发明内容
因此,本发明的一个目的是提供一种当归黄芪提取物的制备方法,该方法可以去粗存精,保留当归黄芪原料中的有效部分。
本发明的另一个目的是提供通过本发明方法制备得到的当归黄芪提取物。
本发明的再一个目的是提供本发明的当归黄芪提取物在治疗和/或预防肺纤维化疾病中的用途。
本发明的再一个目的是提供含有本发明的当归黄芪提取物的药物组合物在治疗和/或预防肺纤维化疾病中的用途。
本发明的再一个目的是提供一种药物组合物,该组合物含有本发明方法得到的当归黄芪提取物。
本发明一方面提供了一种当归黄芪提取物的制备方法,该方法包括以下步骤:
a.将当归、黄芪水提醇沉或醇提取得到的提取液通过大孔吸附树脂,并依次用水和醇洗脱,收集醇洗脱液;
b.浓缩所述的醇洗脱液,再经醇沉处理,得到所述的当归黄芪提取物。
作为优选,所述的大孔吸附树脂选自型号为D101的大孔吸附树脂。
优选地,在所述的步骤a中,首先将当归、黄芪水提醇沉或醇提取得到的提取液减压浓缩得浓缩液,接着将所述浓缩液过滤,再将得到的滤液通过大孔吸附树脂,并依次用水和醇洗脱,收集醇洗脱液。
优选地,步骤a中的当归和黄芪的重量比为1∶2-8。
更优选地,步骤a中的当归和黄芪的重量比为1∶3-7。
最优选地,步骤a中的当归和黄芪的重量比为1∶5。
优选地,所述步骤a中的水提醇沉为用丹参黄芪总重量8-12倍的水煎煮1-3次,每次1-3小时,得到提取物,再向提取物中加入乙醇沉淀。
优选地,在所述步骤a中,所述的醇提取为用当归和黄芪总重量6-10倍的45-95%乙醇提取1-3次,每次1-3小时;或者,所述的醇提取为用当归和黄芪总重量8倍的70%的乙醇提取2次,每次2小时。
优选地,在所述的步骤a中所述的减压浓缩条件为50-80℃,真空度为-0.05--0.1。
更优选地,减压浓缩条件为70℃,真空度为-0.08。
优选地,步骤a中所述的醇洗脱为乙醇洗脱。
更优选地,所述乙醇为80%的乙醇。
优选地,在所述的步骤b中,将醇洗脱液浓缩至无乙醇味,加乙醇至含醇量达90%,冷藏后过滤,回收乙醇,减压浓缩至干粉,得到所述的当归黄芪提取物。
本发明另一方面提供了本发明的方法制备得到的当归黄芪提取物。
优选地,在本发明的当归黄芪提取物中的当归黄芪总苷含量大于提取物重量的50%。
优选地,所述的当归黄芪提取物中含有黄芪甲苷、黄芪苷II和阿魏酸。
更优选地,所述的当归黄芪提取物中含有提取物总重量2-8%黄芪甲苷、1-3%黄芪苷II和1-5%阿魏酸。
更优选地,所述的当归黄芪提取物中含有提取物总重量3~6%的黄芪甲苷、1.00~2%的黄芪苷II和2.00~4%的阿魏酸。
本发明再一方面还提供的当归黄芪提取物在制备用于预防和/或治疗肺纤微化疾病的药物的用途。
本发明提供了一种药物组合物,其中所述的药物组合物中含有本发明的当归黄芪提取物。
优选地,所述的药物组合物包括片剂、散剂、颗粒剂、胶囊剂、水针剂和粉针剂中的一种或几种。
本发明的有益效果在于:1.本发明当归黄芪提取物的制备,通过对提取条件中的乙醇浓度、乙醇用量、提取时间和提取次数的多次实验,得到了最适宜的提取方法。该法精密度、重现性良好,简便易行、快速准确。2.本发明制备方法得到的当归黄芪提取物与传统的当归补血汤相比,通过对IPF大鼠的干预作用比较发现,本发明制备方法得到的当归黄芪提取物能明显降低IPF大鼠血清中透明质酸(HA)、层粘连蛋白(LN)、III型前胶原(PCIII)和IV型胶原(CIV)含量,提示本发明制备方法得到的当归黄芪提取物能够明显减少IPF大鼠ECM(细胞外基质)的生成,其作用明显优于当归补血汤。3.通过本发明方法制备得到的当归黄芪提取物中黄芪甲苷、黄芪苷II和阿魏酸的平均含量稳定,均在上面提到的保护范围内,从而可见,本发明方法得到的当归黄芪提取物中的主要成分含量稳定,药效稳定。
具体实施方式
实施例1本发明当归黄芪提取物的制备方法:
黄芪、当归均符合《中国药典》2005年版一部有关规定。取黄芪、当归加水8倍量煎煮三次,每次1.5小时,合并煎液,滤过,滤液减压浓缩至(温度70℃,真空数-0.08Pa(帕斯卡))每1ml相当于原生药材2g,用95%乙醇沉淀至含醇量达80%,冷藏静置48小时,滤过,取滤液浓缩回收乙醇,冷藏静置24小时,滤过,滤液通过大孔树脂,大孔树脂柱购自中国科学技术大学玻璃仪器厂,大孔树脂柱内径为(Ф1.5cm×30cm,Ф5.0cm×80cm),水洗除去水溶性杂质,用70%乙醇洗脱,收集洗脱液,滤过,回收乙醇,并浓缩至无醇味,加95%乙醇至含醇量达90%,冷藏24小时,滤过,回收乙醇,减压浓缩至干粉。
实施例2本发明当归黄芪提取物的制备方法:
取黄芪、当归加水12倍量煎煮三次,每次2小时,合并煎液,滤过,滤液减压浓缩至(温度70℃,真空数-0.08Pa)每1ml相当于原生药材2g,用95%乙醇沉淀至含醇量达80%,冷藏静置48小时,滤过,取滤液浓缩回收乙醇,冷藏静置24小时,滤过,滤液通过大孔树脂,大孔树脂柱购自中国科学技术大学玻璃仪器厂,大孔树脂柱内径为(Ф1.5cm×30cm,Ф5.0cm×80cm)。水洗至无糖反应,用80%乙醇洗脱,收集洗脱液,滤过,回收乙醇,并浓缩至无醇味,加95%乙醇至含醇量达90%,冷藏24小时,滤过,回收乙醇,减压浓缩至干粉。
实施例3本发明当归黄芪提取物的制备方法:
取黄芪、当归加95%乙醇8倍量提取三次,每次1.5小时,合并提取液,滤过,滤液减压浓缩至(温度70℃,真空数-0.08Pa)每1ml相当于原生药材1g,再加水稀释至每4ml相当于原生药材1g,冷藏静置48小时,滤过,滤液通过大孔树脂,大孔树脂柱购自中国科学技术大学玻璃仪器厂,大孔树脂柱内径为(Ф1.5cm×30cm,Ф5.0cm×80cm),水洗除去水溶性杂质,用80%乙醇洗脱,收集洗脱液,滤过,回收乙醇,并浓缩至无醇味,加95%乙醇至含醇量达90%,冷藏24小时,滤过,回收乙醇,减压浓缩至干粉。
实施例4本发明当归黄芪提取物的制备方法:
取黄芪、当归加70%乙醇10倍量提取三次,每次2小时,合并提取液,滤过,滤液减压浓缩至(温度70℃,真空数-0.08Pa)每1ml相当于原生药材1g,再加水稀释至每3ml相当于原生药材1g,冷藏静置48小时,滤过,滤液通过大孔树脂,大孔树脂柱购自中国科学技术大学玻璃仪器厂,大孔树脂柱内径为(Ф1.5cm×30cm,Ф5.0cm×80cm)。水洗除去水溶性杂质,用70%乙醇洗脱,收集洗脱液,滤过,回收乙醇,并浓缩至无醇味,加95%乙醇至含醇量达90%,冷藏24小时,滤过,回收乙醇,减压浓缩至干粉。
实施例5当归黄芪提取物组分的确定
黄芪甲苷、黄芪苷II的含量测定
1.1色谱条件
色谱柱Kromail C18(4.6mm*250mm,5μm);流动相乙腈-水(37.5∶62.5);流速0.8mL·min-1;进样量20μL;漂移管温度100℃;N2气流流速2.60L·min-1。
1.2供试品溶液的制备
取实施例4的制得的样品约50mg,精密称定,用200mL水饱和的正丁醇溶解后置分液漏斗中,用氨试液(40→100mL)提取2次,每次100mL,弃去氨液,正丁醇液减压蒸干,残渣用甲醇溶解,转移置10mL量瓶中,加甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀,微孔滤膜(0.45μm)过滤,即得。
1.3对照品溶液制备
精密称取黄芪甲苷、黄芪苷II对照品适量,加甲醇溶解并稀释,制成浓度分别约为120μg/ml、240μg/ml的混合溶液,作为对照品溶液。
1.4系统适应性试验
在上述的色谱实验条件下,取供试品溶液及对照品溶液各20μl,注入液相色谱仪中,由色谱图可见,黄芪甲苷对照品峰的保留时间约为6.5~7.5min左右,理论塔板数约10000,拖尾因子约1.07;黄芪苷II对照品峰的保留时间约为10.0~11.0min左右。理论塔板数约13000,拖尾因子约1.01;供试品在与黄芪甲苷、黄芪苷II对照品色谱峰相对应位置上均出现特征色谱峰,且与杂质峰分离良好。
1.5线性关系考察
1.6黄芪甲苷的线性关系考察
精密称取黄芪甲苷对照品16.92mg,置10ml量瓶中,加甲醇超声溶解并稀释至刻度,分别精密量取0.25ml、0.5ml、1ml、1.5ml、2ml置10ml容量瓶中,加甲醇稀释至刻度,照上述色谱条件分别进样20μL,记录色谱峰面积。以浓度的对数值(lgC)为横坐标,以峰面积的对数值(lgS)为纵坐标,进行线性回归,回归方程见下表。从结果可知,进样量在0.85ug~6.76ug的范围内,lgC与lgS具有良好的线性关系(见下表1)。
表1黄芪甲苷线性范围考察表
1.7黄芪苷II的线性关系考察
精密称取黄芪苷II对照品10.5mg,置10ml量瓶中,加甲醇超声溶解并稀释至刻度,分别精密量取0.25ml、0.5ml、1ml、1.5ml、2ml置5ml容量瓶中,加甲醇稀释至刻度,照上述色谱条件分别进样20μL,记录峰面积。以浓度的对数值(lgC)为横坐标,以峰面积的对数值(lgS)为纵坐标,进行线性回归,回归方程见下表2。从结果可知,在进样量为1.05ug~8.4ug的范围内lgC与lgS具有良好的线性关系。
表2黄芪苷II线性范围考察表
1.8精密度考察
精密吸取黄芪甲苷、黄芪苷II对照品混合溶液(混合后黄芪甲苷的浓度为67.7μg/ml,皂苷的浓度为84μg/ml),连续进样5次,每次20μL,记录峰面积,计算RSD,结果分别为2.66%,1.52%,表明本方法精密度良好。结果见表3和表4。
表3黄芪甲苷精密度试验结果
表4黄芪苷II精密度试验结果
1.9稳定性试验
精密吸取供试品溶液,照上述色谱条件,分别于0,1,2,4,8,24h进样20μL,记录色谱图,以峰面积计算RSD,结果表明:样品溶液在24h内基本稳定。
表5供试品中黄芪甲苷稳定性试验结果
表6:供试品中黄芪苷II稳定性试验结果
1.10供试品中黄芪甲苷、黄芪苷II的含量测定
取照实施例1-3的制的样品,按上述试验方法,分别制备供试品溶液进行检测,结果见表7。
表7样品中黄芪甲苷和黄芪苷II含量测定(n=3)
2阿魏酸的含量测定
2.1色谱条件
色谱柱:Shim-Pack VP-ODS(150×4.6mm),流动相:乙腈-1%醋酸(17∶83),流速:1ml/min,检测波长:320nm,柱温:室温。
2.2供试品溶液制备
取实施例4制得的样品2mg,加水溶解并稀释至20ml,用醋酸调节pH为4~5后,用无水乙醚萃取3次,每次20ml,合并乙醚液,用水洗涤2次,每次20ml,取乙醚层,蒸干,残渣加1%醋酸甲醇使溶解并定容至5.0ml容量瓶中,摇匀,用微孔滤膜(0.45μm)滤过,作为供试品溶液。
2.3对照品溶液的制备
精密称取阿魏酸对照品6.6mg,置100ml棕色量瓶中,加1%醋酸甲醇使溶解并稀释至刻度,摇匀,作为阿魏酸对照品储备液。精密吸取储备液2ml至10ml量瓶中,加1%醋酸甲醇稀释至刻度,摇匀,作为对照品溶液。
2.4系统适应性试验
供试品进样20μl测定,结果表明,阿魏酸的保留时间约为11min,样品中阿魏酸色谱峰与其他杂质峰能完全分离,因此可见样品中含有阿魏酸。
2.5标准曲线的制备及线性范围的考察
分别精密吸取对照品储备液0.5、1.0、2.0、3.0及4.0ml,分别置10ml量瓶中,加甲醇稀释至刻度,摇匀,分别精密吸取上述溶液各20μl按上述色谱条件依法测定峰面积值,以峰面积值为纵坐标,阿魏酸浓度(μg/ml)为横坐标,绘
制标准曲线。实验数据经直线回归,得回归方程为y=51746x+6562.8,r=0.9998(n=5),结果见表8。实验表明:阿魏酸对照品在所试浓度3.3μg/ml-26.4μg/ml范围内与峰面积值具有良好的线性关系。
表8阿魏酸线性范围考察表
2.6精密度试验
精密吸取阿魏酸对照品、供试品溶液,分别重复进样5次,按含量测定的方法测定阿魏酸的峰面积积分值,其对照品RSD=0.077%,供试品RSD=0.72%,结果见表9表10,表明本法精密度较好。
表9阿魏酸对照品精密度试验结果
表10供试品精密度试验结果
2.7重现性试验
取样品按供试品的制备方法制成供试品溶液5份,按含量测定的方法测定5份供试品中阿魏酸含量,其相对标准偏差RSD=1.80%。实验表明:本法重现性较好。结果见表11。
2.8稳定性试验
取供试品溶液,每隔1小时进样一次,依法测定峰面积值,直至6小时,结果表明:阿魏酸在所试的6小时内稳定,其相对标准偏差RSD=1.78%,结果见表12。
表11重现性试验结果
表12稳定性试验结果
2.9样品中阿魏酸的含量测定
取照实施例1-3的供试品,按上述试验方法,分别制备供试品溶液进行检测,结果见表13。
表13样品中阿魏酸含量测定(n=3)
3紫外法测定当归黄芪总苷的含量
3.1样品溶液的制备
精密称取实施例1的制得的样品约10mg,置25ml容量瓶中,加无水乙醇溶解并稀释至刻度,作为供试品溶液。
3.2对照品溶液的制备
精密称取黄芪甲苷标准品5.0mg,置于10ml的容量瓶中,用无水乙醇溶解并稀释至刻度,摇匀即得。
3.3吸收曲线的测定
吸取供试品溶液及对照品溶液各0.2ml,加无水乙醇补足体积至0.5ml,再分别加入8%的香草醛无水乙醇试液0.5ml和72%的硫酸5.0ml摇匀,立即放入62℃恒温水浴中,保温20min后,置冷水浴中冷却至室温,以试剂作空白对照,用紫外分光光度计在400~700nm范围扫描。黄芪甲苷与供试品在540nm波长均有最大吸收,故选择540nm为测定波长。
3.4标准曲线的制备
精密吸取对照品溶液0.05、0.1、0.2、0.3、0.4和0.5ml,置具塞试管中,加无水乙醇补足体积至0.5ml,再分别加入8%的香草醛无水乙醇试液0.5mL和72%的硫酸5.0ml摇匀,立即放入62℃恒温水浴中,保温20min后,置冷水浴中冷却至室温,于540nm波长处测吸光度。同时以随行试剂作空白。以吸光度(Y)为纵坐标,黄芪甲苷的浓度μg·ml-1(X)为横坐标,绘制标准曲线计算回归方程为:Y=0.0035 X-0.0032,r=0.9986。
3.5样品测定
实施例1至3中当归黄芪粗总苷中以黄芪甲苷计算,结果见表14。
表14三批粗总苷中当归补血总苷的含量结果
实施例5对肺纤维化大鼠的干预作用比较
1.动物分组、给药方案及标本采集
清洁级健康Wistar大鼠50只,雌雄不拘,体重为180~220g,由安徽医科大学实验动物中心提供(动物合格证号:皖医实动准01),于实验前一周一次性购进,按清洁级标准饲养于安静、温暖且避强光的环境中,动物自由饮水进食,室温18-22℃,饲养常规观察一周后使用。将大鼠随机分为正常对照组、模型对照组、阳性药组、本发明实施例1的当归黄芪提取物组(中剂量组)和当归补血汤组,每组10只。除正常对照组以外,其余各组均被制成肺纤维化模型;各组动物分别于造模第二天开始灌胃,造模后28d取10只取材。正常对照组与模型组生理盐水灌胃,每日一次。阳性药组大鼠给予醋酸强的松混悬液,给药剂量为3mg·kg-1,当归黄芪提取物组给予相应浓度的药物混悬液,剂量为32mg·kg-1,当归补血汤组剂量为3600mg·kg-1。每日灌胃一次(醋酸强的松、当归黄芪提取物组中剂量组和当归补血汤组用量相当于成人常用量,按照体表面积折算)。
标本收集与处理:实验动物于造模后28d取10只取材,腹主动脉采集血样,分离血清保存于-20℃待测;处死动物,取肺脏组织左叶,置于10%中性甲醛溶液中固定,用于病理检查。
2.统计学处理
实验数据计量资料以均数±标准差
表示,采用SPSS12.0统计软件进行单因素方差分析,P<0.05表示差异有显著性。
3.当归黄芪提取物对肺纤维化大鼠血清HA、LN、PCIIIand CIV的影响
透明质酸(HA)、层粘连蛋白(LN)、III型前胶原(PCIII)和IV型胶原(CIV)放免试剂盒使用参见使用说明书。结果显示,模型组大鼠28天血清中HA、LN、PCIII和CIV含量明显升高,与正常组比较有显著差异(P<0.01)。当归黄芪提取物(32mg·kg-1)及强的松组血清中HA、LN、PCIIIand CIV含量明显下降,与模型组比较差异显著(P<0.01),当归黄芪提取物治疗组血清HA、LN、PCIIIand CIV含量亦下降(P<0.05)。提示TGDGBX(32mg·kg-1)能明显减少博来霉素所致肺纤维化大鼠细胞外基质成分,可明显减轻肺纤维化大鼠肺纤维化程度,其治疗作用优于当归补血汤组。
4.当归黄芪提取物对肺纤维化大鼠肺组织病理形态学的影响
各组大鼠分别于28d取材,均用10%水合氯醛腹腔注射麻醉后,行颈主动脉切开灌注。4%多聚甲醛进行活体灌流固定,以20cm水柱,15min为宜。麻醉后快速开胸取肺组织、固定、脱水、包埋、切片,每片厚度为5μm,组织片分别裱于涂有蛋白甘油的载玻片(用于HE、Masson染色)切片入37℃温箱干燥48h保存备用。
结果显示,光镜下可见,造模后28d模型组大鼠肺组织中胶原纤维排列纵横交错,而当归黄芪提取物(32mg·kg-1)组胶原纤维显著减少,提示当归黄芪提取物可明显减轻博来霉素所致肺纤维化大鼠的纤维化程度。结果见图1。
已经根据优选实施例对本发明作了描述。应当理解的是前面的描述和实施例仅仅为了举例说明本发明而已。在不偏离本发明的精神和范围的前提下,本领域技术人员可以设计出本发明的多种替换方案和改进方案,其均应被理解为在本发明的保护范围之内。