发明内容
本发明的目的在于,提供一种天麻灵芝颗粒的检测方法;所述检测方法准确,灵敏度高,重复性好,结果可靠,能有效控制该产品的质量,确保药物的临床药效。
为解决上述技术问题,本发明采用如下技术方案实现:
一种天麻灵芝颗粒的检测方法,所述药物由天麻50-150份、灵芝300-400份、制黄精300-400份、淫羊藿50-150份和制何首乌100-210份按照下述方法制备而成。
具体地说,所述天麻灵芝颗粒的药物,按照重量组份计算,由天麻100份、灵芝333份、制黄精333份、淫羊藿100份和制何首乌167份制备而成。
其制备方法为:根据配方称取各药物,用水煎煮提取,滤过,滤液浓缩至稠膏,干燥,粉碎,制成颗粒;
具体地说,其制备方法为:颗粒剂这样制备:按比例称取天麻和灵芝加10倍的水煮2小时,滤过,取黄精、淫羊藿、制首乌加入合煎,加水煎煮两次,第一次2小时,加8倍量水,第二次1小时,加6倍量水。滤过,合并三次滤液,浓缩至60℃相对密度为1.30~1.31的稠膏,备用;加入糊精:蔗糖粉=5:14混合均匀制软材,迅速过14目筛进行制粒,于60℃干燥箱内干燥,16目筛整粒,制成1000g,即得。
所述检测方法包括鉴别方法和含量测定方法;所述鉴别方法包括对天麻、淫羊藿和/或灵芝的薄层鉴别检测;所述含量测定方法包括对天麻素和/或淫羊藿苷的含量测定。
前述天麻灵芝颗粒的检测方法中,所述天麻的鉴别方法为:取药物颗粒1g加15ml水饱和的正丁醇超声30min,滤过,滤液挥干,残渣加水20ml溶解,加在已处理好的内径1.5cm 柱高16cm的D101型大孔树脂柱上用水20ml洗脱,弃去洗脱液,再加20%乙醇25ml洗脱,收集洗脱液,蒸干,残渣加1ml甲醇作为供试品溶液;取天麻素对照品加甲醇制成1ml含1mg的溶液作为对照品溶液;照中国药典薄层色谱法实验,吸取上述三种溶液各10μl,分别点于同一硅胶G薄层板上,以乙酸乙酯:甲醇:水=9:1:0.2为展开剂,展开取出晾干,喷10%磷钼酸乙醇溶液在105℃下加热至斑点清晰;供试品色谱中,在与对照品色谱相应位置上,显相同颜色斑点。
前述天麻灵芝颗粒的检测方法中,所述淫羊藿的鉴别方法为:取药物颗粒2g加乙醇30ml,回流30min,滤过,滤液挥干残渣加水30ml溶解,乙醚振摇提取两次每次20ml,弃去乙醚液,再用乙酸乙酯20ml提取,取乙酸乙酯液蒸干,残渣加无水乙醇1ml使溶解作为供试品溶液;取淫羊藿对照药材0.5g加乙醇20ml回流30min,滤过,滤液蒸干加无水乙醇1ml,作为对照药材溶液;另取淫羊藿苷对照品加无水乙醇制成1ml含1mg的对照品溶液;照中国药典薄层色谱法实验,吸取上述三种溶液各5μl,分别点于同一硅胶G薄层板上,以乙酸乙酯:丁酮:甲酸:水=10:1:1:1为展开剂,展开取出晾干,喷三氯化铝溶液在105℃下加热5min,在紫外灯365nm下检测;供试品色谱中,在与对照药材色谱与对照品色谱相应位置上,显相同颜色斑点。
前述天麻灵芝颗粒的检测方法中,所述灵芝的鉴别方法为:取药物颗粒8g加60ml乙醇回流30min,滤过,滤液蒸干,残渣加甲醇1ml溶解,作为供试品溶液;另取灵芝对照药材1g,加20ml乙醇,同法制得对照药材溶液;照中国药典薄层色谱法实验,吸取上述两种溶液各5μl,分别点于同一硅胶G薄层板上,以石油醚60~90℃:甲酸乙酯:甲酸=10:5:1上层液为展开剂,展开取出晾干,在紫外灯365nm下检测;供试品色谱中,在与对照药材色谱色谱相应位置上,显相同颜色斑点。
前述天麻灵芝颗粒的检测方法中,所述天麻素的含量检测方法为:照中国药典附录高效液相色谱法试验:
色谱条件与系统适用性试验:以碳十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;以乙腈:0. 2%磷酸= 7:93为流动相,检测波长为220nm;理论板数按天麻素峰计算应不低于7000;
对照品溶液的制备:精密称取天麻素对照品2.51 mg,置10 ml棕色量瓶中,加甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀,精密吸取1ml,置10 ml棕色量瓶中,加甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀,即得含天麻素0.0251mg/ml的对照品溶液;
供试品溶液的制备:取颗粒剂0.3g研细,精密称定,置25ml量瓶中,加40%甲醇约20ml,用功率150W,频率50kHz的超声处理30min,取出,放冷,用40%甲醇稀释至刻度,摇匀,微孔滤膜滤过,取续滤液,即得;
测定法:分别吸取对照品溶液和供试品溶液各10μl,注入液相色谱仪,测定,即得。
前述天麻灵芝颗粒的检测方法中,所述淫羊藿苷的含量检测方法为:照中国药典附录高效液相色谱法试验:
色谱条件与系统适用性试验:以十八垸基硅烷键合硅胶为填充剂;以以乙腈:水=30∶70为流动相,检测波长为270nm;理论板数按淫羊藿苷峰计算应不低于1500;
对照品溶液的制备:精密称取淫羊藿苷对照品5.13mg置10ml容量瓶中,加甲醇至刻度,制成每1ml含0.513mg的溶液,即得;
供试品溶液的制备:取颗粒剂0.6 g研细,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入甲醇25ml,超声处理40min,放冷,用甲醇补足减失的重量,摇匀,用0.45μm微孔滤膜滤过,取续滤液,即得;
测定法:分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10μl,注入液相色谱仪,测定,即得。
前述天麻灵芝颗粒的检测方法中,所述药物这样检测:
性状:棕色至棕褐色的颗粒,味先甜后苦;
鉴别:(1)取药物颗粒1g加15ml水饱和的正丁醇超声30min,滤过,滤液挥干,残渣加水20ml溶解,加在已处理好的内径1.5cm 柱高16cm的D101型大孔树脂柱上用水20ml洗脱,弃去洗脱液,再加20%乙醇25ml洗脱,收集洗脱液,蒸干,残渣加1ml甲醇作为供试品溶液;取天麻素对照品加甲醇制成1ml含1mg的溶液作为对照品溶液;照中国药典薄层色谱法实验,吸取上述三种溶液各10μl,分别点于同一硅胶G薄层板上,以乙酸乙酯:甲醇:水=9:1:0.2为展开剂,展开取出晾干,喷10%磷钼酸乙醇溶液在105℃下加热至斑点清晰;供试品色谱中,在与对照品色谱相应位置上,显相同颜色斑点。
(2)取药物颗粒2g加乙醇30ml,回流30min,滤过,滤液挥干残渣加水30ml溶解,乙醚振摇提取两次每次20ml,弃去乙醚液,再用乙酸乙酯20ml提取,取乙酸乙酯液蒸干,残渣加无水乙醇1ml使溶解作为供试品溶液;取淫羊藿对照药材0.5g加乙醇20ml回流30min,滤过,滤液蒸干加无水乙醇1ml,作为对照药材溶液;另取淫羊藿苷对照品加无水乙醇制成1ml含1mg的对照品溶液;照中国药典薄层色谱法实验,吸取上述三种溶液各5μl,分别点于同一硅胶G薄层板上,以乙酸乙酯:丁酮:甲酸:水=10:1:1:1为展开剂,展开取出晾干,喷三氯化铝溶液在105℃下加热5min,在紫外灯365nm下检测;供试品色谱中,在与对照药材色谱与对照品色谱相应位置上,显相同颜色斑点。
(3)取药物颗粒8g加60ml乙醇回流30min,滤过,滤液蒸干,残渣加甲醇1ml溶解,作为供试品溶液;另取灵芝对照药材1g,加20ml乙醇,同法制得对照药材溶液;照中国药典薄层色谱法实验,吸取上述两种溶液各5μl,分别点于同一硅胶G薄层板上,以石油醚60~90℃:甲酸乙酯:甲酸=10:5:1上层液为展开剂,展开取出晾干,在紫外灯365nm下检测;供试品色谱中,在与对照药材色谱色谱相应位置上,显相同颜色斑点。
检查:应符合《中国药典》颗粒剂项下有关的各项规定;
含量测定:(1)天麻素:照中国药典附录高效液相色谱法试验:
色谱条件与系统适用性试验:以碳十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;以乙腈:0. 2%磷酸=7:93为流动相, 检测波长为220nm;理论板数按天麻素峰计算应不低于7000;
对照品溶液的制备:精密称取天麻素对照品2.51 mg,置10 ml棕色量瓶中,加甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀,精密吸取1ml,置10 ml棕色量瓶中,加甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀,即得含天麻素0.0251mg/ml的对照品溶液,即得;
供试品溶液的制备:取颗粒剂0.3g研细,精密称定,置25ml量瓶中,加40%甲醇约20ml,用功率150W,频率50kHz的超声处理30min,取出,放冷,用40%甲醇稀释至刻度,摇匀,微孔滤膜滤过,取续滤液,即得;
测定法:分别吸取对照品溶液和供试品溶液各10μl,注入液相色谱仪,测定,即得;
(2)淫羊藿苷:照中国药典附录高效液相色谱法试验:
色谱条件与系统适用性试验:以十八垸基硅烷键合硅胶为填充剂;以以乙腈:水=30∶70为流动相,检测波长为270nm;理论板数按淫羊藿苷峰计算应不低于1500;
对照品溶液的制备:精密称取淫羊藿苷对照品5.13mg置10ml容量瓶中,加甲醇至刻度,制成每1ml含0.513mg的溶液,即得;
供试品溶液的制备:取颗粒剂0.6 g研细,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入甲醇25ml,超声处理40min,放冷,用甲醇补足减失的重量,摇匀,用0.45μm微孔滤膜滤过,取续滤液,即得;
测定法:分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10μl,注入液相色谱仪,测定,即得。
发明人进行了大量的实验,以下是本发明所述检测方法的研究
实验例:检测方法研究
(一)样品及对照品来源
1、样品:天麻,灵芝,制黄精,淫羊藿和制何首乌。
颗粒剂:按照本发明所述颗粒剂制备方法进行制备,天麻素(批号:110807-200205);淫羊藿苷(批号:110737-200415)。
2、对照品:天麻对照药材(批号:120944-200608 );淫羊藿对照药材(批号: 110737-200912));灵芝对照药材(批号:120968-200906)
(二)鉴别。
1、天麻的薄层鉴别:
(1)供试品溶液的制备:取天麻灵芝颗粒1g加15ml水饱和的正丁醇超声30min,滤过,滤液挥干,残渣加水20ml溶解,加在已处理好的D101型大孔树脂柱上(内径1.5cm 柱高16cm)用水20ml洗脱,弃去洗脱液,再加20%乙醇25ml洗脱,收集洗脱液,蒸干,残渣加甲醇1ml作为供试品溶液。
对照品溶液的制备:取天麻素对照品加甲醇制成1ml含1mg的溶液作为对照品溶液。
对照药材溶液的制备:取天麻对照药材1g加20ml水水浴回流30min,滤过,滤液蒸干,残渣加乙醚25ml振摇提取,弃去乙醚液,水层用正丁醇振摇提取,取正丁醇液蒸干,残渣加甲醇1ml,作为对照药材溶液。
阴性对照溶液的制备:按照处方制作缺乏天麻药材的颗粒,再按照供试品的制作方法制成阴性对照溶液。
薄层色谱层析条件:吸取上述四种溶液各10ul,分别点于同一硅胶G薄层板上,以乙酸乙酯-甲醇-水(9:1:0.2)为展开剂,展开取出晾干,喷10%磷钼酸乙醇溶液在105℃下加热至斑点清晰,供试品,对照药材与对照品在相应位置上显相同颜色斑点。结果见图1。结果表明,在与对照药材色谱相应的位置上均显相同颜色的斑点,阴性对照无干扰,与原剂型的鉴别结果一致,故列入质量标准正文。由于对照药材的提取方法与供试品溶液的制备方法不一致,故不列入标准中。见图1。
2、淫羊藿的薄层鉴别:
(1)供试品溶液的制备:取天麻灵芝颗粒2g加乙醇30ml,回流30min,滤过,滤液挥干残渣加水30ml溶解,乙醚振摇提取两次每次20ml,弃去乙醚液,再用乙酸乙酯20ml提取,取乙酸乙酯液蒸干,残渣加无水乙醇1ml使溶解作为供试品溶液。
对照品溶液的制备:取淫羊藿苷对照品加无水乙醇制成1ml含1mg的溶液,作为对照品溶液。
对照药材溶液的制备:对照药材0.5g加乙醇20ml回流30min,滤过,滤液蒸干加无水乙醇1ml,作为对照药材溶液。
阴性对照溶液的制备:按照处方制作缺乏淫羊藿药材的颗粒,再按照供试品的制作方法制成阴性对照溶液。
薄层色谱层析条件:照薄层色谱法(《中国药典》2010版一部附录Ⅵ B)实验,吸取上述四种溶液各5ul,分别点于同一硅胶G薄层板上,以乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水(10:1:1:1)为展开剂,展开取出晾干,喷三氯化铝溶液在105℃下加热5min,在紫外灯365nm下检测,供试品,对照药材与对照品在相应位置上显相同颜色斑点。结果见图2。结果表明,在与对照药材色谱、对照品色谱相应的位置上均显相同颜色的斑点,阴性对照无干扰,故列入质量标准正文。见图2。
3、灵芝的薄层鉴别:
供试品溶液的制备:取天麻灵芝颗粒8g加60ml乙醇回流30min,滤过,滤液蒸干,残渣加甲醇1ml溶解,作为供试品溶液。
对照药材溶液的制备:取天麻对照药材1g,加20ml乙醇回流30min,滤过,滤液蒸干,残渣加甲醇1ml溶解,作为供试品溶液。
阴性对照溶液的制备:取天麻药材的阴性样品8g,同法制成阴性对照溶液。
薄层色谱层析条件:照薄层色谱法(《中国药典》2010版一部附录Ⅵ B)实验,吸取上述三种溶液各5μl,分别点于同一硅胶G薄层板上,以石油醚(60~90℃)-甲酸乙酯-甲酸(10:5:1)上层液为展开剂,展开取出晾干,在紫外灯365nm下检测,供试品,对照药材在相应位置上显相同颜色斑点,阴性对照无干扰,故列入质量标准正文。结果见图3。
(三)含量测定:
天麻素
1方法:(1)仪器与试药:WAT-GZ050926CWJ型WATERS高效液相色谱仪(美国WATERS公司);SPD-20A紫外-可见检测器,waters2487;515HPLC pump;JJW-3KV精密净化稳压电源(东方集团易事务公司);7725型手动进样;HT-200A型柱温箱;AE240型电子天平(上海梅特勒仪器有限公司);SK8210HP型超声波清洗机(上海科导超声仪器有限公司,功率250W,频率33kHz);乙腈(天津市科密欧化学试剂有限公司,批号:20130416);甲醇(天津市科密欧化学试剂有限公司,批号:20130417)均为色谱纯;水为娃哈哈纯净水(批号:20130316); 磷酸(重庆川江化学试剂厂,批号:20130725)。 天麻素(中国药品生物制品检定所,批号:110807-200205)。
(2)色谱条件:色谱柱:Kromasil C18柱(4.6 mm x250 mm),流动相: 乙腈-0.2%磷酸( 7:93) , 流速:1.0 mL/min; 柱温:28℃;检测波长:220nm;理论塔板数:以天麻素计不低于5000。
(3)检测波长的选择
参考《中国药典》2010年版天麻药材含量测定项下天麻素测定方法,检测波长为220nm,故按法定标准选择220nm为检测波长。
(4)系统适用性试验
取供试品溶液, 天麻素对照品溶液及缺天麻阴性对照溶液, 照色谱条件项下色谱条件, 各进样10μL,测得HPLC 图谱, 见图4。图谱表明阴性对照溶液色谱峰不干扰供试品溶液色谱峰中的天麻素峰,即本试验条件下天麻素与其他组分分离完全,分离度远大于1.5,根据不同色谱柱比较结果,理论塔板数以野黄芩苷峰计,应不低于5000。见图4-图6。
2线性关系考察:
(1)对照品储备液的制备
精密称取天麻素对照品2.51mg,置10ml棕色量瓶中,加甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀,精密量取1ml,置10ml棕色量瓶中,加甲醇至刻度,摇匀,即得(每1ml中含天麻素0.0251mg)。
(2)标准曲线的绘制
分别精密吸取 2 ,4,6,8,10,12 μL对照品溶液注入液相色谱仪中,记录色谱,以峰面积A对进样量C(μg)进行线性回归,得线性回归方程:y=1.6E+6x-16711 (r=0.9996)。线性范围: 0.0502~0.3012μg。结果见表1、图7。
3供试品溶液的制备
(1) 提取溶剂的选择 样品研细,取约0.3g,精密称定,分别用100%乙醇、100%甲醇、80%甲醇、40%甲醇、30%甲醇进行样品提取,用0.45微孔滤膜滤过,取续滤液,测定样品中天麻素的含量,比较提取结果。结果见表2;
结果表明:40%甲醇甲醇作为溶剂时杂质峰较少、分离效果好、专属性强、稳定性好, 故确定40%甲醇甲醇为提取溶剂。
(2) 提取方法的选择 样品研细,取约0.3g,精密称定,用40%甲醇作为溶剂进行回流和超声(功率150W,频率50kHz)提取样品,用0.45微孔滤膜滤过,取续滤液,测定样品中天麻素的含量,比较提取结果。结果见表3;
结果表明:用40%甲醇作为溶剂,超声(功率150W, 频率50kHz)提取的样品,含量高、提取效率较回流提取的高、分离效果好。
(3) 稀释体积的优选样品研细,取约0.3g,精密称定,用分别10mL,25mL,50mL的容量瓶,40%甲醇进行超声(功率150W, 频率50kHz)提取 30min,用0.45微孔滤膜滤过,取续滤液,测定样品中天麻素的含量,比较提取结果。结果见表4;
结果表明:将制好的颗粒中25mL的容量瓶超声(功率150W, 频率50kHz)提取同一批号样品,天麻素的含量要高于10mL容量瓶 和50mL容量瓶,因此,提取的最佳时间为25mL容量瓶。
(4) 提取时间优选 样品研细,取约0.3g,精密称定,用40%甲醇分别进行超声(功率150W, 频率50kHz)时间为(15,30,40,60min)提取样品,用0.45微孔滤膜滤过,取续滤液,测定样品中天麻素的含量,比较提取结果。结果见表5;
结果表明:将制好的颗粒中用40%甲醇超声(功率150W, 频率50kHz)提取 30min,天麻素的含量最高,因此,提取的最佳时间为30min。
综上所述:在供试品溶液制备中,结果表明取本品适量,研细,取约 0.3g用25mL容量瓶、40%甲醇、超声(功率150W, 频率50kHz)、提取30min为最佳提取条件。
(5)供试品溶液的制备 取制好的颗粒,研细,取0.3012g,精密称定,置25ml量瓶中,加40%甲醇约20ml,超声处理(功率150W, 频率50kHz)30min, 取出,放冷,用40%甲醇稀释至刻度,摇匀,微孔滤膜滤过,取续滤液,即得。
(6)阴性供试品溶液的制备 取缺天麻药材的制剂,按供试品溶液的制备方法制备。
4精密度试验 精密吸取对照品溶液(0.0251mg/mL)10μl,重复进样6次,记录色谱图,结果见表6、图8。
结果表明,仪器精密度良好。
5 重复性试验 精密称取同一批号(20130718)供试品,每份0.3g,按供试品溶液的制备方法,制备供试品溶液,分别注入色谱仪10μl,记录色谱图,计算(结果见表7、图9),平均含量1.1943mg/g,RSD1.02%;
结果表明,重复性良好。
6 稳定性试验 精密称取供试品(批号为:20130718)0.3012g,按拟订的制备方法制成供试品溶液,在室温下放置,分别在0、2、4、6、8、10、12h注入液相色谱仪10μl,记录色谱图,结果见表8、图10。
结果表明,供试品溶液中天麻素在12小时内的稳定。
7 回收率(准确度)试验分别精密称取已知含量的供试品(批号为:20130718 )9份,每份0.3g,按80%、100%、120%3个不同浓度,分别加入天麻素对照品溶液,照供试品溶液制备方法处理样品,分别进样10μl,记录色谱图,结果见表9、图11-13。
结果表明,该方法加样回收率良好
8 耐用性试验
(1)流动相比例考察 色谱条件:色谱柱:Inertsil ODS-SP柱(4.6×250㎜,5μm),检测波长:220 nm;柱温:25℃;流速:1.0 mL·min-1。精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10μL,分别进样,如表8不同流动相比例条件下测定,计算,结果见表10:
注:1.乙腈:0.2%磷酸溶液(5:95);2.乙腈:0.2%磷酸溶液(6:94);3.乙腈:0.2%磷酸溶液(7:93);4.乙腈:0.2%磷酸溶液(8:92);5.乙腈:0.2%磷酸溶液(9:91)
实验结果表明,流动相比例在1~5之间,含量RSD为2.62%,对含量测定的影响较大;流动相比例在2~4之间,含量RSD为1.09%,对天麻素的含量测定没有显著影响,能够对其进行天麻素含量测定。
(2)不同柱温考察 色谱条件:色谱柱:Inertsil ODS-SP柱(4.6×250㎜,5μm),检测波长:220 nm;流速:1.0 mL·min-1。精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10μL,分别进样,如表9不同柱温条件下测定,计算含量,结果见表11:
实验结果表明:色谱柱温度在26~30℃范围内含量测定RSD为2.67%,主要在26℃点变化较大;在28~30℃范围内含量测定RSD为0.84%。故色谱柱温度在28~30℃范围内可对天麻素进行准确的含量测定。
(3)不同pH考察 色谱条件:色谱柱:Inertsil ODS-SP柱(4.6×250㎜,5μm),检测波长:220 nm;柱温:28℃;流速:1.0mL·min-1。精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10μL,分别进样,如表9不同PH条件下测定,计算,结果见表12:
注:1.乙腈-:0.1%磷酸溶液(7:93);2.乙腈-:0.15%磷酸溶液(7:93);3.乙腈-:0.2%磷酸溶液(7:93);4.乙腈-:0.25%磷酸溶液(7:93);5.乙腈-:0.3%磷酸溶液(7:93)
实验结果表明:流动相pH在2.16~2.54范围内变化,对天麻素的含量测定没有显著影响,能够对其天麻素含量测定。
(4) 不同色谱柱考察 色谱条件:检测波长:220 nm;柱温:28℃;流速:1.0 mL·min-1。精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10μL,分别进样,如表11不同厂牌色谱柱条件下测定,计算含量,结果见表13:
注:1.Kromasil C18柱(4.6 mm x250 mm)色谱柱;2.Diamonsil C18(4.6 mm x250 mm)色谱柱;3.1nertsilODS--SP2(5um,4.6×250mm) 色谱柱
实验结果表明,不同厂家色谱柱对天麻素含量测定没有显著变化,天麻素均能达到较好的分离,且都能达到中国药典的相关要求。
8 样品测定 按制剂质量标准(草案)制备供试品溶液和对照品溶液,分别进样,记录色谱图,按下式计算含量(结果见表14):
C对:对照品溶液浓度
V对:对照品进样体积
V样:供试品进样体积
A样:供试品峰面积
A对:对照品峰面积
W样:供试品取样量
10 样品含量限度
天麻素 从10批天麻灵芝颗粒样品测定结果可见,各批号样品中天麻素提取率均在100%以上(可能是药材质量较好的原因),故制剂中天麻素提取率按不低于100%计。每袋制剂中天麻素含量限度计算如下: 天麻素含量限度=制剂含天麻药材(g)×天麻药材含天麻素限度×转移率×3.1(g)/制备量(g)=100g×0.20%×100%×3.1g×1000/1000g=0.62mg/粒,故暂定本品每袋含天麻以天麻素(C13H18O7)计,不得少于0.62mg。
淫羊藿苷
1方法:(1)仪器与试药:WAT-GZ050926CWJ型WATERS高效液相色谱仪(美国WATERS公司);SPD-20A紫外-可见检测器,waters2487;515HPLC pump;JJW-3KV精密净化稳压电源(东方集团易事务公司);7725型手动进样;HT-200A型柱温箱;AE240型电子天平(上海梅特勒仪器有限公司);SK8210HP型超声波清洗机(上海科导超声仪器有限公司,功率500W,频率59kHz)。乙腈(天津市科密欧化学试剂有限公司,批号:20130416,20130610);甲醇(天津市科密欧化学试剂有限公司,批号:20130417,20131010)均为色谱纯;水为娃哈哈纯净水(批号:20130316); 磷酸(重庆川江化学试剂厂,批号:20130725)。无水乙醇(批号:20120208 重庆川东化工有限公司);淫羊藿苷对照品(中国药品生物制品检定所,批号:110737-200415)。
(2)色谱条件 色谱柱:Inertsil ODS-SP柱(4.6×250㎜,5μm);流动相:乙腈-水(30:70);检测波长:270nm;柱温:25℃;流速:1.0mL·min-1;理论塔板数:以淫羊藿苷计不低于1500。
(3) 检测波长的选择
参与《中国药典》2010年版天麻药材含量测定项下天麻素测定方法,检测波长为270nm,故按法定标准选择270nm为检测波长。
(4) 系统适用性试验
取供试品溶液, 淫羊藿苷对照品溶液及缺淫羊藿药材阴性对照溶液, 照色谱条件项下色谱条件, 各进样10μL,测得HPLC 图谱, 见图14-16。图谱表明阴性对照溶液色谱峰不干扰供试品溶液色谱峰中的淫羊藿苷峰,即本试验条件下淫羊藿苷与其他组分分离完全,分离度远大于1.5,根据不同色谱柱比较结果,理论塔板数以野黄芩苷峰计,应不低于1500。
2线性关系考察
(1)对照品储备液的制备 精密称取淫羊藿苷对照品5.28mg置50mL容量瓶中,加甲醇至刻度,摇匀,即得(每1ml中含淫羊藿苷0.1056mg)。
(2)标准曲线的绘制 取照品储备液40mL置50mL容量瓶中,加甲醇至刻度,再分别精密吸取1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0mL于10mL量瓶,加甲醇定容至刻度。分别精密吸取上述 6 种浓度的对照品溶液各10μL,注入液相色谱仪,记录色谱,以峰面积A对进样量C(μg)进行线性回归,得线性回归方程Y=2.1E+7X+5164.0,r=0.9998,线性范围: 0.008448~0.084480mg范围内线性良好,见表15,图17。
3供试品溶液的制备
(1) 提取溶剂的选择 根据2010版药典淫羊藿药材中淫羊藿苷所用的提取溶剂为甲醇;原剂型提取溶剂也为甲醇,可选择甲醇为提取溶剂,因本品为颗粒剂,单用甲醇不能完全溶解颗粒促使野黄芩苷释放出来,故选择不同浓度的甲醇为提取溶剂。取装量差异项下的本品,混均,研细,取约2g,精密称定,置具塞锥形瓶中,分别精密加入50%、75%、100%甲醇20ml,称定重量,超声处理25分钟,放冷,再称定重量,用相应溶剂补足减失的重量,摇匀,滤过,取续滤液,即得。分别注入液相色谱仪作比较,结果见表16。
结果表明: 75%甲醇溶液在25分钟内提取效率最高,故选择75%甲醇提取溶剂。
(2)超声处理时间考察 取装量差异项下的本品,混均,研细,取约2g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入75%甲醇25ml(将提取溶剂增加至25ml,避免溶液浓度过饱和),称定重量,超声处理10、20、30分钟,放冷,再称定重量,用75%甲醇补足减失的重量,摇匀,滤过,取续滤液,即得。分别注入液相色谱仪作比较,分别注入液相色谱仪,考察不同提取时间对结果的影响,结果见表17。
结果表明:提取20和30分钟的方法结果基本一致,故采用超声处理20分钟。
(3)供试品溶液的制备 取装量差异项下的本品,混均,研细,取约2g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入75%甲醇25ml,称定重量,超声处理20分钟,放冷,再称定重量,用75%甲醇补足减失的重量,摇匀,滤过,取续滤液,即得。
(4)阴性供试品溶液的制备 取缺淫羊藿药材的制剂,按供试品溶液的制备方法制备。
4精密度试验 精密吸取对照品溶液(0.05071mg/mL)10μl,重复进样6次,记录色谱图,结果见表18、图18。
结果表明,仪器精密度良好。
5重复性试验 精密称取同一批号(20130718)供试品,每份约0.6g,按供试品溶液的制备方法,制备供试品溶液,分别注入色谱仪10μl,记录色谱图,计算(结果见表19、图19),平均含量0.5628mg/g,RSD0.59%。
结果表明,重复性良好。
6稳定性试验 精密称取供试品(批号为:20130718)0.6025g,按拟订的制备方法制成供试品溶液,在室温下放置,分别在0、2、4、6、8、10、12h注入液相色谱仪10μl,记录色谱图,结果见表20、图20。
结果表明,供试品溶液中淫羊藿苷在12小时内的稳定。
7 回收率(准确度)试验 分别精密称取已知含量的供试品(批号为:20130718 )9份,每份0.3g,分别加入淫羊藿苷对照品溶液(0.0169mg·mL-1)8mL、10mL、12mL,照供试品溶液制备方法处理样品,分别进样10μl,记录色谱图,结果见表21、图21-23。
结果表明,该方法加样回收率良好
8耐用性试验
(1)流动相比例考察
色谱条件:色谱柱:Inertsil ODS-SP柱(4.6×250㎜,5μm),检测波长:270 nm;柱温:25℃;流速:1.0 mL·min-1。精密吸取对照品溶液(0.1026mg·mL-1)和供试品溶液各10μL,分别重复进样2针,如表20不同流动相比例条件下测定,记录色谱图,取平均值计算含量,结果见表22,色谱图见图24-28。
注:1.乙腈:水(30:70);2.乙腈:水(29:71);3.乙腈:水(28:72);4.乙腈:水(27:73);5.乙腈:水(26:74)
实验结果表明,流动相比例在(30:70)~(26:74)之间,含量RSD为4.19%,对含量测定的影响较大。
(2)不同柱温考察 色谱条件:色谱柱:Inertsil ODS-SP柱(4.6×250㎜,5μm),检测波长:270 nm;流速:1.0 mL·min-1。精密吸取对照品溶液(0.0513mg·mL-1)和供试品溶液各10μL,分别进样,如表10不同柱温条件下测定,计算含量,结果见表23,图29-31;
实验结果表明:色谱柱温度在20~30℃范围内含量测定RSD为4.9%,主要在30℃点变化较大;在20~25℃范围内含量测定RSD为0.34%。故色谱柱温度在20~25℃范围内可对淫羊藿苷进行准确的含量测定。
(3)流动相pH考察 色谱条件:色谱柱:Inertsil ODS-SP柱(4.6×250㎜,5μm),检测波长:270 nm;柱温:25℃;流速:1.0 mL·min-1。精密吸取对照品溶液(0.1026mg·mL-1)和供试品溶液各10μL,分别进样,如表9不同流动相比例条件下测定,计算,结果见表24,图32-36;
注:1.乙腈-:0.01%磷酸溶液(30:70);2.乙腈-:0.025%磷酸溶液(30:70:);3.乙腈-:0.05%磷酸溶液(30:70:);4.乙腈-:0.075%磷酸溶液(30:70:);5.乙腈-:0.1%磷酸溶液(30:70:)
实验结果表明:流动相pH在2.14~2.86范围内,含量RSD为5.2%,主要在2.14点变化较大;在2.22~2.86范围内,含量RSD为1.4%,分离度也符合要求,故pH在2.22~2.86范围内均可以对淫羊藿苷进行准确的含量测定。
(4) 不同色谱柱考察 流动相:乙腈-水(30:70);检测波长:270 nm;柱温:25℃;流速:1.0 mL·min-1。精密吸取对照品溶液(0.0513mg·mL-1)和供试品溶液各10μL,分别重复进样2针,如表23不同厂牌色谱柱条件下测定,记录色谱图,计算含量,结果见表25,色谱图见图37-39。
注:1.Inertsil ODS-SP(日本岛津);2.Diamonsil C18(美国);3.ZORBAX SB-C18(美国)
实验结果表明,不同厂家色谱柱对淫羊藿苷含量测定没有显著影响,淫羊藿苷均能达到较好的分离,且都能达到中国药典的相关要求。
9 样品测定 按制剂质量标准(草案)制备供试品溶液和对照品溶液,分别进样,记录色谱图,按下式计算含量(结果见表26):
C对:对照品溶液浓度
V对:对照品进样体积
V样:供试品进样体积
A样:供试品峰面积
A对:对照品峰面积
W样:供试品取样量
10样品含量限度
淫羊藿苷 从10批天麻灵芝颗粒样品测定结果可见,各批号样品中天麻素提取率均在100%以上(可能是药材质量较好的原因),故制剂中天麻素提取率按不低于100%计。每袋制剂中淫羊藿苷含量限度计算如下: 淫羊藿苷含量限度=制剂含淫羊藿药材(g)×淫羊藿药材含淫羊藿苷限度×转移率×3.1(g)/制备量(g)=100g×0.50%×100%×3.1g×1000/1000g=1.55mg/粒,故暂定本品每袋含天麻以天麻素(C33H40O15)计,不得少于1.55mg。
本发明的有益效果在于:本发明提供了一种天麻灵芝颗粒的检测方法,包括以有效成分天麻素和淫羊藿苷为指标,采用高效液相色谱法测定天麻素和淫羊藿苷的含量;以及药物中天麻、淫羊藿和/或灵芝的薄层色谱(TLC)鉴别方法;所述检测方法准确,灵敏度高,重复性好,检测结果稳定,可有效控制天麻灵芝颗粒的质量,既更有利于生产厂家和监督管理部门对产品质量的监测,也可以为医疗部门和患者的治疗提供更好的保障。