法,其特征在于:所述三七、人参的鉴别方法为:取本品40丸,研细,取7g,加甲醇40-60ml,加热回流提取20-40min,滤过,滤液蒸干,残渣加水10-20ml使溶解,用三氯甲烷洗涤2-3次,每次10ml,弃去三氯甲烷液,用水饱和的正丁醇振摇提取2-3次,每次10ml,合并正丁醇液,用0.5-1.5%氢氧化钠溶液洗涤2-3次,每次10ml,再用正丁醇饱和的水洗至中性,取正丁醇液,蒸干,残渣加甲醇1ml使溶解,作为供试品溶液;另取三七、人参对照药材各1g,同法制成对照药材溶液;取人参皂苷Rb1,人参皂苷Re,人参皂苷Rg1、三七皂苷R1对照品,加甲醇制成每1ml各含0.5mg的混合溶液,作为对照品溶液;照中国药典薄层色谱法试验,吸取上述4种溶液各5μl,分别点于同一硅胶G薄层板上,以三氯甲烷-甲醇-水=8-12:2-5:0.2-1为展开剂,展开,取出,晾干,喷以10%硫酸乙醇溶液,在100-110℃加热2-5分钟,置365nm紫外灯下检视;供试品色谱中,在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上,显相同颜色的荧光斑点。
5.根据权利要求1所述的杜仲壮骨丸的质量检测方法,其特征在于:所述肿节风的鉴别方法为:取本品40丸,研细,取7g,加石油醚:乙醚=1:1混合溶剂30ml,超声1-2h,过滤,滤渣用5-15ml乙醚洗涤,挥干滤渣表面溶剂,加50-70%甲醇60-80ml,超声20-40min,过滤,滤渣用5-15ml乙酸乙酯洗涤,蒸干滤液,残渣加30-50ml水溶解,用三氯甲烷提取2-3次,每次10-20ml,收集三氯甲烷层,蒸干,残渣加1ml甲醇溶解,作为供试品;取肿节风对照药材1g,同法制得对照药材溶液;取异嗪皮啶对照品,加甲醇制成每1ml含0.1mg的溶液,作为对照品溶液;照中国药典薄层色谱法试验,吸取上述3种溶液各15μl,分别点于同一硅胶G薄层板上,以甲苯-乙酸乙酯-甲酸=6-12:3-5:0.5-1.5为展开剂,展开,取出,晾干,置365nm紫外灯下检视;供试品色谱中,在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上,显相同颜色的荧光斑点。
6.根据权利要求1所述的杜仲壮骨丸的质量检测方法,其特征在于:所述马兜铃酸I、马兜铃内酰胺-I的含量检测方法为:照中国药典高效液相色谱法测定:
色谱条件与系统适用性试验:以碳十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;流动相:以乙腈为流动相A,1%乙酸-0.02%三乙胺水溶液为流动相B;检测波长:316nm;流速:0.6-1ml/min;柱温:25-35℃,流动相梯度洗脱见下表:
对照品溶液的制备:
马兜铃酸I:精密称取马兜玲酸I对照品2-3mg,加甲醇溶解并制成每1ml中含马兜玲酸I0.002mg的对照品溶液,摇匀,即得;
马兜铃内酰胺-I:精密称取马兜铃内酰胺I对照品2-3mg,加甲醇溶解并制成每1ml中含马兜铃内酰胺I0.0426mg,摇匀,即得;
供试品溶液的制备:取本品40丸,除去包衣,研细,取2.0g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加70%甲醇40-60ml,称定重量,超声提取30-50分钟,放冷,再称定重量,用70%甲醇溶剂补足减失的重量,摇匀,滤过,取续滤液,即得;
测定法:分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl,注入液相色谱仪,测定,即得。
7.根据权利要求1所述的杜仲壮骨丸的质量检测方法,其特征在于:所述淫羊藿苷的含量检测方法为:照中国药典高效液相色谱法测定:
色谱条件与系统适用性试验:以碳十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;乙腈-水=25-30:70-75为流动相;检测波长为270nm,理论塔板数按淫羊藿苷峰计算大于5000;
对照品溶液的制备:取淫羊藿苷对照品适量,精密称定,加甲醇制成每1ml含18μg的溶液,即得;
供试品溶液的制备:取本品40丸,除去包衣,研细,取2g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入甲醇20-30ml,称定重量,超声处理25-35分钟,放冷,再称定重量,用甲醇补足减失的重量,摇匀,滤过,取续滤液,即得;
测定法:分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl,注入液相色谱仪,测定,即得。
8.根据权利要求1所述的杜仲壮骨丸的质量检测方法,其特征在于:所述杜仲壮骨丸的质量检测方法包括鉴别方法和含量测定方法;所述鉴别方法包括对黄芪、淫羊藿、三七、人参或肿节风的薄层鉴别检测;所述含量测定方法包括对马兜铃酸I、马兜铃内酰胺-I或淫羊藿苷的含量测定,具体如下所示:
性状:本品为黑色糖衣浓缩水丸,除去糖衣后显棕褐色;气香,味微苦;
鉴别:(1)黄芪的鉴别方法为:取本品40丸,研细,取7g,加乙醇50ml,加热回流30min,滤过,滤液蒸干,残渣加水30ml使溶解,用乙醚洗涤2次,每次20ml,弃去乙醚液,取水溶液,用水饱和的正丁醇振摇提取3次,每次20ml,合并正丁醇液,用正丁醇饱和的水溶液洗涤3次,每次20ml,取正丁醇溶液,蒸干,残渣加甲醇5ml使溶解,溶液加于中性氧化铝柱100-120目、5g、内径1.5cm上,先用甲醇40ml洗涤,弃去洗涤液,用40%甲醇50ml洗脱,收集洗脱液至水浴上蒸干,残渣加甲醇1ml使溶解,作为供试品溶液;另取黄芪对照药材1g,同法制成对照药材溶液;照中国药典通薄层色谱法试验,吸取上述2种溶液各15μl,分别点于同一硅胶G薄层板上,以三氯甲烷-甲醇-水=10:3:0.3为展开剂,展开,取出,晾干,喷以10%硫酸乙醇溶液,在105℃加热2-5分钟,置365nm紫外灯下检视,供试品色谱中,在与对照药材色谱相应的位置上,显相同颜色的荧光斑点;
(2)淫羊藿的鉴别方法为:取本品40丸,研细,取7g,加乙醇50ml,60℃温浸30分钟,滤过,蒸干,残渣加甲醇1ml使溶解,作为供试品溶液;另取淫羊藿对照药材1g,同法制成对照药材溶液,即得;取淫羊藿苷对照品适量,精密称定,加甲醇制成每1ml含1mg的对照品溶液;照中国药典薄层色谱法试验,吸取上述3种溶液各15μl,分别点于同一硅胶H薄层板上,以乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水=10:1:1:1为展开剂,展开,取出,晾干,喷以3%三氯化铝溶液,在105℃加热2-5分钟,置365nm紫外灯下检视;供试品色谱中,在与对照药材色谱相应的位置上,显相同颜色的荧光斑点;
(3)三七、人参的鉴别方法为:取本品40丸,研细,取7g,加甲醇50ml,加热回流提取30min,滤过,滤液蒸干,残渣加水15ml使溶解,用三氯甲烷洗涤2次,每次10ml,弃去三氯甲烷液,用水饱和的正丁醇振摇提取2次,每次10ml,合并正丁醇液,用1%氢氧化钠溶液洗涤2次,每次10ml,再用正丁醇饱和的水洗至中性,取正丁醇液,蒸干,残渣加甲醇1ml使溶解,作为供试品溶液;另取三七、人参对照药材各1g,同法制成对照药材溶液;取人参皂苷Rb1,人参皂苷Re,人参皂苷Rg1、三七皂苷R1对照品,加甲醇制成每1ml各含0.5mg的混合溶液,作为对照品溶液;照中国药典薄层色谱法试验,吸取上述4种溶液各5μl,分别点于同一硅胶G薄层板上,以三氯甲烷-甲醇-水=10:4:0.6为展开剂,展开,取出,晾干,喷以10%硫酸乙醇溶液,在105℃加热2-5分钟,置365nm紫外灯下检视;供试品色谱中,在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上,显相同颜色的荧光斑点;
(4)肿节风的鉴别方法为:取本品40丸,研细,取7g,加石油醚:乙醚=1:1混合溶剂30ml,超声1h,过滤,滤渣用10ml乙醚洗涤,挥干滤渣表面溶剂,加60%甲醇70ml,超声30min,过滤,滤渣用10ml乙酸乙酯洗涤,蒸干滤液,残渣加40ml水溶解,用三氯甲烷提取2次,每次15ml,收集三氯甲烷层,蒸干,残渣加1ml甲醇溶解,作为供试品;取肿节风对照药材1g,同法制得对照药材溶液;取异嗪皮啶对照品,加甲醇制成每1ml含0.1mg的溶液,作为对照品溶液;照中国药典薄层色谱法试验,吸取上述3种溶液各15μl,分别点于同一硅胶G薄层板上,以甲苯-乙酸乙酯-甲酸=9:4:1为展开剂,展开,取出,晾干,置365nm紫外灯下检视;供试品色谱中,在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上,显相同颜色的荧光斑点;
检查:符合中国药典丸剂项下的各项规定;
含量测定:(5)马兜铃酸I、马兜铃内酰胺-I的含量检测方法为:照中国药典通则0512高效液相色谱法测定:
色谱条件与系统适用性试验:以碳十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;流动相:以乙腈为流动相A,1%乙酸-0.02%三乙胺水溶液为流动相B;检测波长:316nm;流速:0.8ml/min;柱温:30℃,流动相梯度洗脱见下表:
对照品溶液的制备:
马兜铃酸I:精密称取马兜玲酸I对照品2.3mg,加甲醇溶解并制成每1ml中含马兜玲酸I0.002mg的对照品溶液,摇匀,即得;
马兜铃内酰胺-I:精密称取马兜铃内酰胺I对照品2.13mg,加甲醇溶解并制成每1ml中含马兜铃内酰胺I0.0426mg,摇匀,即得;
供试品溶液的制备:取本品40丸,除去包衣,研细,取2.0g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加70%甲醇50ml,称定重量,超声提取40分钟,放冷,再称定重量,用70%甲醇溶剂补足减失的重量,摇匀,滤过,取续滤液,即得;
测定法:分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl,注入液相色谱仪,测定,即得;
(6)淫羊藿苷的含量检测方法为:照中国药典高效液相色谱法测定:
色谱条件与系统适用性试验:以碳十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;乙腈-水=28:72为流动相;检测波长为270nm,理论塔板数按淫羊藿苷峰计算大于5000;
对照品溶液的制备:取淫羊藿苷对照品适量,精密称定,加甲醇制成每1ml含18μg的溶液,即得;
供试品溶液的制备:取本品40丸,除去包衣,研细,取2g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入甲醇25ml,称定重量,超声处理30分钟,放冷,再称定重量,用甲醇补足减失的重量,摇匀,滤过,取续滤液,即得;
测定法:分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl,注入液相色谱仪,测定,即得。
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