CN106918674B - 一种治疗腰膝酸痛、坐骨神经痛的中药组合物的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种治疗腰膝酸痛、坐骨神经痛的中药组合物的检测方法，所述中药组合物的原料包括狗脊、金樱子、鸡血藤、千斤拔、黑老虎、牛大力、女贞子、桑寄生、菟丝子、延胡索、两面针、乳香和没药；所述检测方法包括采用高效液相色谱法测定黑老虎中(2′S)‑南五味子木质素J的含量；还可以包括高效液相色谱法测定女贞子中特女贞苷的含量，采用薄层色谱法检测黑老虎、狗脊和桑寄生。本发明还具体公开各个检测方法的条件和具体操作步骤。本发明提供的检测方法定性、定量检测的原料药总数达到5种，占原料药总数的三分之一，从而更有效地保证药品质量，满足医疗需求。

Description

一种治疗腰膝酸痛、坐骨神经痛的中药组合物的检测方法

技术领域

本发明属于分析化学领域，具体涉及一种治疗腰膝酸痛、坐骨神经痛的中药组合物的检测方法，所述的中药组合物是舒筋健腰丸。

背景技术

舒筋健腰丸收载于《中华人民共和国卫生部药品标准》中药成方制剂第十二册，标准号为WS₃-B-2441-97。舒筋健腰丸由狗脊、金樱子、鸡血藤、千斤拔、黑老虎、牛大力、女贞子、桑寄生、菟丝子、延胡索、两面针、乳香、没药等十三味药制成，具有补益肝肾，强健筋骨，驱风除湿，活络止痛的作用，用于治疗腰膝酸痛、坐骨神经痛。

在现行药品标准中，对本品进行了显微鉴别，理化鉴别以及狗脊和没药的薄层色谱鉴别。其中理化鉴别采用生物碱沉淀反应，只能说明制剂中含有生物碱这一类成分，没有专属性。狗脊的薄层鉴别色谱特征图谱分离不好，特征点不清晰。本品种现行标准没有指标成分的含量测定。

因此，有必要制定出更有针对性、更能反映舒筋健腰丸质量的检测方法，从而提升其质量标准，更好地保障患者用药安全。

发明内容

针对上述问题，本发明的一个目的在于提供一种舒筋健腰丸的检测方法。该检测方法包括了对黑老虎中(2′S)-南五味子木质素J(C₂₇H₃₄O₈)的含量测定和女贞子中特女贞苷(C₃₁H₄₂O₁₇)的含量测定，还包括狗脊、黑老虎和桑寄生的薄层色谱鉴别。相较现行的质量标准，本发明提供的检测方法对药品特征成分的监测更全面：现有技术中的质量标准仅有没药和狗脊两味药的薄层鉴别，本发明的检测方法不仅优化了狗脊薄层色谱鉴别方法，而且增加了定量检测黑老虎和女贞子的特征成分，以及定性鉴别黑老虎、桑寄生的方法，从而对原料药的检测数量达到了5味。本发明的检测方法专属性强，重现性良好，有利于实现对舒筋健腰丸成品质量的有效控制。

为了实现上述发明目的，本发明采用了如下的技术方案。

一种治疗腰膝酸痛、坐骨神经痛的中药组合物的检测方法，所述中药组合物的原料包括狗脊、金樱子、鸡血藤、千斤拔、黑老虎、牛大力、女贞子、桑寄生、菟丝子、延胡索、两面针、乳香和没药；所述检测方法包括采用高效液相色谱法测定黑老虎中(2′S)-南五味子木质素J的含量。

优选的，所述高效液相色谱法测定黑老虎中(2′S)-南五味子木质素J的含量的色谱条件如下：

填充剂：十八烷基硅烷键合硅胶；

柱温：30℃；

检测波长：214nm；

流动相：体积比为60～80:20～40的乙腈-水，或体积比为60～90:10～40的甲醇-水；更优选为体积比为70:30的乙腈-水；

流速：1ml/min；

理论板数按(2′S)-南五味子木质素J峰计算应不低于2500。

上述高效液相色谱法测定黑老虎中(2′S)-南五味子木质素J的含量的具体操作步骤为：

1)对照品溶液的制备：取(2′S)-南五味子木质素J对照品，精密称定，加乙醇制成每1ml含(2′S)-南五味子木质素J 6～30μg的溶液，即得；

2)供试品溶液的制备：取所述中药组合物，研细，取2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入95％乙醇50ml，称定重量，功率250W、频率40kHz超声处理45分钟，放冷，再称定重量，用95％乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；

3)测定：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

优选的，上述检测方法还可以包括高效液相色谱法测定女贞子中特女贞苷的含量。

优选的，所述高效液相色谱法测定女贞子中特女贞苷的色谱条件如下：

填充剂：十八烷基硅烷键合硅胶；

柱温：30℃；

检测波长：224nm；

流动相：体积比为10～30:90～70的乙腈-水，或体积比为20～45:80～55的甲醇-水；更优选为体积比为17:83的乙腈-水；

理论板数按特女贞苷峰计算应不低于2500。

上述高效液相色谱法测定女贞子中特女贞苷的含量的具体操作步骤为：

1)对照品溶液的制备：取特女贞苷对照品，精密称定，加体积百分比浓度为80％的甲醇水溶液制成每1ml含20～80μg的溶液，即得；

2)供试品溶液的制备：取所述中药组合物，研细，取5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入体积百分比浓度为80％的甲醇水溶液50ml，称定重量，超声处理(功率250W、频率40kHz)30分钟，放冷，再称定重量，用体积百分比浓度为80％的甲醇水溶液补足减失的重量，摇匀，滤过；取续滤液20ml，蒸干，残渣用体积百分比浓度为80％的甲醇水溶液5ml使溶解，加在中性氧化铝柱上，用80％甲醇50～100ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加体积百分比浓度为80％的甲醇水溶液使溶解并定容至10ml，滤过，取续滤液，即得；其中所述中性氧化铝柱内径1.5cm，内装5g 100～200目中性氧化铝；

3)测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

上述高效液相色谱法测定女贞子中特女贞苷的含量的操作步骤中，所述供试品溶液还可以通过如下方法制备：

取所述中药组合物，研细，取2.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入体积百分比浓度为70％的甲醇水溶液50ml，密塞，称定重量，功率250W、频率40kHz超声处理45分钟，放冷，再称定重量，用体积百分比浓度为70％的甲醇水溶液补足减失的重量，摇匀，滤过；精密量取续滤液20ml，置蒸发皿中，水浴蒸干，残渣用甲醇溶解，与3g 100～200目硅胶搅拌均匀，蒸干，干法上硅胶柱(柱层析用，100～200目,5g)，先用1,2-二氯乙烷50ml洗脱，弃去洗脱液，继用体积比为3:1的1，2-二氯乙烷-甲醇混合溶剂80ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣用体积百分比浓度为70％的甲醇水溶液溶解并定容至5ml，即得。

优选的，上述检测方法还可以包括薄层色谱法检测黑老虎。

优选的，所述薄层色谱法检测黑老虎的色谱条件如下：

采用硅胶G薄层板，以体积比为5:1:0.2的甲苯-丙酮-甲酸混合溶剂为展开剂，预饱和10分钟；以10％硫酸乙醇溶液为显色剂，紫外光灯365nm下检视。

优选的，上述薄层色谱法检测黑老虎的操作步骤为：

1)供试品溶液制备：取所述中药组合物4g，研细，置具塞锥形瓶中，加水10ml润湿，再加醋酸乙酯50ml，超声处理30分钟，冷却，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇2ml使溶解，即得；

2)对照药材溶液的制备：取黑老虎对照药材2g，粉碎，置具塞锥形瓶中，加水10ml润湿，再加醋酸乙酯50ml，超声处理30分钟，冷却，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇2ml使溶解，即得；

3)检测：吸取上述两种溶液各2μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以体积比为5:1:0.2的甲苯-丙酮-甲酸为展开剂，预饱和10分钟，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，置紫外光灯365nm下检视，供试品色谱中，是否在与黑老虎对照药材色谱相应的位置上，显相同的墨绿色斑点。

优选的，上述检测方法还可以包括薄层色谱法检测狗脊。

优选的，所述薄层色谱法检测狗脊的色谱条件如下：

采用硅胶G薄层板，以体积比为5:1:0.2的甲苯-丙酮-甲酸混合溶剂为展开剂，紫外光灯365nm下检视。

上述薄层色谱法检测狗脊的操作步骤为：

1)供试品溶液制备：取所述中药组合物3.5g，研细，加入盐酸乙醇溶液50ml，超声30分钟，滤液蒸干，用5ml甲醇超声使溶解，过滤，取续滤液，即得；其中，所述盐酸乙醇溶液的配制方法为：取1.35ml分析纯的浓盐酸用95％乙醇稀释至100ml；

2)对照药材溶液的制备：取狗脊对照药材2g，粉碎，加入所述盐酸乙醇溶液50ml，超声30分钟，滤液蒸干，用5ml甲醇超声使溶解，过滤，取续滤液，即得；

3)检测：吸取上述两种溶液各4μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以体积比为5:1:0.2的甲苯-丙酮-甲酸为展开剂，预饱和10分钟，展开，取出，晾干，置紫外光灯365nm下检视，供试品色谱中，是否在与狗脊对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。

优选的，上述检测方法还可以包括薄层色谱法检测桑寄生。

优选的，所述薄层色谱法检测桑寄生的色谱条件如下：

采用硅胶G薄层板，以体积比8:2:0.5的三氯甲烷-甲醇-甲酸混合溶剂为展开剂，以5％三氯化铝乙醇溶液为显色剂，105℃加热至斑点显色清晰，置紫外光灯365nm下检视。

上述薄层色谱法检测桑寄生的具体操作步骤为：

1)供试品溶液制备：取本发明所述中药组合物10g，研细，加水5ml使润湿，再加乙酸乙酯60ml，浸泡过夜，超声处理30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇0.5ml使溶解，即得；

2)对照药材溶液制备：取桑寄生对照药材1g，加水2ml使润湿，再加乙酸乙酯30ml，浸泡过夜，超声处理30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇0.5ml使溶解，即得；

3)检测：吸取上述两种溶液各8μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以体积比8:2:0.5的三氯甲烷-甲醇-甲酸混合溶剂为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5％三氯化铝乙醇溶液，105℃加热至斑点显色清晰，置紫外光灯365nm下检视；供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同的绿色荧光斑点。

本发明的所述检测方法中的各检测项并不需要按照固定的顺序进行。

上述治疗腰膝酸痛、坐骨神经痛的中药组合物，除所述原料药外，还可以包括药学上可以接受的辅料，制成临床上可以接受的制剂。

所述药学上可以接受的辅料可以选自炼蜜、水、淀粉、糊精、预胶化淀粉、乳糖、微晶纤维素、硫酸钙、磷酸氢钙、碳酸钙、氧化镁、碳酸镁、氢氧化铝凝胶、β-环糊精、甘露醇、山梨醇、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、羟甲基纤维素钠、羧甲基淀粉钠、低取代羟丙基纤维素、交联聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇和十二烷基硫酸钠中的一种或多种。

所述临床上可以接受的制剂选自丸剂、片剂、胶囊剂、颗粒剂、散剂或口服液。优选的，所述制剂为上述治疗腰膝酸痛、坐骨神经痛的中药组合物为浓缩水蜜丸。

作为本发明的一个优选的实施方式，本发明所述治疗腰膝酸痛、坐骨神经痛的中药组合物为舒筋健腰丸，原料药组成为：

狗脊600重量份，金樱子192重量份，鸡血藤360重量份，千斤拔144重量份，黑老虎360重量份，牛大力240重量份，蒸女贞子30重量份，蒸桑寄生180重量份，盐制菟丝子30重量份，制延胡索26重量份，两面针26重量份，制乳香12重量份，制没药20重量份；

通过如下方法制备：

以上十三味，狗脊、金樱子、鸡血藤、千斤拔、黑老虎的木部加水煎煮二次，滤过，合并滤液，浓缩成稠膏；其余牛大力、蒸女贞子、蒸桑寄生、盐制菟丝子、制延胡索、两面针、制乳香、制没药及黑老虎的皮部共粉碎成粗粉，加入上述稠膏，混匀，干燥，粉碎成细粉，过筛，混匀；每100g粉末用炼蜜35～40g与水泛丸，用黑氧化铁包衣，干燥，打光，即得。

对于上述舒筋健腰丸，在进行上述各项检测的同时，还可以进行常规检测，如形状的观察和显微鉴别，即：取舒筋健腰丸成品，置显微镜下观察，应见：嵌晶纤维近无色，直径30～50μm，壁极厚，胞腔浅形或不明显，纤维壁外层密嵌细小草酸钙方晶；石细胞近无色，类方形，直径14～76μm，大多三面壁厚，胞腔靠一侧，常含草酸钙方晶或棕色团块状物。

上述舒筋健腰丸还应符合中国药典丸剂项下有关的各项规定。

现有技术中，舒筋健腰丸的检测方法全部为定性检测，包括常规的显微鉴别、碘化铋钾定性鉴别生物碱的反应、以及薄层色谱法检测狗脊和没药。碘化铋钾鉴别反应结果假阳性或假阴性几率大；即使不受干扰，其结果并不能给出生物碱来源的任何信息，即无法直接反映本发明所述中药组合物原料药的组成和质量。薄层色谱法检测狗脊时，还存在供试品色谱中的斑点不清楚的问题。与现有技术相较，本发明具有如下有益技术效果：

1.本发明的检测方法增加了对主要原料药——黑老虎和女贞子特征成分的定量检测，能更加有效控制产品质量。试验过程可操作性强，经过方法学考察证明本法灵敏度高，重复性好，回收率良好，可以作为控制所述中药组合物内在质量的方法之一。

2.从供试品溶液制备、薄层色谱展开剂、显色方法和显色剂等方面改进了狗脊的薄层色谱检测方法，供试品色谱中的斑点更清楚、显色方法更简单。通过上述改进，提高了结果的准确性。

3.增加了桑寄生和黑老虎的薄层色谱鉴别，使定性、定量检测的原料药总数达到5种，占原料药总数的三分之一，从而更有效地保证药品质量，满足医疗需求。

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：

图1显示的是实施例1中的薄层色谱照片，其中：1是批号AX7721的舒筋健腰丸，2是批号AX7771的舒筋健腰丸，3是批号VO6013的舒筋健腰丸，4是狗脊对照药材，5是阴性样品。

图2显示的是对比例1中的薄层色谱照片，其中：1是批号AX7721的舒筋健腰丸，2是批号AX7771的舒筋健腰丸，3是批号VO6013的舒筋健腰丸，4是狗脊对照药材，5是阴性样品。

图3显示的是实施例2中的薄层色谱照片，其中：1是批号AX7721的舒筋健腰丸，2是批号AX7771的舒筋健腰丸，3是批号VO6013的舒筋健腰丸，4是黑老虎对照药材，5是阴性样品。

图4显示的实施例4中的薄层色谱照片，其中：1是批号AX7721的舒筋健腰丸，2是批号AX7771的舒筋健腰丸，3是桑寄生对照药材，4是批号VO6013的舒筋健腰丸，5是阴性样品。

图5显示的是实施例5中提取溶剂考察试验的高效液相色谱图，其中：图5a以甲醇为提取溶剂，图5b以乙醇为提取溶剂，图5c以70％乙醇为提取溶剂，图中标注1的吸收峰为(2′S)-南五味子木质素J的吸收峰。各图的横坐标表示时间，单位为min，纵坐标表示电信号，单位mAU。

图6显示的是实施例5中黑老虎阴性样品的高效液相色谱图。图中横坐标表示时间，单位为min，纵坐标表示电信号，单位mAU。

图7显示的是实施例5中(2′S)-南五味子木质素J对照品的高效液相色谱图；图中标注1的吸收峰为(2′S)-南五味子木质素J的吸收峰。图中横坐标表示时间，单位为min，纵坐标表示电信号，单位mAU。

图8显示的是实施例5批号FU4901的舒筋健腰丸的高效液相色谱图，图中标注1的吸收峰为(2′S)-南五味子木质素J的吸收峰。图中横坐标表示时间，单位为min，纵坐标表示电信号，单位mAU。

图9显示的是实施例8中女贞子阴性样品的高效液相色谱图。图中横坐标表示时间，单位为min，纵坐标表示电信号，单位mAU。

图10显示的是实施例8中特女贞苷对照品的高效液相色谱图；图中标注2的吸收峰为特女贞苷的吸收峰。图中横坐标表示时间，单位为min，纵坐标表示电信号，单位mAU。

图11显示的是实施例8中批号FU4901的舒筋健腰丸的高效液相色谱图；图中标注2的吸收峰为特女贞苷的吸收峰。图中横坐标表示时间，单位为min，纵坐标表示电信号，单位mAU。

具体实施方式

以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的药材原料、试剂材料等，如无特殊说明，均为市售购买产品。

其中，所用的供试品都是广州白云山陈李济药厂有限公司生产的舒筋健腰丸(在以下各实施例中均简称“本品”)，其为黑色的包衣浓缩水蜜丸，除去包衣后显黑褐色；味甘、涩、微苦。原料药处方为：

狗脊600g，金樱子192g，鸡血藤360g，千斤拔144g，黑老虎360g，牛大力240g，蒸女贞子30g，蒸桑寄生180g，盐制菟丝子30g，制延胡索26g，两面针26g，制乳香12g，制没药20g；

通过如下方法制备：

以上十三味，狗脊、金樱子、鸡血藤、千斤拔、黑老虎的木部加水煎煮二次，滤过，合并滤液，浓缩成稠膏；其余牛大力、蒸女贞子、蒸桑寄生、盐制菟丝子、制延胡索、两面针、制乳香、制没药及黑老虎的皮部共粉碎成粗粉，加入上述稠膏，混匀，干燥，粉碎成细粉，过筛，混匀；每100g粉末用炼蜜35～40g与适量水泛丸，用黑氧化铁包衣，干燥，打光，即得。

另外，按照上述舒筋健腰丸的原料药处方及制备方法，分别制备不含狗脊的阴性样品，不含黑老虎的阴性样品，不含桑寄生的阴性样品和不含女贞子的阴性样品。

实施例1薄层色谱法检测狗脊

1)供试品溶液的制备：分别取批号为AX7721、AX7771和VO6013的本品3.5g，研细，加入盐酸乙醇溶液(1.35→100)50ml，超声30分钟，滤液蒸干，用5ml甲醇超声使溶解，过滤，作为供试品溶液。

2)对照药材溶液的制备：取狗脊对照药材2g，按照步骤1相同的方法制成对照药材溶液。

3)阴性样品溶液的制备：取不含狗脊的阴性样品，按照供试品溶液相同的步骤和方法制备得到阴性样品溶液。

4)检测：照薄层色谱法(《中国药典》2010年版一部附录VI B)试验，吸取上述各种溶液各4μl，分别点于同一硅胶G预制薄层板上，以甲苯-丙酮-甲酸(5:1:0.2)为展开剂，预饱和10分钟，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。见附图1。

对比例1薄层色谱法检测狗脊

1)供试品溶液的制备：分别取批号为AX7721、AX7771和VO6013的本品15g，研细，加入乙醚50ml，浸渍并时时振摇约一小时，滤过，滤液挥去乙醚，残渣用乙醚2ml溶解，作为供试品溶液。

2)对照药材溶液的制备：取狗脊对照药材5g，按照步骤1相同的方法制成对照药材溶液。

3)阴性样品溶液的制备：取不含狗脊的阴性样品，按照供试品溶液相同的步骤和方法制备得到阴性样品溶液。

4)检测：照薄层色谱法(《中国药典》2010年版一部附录VI B)试验，吸取上述两种溶液各10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以氯仿-醋酸乙酯-甲酸(8:2:0.1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5％三氯化铁的0.5mol/L盐酸溶液(必要时加热使显色)。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同的墨绿色斑点。见附图2。

与图1比较，图2中供试品色谱斑点不太清晰。说明本发明对狗脊薄层色谱检测方法改进后，供试品色谱斑点清晰，结果更显著。

实施例2薄层色谱法检测黑老虎

1)供试品溶液的制备：分别取批号为AX7721、AX7771和VO6013的本品4g，研细，置具塞锥形瓶中，加水10ml润湿，再加醋酸乙酯50ml，超声处理30分钟，冷却，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇2ml使溶解，作为供试品溶液。

2)对照药材溶液的制备：取黑老虎对照药材2g,按照步骤1相同的方法制成对照药材溶液。

3)阴性样品溶液的制备：取不含黑老虎的阴性样品，按照供试品溶液相同的步骤和方法制备得到阴性样品溶液。

4)检测：照薄层色谱法(《中国药典》2010年版一部附录VI B)试验，吸取上述两种溶液各2μl，分别点于同一硅胶G预制薄层板上，以甲苯-丙酮-甲酸(5:1:0.2)为展开剂，预饱和10分钟，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，置紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。见附图3。

实施例3薄层色谱法检测桑寄生

1)供试品溶液的制备：分别取批号为AX7721、AX7771和VO6013的本品10g，研细，加水5ml使润湿，再加乙酸乙酯60ml，浸泡过夜，超声处理30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇0.5ml使溶解，作为供试品溶液。

2)对照药材溶液的制备：取桑寄生对照药材1g，加水2ml使润湿，再加乙酸乙酯30ml，按照步骤1相同的方法制成对照药材溶液。

3)阴性样品溶液的制备：取不含桑寄生的阴性样品，按照供试品溶液相同的步骤和方法制备得到阴性样品溶液。

4)检测：照薄层色谱法(《中国药典》2010年版一部附录VI B)试验，吸取上述两种溶液各8μl，分别点于同一硅胶G预制薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-甲酸(8:2:0.5)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5％三氯化铝乙醇溶液，105℃加热至斑点显色清晰，置紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同的绿色荧光斑点。见附图4。

实施例4高效液相色谱法测定黑老虎中(2′S)-南五味子木质素J的含量

色谱条件:

Waters 2695型高效液相色谱仪；Waters 2487DualλAbsorbance Detector；

色谱柱：Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C₁₈,5μm,4.6×250mm；

柱温：30℃；

检测波长：214nm；

流动相：乙腈-水(70:30)；

流速：1ml/min；

理论板数按(2′S)-南五味子木质素J峰计算应不低于2500。

具体操作步骤为：

1)对照品溶液的制备：取(2′S)-南五味子木质素J对照品(纯度为98.7％)适量，精密称定，加乙醇制成每1ml含(2′S)-南五味子木质素J 9.45μg的溶液，即得。

2)供试品溶液的制备：取本品适量，研细，取约2.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入乙醇50ml，称定重量，超声处理(功率250W，频率40kHz)45分钟，放冷，再称定重量，用乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

3)测定法：照高效液相法(《中国药典》2010年版一部附录ⅥD)，分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

本品每1g含黑老虎以(2′S)-南五味子木质素J计，不得少于0.25mg。

实施例5高效液相法测定黑老虎中(2′S)-南五味子木质素J含量的方法学考察

所用仪器为Waters 2695型高效液相色谱仪；Waters 2487DualλAbsorbanceDetector；Agilent 1200型高效液相色谱仪；SB-5200DTD超声波处理器(宁波新芝生物科技股份有限公司)；紫外光谱仪:UV-2450(SHIMADZU)。

1.色谱条件与系统适用性试验

1.1流动相的选择

考察了不同比例的甲醇-水和乙腈-水系统，结果以乙腈-水(70:30)为流动相，供试品中(2′S)-南五味子木质素J峰达到基线分离，峰形对称，保留时间适中(约18分钟)，理论板数为5482，因此，选用乙腈-水(70:30)为流动相。

1.2测定波长的选择

取(2′S)-南五味子木质素J对照品的乙醇溶液(0.05mg/ml)，在紫外分光光度计200～380nm波长间扫描。结果，在214nm波长处有最大吸收，故选择214nm为本品的测定波长。

1.3色谱柱

Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C₁₈,5μm,4.6×250mm色谱柱。

2.色谱条件的考察

2.1提取溶剂的考察

考察五种溶剂的提取效果，分别是甲醇、95％乙醇、70％乙醇(其中的浓度都是体积百分比浓度)。

取同一批号的舒筋健腰丸(批号:FA1071)粉末分别称取3份，每份2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入溶剂50ml，密塞，称定重量，超声处理45分钟，放冷，再称定重量，用溶剂补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。

取上述供试品溶液，分别按含量测定方法测定(2′S)-南五味子木质素J的含量。测定结果见表1，图谱见附图5a～5c。

表1不同提取溶剂的试验结果(n＝2)

上述不同溶剂的提取效果基本相当，结合附图可以看出用95％乙醇提取杂质峰峰高相对较小。因此，选用95％乙醇作为提取溶剂。

2.2提取方法的选择

同一批号的舒筋健腰丸(批号:FA1071)粉末分别称取2份，每份2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入95％乙醇50ml，密塞，称定重量，其中1份回流提取2小时，另外1份超声提取45分钟,放冷，再称定重量，用95％乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。

取上述供试品溶液，分别按含量测定方法测定(2′S)-南五味子木质素J的含量。结果见表2。

表2不同提取方法的试验结果(n＝2)

结果显示，超声提取和回流提取效果相似，但超声提取操作更方便，因此，选择超声提取。

2.3超声提取时间的选择

同一批号的舒筋健腰丸(批号:FA1071)粉末分别称取3份，每份2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入95％乙醇50ml，密塞，称定重量，超声时间分别为30分钟、45分钟、60分钟，放冷，再称定重量，用95％乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。

取上述供试品溶液，分别按含量测定方法测定(2′S)-南五味子木质素J的含量，结果见表3。

表3不同提取时间的试验结果(n＝2)

结果表明超声提取45分钟的提取效果最好，长时间超声并不能提高检测成分的提取率。因此优选超声时间为45分钟。

2.4不同规格色谱柱的比较

取同一对照品溶液、供试品溶液，按含量测定方法操作，比较Waters AtlantisT35μm 4.6×250mm色谱柱(A)、Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C₁₈(250×4.6mm,5μm)色谱柱(B)和phenomenex luna C₁₈(250×4.6mm,5μm)色谱柱(C)测定得到的(2′S)-南五味子木质素J含量，结果见表4。

表4不同色谱柱的考察(n＝2)

试验表明，使用不同生厂商的色谱柱进行分析，色谱峰都能达到基线分离，峰形对称，测定结果没有显著性差别。因此，本方法对色谱柱的依赖性小，适用性好。十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱都可以用于本方法。(下面的各项方法学试验及含量测定，都采用Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C₁₈(250×4.6mm,5μm)色谱柱。)

3.方法学验证

3.1专属性:

阴性对照品溶液的制备：取不含黑老虎的阴性样品2g，按实施例5的步骤2制备成阴性对照品溶液。

精密吸取阴性对照品溶液10μl，注入液相色谱仪，按含量测定方法测定。结果未见阴性对照品溶液对试验有干扰。见附图6。

3.2线性考察

精密量取(2′S)-南五味子木质素J对照品溶液(47.12μg/ml)1、2、4、6、8、10ml,置10ml量瓶中，加乙醇至刻度，摇匀，即得每1ml含4.712、9.424、18.848、28.272、37.696、47.12μg的梯度溶液。分别精密吸取10μl，注入液相色谱仪，按含量测定方法测定，以对照品的浓度(μg/ml)为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程:y＝52103x+2600.4，r＝0.9999。结果表明，(2′S)-南五味子木质素J对照品浓度在4.712～47.12μg/ml之间与其峰面积呈良好的线性关系，结果详见表5。

表5线性关系考察结果

3.3范围

本方法的最低限度为每1g含黑老虎以(2′S)-南五味子木质素J计，不得少于0.25mg。故按限度的60％和300％(即0.15～0.75mg/g)考察测定范围的准确度。

范围准确度:取同一批舒筋健腰丸(批号:FA1071，含量0.2847mg/g)粉末共12份，其中低限度组6份，每份0.52g，高限度组6份，每份2.6g，精密称定；按当前取样含量约1:1分别精密加入(2′S)-南五味子木质素J对照品溶液(低限度组0.1428mg/ml×1ml、高限度组0.1428mg/ml×5ml)，按含量测定方法测定，计算(2′S)-南五味子木质素J的回收率。结果见表6。

表6范围准确度试验结果

测定结果显示：低限度组平均回收率为98.98％，RSD＝0.64％；高限度组平均回收率为99.28％,RSD＝0.83％。根据线性、精密度和准确度的试验结果，本方法适合检测含量在6～30μg/ml浓度范围的供试品溶液。

3.4耐用性

3.4.1稳定性试验

取同一份供试品溶液，按含量测定方法，分别在0、2、4、6、8、12、24小时进样测定。结果供试品溶液自制备后24小时内测定基本稳定，详见表7。

表7稳定性试验结果(批号：FA1071)

3.4.2重复性试验

舒筋健腰丸(批号:FA1071)粉碎，取粉末共6份，每份约2g，精密称定，按实施例5的步骤2所述的方法制备供试品溶液，测定，即得。结果见表8。

表8重复性试验结果(批号:FA1071)

结论：重复性试验的RSD为1.14％，说明本发明重复性良好。

3.5回收率

3.5.1加样回收用(2′S)-南五味子木质素J母液的制备

精密称取(2′S)-南五味子木质素J对照品14.28mg，置100ml量瓶，加95％乙醇适量使溶解，并稀释至刻度，摇匀，作为回收用(2′S)-南五味子木质素J对照品母液(每1ml含(2′S)-南五味子木质素J0.1428mg)。

3.5.2回收供试品溶液的制备:

舒筋健腰丸(批号:FA1071，含(2′S)-南五味子木质素J0.2847mg/g)粉碎，称取粉末共6份，每份约1g，精密称定，分别置具塞锥形瓶中，精密加入上述回收用(2′S)-南五味子木质素J母液2ml，再精密加入95％乙醇50ml，称定重量，超声处理(功率250W，频率40kHz)45分钟，放冷，再称定重量，用95％乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

3.5.3测定

照高效液相法(《中国药典》2010年版一部附录ⅥD)，精密吸取回收供试品溶液10μl，注入液相色谱仪，测定，计算回收率，结果见表9。

表9回收试验测定结果

3.5.4结论

平均回收率为98.88％，RSD为1.49％。结果表明，本方法具有良好的回收率。

4.样品含量测定

取不同生产批号(广州白云山陈李济药厂有限公司生产)的舒筋健腰丸，按含量测定方法操作，测定，结果见表10，其中对照品色高效液相色谱图见附图7，批号FU4901的舒筋健腰丸的高效液相色谱图见附图8。

表10十批含量测定结果

5.含量限度的确定

根据以上10批样品的测定结果，(2′S)-南五味子木质素J的含量在0.2791～0.4658mg之间，考虑生产过程中的损耗等不稳定因素，故规定本品每1g含黑老虎以(2′S)-南五味子木质素J计，不得少于0.25mg。

实施例6高效液相色谱法测定女贞子中特女贞苷的含量

色谱条件:

Agilent 1200型高效液相；Waters 2487DualλAbsorbance Detector；

色谱柱：Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C₁₈(250×4.6mm,5μm)；

柱温：30℃；

检测波长：224nm；

流动相：乙腈-水(17:83)；

流速：1ml/min；

理论板数按特女贞苷峰计算应不低于2500。

具体操作步骤为：

1)对照品溶液的制备：取特女贞苷对照品(批号：111926-201102，中国食品药品检定研究院)适量，精密称定，加80％甲醇制成每1ml含62.34μg的溶液，即得。

2)供试品溶液的制备：取本品适量，研细，取约5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入80％甲醇50ml，称定重量，超声处理(功率250W，频率40kHz)30分钟，放冷，再称定重量，用80％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液20ml，蒸干，残渣用80％甲醇5ml使溶解，加在中性氧化铝柱(100～200目，5g，内径约1.5cm)上，用80％甲醇70ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加80％甲醇使溶解，转移至10ml量瓶中，加80％甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

3)测定法：照高效液相法(《中国药典》2010年版一部附录ⅥD)，分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

本品每1g含女贞子以特女贞苷(C₃₁H₄₂O₁₇)计，不得少于0.15mg。

实施例7高效液相色谱法测定女贞子中特女贞苷的含量

色谱条件:

Agilent 1200型高效液相；Waters 2487DualλAbsorbance Detector；

色谱柱：Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C₁₈(250×4.6mm,5μm)；

柱温：30℃；

检测波长：224nm；

流动相：乙腈-水(17:83)；

流速：1ml/min；

理论板数按特女贞苷峰计算应不低于2500。

具体操作步骤为：

1)对照品溶液的制备：取特女贞苷对照品(批号：111926-201102，中国食品药品检定研究院)适量，精密称定，加80％甲醇制成每1ml含62.34μg的溶液，即得。

2)供试品溶液的制备：取本品适量，研细，取约2.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70％甲醇50ml，密塞，称定重量，超声处理45分钟(功率250W，频率40kHz)，放冷，再称定重量，用70％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过。精密量取续滤液20ml，置蒸发皿中，水浴蒸干，残渣用适量甲醇溶解，拌硅胶(柱层析用，100～200目)3g，蒸干，干法上硅胶柱(柱层析用，100～200目,5g)，用1，2-二氯乙烷50ml洗脱，弃去洗脱液，继用1，2-二氯乙烷:甲醇(3:1)的混合溶剂80ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣用70％甲醇溶解并转移至5ml量瓶中，加70％甲醇至刻度，摇匀，即得。

3)测定法：照高效液相法(《中国药典》2010年版一部附录ⅥD)，分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

本品每1g含女贞子以特女贞苷(C₃₁H₄₂O₁₇)计，不得少于0.15mg。

实施例8高效液相法测定女贞子中特女贞苷含量的方法学考察

所用仪器为Waters 2695型高效液相色谱仪；Waters 2487DualλAbsorbanceDetector；SB-5200DTD超声波处理器(宁波新芝生物科技股份有限公司)；紫外光谱仪:UV-2450(SHIMADZU)。

1.色谱条件与系统适用性试验

1.1流动相的选择

考察了不同比例的甲醇-水和乙腈-水系统，结果以乙腈-水(17:83)为流动相，供试品中特女贞苷峰达到基线分离，峰形对称，保留时间适中(约17分钟)，因此，选用乙腈-水(17:83)为流动相。

1.3色谱柱

Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C₁₈,5μm,4.6×250mm色谱柱。

2.色谱条件的考察

2.1提取溶剂的考察

考察五种溶剂的提取效果，分别是甲醇、80％甲醇、70％甲醇、95％乙醇、稀乙醇(其中的浓度都是体积百分比浓度)。

取同一批号的舒筋健腰丸(批号:FW7851)粉末，分别称取5份，每份5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入溶剂50ml，密塞，称定重量，超声处理45分钟，放冷，再称定重量，用溶剂补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液20ml，蒸干，残渣用80％甲醇5ml使溶解，加在中性氧化铝柱(100～200目，5g，内径约1.5cm)上，用80％甲醇100ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加80％甲醇使溶解，转移至10ml量瓶中，加80％甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

取上述供试品溶液，分别按含量测定方法测定特女贞苷的含量。测定结果见表11。

表11不同提取溶剂的试验结果(n＝2)

上述不同溶剂的提取结果可以看出，甲醇和乙醇提取的效果相对较差，而80％甲醇、70％甲醇和稀乙醇提取效果基本相当。但稀乙醇提取液不易过滤，不方便操作。80％甲醇和70％甲醇相比较，80％甲醇的提取液过柱后相对浸膏量较少，杂质较少，因此选择80％甲醇作为提取溶剂。

2.2超声提取时间的选择

同一批号的舒筋健腰丸(批号:FW7851)粉末，分别称取3份，每份5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入80％甲醇50ml，密塞，称定重量，超声时间分别为30分钟、45分钟、60分钟，放冷，再称定重量，用溶剂补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液20ml，蒸干，残渣用80％甲醇5ml使溶解，加在中性氧化铝柱(100～200目，5g，内径约1.5cm)上，用80％甲醇100ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加80％甲醇使溶解，转移至10ml量瓶中，加80％甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

取上述供试品溶液，分别按含量测定方法测定特女贞苷的含量，结果见表12。

表12不同提取时间的试验结果(n＝2)

结果表明超声提取30分钟、45分钟、60分钟的提取效果基本一致，长时间超声并不能提高检测成分的提取率。因此优选超声时间为30分钟。

2.3氧化铝柱洗脱溶剂用量的选择

同一批号的舒筋健腰丸(批号:FW7851)粉末，分别称取4份，每份5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入80％甲醇50ml，密塞，称定重量，超声时间30分钟，放冷，再称定重量，用溶剂补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液20ml，蒸干，残渣用80％甲醇5ml使溶解，加在中性氧化铝柱(100～200目，5g，内径约1.5cm)上，分别用80％甲醇30ml、50ml、70ml、100ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加80％甲醇使溶解，转移至10ml量瓶中，加80％甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

取上述供试品溶液，分别按含量测定方法测定特女贞苷的含量，结果见表13。

表13不同洗脱溶剂用量的试验结果(n＝2)

结果表明洗脱溶剂用量70ml基本可以达到洗脱要求，含量增加不明显，因此优选洗脱溶剂用量为70ml。

2.4不同规格色谱柱的比较

取同一对照品溶液、供试品溶液，按含量测定方法操作，比较Waters AtlantisT35μm 4.6×250mm色谱柱(A)、Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C₁₈(250×4.6mm,5μm)色谱柱(B)和phenomenex luna C₁₈(250×4.6mm,5μm)色谱柱(C)测定得到的特女贞苷含量，结果见表14。

表14不同色谱柱的考察(n＝2)

试验表明，使用不同生厂商的色谱柱进行分析，色谱峰都能达到基线分离，峰形对称，测定结果没有显著性差别。因此，本方法对色谱柱的依赖性小，适用性好。十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱都可以用于本方法。(下面的各项方法学试验及含量测定，都采用Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C₁₈(250×4.6mm,5μm)色谱柱。)

3.方法学验证

3.1专属性:

阴性对照品溶液的制备：取不含女贞子的阴性样品5g，按实施例6的步骤2制备成阴性对照品溶液。

精密吸取阴性对照品溶液10μl，注入液相色谱仪，按含量测定方法测定。结果未见阴性对照品溶液对试验有干扰。见附图9。

3.2线性考察

精密量取特女贞苷对照品溶液(147.8μg/ml)1、2、4、6、8、10ml,置10ml量瓶中，加80％醇至刻度，摇匀，即得每1ml含14.78、29.56、59.12、88.68、118.24、147.8μg的梯度溶液。分别精密吸取10μl，注入液相色谱仪，按含量测定方法测定，以对照品的浓度(μg/ml)为横坐标，吸收峰峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程:y＝10552x+686.12，r＝0.9996。结果表明，特女贞苷对照品浓度在14.78～147.8μg/ml之间与其峰面积呈良好的线性关系，结果详见表15。

表15线性关系考察结果

3.3范围

本方法的最低限度为每1g含女贞子以特女贞苷计，不得少于0.15mg。故按限度的60％和400％(即0.09～0.60mg/g)考察测定范围的准确度。

范围准确度:取同一批舒筋健腰丸(批号:FW7851，含量0.3262mg/g)粉末共12份，其中低限度组6份，每份0.68g，高限度组6份，每份4.59g，精密称定；按当前取样含量约1:1分别精密加入特女贞苷对照品溶液(低限度组0.3728mg/ml×0.6ml、高限度组0.3728mg/ml×4ml)，按含量测定方法测定，计算特女贞苷的回收率。结果见表16。

表16范围准确度试验结果

测定结果显示：低限度组平均回收率为97.05％，RSD＝1.58％；高限度组平均回收率为98.96％,RSD＝1.14％。根据线性、精密度和准确度的试验结果，本方法适合检测含量在18～120μg/ml浓度范围的供试品溶液。

3.4耐用性

3.4.1稳定性试验

取同一份供试品溶液，按含量测定方法，分别在0、2、4、6、8、12、24小时进样测定。结果供试品溶液自制备后24小时内测定基本稳定，详见表17。

表17稳定性试验结果(批号:FW7851)

3.4.2重复性试验

舒筋健腰丸(批号:FW7851)粉碎，取粉末共6份，每份约5g，精密称定，按实施例6的步骤2所述的方法制备供试品溶液，测定，即得。结果见表18。

表18重复性试验结果(批号:FW7851)

结论：重复性试验的RSD为0.94％，说明本发明重复性良好。

3.5回收率

3.5.1加样回收用特女贞苷母液的制备

精密称取特女贞苷对照品18.64mg，置50ml量瓶，加80％甲醇适量使溶解，并稀释至刻度，摇匀，作为回收用特女贞苷对照品母液(每1ml含特女贞苷0.3728mg)。

3.5.2回收供试品溶液的制备:

舒筋健腰丸(批号:FW7851，含特女贞苷0.3262mg/g)粉碎，称取粉末共6份，每份约2.5g，精密称定，分别置具塞锥形瓶中，精密加入上述回收用特女贞苷母液2.2ml，按含量测定方法测定，计算特女贞苷的回收率。

3.5.3测定

照高效液相法(《中国药典》2010年版一部附录ⅥD)，精密吸取回收供试品溶液10μl，注入液相色谱仪，测定，计算回收率，结果见表19。

表19回收试验测定结果

3.5.4结论

平均回收率为97.65％，RSD为1.07％。结果表明，本方法具有良好的回收率。

4.样品含量测定

取不同生产批号(广州白云山陈李济药厂有限公司生产)的舒筋健腰丸，按含量测定方法操作，测定，结果见表20，其中对照品高效液相色谱图见附图10，批号FU4901的舒筋健腰丸的高效液相色谱图见附图11

表20十批含量测定结果

5.含量限度的确定

根据以上10批样品的测定结果，特女贞苷的含量在0.1657～0.4780mg之间，考虑生产过程中的损耗等不稳定因素，故规定本品每1g含女贞子以特女贞苷计，不得少于0.15mg。

实施例9一种舒筋健腰丸的检测方法

1.高效液相色谱法测定黑老虎中(2′S)-南五味子木质素J的含量

按照实施例4所述方法进行测定。

2.高效液相色谱法测定女贞子中特女贞苷的含量

按照实施例6所述方法进行测定。

3.薄层色谱法检测狗脊

按照实施例1所述方法进行检测。

4.薄层色谱法检测黑老虎

按照实施例2所述方法进行检测。

5.薄层色谱法检测桑寄生

按照实施例4所述方法进行测定。

实施例10一种舒筋健腰丸的检测方法

1.高效液相色谱法测定黑老虎中(2′S)-南五味子木质素J的含量

按照实施例4所述方法进行测定。

2.高效液相色谱法测定女贞子中特女贞苷的含量

按照实施例7所述方法进行测定。

3.薄层色谱法检测狗脊

按照实施例1所述方法进行检测。

4.薄层色谱法检测黑老虎

按照实施例2所述方法进行检测。

5.薄层色谱法检测桑寄生

按照实施例4所述方法进行测定。

以上对本发明具体实施方式的描述并不限制本发明，本领域技术人员可以根据本发明做出各种改变或变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明所附权利要求的范围。

Claims (6)

1.一种治疗腰膝酸痛、坐骨神经痛的中药组合物的检测方法，所述中药组合物的原料包括狗脊、金樱子、鸡血藤、千斤拔、黑老虎、牛大力、女贞子、桑寄生、菟丝子、延胡索、两面针、乳香和没药；所述检测方法包括采用高效液相色谱法测定黑老虎中(2′S)-南五味子木质素J的含量；所述高效液相色谱法测定黑老虎中(2′S)-南五味子木质素J的含量的色谱条件如下：

填充剂：十八烷基硅烷键合硅胶；

柱温：30℃；

检测波长：214nm；

流动相：体积比为60～80:20～40的乙腈-水，或体积比为60～90:10～40的甲醇-水；

流速：1ml/min；

理论板数按(2′S)-南五味子木质素J峰计算应不低于2500；

所述高效液相色谱法测定黑老虎中(2′S)-南五味子木质素J的含量的具体操作步骤为:

1)对照品溶液的制备：取(2′S)-南五味子木质素J对照品，精密称定，加乙醇制成每1ml含(2′S)-南五味子木质素J 6～30μg的溶液，即得；

2)供试品溶液的制备：取所述中药组合物，研细，取2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入95％乙醇50ml，称定重量，功率250W、频率40kHz超声处理45分钟，放冷，再称定重量，用95％乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；

3)测定：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得；

所述检测方法还包括高效液相色谱法测定女贞子中特女贞苷的含量；所述高效液相色谱法测定女贞子中特女贞苷的含量的色谱条件如下：

填充剂：十八烷基硅烷键合硅胶；

柱温：30℃；

检测波长：224nm；

流动相：体积比为10～30:90～70的乙腈-水，或体积比为20～45:80～55的甲醇-水；

理论板数按特女贞苷峰计算应不低于2500；

所述高效液相色谱法测定女贞子中特女贞苷的含量的具体操作步骤为：

1)对照品溶液的制备：取特女贞苷对照品，精密称定，加体积百分比浓度为80％的甲醇水溶液制成每1ml含20～80μg的溶液，即得；

2)供试品溶液的制备：取所述中药组合物，研细，取2.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入体积百分比浓度为70％的甲醇水溶液50ml，密塞，称定重量，功率250W、频率40kHz超声处理45分钟，放冷，再称定重量，用体积百分比浓度为70％的甲醇水溶液补足减失的重量，摇匀，滤过；精密量取续滤液20ml，置蒸发皿中，水浴蒸干，残渣用甲醇溶解，与3g 100～200目硅胶搅拌均匀，蒸干，干法上硅胶柱，先用1,2-二氯乙烷50ml洗脱，弃去洗脱液，继用体积比为3:1的1,2-二氯乙烷-甲醇混合溶剂80ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣用体积百分比浓度为70％的甲醇水溶液溶解并定容至5ml，即得；其中所述硅胶柱装内径1.5cm，内装5g100～200目硅胶；

3)测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述高效液相色谱法测定黑老虎中(2′S)-南五味子木质素J含量，所述流动相为体积比为70:30的乙腈-水。

3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述高效液相色谱法测定女贞子中特女贞苷含量，所述流动相为体积比为17:83的乙腈-水。

4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述检测方法还包括薄层色谱法检测黑老虎；所述薄层色谱法检测黑老虎的色谱条件为：

采用硅胶G薄层板，以体积比为5:1:0.2的甲苯-丙酮-甲酸混合溶剂为展开剂，预饱和10分钟；以10％硫酸乙醇溶液为显色剂，紫外光灯365nm下检视；

所述薄层色谱法检测黑老虎的操作步骤为：

1)供试品溶液制备：取所述中药组合物4g，研细，置具塞锥形瓶中，加水10ml润湿，再加醋酸乙酯50ml，超声处理30分钟，冷却，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇2ml使溶解，即得；

2)对照药材溶液的制备：取黑老虎对照药材2g，粉碎，置具塞锥形瓶中，加水10ml润湿，再加醋酸乙酯50ml，超声处理30分钟，冷却，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇2ml使溶解，即得；

3)检测：吸取上述两种溶液各2μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以体积比为5:1:0.2的甲苯-丙酮-甲酸为展开剂，预饱和10分钟，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，置紫外光灯365nm下检视，供试品色谱中，是否在与黑老虎对照药材色谱相应的位置上，显相同的墨绿色斑点。

5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述检测方法还包括薄层色谱法检测狗脊；所述薄层色谱法检测狗脊的色谱条件为：

采用硅胶G薄层板，以体积比为5:1:0.2的甲苯-丙酮-甲酸混合溶剂为展开剂，紫外光灯365nm下检视；

所述薄层色谱法检测狗脊的操作步骤为：

1)供试品溶液制备：取所述中药组合物3.5g，研细，加入盐酸乙醇溶液50ml，超声30分钟，滤液蒸干，用5ml甲醇超声使溶解，过滤，取续滤液，即得；其中，所述盐酸乙醇溶液的配制方法为：取1.35ml分析纯的浓盐酸用95％乙醇稀释至100ml；

2)对照药材溶液的制备：取狗脊对照药材2g，粉碎，加入所述盐酸乙醇溶液50ml，超声30分钟，滤液蒸干，用5ml甲醇超声使溶解，过滤，取续滤液，即得；

3)检测：吸取上述两种溶液各4μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以体积比为5:1:0.2的甲苯-丙酮-甲酸为展开剂，预饱和10分钟，展开，取出，晾干，置紫外光灯365nm下检视，供试品色谱中，是否在与狗脊对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。

6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述检测方法还包括薄层色谱法检测桑寄生；所述薄层色谱法检测桑寄生的色谱条件为：

采用硅胶G薄层板，以体积比8:2:0.5的三氯甲烷-甲醇-甲酸混合溶剂为展开剂，以5％三氯化铝乙醇溶液为显色剂，105℃加热至斑点显色清晰，置紫外光灯365nm下检视；

所述薄层色谱法检测桑寄生的具体操作步骤为：

1)供试品溶液制备：取所述中药组合物10g，研细，加水5ml使润湿，再加乙酸乙酯60ml，浸泡过夜，超声处理30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇0.5ml使溶解，即得；

2)对照药材溶液制备：取桑寄生对照药材1g，加水2ml使润湿，再加乙酸乙酯30ml，浸泡过夜，超声处理30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇0.5ml使溶解，即得；

3)检测：吸取上述两种溶液各8μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以体积比8:2:0.5的三氯甲烷-甲醇-甲酸混合溶剂为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5％三氯化铝乙醇溶液，105℃加热至斑点显色清晰，置紫外光灯365nm下检视；供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同的绿色荧光斑点。