CN100341530C - 当归补血微丸的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种当归补血微丸的制备方法，该方法应用现代技术提取纯化黄芪当归的有效部位，同时通过优化当归补血微丸制剂处方和提取工艺，制备成疗效稳定、质量可控的中药制剂当归补血微丸。所得微丸成球性能较好，微丸得率大于60%，且有粒径大小分布区域宽、易形成不规则形状，辅料用量少。由该方法所得的当归补血微丸与当归补血汤相比，其相对生物利用度为128%，药理效应法研究当归补血微丸的生物利用度得出，初步药效研究结果表明，当归补血微丸优于当归补血汤剂。

Description

当归补血微丸的制备方法

技术领域

本发明涉及黄芪当归补血汤有效部位的提取纯化制造当归补血微丸的方法，属于中药制备技术领域。

背景技术

中药自身的特点是中药处方使用的基本上都是原植物、动物或矿物，当归补血汤系中医经典名方，为李东垣首创，始载于《内外伤辨惑》，全方由黄芪、当归两药按5∶1组成，具有补气生血的功效，临床应用广泛。对当归补血汤复方的实验研究，始于20世纪70年代后期。近20多年以来，已进行了大量的现代研究，包括免疫功能、心血管、血液、立方基础、抗氧化、保肝、配伍比例等几个方面，因而在细胞、亚细胞水平对当归补血汤的作用机理和物质基础进行了探讨，对该方的配伍规律予以了一定的阐明，从而为临床应用提供了科学依据，为中医复方的深入研究进行了有益的探索。现代研究表明当归补血汤中多糖与非多糖均为有效组分；多糖组分作用较强，尤以当归多糖的作用更为显著；非多糖组分主要是黄芪的苷类、苷元及当归的酚性物质等，以阿魏酸作用最强；以上各成分可在不同的作用环节上促进造血细胞的形成。如何将其有效成分提取制成高效、速效、体积小、单剂量小以及贮存、携带、服用方便的优质品种微丸，是人们一直在研究的问题。

发明内容

本发明的目的是依据中医药理论，应用分离精制技术提取纯化黄芪当归的有效部位(皂苷、酚性成分和多糖)，达到中药制剂的“三小”同时通过优化当归补血微丸制剂技术，制备成疗效稳定、质量可控的中药制剂当归补血微丸，达到制剂“三效”。

技术方案本发明当归补血微丸制备方法其步骤如下

(1)黄芪醇回流：--------称取黄芪药材粗粉，精密称定，加醇回流提取并浓缩药液得醇液和药渣，药渣备用；

(2)将步骤(1)中所得醇液进一步浓缩，并回收醇液，得醇提浓缩液；

(3)将步骤(2)中所得醇提浓缩液用有机溶剂如丁醇、正丁醇、乙醇或丙酮等，优选正丁醇萃取或用大孔树脂，优选AB-8型大孔吸附树脂进行吸附纯化可得黄芪皂苷；

(4)当归醇回流------称取当归药材粗粉，精密称定，加醇液提取并浓缩得醇液和药渣，药渣备用；

(5)将步骤(4)中所得醇浓缩液进一步浓缩并回收醇，得醇提浓缩液；

(6)将步骤(5)中所得醇提浓缩液用有机溶剂如醋酸乙酯、乙醇、丁醇等，优选醋酸乙酯或者大孔树脂，优选AB-8型大孔吸附树脂进行吸附、纯化可得当归酚酸类成份；

(7)将(1)(4)两步中的药渣合并加水溶解得水提取液，浓缩得粗多糖溶液；

(8)将(7)所得粗多糖溶液加乙醇使含醇量达60％-85％沉淀，得多糖；

(9)将(3)中的黄芪皂苷，(6)中的当归酚酸类成分，(8)中的多糖混合造丸得当归补血微丸。

本发明当归补血微丸的制备方法，还可采取以下措施进一步实现：

前述的一种当归补血微丸的制备方法，其特征在于步骤(1)中所述的醇液为乙醇液，重量百分比浓度为55％---95％；优选乙醇溶液重量百分比浓度为60％---75％，更优选乙醇液重量百分比浓度为65％。

前述的一种当归补血微丸的制备方法，其特征在于其中步骤(9)所述的当归补血微丸是在蒸馏水中以挤出滚圆的技术方式得补血微丸。

本发明较目前现有的方法，将黄芪药材使用醇法回流，然后用大孔树脂进行吸附，从而提高了黄芪皂苷的提取含量和纯度；对当归药材也同样采用了醇回流的方法和大孔树脂进行吸附，提高了当归酚酸类成分的提取含量和纯度，并且对黄芪和当归回流时产生的药渣合并提取多糖，然后将黄芪皂苷、当归酚酸类成分和多糖混合，以挤出滚圆的技术方式制得当归补血微丸；工艺过程简单，成本低，并且减少了对环境的污染。而且本发明首次建立了血浆中黄芪甲苷的测定方法，共存组分不干扰、出峰时间合适和方法灵敏度高的优点，对于新药研制开发及体内代谢动力学研究有参考价值。

附图说明

图1为本发明当归补血微丸正丁醇萃取法样品图谱；

图2为本发明当归补血微丸大孔吸附树脂法样品图谱。

具体实施方式

以下结合实践中当归补血微丸的制备工艺及其药用效果进一步说明其工艺过程的优化和医药用途：

黄芪药材用乙醇回流提取可采用不同浓度乙醇冷浸或回流和/或索氏提取；沉淀时可静置，静置方法可用冷藏静置和/或常温静置；分离方法可采用离心分离，主要是去除杂质，和冷藏静置分离，主要是去除上浮油脂。树脂柱纯化分离时，事先可按常规将大孔树脂进行预处理。本发明制备方法中回收乙醇可采用常压回收和/或减压回收。干燥分离的沉淀时，可采用烘箱干燥、真空干燥、冷冻干燥和/或喷雾干燥。黄芪等水提取可用冷浸和/或煎煮。本发明制备方法中，凡涉及浓缩工艺时，可采用减压浓缩、常压浓缩和/或薄膜蒸发浓缩。

本发明方法中凡涉及沉淀或析出物与液体分离时，可采用离心分离、膜分离和/或常压或减压过滤。粉碎可采用单独粉碎和/或混合粉碎。

对影响黄芪醇回流提取的主要因素：乙醇浓度按四因素三水平L(3)进行正交试验。试验结果表明，影响黄芪总皂苷的主要因素为提取次数；影响黄芪甲苷的主要因素为乙醇的百分浓度，其次为提取次数，溶媒量和提取时间影响较小。综合三者，总提取物多者，即带进杂质亦较多，给下一步的纯化增加困难，根据综合分析的结果选择了发明药物组合物的制备方法。

提取液减压回收乙醇，离心或静置除去上浮油脂，AB-8树脂和/或D101大孔树脂和/或D605、和/或NAK、和/或纯化，乙醇洗脱，洗脱液减压回收乙醇，干燥，得黄芪总皂苷。结果见表1。

        表1、水醇法与大孔树脂纯化法样品含量比较

纯化方法	总皂苷含量mg/g	总提取物mg/g	总提取中总皂苷含量(％)
				树脂法水醇法	73.314.7	10.563.0	69.82.3

本发明黄芪总皂苷提取物用AB-8大孔树脂和/或D101大孔树脂和/或D605、和/或NAK、和/或分离纯化方法比传统的水醇方法比较，本发明制得的样品中黄芪总皂苷含量较高，且总皂苷含量占总固体比例高，表明AB-8大孔树脂含量较大，表明用大孔树脂纯化法除去杂质的同时保留了有效成分的比例高。与传统工艺即水醇法比较，结果总皂苷的含量提高5倍，总皂苷占总固体物的比例由原来的2.3％提高至50％以上。

在总皂苷解吸过程中，用55-95％乙醇洗脱总皂甙含量较高，用60-75％乙醇洗脱更好，用65％乙醇洗脱最好，其总提取物中总皂苷含量为56.6％，高于其它浓度。

对影响黄芪、当归多糖提取的因素：加水量、药材浸泡时间、提取次数按四因素三水平L₉(3⁴)进行正交试验。试验表明，影响多糖提取的主要因素均为煎煮时间，且均以煎煮三次，每次1.5小时为佳。

1黄芪总皂苷提取、纯化工艺优选

1.1黄芪总皂苷醇提取工艺参数优选

1正交表设计：根据预试验，对影响醇回流工艺的主要因素：醇浓度、加溶媒量、提取时间和提取次数按四因素三水平进行L₉(3⁴)正交试验。因素水平见表2。

                表2醇回流正交试验团素水平表

因素水平	醇浓度(％)A	溶媒量*(倍)B	提取时间(h)C	提取次数D
					123	507090	468	1.01.52.0	123

2正交试验的样品制备：分别称取黄芪药材50g，精密称重，按正文试验表各行所列条件制备样品，调整到每ml含生药0.5g，过滤，备用。

3指标测定

(1)总皂苷含量测定

对照品溶液的制备：取黄芪甲苷对照品10.08mg，精密称定，置10ml量瓶中，加无水乙醇溶解，并稀释至刻度，摇匀，即得。

标准曲线的制备：精密量取对照品溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5ml，置10ml量瓶中，各精密加入无水乙醇至0.5ml，再分别加入8％香草醛无水乙醇试剂0.5ml，摇匀，置冰水浴中缓缓加入72％硫酸试液5ml，摇匀后置62℃水浴中保温20分钟，取出，立即冰水浴冷却至室温。以相应的试剂作空白，照分光光度法(《中国药典》2000年版一部附录VB)在536nm的波长处测定吸收度。以吸收度为纵坐标，对照品浓度为横坐标绘制标准曲线，Y＝2.8670X+0.1013，r＝0.999。

测定法：精密量取样品0.2ml，照标准曲线的制备项下的方法自“8％香草醛无水乙醇试剂”起，依法测定吸收度，从标准曲线上读出供试品溶液中总皂苷的含量，即得。

(2)黄芪甲苷含量测定

分别量取样品各8ml，水浴蒸干，加水20ml超声溶解，用水饱和正丁醇萃取5次，每次20ml，合并正丁醇液，用氨试液洗涤两次，每次20ml，弃去氨水层，取正丁醇层蒸干，残渣用甲醇溶解定容到1ml。另取黄芪甲苷对照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(中国药典2000年版一部附录VIB)试验，吸取供试品溶液4μl，对照品溶液2μl与6μl，分别交叉点于同一硅胶G薄层板上，以氯仿-甲醇-水(65∶35∶10)下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，于105℃烘约5～7分钟至斑点显色清晰，取出，在薄层板上覆盖同样大小的玻璃板，周围用胶布固定，照薄层色谱法(中国药典2000年版一部附录VI B薄层扫描法)进行扫描，波长：λ_s＝530nm，λ_R＝700nm，测量供试品吸收度积分值与对照品吸收度积分值，计算，即得。

(3)总提取物测定：精密量取各试验样品10ml，置干燥恒重的蒸发皿中，水浴蒸干，置105℃干燥3小时，置干燥器中冷却半小时，迅速称量。

4结果：列于表3。

                                       表3醇提取黄芪的正交试验

序列	A	B	C	D	总皂苷％	黄芪甲苷mg/g	总提取物％	综合评分
									123456789	111222333	123123123	123231312	123312231	3.1494.1764.3834.6873.7875.5893.4795.5902.912	0.4210.6130.7030.7810.5760.6500.4160.5050.306	20.3528.7928.1424.8623.3628.4220.5524.6618.17	11.0215.3216.8418.3814.1518.3211.5516.479.13
总K1皂K2苷K3R×3	11.70814.06311.9812.396	11.31513.55312.8842.279	14.32811.77511.6492.638	9.84813.24414.6604.853
									黄K1芪K2甲K3苷R×3	17372.0071.2270.780	1.6181.6941.6590.076	1.5761.7001.6950.124	1.3031.6791.9890.686
总K1提K2取K3物R×3	77.2876.6463.3813.90	65.7676.8174.7311.05	73.4371.8272.051.61	61.8877.7677.6615.88
									综K1合K2分K3R×3	43.1850.8537.1513.70	40.9545.9444.294.99	45.8142.8342.543.27	34.3045.1951.6917.69

5数据分析

试验结果表明，影响黄芪总皂苷的主要因素为D，最佳组合为A₂B₂C₁D₃；影响黄芪甲苷的主要因素为A，其次为D因素，B和C因素影响较小，最佳组合为A₂B₂C₂D₃。因二者最佳组合不完全一致，且二者同等重要，因此以各自最高数据计为10分，其余以此折算，并合计为综合分，结果表明，D、A为主要因素，B、C为次要因素，最佳组合为A₂B₂C₁D₃。

影响总提取物的主要因素为D，其次为A因素，再其次为B因素，C因素影响最小；最佳组合为A₁B₂C₁D₂。

综合三者，总提取物多者，即带进杂质亦较多，给下一步的纯化增加困难，因此根据综合分的结果A因素选择A₂；B、C因素影响均较小，根据试验选择B₂；提取时间结合中试结果，并考虑到大生产时设备较大，为使药材提取透，因此选择C₃；进一步以黄芪总皂苷为指标进行方差分析，D因素无显著性影响；而以黄芪甲苷为指标进行方差分析，D因素有显著性影响；从生产实际考虑，拟选择D₂。因此，安排验证试验，分析提取2次的可能性。

6验证试验：分别制备回流提取2次与3次样品，测定黄芪甲苷的含量，结果提取2次样品中黄芪甲苷含量为提取3次样品中含量的89.42％，多提取一次，黄芪甲苷含量增加的较少，而相应乙醇、能耗增加较大，生产成本增加较多，因此，提取次数选择2次。

7结论：黄芪醇提取条件为：药材加70％乙醇回流提取2次，每次2小时，第1次加8倍量，第2二次加6倍量。

1.2黄芪总皂苷纯化方法优选

1方法：称取黄芪药材粗粉500g，加8倍量70％乙醇回流提取2次，每次2小时，浓缩药液并定容到500ml。

(1)正丁醇萃取法：精密量取上述黄芪提取物25ml，用水饱和的正丁醇振摇提三次，每次25ml，合并正丁醇液，蒸干，残渣加甲醇使溶解，定容到50ml。

(2)大孔吸附树脂法：精密量取黄芪提取液10ml(1g生药/ml)，加到已经前处理好的树脂上，上样速度为1BV/h，上样完毕后，用蒸馏水洗至流出液无色，再用95％乙醇洗脱，收集洗脱液至流出液无色为止，定容到100ml。

2指标的测定

(1)总皂苷测定：同上测定。

(2)总提取物测定：精密量取各试验样品10ml，置干燥恒重的蒸发皿中，水浴蒸干，置105℃干燥3小时，置干燥器中冷却半小时，迅速称重。

(3)指纹谱测定：

①仪器：Agilent1100高效液相色谱仪，包括：四元泵，在线脱气机，柱温箱，VWD检测器，化学工作站(chemstation system工作站)；乙腈：HPLC级。

②色谱条件：柱：ZORBAX SB-C₁₈(4.6×250mm，5-Micro)；柱温：30℃；检测波长：203nm；分析时间：60min；流动相：0～50min：0～50％乙腈；流速：1.0ml/min。

3结果：2种方法总皂苷含量无明显差异，指纹谱具有相似性，但又有一定差别，见图1、2。

黄芪皂苷指纹谱的特征可分为二组簇峰：一是为30～35分钟内的以4个主峰为特征的A组，另一为42～48分钟以三个主峰为特征的B组。正丁醇萃取法以B组峰明显强于大孔吸附树脂法，而大孔吸附树脂法以A组明显强于正丁醇萃取法。

1.3黄芪总皂苷大孔树脂吸附纯化工艺参数优选

1.3.1不同型号大孔吸附树脂对黄芪总皂苷吸附的研究

1树脂的前处理

取市售大孔吸附树脂，用乙醇加热回流提取洗脱，洗至洗脱液蒸干后无残留。经乙醇洗净的树脂保存备用。以乙醇湿法装柱。继续用乙醇在柱上流动清洗，不时检查流出的乙醇，至与水混合不呈现白色混浊为止(取1ml乙醇液加5ml蒸馏水)。然后以大量的蒸馏水洗去乙醇，备用。少量乙醇的残留将会大大降低树脂的吸附能力。

2比吸附量(absorption ratio)的测定

精密量取黄芪提取液50ml(每克含生药1g)，加到已经前处理的树脂，调节流速为0.5ml/min，过柱流出液重吸附2次，静置15分钟，用水洗至流出液无色(收集200ml)，再用80％的乙醇洗脱，洗脱至流出液无色为止(收集100ml)。结果见表4。可见，AB-8型大孔吸附树脂比吸附量最大，故选择该型号的树脂作为黄芪总皂苷纯化的树脂。

同时测定不同树脂洗脱样品的指纹图谱，从HPLC图谱上亦表明，以AB-8型大孔吸附树脂较佳。

                表4不同型号大孔吸附树脂对黄芪总皂苷比吸附量的研究结果

树脂型号	M(g)	M上(mg)	M残+M水(mg)	A	A平均
						D101D605D140AB-8NKAII	7777777777	1075107510751075107510751075107510751075	747.39867.85783.81853.84839.84733.39512.36502.68577.23589.76	46.8029.5941.6031.5933.5948.8080.3881.7671.1169.32	38.2036.6041.2081.0770.22

M：干树脂的重量；                    M_上：为上柱液中成分的质量

M_残：为过柱流出液中成分的质量；      M_水：为水洗脱下来成分的质量

A(比吸附量)：单位质量干树脂吸附成分的总和A＝(M_上-M_残-M_水)/M

1.3.2AB-8型大孔吸附树脂对黄芪总皂苷吸附、分离相关参数的研究

1比上柱量(saturation ratio)的测定：精密量取黄芪提取液50ml(1g生药/ml)，加到已经前处理的树脂，调节流速为0.5ml/min，过柱流出液吸附2次，静置15分钟，测定其比上柱量。比上柱量是所用树脂达吸附终点时，单位质量干树脂吸附夹带成分的总和，即S＝(M_上-M_残)/M。结果S_平均＝82.67。

2比吸附量(absorption ratio)的测定：精密量取黄芪提取液50ml(1g生药/ml)，加到已经前处理的树脂，调节流速为0.5ml/min，过柱流出液重吸附2次，静置15分钟，用水洗至流出液Molish反应呈阴性(收集250ml)，测定其比吸附量。比吸附量是单位质量干树脂吸附成分的总和。即A＝(M_上-M_残-M_水)/M。结果A_平均＝49.48。

3洗脱溶媒的选择：取AB-8型大孔吸附树脂7克，湿法上柱，平行制备7份，分别经过前处理，根据吸附容量，精密吸取黄芪提取物(1g生药/ml)上柱，用蒸馏水洗脱至流出液Molish反应呈阴性，分别用30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％的乙醇洗脱，收集洗脱液各100ml。结果显示80％乙醇洗脱，解吸率较高，更高浓度的乙醇洗脱，黄芪皂苷的纯度不再提高。故确定用80％乙醇洗脱黄芪总皂苷(以黄芪甲苷含量计)。

4洗脱累积率的测定：取AB-8型大孔吸附树脂7克，湿法上柱，经过前处理，根据该树脂的吸附容量，精密吸取黄芪提取液(每ml含1克生药)上柱，用蒸馏水洗脱至流出液无色，用80％乙醇液洗脱，刚开始连续收集50ml洗脱液，以后分段收集，每段50ml，累计收集350ml。计算各部分洗脱液中黄芪总皂苷的含量。

该吸附柱参数为：直径D＝1.5cm，高度H＝10cm，计算得BV(树脂床体积)为18cm³。由洗脱累积率的测定结果可知，用80％乙醇液洗脱，收集150ml洗脱液，94.60％的指标成分已从树脂上解吸下来，即洗脱体积为9BV。

5比洗脱量(Eluation ratio)的测定

取AB-8型大孔吸附树脂，湿法上柱，经过前处理，根据该树脂的吸附容量，精密吸取黄芪提取液(每ml含1克生药)上柱，用蒸馏水洗脱至流出液无色，用80％乙醇液洗脱，收集洗脱液200ml(终点)，计算其比洗脱量。比洗脱量是吸附达饱和后，用一定浓度的乙醇洗脱至终点，单位质量干树脂洗脱成分的质量，即E＝M_醇/M。结果比洗脱量为119.28，RSD＝0.56％。

2当归总酚酸提取、纯化工艺优选

2.1当归总酚酸醇提取工艺参数优选

1正交表设计

根据预试验，对影响醇回流工艺的主要因素：醇浓度、加溶媒量、提取时间和提取次数按四出素三水平进行L₉(3⁴)正交试验。因素水平见表5。

                 表5醇回流正交试验团素水平表

因素水平	醇浓度(％)A	溶媒量*(倍)B	提取时间(h)C	提取次数D
					123	506070	468	1.01.52.0	123

2正交试验的样品制备

分别称取当归药材50g，精密称重，按正文试验表各行所列条件制备样品，调整到每ml含生药0.16g，过滤，备用。

3指标测定

(1)阿魏酸含量测定

①色谱条件：ZORBAX SB-C(5mm，4.6×250mm)色谱柱：柱温：30℃；流动相：甲醇∶0.05％冰醋酸(40∶60)；检测波长：320nm：流速：0.6ml/min。

②对照品的制备：精密称取阿魏酸适量，用甲醇配成每ml含8.62μg的对照品溶液。

③样品的制备：精密吸取上述样品各1ml置水浴挥去溶媒，加水定容到10ml，精滤后备用。

④含量的测定：分别吸取对照品，样品溶液各20μl，注入高效液相色谱仪，用外标两点法测定阿魏酸的含量。

(2)总提取物测定：精密量取各试验样品10ml，置干燥恒重的蒸发皿中，水浴蒸干，置105℃干燥3小时，置干燥烘器中冷却半小时，迅速称重。

4结果：列于表6。

                                    表6醇提取正交试验

序列	A	B	C	D	阿魏酸mg/g	总提取物％
							123456789	111222333	123123123	123231312	123312231	0.3550.4660.4810.4270.4220.5570.4360.6480.453	29.347.454.641.236.750.029.448.329.3
阿K1魏K2酸K1R×3	1.3021.4061.5370.235	1.2181.5361.4910.318	1.5601.3461.3390.221	1.2301.4591.5560.326
							总K1提K2取K3物R×3	131.3127.9107.924.3	99.9132.4133.924.0	127.6117.9120.79.7	95.3126.8144.148.8

5数据分析

实验结果表明，影响阿魏酸提取的主要因素为D，其次为B因素，A和C因素影响相对较小，最佳组合为A₃B₂C₁D₃，且60％与70％的乙醇提取，阿魏酸含量并无显著性差异，从节约成本的角度考虑，选择60％乙醇提取为宜。

6结论

当归醇提取条件为：药材加60％乙醇6倍回流量提取3次，每次1小时。

2.2当归总酚酸纯化方法优选

1方法：称取当归药材100g，加60％乙醇6倍量回流量提取3次，每次1小时。合并浓缩至每ml含生药1g。

(1)大孔吸附树脂法：精密量取提取液10ml(1g生药/ml)，加到已经前处理好的树脂上，上样速度为1BV/h，上样完毕后，用蒸馏水洗至流出液无色，再用95％乙醇洗脱，收集洗脱液至流出液无色为止，定容到100ml。

(2)有机溶剂萃取法：文献报道用醋酸乙酯提取水溶性酚酸类成分有较好的提取率。精密量取上述提取物25ml，用醋酸乙酯振摇提5次，每次25ml，合并，蒸干，残渣加甲醇使溶解，定容到50ml。

2指标测定

(1)阿魏酸含量的测定：同上。

(2)总提取物测定：精密量取各试验样品10ml.置干燥恒重的蒸发皿中，水浴蒸干，置105℃干燥3小时，置干燥器冷却半小时，迅速称重。

3结果：见表7。

             表7纯化方法选择

方法	阿魏酸mg/g	总固体
			大孔树脂溶剂萃取	0.5550.615	12.714.5

4结论：溶媒法是液液萃取，所用溶媒耗量大，回收成本较高，而且有些化学成分长时间在溶媒中不稳定。采用大孔树脂吸附法，不仅溶媒用量少，而且避免了由于溶媒而产生的乳化现象。大孔树脂再生容易，一般用水，稀酸碱或有机溶剂如乙醇等即可，同时分离出的物质灰分低，基本没有无机物掺杂其间。

2.3当归总酚酸大孔树脂吸附纯化工艺参数优选

2.3.1不同型号大孔吸附树脂对当归总酚酸吸附的研究

1树脂的前处理

取市售大孔吸附树脂，用乙醇加热回流提取洗脱，洗至洗脱液蒸干后无残留。经乙醇洗净的树脂保存备用。以乙醇湿法装柱。继续用乙醇在柱上流动清洗，不时检查流出的乙醇，至与水混合不呈现色包混浊为止(取1ml乙醇液加5ml蒸馏水)。然后以大量的蒸馏水洗去乙醇，备用。少量乙醇的残留将会大大降低树脂的吸附能力。

2不同吸附树脂比吸附量(absorption ratio)的测定

精密量取当归提取液90ml(每克含生药1g)，加到已经前处理的树脂，调节流速为0.5ml/min，过柱流出液得吸附2次，静置15分钟，用水洗至流出液Molish反应呈阴性(收集250ml)，再用95％的乙醇洗脱，洗脱至液出液无色为止(收集100ml)。

3结果：见表8。

                表8不同型号大孔吸咐树脂对当归总酚酸比吸附量的研究结果

树脂型号	M(g)	M上(mg)	M残+M水(mg)	M醇(mg)	A	A平均
							NKA IIAB-8D101D605D140	7777777777	55.5355.5355.5355.5355.5355.5355.5355.5342.2042.20	29.9129.4824.0824.8231.5131.1348.5847.8131.8932.76	26.2526.7930.6630.2128.1428.798.498.1710.209.02	3.663.724.494.393.433.480.991.101.471.35	3.694.443.461.041.41

M：干树脂的重量；                  M_上：为上柱液中成分的质量；

M_残：为过柱流出液中成分的质量；    M_水：为水洗脱下来成分的质量；

M_醇：为不同浓度的乙醇洗脱下来成分的质量；

A(比吸附量)：单位质量干树脂吸附成分的总和A＝(M_上-M_残-M_水)/M

AB-8型大孔吸附树脂的比吸附量最大，即吸附同数量的当归提取液所需该树脂量相对较少。

4结论

从生产实际出发，选择AB-8型大孔吸附树脂作为当归总酚酸吸附纯化的树脂。

2.3.2AB-8型大孔吸附树脂对当归总酚酸吸附、分离相关参数的研究

1比上柱量(saturation ratio)的测定：精密量取当归提取液60ml(1g生药/ml)，加到已经前处理的树脂，调节流速为0.5ml/min，过柱流出液吸附2次，静置15分钟，测定其比上柱量。比上柱量是所用树脂达吸附终点时，单位质量干树脂吸附夹带成分的总和，即S＝(M_上-M_残)/M。由表23结果可知，AB-8型大孔吸附树脂对当归总酚酸(以阿魏酸计)的比上柱量为5.60，RSD＝3.40％

2比吸附量(absorption ratio)的测定：上述树脂用水洗至流出液Molish反应呈阴性(收集250ml)，测定其比吸附量。比吸附量是单位质量干树脂吸附成分的总和。即A＝(M_上-M_残M_水)/M。由表24结果可知，AB-8型大孔吸附树脂对当归总酚酸(以阿魏酸计)的比吸附量为3.88，RSD＝3.99％。

3洗脱溶媒的选择：取AB-8型大孔吸附树脂7克，湿法上柱，平行制备7份，分别经过前处理，根据吸附容量，精密吸取当归提取液(1g生药/ml)上柱，过柱流出液重吸附2次，静置15分钟，用蒸馏水洗脱至流出液Molish反应呈阴性，分别用30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％的乙醇洗脱，测定其中阿魏酸的含量。

另当归提取物每ml含固形物0.537g，经过计算，其纯度为0.158％.结果显示30％乙醇沉脱液所得样品中，阿魏酸纯度为9.60％，相对含量最高，故确定洗脱媒为30％的乙醇溶液。当归提取物经过AB-8大孔吸附树脂的吸附、洗脱后，在固形物含量降低的同时，纯度呈显著性提高。

4洗脱曲线的绘制

取AB-8型大孔吸附树脂7克，湿法上柱，经过前处理，根据该树脂的吸附容量，精密吸取当归提取液(1g生药/ml)上柱，用蒸馏水洗脱至流出液Mol i sh反应呈阴性，依次用30％，50％，70％，90％的乙醇作梯度洗脱，洗脱液流速为1.5ml/min，蒸馏水洗脱液收集250ml：30％乙醇，；50％乙醇，70％乙醇，90％乙醇洗脱液分别收集50ml 5份。测定阿魏酸的含量，以容量瓶编号(X)为横坐标，阿魏酸含量(Y)为纵坐标绘制洗脱液曲线。结果显示，阿魏酸主要集中在30％乙醇洗脱液中，占全部洗脱液中阿魏酸含量的99％以上。故确定洗脱条件为：先用蒸馏水洗去水溶性杂质，再用30％乙醇洗脱阿魏酸，收集30％乙醇洗脱部分。

5.洗脱累积率的侧定

取AB-8型大孔吸附树脂7克，湿法上柱，经过前处理，根据该树脂的吸附容量，精密吸取当归提取液(每ml含1克生药)上柱，用蒸馏水洗脱至流出液无色，用30％乙醇液洗脱，刚开始连续收集50ml洗脱液，以后分段收集，每50收集一次，累计收集350ml。计算各部分洗脱液中阿魏酸的含量，结果见表9。

                表9洗脱累积率的测定结果

序号	乙醇用量(ml)	M醇(mg)	累积洗脱率(％)
				1234567	0～5050～100100～150150～200200～250250～300300～350	13.829.532.320.110.0660.0220.00	53.4390.2799.2399.6699.91100.00

6比洗脱量(Eluation ration)的测定

取AB-8型大孔吸附树脂，湿法上柱，经过前处理，根据该树脂的吸附容量，精密吸取当归提取液(每ml含1克生药)上柱，用蒸馏水洗脱至流出液无色，用30％乙醇洗脱，收集洗脱液200ml(终点)，计算其比洗脱量。比洗脱量是吸附达饱和后，用一定浓度的乙醇洗脱至终点，单位质量干树脂洗脱成分的质量，即E＝M_醇/M。结果比洗脱量为3.16，RSD＝2.69％。

7当归提取物浓度对AB-8树脂吸附性能的影响

原液浓度会直接影响到AB-8树脂吸附性能。故用不同浓度的当归提取物上柱，考察其比吸附量及解吸率，为选择适宜的上样浓度提供依据。定量加入已知含量的当归提取物，以2BV/l小时的流速上样吸附洗脱，用蒸馏水洗脱至流出液无色，再用30％乙醇液洗脱至终点。结果显示，虽然上样浓度高，比吸附量也随之增加，但解吸率显著降低，有效成分不能被完全洗脱下来。因此选择当归药液浓度为1.0g/ml为宜。

3黄芪、当归多糖提取、纯化工艺优选

3.1黄芪、当归多糖水提取工艺参数优选

1对影响水提取工艺的主要因素

选择加水量、提取时间和提取次数按四因素三水平表进行L₉(3⁴)正交试验。按常规，将中药的水煎煮条件设计为中间水平，分别再取高低两个水平，各因素水平见表10。

        表10水提取正交试验因素水平表

因素水平	煎煮次数A	煎煮时间(h)B	加水量(倍)C
				123	123	1.01.52.0	81012

2正交试验的样品制备

分别按正交试验表各行所列条件制备样品。

                          表11水提取正交试验

序列	A	B	C	D	多糖得率％
						123456789	111222333	123123123	123231312	123321231	2.516.669.636.459.094.767.744.417.76
得K1K2率K3R×3	18.8020.3019.911.50	16.7020.1622.155.45	11.6820.8726.4614.78	19.3619.2620.491.33

3多糖得率测定：样品加乙醇沉淀，取沉淀，加水溶解，去除不溶物，干燥，称重，计算得率。

4结果：列于表11。

5数据分析：影响多糖精提物得率的主要因素亦C，A、B因素影响均较小，结合方差分析，C因素有极显著差异，A、B因素影响相对较小，故最佳组合确定为A₁B₃C₃。

6结论：多糖的提取条件为：取乙醇提取后的黄芪，当归药渣(烘干)按5∶1投料，合并水煎煮，加水12倍量，煎煮2次，每次2小时。

3.2黄芪、当归多糖纯化工艺参数优选

1因素水平设计：多糖不溶于一定浓度乙醇，因此采用加乙醇沉淀方法，自水煎煮浓缩加醇使多糖沉淀而分离出来。同时，水煎醇沉提取物中，除多糖被沉淀下来之外，亦有蛋白质等其它大分子杂质被乙醇同时沉淀，经再一次水溶解，滤除水不溶性杂质，再用乙醇沉淀多糖，其蛋白质等杂质基本被除尽。预试验表明，醇沉前浸膏浓度高，醇沉时乙醇用量少，多糖得率可提高；同时，醇浓度提高，得率也会在一定范围内增加。因此设计四因素三水平正交试验表，优选醇沉纯化多糖工艺参数。

                    表12多糖纯化正交试验因素水平表

因素水平	药液浓度A(ml/g)	一次醇沉浓度B(％)	药液浓度C(ml/g)	二次醇沉浓度D(％)
					123	1∶11∶21∶3	607080	1∶11∶21∶3	607080

2正交试验的样品制备：分别按正交试验表各行所列条件制备样品，备用。

3指标的测定

(1)多糖测定：a以葡萄糖为对照品测定：

对照品溶液的制备：精密称取D-无水葡萄糖对照品32.8mg，加水配制成每1ml含0.164mg的溶液，作为对照品溶液。

标准曲线的制备：精密吸取对照品溶液0.1，0.2，0.40，0.50，0.60，0.80，1.0分别置带塞试管中，加蒸馏水至2.0ml，分别加入5％苯酚溶液1ml，摇匀，迅速加入浓硫酸5ml，振摇5min，置沸水浴水中加热15min，取出，置冰水浴中冷却30min，(随行空白)，照分光光度法(《中国药典》)2000年版一部附录V)在490nm处测定吸收度。以吸收度为纵坐标，对照品浓度为横坐标绘制标准曲线。

测定法：精密称取本品0.1g，置100ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取2ml，置10ml量瓶中，照标准曲线的制备项下的方法自“加入5％苯酚溶液1ml”起，依法测定吸收度，从标准曲线上读出供试品溶液中以葡萄糖为对照品计算的含量，即得。

结果：列于表13。

                        表13多糖含量

多糖中间体	葡萄糖g/g	半乳糖醛酸g/g	二者之和g/g
				123456789	0.28160.24190.25460.24600.22570.28790.22400.22010.2345	0.43540.27920.31240.27670.23340.40090.39190.39610.4453	0.71700.52110.56700.52270.45910.68880.61590.61620.6798

多糖中间体含量，以葡萄糖和半乳糖醛酸二者测定含量之和计算。

b以半乳糖醛酸为对照品测定：

对照品溶液的制备：精密称取半乳糖醛酸对照品，加水配成每1ml含0.1985mg的溶液，作为对照品溶液。

标准曲线的制备：精密量取对照品溶液0.05、0.20、0.40、0.60、0.80ml，置试管中，各精密加入蒸馏水至1ml，再分别加入浓硫酸6ml，摇匀后置沸水浴中加热20分钟。以水浴冷却，再加入0.2ml咔唑无水乙醇液(1.0mg/ml)，摇匀后暗处放置1.5小时，以相应的试剂作空白，照分光光度法(《中国药典》)2000年版一部附录VB)在530nm的波长处测定吸收度。以吸收度为纵坐标，对照品浓度为横坐标绘制标准曲线。

测定法：精密称取多糖0.1g，置100ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取1ml，置试管中，照标准曲线的制备项下的方法自“加入浓硫酸”起，依法测定吸收度，从标准曲线上读出供试品溶液中以半乳糖醛酸计算的含量，即得。

结果：列于表34。

(2)多糖得率：以所得总多糖与药材量之比。

4结果：列于表14。

                            表14多糖纯化正交试验

序列	A	B	C	D	得率％	多糖g/g
							123456789	111222333	123123123	123231312	123312231	4.725.436.395.475.595.884.907.385.55	0.71700.52110.56700.52270.45910.68880.61590.61620.6798
得K1率K2K3R×3	16.5316.9417.831.30	15.0818.4017.823.32	17.9716.4516.881.52	15.8516.2119.243.39
							多K1糖K2K3R×3	1.80511.67061.91190.2413	1.85561.59641.93560.3392	2.02201.72361.64200.3800	1.85591.82581.70590.1500

5数据分析

试验结果表时，影响多糖含量的主要因素为C，其次为B，再其次为A、D因素；最佳组合为A₃B₃C₁D₁。影响多糖得率的主要因素为D，其次为B、C因素，A因素影响最小；最佳组合为A₃B₂C₁D₃。方差分析结果表明，各因素均无显著性影响。综合以上分析，多糖含量为主要考虑指标，醇沉时药液浓缩至1∶3，醇浓度为80％，二次醇沉药液浓缩至1∶1，醇浓度为70％。

6结论

多糖纯化的工艺为：第一次醇沉时药液浓缩至1∶3，醇浓度为80％，二次醇沉药液。

4微丸制剂成型工艺研究

微丸的形成机理分为成核、聚结、层结和磨蚀转移四个过程。微丸有许多制备方法，大体上可归纳为四类：旋转式制丸、层积式制丸、压缩式制丸和球形化制丸。

挤出滚圆法制备微丸属于压缩式制丸，即用机械力把药物和赋形剂在挤压机械中挤压成高密度条状物，在离心球形化机械中打碎成颗粒并搓圆成微丸。挤出滚圆法制出的微丸大小均匀、粒度分布窄、药物含量均匀、圆整度好。

以成球性为指标，测定微丸的圆整度、流动性、堆密度，筛选了制剂处方和成型工艺。并与旋转式制丸(多功能造粒包衣机)比较，以挤出滚圆法为佳。

                                  表15微丸制备技术比较

制备技术	成球性能	微丸得率	特点
				挤出滚圆旋转式	较好较好	＞90％60％	大小均匀、粒度分布窄，成品率高粒径大小分布区域宽，易形成不规则形状，辅料用量少

5微丸溶出度测定

5.1以阿魏酸为指标测定

(1)仪器与试药

ZRS-8型智能药物溶出仪(天津大学仪器厂)。Agilent 1100高效液相色谱仪，化学工作站(chimstation system工作站)。阿魏酸：由中国药品生物制品检定所提供，批号：773-9708。试剂均为分析纯。

(2)测试方法

①色谱条件：ZORBAX SB-C₁₈(5μm，4.6×150mm)色谱柱；流动相：甲醇-0.05％冰醋酸(40∶60)；流量：0.6ml/min；柱温：30℃；检测波长：320nm。

②标准曲线：精密称取阿魏酸对照品，加流动相配成浓度分别为2.19、4.38、6.57、8.76、10.95μg/ml的对照品溶液。精密吸取不同浓度的对照品溶液各20μl，按上述色谱条件测定峰面积。以对照品量为横坐标，峰面积积分值为纵坐标，计算得回归方程为：Y＝1813X+215，r＝0.9999。结果表明，阿魏酸在43.8～219.0μg之间呈良好的线性关系。

③溶出度测定；按中国药典2000年版二部附录XC溶出度测定法的第一法进行。以水500ml为释放介质，温度37±0.5℃，转速100±2r/min，分别于15、30、45、60、90min时取样5ml(同时立即补充释放介质5ml)，加于固相萃取小柱上，压滤，离心，精密加甲醇0.5ml，离心，取20μl进样，按峰面积计算样品在各时间内的累积溶出百分率。样品测定6份，每份1g。

(3)实验结果

溶出度试验数据处理结果见表16。

                    表16溶出度参数

参数	T50	Td	m	r
					结果	12.22	21.95	0.625	0.985

(4)讨论：由于溶出度试验可部分反映固体制剂中主药的某些理化性质、处方的组成、辅料品种及性质、生产工艺等各方面的差异，目前对西药固体制剂体外溶出试验已越来越多地被用作质控手段，而在中药固体制剂中体外溶出试验的报道尚不多见。参考含量测定方法和中国药典2000年版二部附录XC建立了当归补血微丸的体外溶出度试验方法，对体外溶出性能进行了考察。试验结果表明，样品溶出较好。样品45min内溶出大于80％。

5.2以黄芪甲苷为指标测定

(1)仪器

ZRS-8型智能药物溶出仪(天津大学仪器厂)。LC-MS联用系统：Water2690高效液相色谱仪(美国Waters公司)；Mariner^TM 5140质谱仪(美国Applied Biosystem公司)：电喷雾离子化接口的飞行时间质谱检测器。质谱工作站：Mariner^TM工作站(4.0版)。

(2)药品与试剂：黄芪甲苷对照品，中国药品生物制品检定所(批号：781-200109)；人参皂苷R_g1对照品，中国药品生物制品检定所(批号：703-9914)；甲醇，色谱纯；当归补血微丸，江苏省中医药研究院制备(批号：20021112)。

(3)对照品溶液的配制：精密称取黄芪甲苷对照品，加甲醇溶解并定容至25ml量瓶中，摇匀，即得0.1m g·ml^-1黄芪甲苷对照品储备液。

(4)内标溶液的配制：精密称取人参皂苷R_g1对照品，加甲醇溶解配制成浓度为1m g·ml^-1人参皂苷R_g1对照品溶液。精密吸取上述溶液1ml，加水稀释至200ml，摇匀，得5μg·ml^-1人参皂苷R_g1内标储备液。

(5)色谱条件

色谱柱：Agilent Hypersiol ODS(5μm，4.6mm×250mm)；流动相：流动相为甲醇∶水(80∶20)，流速1.0ml·min^-1；柱温30℃；进样量40μL。

质谱检测参数：离子极性：正离子(positive)；离子化方式：电喷雾离子化源(ESI)；检测离子：黄芪甲苷([M+Na]⁺)：808，人参皂苷R_g1([M+Na]⁺)：824。

(6)线性关系

分别配置黄芪甲苷标准溶液，浓度为10、20、50、100、200、500、1000、2000ng·ml^-1，同时含浓度为1000ng·ml^-1的内标。分别进样，进样量，40μL，记录峰面积，以对照品峰面积与内标峰面积的比值对对照品浓度X作直线回归，黄芪甲苷10～2000ng·ml^-1与峰面积呈良好的线性关系，回归方程为Y＝1.4725×10^-3X+0.056218，r＝0.999。

(7)样品处理方法

水为释放介质的样品：精密量取样品1.0ml，加于C₁₈固相萃取小柱上，压滤，离心，精密加甲醇0.8ml，离心，甲醇洗脱液中加内标溶液0.2ml，摇匀。取40μl进样，按峰面积计算样品在以水为释放介质的各时间内的累积溶出百分率。

70％乙醇为释放介质的样品：精密量取样品5.0ml，水浴挥去乙醇，加水溶解并转移至5ml容量瓶中，加水至刻度，摇匀，精密量取1.0ml，加于C₁₈固相萃取小柱上，压滤，离心，精密加甲醇0.8ml，离心，甲醇洗脱液中加内标溶液0.2ml，摇匀。取40μl进样，按峰面积计算样品在以70％乙醇为释放介质的各时间内的累积溶出百分率。

(8)两种介质中的溶出度试验

将溶出度测定仪按中国药典2000年版二部附录XC溶出度测定法中蓝法装妥。在释放池中加入500ml(已驱气泡)的蒸馏水(或70％乙醇)，加热使介质温度保持至(37±0.5)℃，调节转速为100r·min^-1(±1％)。开动电机。放入已精密称定的当归补血微丸1g，即刻计时。分别于一定时间间隔定位取样，每次取出释放滤液5ml，并及时补充已预热至37℃的蒸馏水(或70％乙醇)5ml于释放池，平行做4份。测定黄芪甲苷含量，再按下式计算溶出度。

(9)实验结果：二种介质的溶出度试验数据处理见表17。

(10)小结：当归补血微丸在蒸馏水中比在70％乙醇中有更快的溶出速率。

                         表17溶出参数

参数	T50	Td	m	r
					蒸馏水70％乙醇	5.2811.56	8.8718.87	0.7060.747	0.9700.988

6血药浓度法研究当归补血微丸的生物利用度

6.1LC-MS测定黄芪甲苷方法学研究

6.1.1材料与方法

1仪器  Water 2690高效液相色谱仪，MarinerTM BiospectrometryWorkstation质谱仪，Agilent Hypersiol ODS(5μm，4.6mm×250mm)。

2药品与试剂  黄芪甲苷对照品，中国药品生物制品检定所(批号：781-200109)；人参皂苷R_g1对照品，中国药品生物制品检定所(批号：703-9914)；甲醇，色谱纯；当归补血微丸，江苏省中医药研究院制备(批号：D020919)；当归补血汤剂浸膏，江苏省中医药研究院制备(批号：J020919)。

3对照品溶液的配置  精密称取黄芪甲苷对照品，加甲醇溶解并定容至25ml量瓶中，摇匀，即得0.1mg·ml^-1黄芪甲苷对照品储备液。

4内标溶液的配置  精密称取人参皂苷R_g1对照品，加甲醇溶解配制成浓度为1m g·ml^-1人参皂苷R_g1对照品溶液。精密吸取上述溶液1ml，加水稀释至200ml，摇匀，得5μg·ml^-1人参皂苷R_g1内标储备液。

5色谱条件  色谱柱：Agilent Hypersiol ODS(5μm，4.6mm×250mm)；流动相：流动相为甲醇∶水(80∶20)，流速1.0ml·min^-1；柱温30℃；进样量40μL。

质谱检测参数  离子极性：正离子(positive)；离子化方式：电喷雾离子化源(ESI)；检测离子：黄芪甲苷([M+Na]⁺)：808，人参皂苷R_g1([M+Na]⁺)：824。

6血浆样品的提取分离  吸取血浆1.0ml，置于250mg的C18固相萃取小柱上，加压使血浆流过小柱，加水1.0ml洗涤，离心5min(2000r·min^-1)；续精密加入甲醇0.8ml，离心5min(2000r·min^-1)，在甲醇洗涤液中精密加入内标储备液0.2ml，混匀。取40μL直接进样，用峰面积进行定量分析。

6.1.2结果

1方法学研究，在本色谱条件下，黄芪甲苷与血浆样品中的杂质峰及内标峰分离良好，内标人参皂苷R_g1保留时间为3.8min，黄芪甲苷的保留时间为6.5min，峰形好，样品峰与杂质峰分离度＞1.5。

2血浆中黄芪甲苷标准曲线制备及其最低检测浓度测定

取空白大鼠血浆1ml，精密加入不同量的黄芪甲苷标准溶液，按照“血浆样品的提取分离”项下操作，使最终浓度为10、20、50、100、200、500、1000、2000、5000ng·ml^-1，同时含浓度为1000ng·ml^-1的内标。分别进样，进样量，40μL，记录峰面积，以对照品峰面积与内标峰面积的比值对对照品浓度X作直线回归，黄芪甲苷10～5000ng·ml^-1与峰面积呈良好的线性关系，回归方程为Y＝1.2668×10^-3X+0.096557，r＝0.999；黄芪甲苷的最低检测浓度为5ng·ml^-1。

3回收率与精密度试验

方法回收率用空白血浆配置含黄芪甲苷分别为50、200、1000ngml^-1的标准血样，按“血浆样品的提取分离”项下方法操作，测定平均方法回收率分别为98.87％、99.31％、100.15％，RSD为3.90％、2.01％、2.21％(n＝6)。

3.2精密度用  空白血浆配制含黄芪甲苷50、200、1000ng·ml^-1的标准血样，按上述“血浆样品的提取分离”操作，测定峰面积，日内RSD分别为3.90％、2.01％、2.38％(n＝6)。相同浓度的标准溶液在5d内的日间RSD分别为4.28％、4.49％、4.82％。

6.2含药血浆处理方法学研究

1方法：吸取空白血浆1.0ml，加浓度为0.1mg·ml^-1黄芪甲苷对照品100μL，置于250mg的C₁₈固相萃取小柱上，加压使血浆流过小柱，加水1.0ml洗涤，离心5min(2000r·min^-1)；续加50％甲醇1.0ml洗涤，离心5min(2000r·min^-1)，50％甲醇洗脱液为A1；再精密加入甲醇0.8ml，离心5min(2000r·min^-1)，甲醇洗脱液为A2；再精密加入甲醇0.5ml，离心5min(2000r·min^-1)，甲醇洗脱液为A3。在A1、A2、A3中分别精密加入内标储备液0.2ml，混匀。取40μL直接进样。

2结果：A1中未检出黄芪甲苷，表明50％甲醇不能洗脱黄芪甲苷；A2中检出黄芪甲苷，而A3中未检出黄芪甲苷，表明甲醇可洗脱黄芪甲苷，且0.8ml即可完全洗出。

3结论：含药血浆可用C₁₈固相萃取小柱纯化处理。

6.3大鼠口服当归补血微丸与汤剂浸膏后血药浓度测定和生物利用度比较

1方法：SD大鼠144只，分成24组，每组6只，平均体重227g，♀♂各半，给药前禁食12h，全程不禁饮水。12组分别灌胃当归补血微丸浸膏4ml/100g；另12组分别灌胃当归补血汤浸膏4ml/100g；每1ml浸膏相当于含1.5g生药。在给药后1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、5.0、6.0、9.0、12.0、24.0小时分别于眼眶取血，放于肝素化的采血管中，离心5min，离心速度为3000r·min^-1，分离得到大鼠血浆，按“血浆样品的提取分离”项下方法操作，测定得大鼠单次给药后的经时血药浓度。

2结果：当归补血微丸与当归补血汤剂比较，以同等黄芪甲苷含量计算，相对生物利用度为128％，结合工艺改进，生物利用度提高1倍。

3讨论：①本文首次建立了血浆中黄芪甲苷的测定方法，共存组分不干扰、出峰时间合适和方法灵敏度高的优点，对于新药研制开发及体内代谢动力学研究有参考价值。

②中药汤剂为速效制剂，研制的微丸口服后血药浓度达峰时间与汤剂一致，表明研制的微丸达到了速释目的，与体外溶出度试验研究结果一致。7药理效应法研究当归补血微丸的生物利用度

方法：杂种犬15条，分成3组，每组3雌2雄，麻醉，手术，插管，给药前及给药后0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0小时分别测定舒张压、收缩压、心输出量、冠脉流量、心率，心肌耗氧量参照文献计算。

${\mathrm{MVO}}_2[\mathrm{ml}{O}_2/\min /100g]=K_1(\mathrm{BPs}\×\mathrm{HR})+K_2\frac{(0.8\mathrm{BPs}+0.2\mathrm{BPd})\×\mathrm{HR}\×\mathrm{SV}}{\mathrm{BW}}+1.43$

K₁＝4.08×10^-4，K₂＝3.25×10^-4，BPs＝血压收缩压(mmHg)，BPd＝血压舒张压(mmHg)，HR＝心率(次/min)，SV＝每博输出量＝心输出量/心率，BW＝体重(Kg)。

结果：①当归补血微丸组、当归补血汤剂组和空白组动物体重平均分别为：8.7、8.9、8.8Kg，三组间动物体重无显著性差异，具有可比性。

②当归补血微丸、汤剂灌胃给药后均能增加犬心输出量，当归补血微丸组作用优于汤剂组，当归补血微丸组曲线下面积是汤剂组的154％。

③当归补血微丸、汤剂灌胃给药后均能降低犬心率，当归补血微丸组作用优于汤剂组，当归补血微丸组曲线下面积是汤剂组的135％。

④当归补血微丸、汤剂灌胃给药后均能降低犬心肌耗氧量，当归补血微丸组作用优于汤剂组，当归补血微丸组曲线下面积是汤剂组的170％。

结论：初步药理效应法研究当归补血微丸与汤剂的结果，总体表明：微丸作用优于汤剂。

实施例1

(1)醇回流：称取黄芪药材粗粉50g，精密称定。加8倍量70％乙醇回流提取，第二2次加6倍量共回流提取两次，每次1小时，减压浓缩药液并定容到50ml。药渣备用。

(2)将步骤(1)中所得的乙醇液进一步减压浓缩，减压回收乙醇，得醇提浓缩液。

(3)将步骤(2)中所得醇提浓缩液用水饱和的正丁醇振摇三次萃取，合并正丁醇液，蒸干，残渣加甲醇使溶解；

(4)当归醇回流：称取当归药材粗粉50g，精密称定。加8倍量60％乙醇减压回流提取2次，每次1小时，减压浓缩药液并定容到700ml。药渣备用；

(5)将步骤(4)中所得醇浓缩液进一步减压浓缩并减压回收乙醇，得醇提浓缩液；

(6)将步骤(5)中所得醇提浓缩液用醋酸乙脂振摇提5次，每次25ml，合并蒸干，残渣加甲醇使溶解，纯化得当归酚酸成分；

(7)将步骤(1)(4)中所得的药渣按5∶1投料，合并水煎煮，加水12倍量，煎煮2次，每次2小时，得粗多糖；

(8)将步骤(7)中所得的粗多糖加乙醇沉淀，取沉淀，加水溶解，去除不溶物，干燥，称重得多糖；

(9)将(3)中所得的黄芪皂苷，(6)中所得的当归酚酸类成分，(8)中所得的多糖混合并在70％乙醇溶液中以挤出滚圆的技术制得当归补血微丸；该方法所得微丸成球性能较好，微丸得率大于90％，且有大小均匀、粒度分布窄、成品率高的特点。

本发明方法制得的当归补血微丸与当归补血汤制剂相比，其相对生物利用度为128％，药理效应法研究当归补血微丸的生物利用度得出，初步药效研究结果表明，当归补血微丸优于当归补血汤剂。

实施例2

(1)醇回流：称取黄芪药材粗粉50g，精密称定。加8倍量70％乙醇回流提取，第二2次加6倍量共回流提取两次，每次1小时，减压浓缩药液并定容到50ml。药渣备用。

(2)将步骤(1)中所得的乙醇液进一步减压浓缩，减压回收乙醇，得醇提浓缩液。

(3)将步骤(2)中所得醇提浓缩液用AB-8型大孔吸附树吸附纯化；

(4)当归醇回流：称取当归药材粗粉50g，精密称定。加8倍量60％乙醇减压回流提取2次，每次1小时，减压浓缩药液并定容到700ml。药渣备用；

(5)将步骤(4)中所得醇浓缩液进一步减压浓缩并减压回收乙醇，得醇提浓缩液；

(6)将步骤(5)中所得醇提浓缩液用大孔吸附树脂吸附纯化得当归酚酸成分；

(7)将步骤(1)(4)中所得的药渣按5∶1投料，合并水煎煮，加水12倍量，煎煮2次，每次2小时，得粗多糖；

(8)将步骤(7)中所得的粗多糖加乙醇沉淀，取沉淀，加水溶解，去除不溶物，干燥，称重得多糖；

(9)将(3)中所得的黄芪皂苷，(6)中所得的当归酚酸类成分，(8)中所得的多糖混合并在70％乙醇溶液中以旋转式的技术制得当归补血微丸；该方法所得微丸成球性能较好，微丸得率大于60％，且有粒径大小分布区域宽、易形成不规则形状，辅料用量少的特点。

与单剂量由一个单元组成的剂型相比，具有如下特点：①微丸剂服用后可广泛、均匀地分布在胃肠道内，由于药物在胃肠表面分布面积增大，提高了生物利用度，减小了局部刺激性。②由于粒径小，微丸在胃肠道内的转运不受食物输送节律的影响(尤其是幽门的启闭)，因此胃空速率对其影响小。若微丸用非生物降解材料包衣，则可获得重现性好、不依赖pH的零级释药速率。③将微丸进一步制成缓释或控释制剂(通过包衣技术实现)，其释药行为是组成一个剂量的各个微丸释药行为的总和，个别微丸在制备上的失误或缺陷不致对整体制剂的释药行为产生严重影响，因此在释药规律的重现性、一致性方面优于缓释片剂。④几种不同释药速率的微丸可按需要制成胶囊，服后既可使血药浓度迅速达到治疗效果，并能维持平稳、长时间的有效血药浓度，降低不良反应发生率。⑤由不同微丸组成的复方胶囊，可增加药物的稳定性，提高疗效，降低不良反应，且有利于生产工艺过程中的质量控制。⑥流动性好，分剂量准确，易于包衣或填充胶囊。⑦适合复方制剂的配伍。

本发明的实施例不以任何形式限定本发明的实施，凡以等同替换或等效变换的形式所采用的技术方案，均落在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1、一种当归补血微丸的制备方法，它包括下列步骤：

(1)黄芪醇回流：--------称取黄芪药材粗粉，精密称定，加醇回流提取并浓缩药液得醇液和药渣，药渣备用；

(2)将(1)中所得醇液进一步浓缩，并回收醇液，得醇提浓缩液；

(3)将步骤(2)中所得醇提浓缩液用有机溶剂萃取或用大孔树脂进行吸附纯化可得黄芪皂苷；

(4)当归醇回流--------称取当归药材粗粉，精密称定，加醇液提取并浓缩得醇液和药渣，药渣备用；

(5)将(4)中所得醇液进一步浓缩，并回收醇，得醇提浓缩液；

(6)将(5)中所得醇提浓缩液用有机溶剂或大孔树脂进行吸附、纯化可得当归酚酸类成份；

(7)将(1)(4)两步中的药渣合并加水溶解得水提取液，浓缩得粗多糖溶液；

(8)将(7)所得粗多糖溶液加乙醇使含醇量达60％-85％沉淀，得多糖；

(9)将(3)中的黄芪皂苷，(6)中的当归酚酸类成分，(8)中的多糖混合造丸得当归补血微丸。

2、根据权利要求1所述的一种当归补血微丸的制备方法，其特征在于步骤(1)中所述的醇液为乙醇液，重量百分比浓度为55％---95％。

3、根据权利要求2所述的一种当归补血微丸的制备方法，其特征在于其中所述的乙醇溶液重量百分比浓度为60％---75％。

4、根据权利要求3所述的一种当归补血微丸的制备方法，其特征在于其中所述的乙醇液重量百分比浓度为65％。

5、根据权利要求1所述的一种当归补血微丸的制备方法，其特征在于其中步骤(3)所述有机溶剂是丁醇、乙醇或丙酮。

6、根据权利要求1所述的一种当归补血微丸的制备方法，其特征在于其中步骤(6)所述的有机溶剂是醋酸乙酯、乙醇或丁醇。

7、根据权利要求1所述的一种当归补血微丸的制备方法，其特征在于其中所述的大孔吸附树脂是AB-8型大孔吸附树脂。

8、根据权利要求1所述的一种当归补血微丸的制备方法，其特征在于其中步骤(9)所述的当归补血微丸按提取物1-3份、改良淀粉0-1份、微晶纤维素0-3份、微粉硅胶0.5-3份、硬脂酸镁0.05-0.5份在40％-80％乙醇中以挤出滚圆的技术方式得补血微丸。

9、根据权利要求1所述的一种当归补血微丸的制备方法，其特征在于步骤如下：

(1)黄芪醇回流：称取黄芪药材粗粉50g，精密称定，加8倍量70％乙醇回流提取，第二2次加6倍量共回流提取两次，每次1小时，减压浓缩药液并定容到50ml；药渣备用；

(2)将步骤(1)中所得的乙醇液进一步减压浓缩，减压回收乙醇，得醇提浓缩液；

(3)将步骤(2)中所得醇提浓缩液用水饱和的正丁醇振摇三次萃取，合并正丁醇液，蒸干，残渣加甲醇使溶解；

(4)当归醇回流：称取当归药材粗粉50g，精密称定；加8倍量60％乙醇减压回流提取2次，每次1小时，减压浓缩药液并定容到700ml；药渣备用；

(5)将步骤(4)中所得醇浓缩液进一步减压浓缩并减压回收乙醇，得醇提浓缩液；

(6)将步骤(5)中所得醇提浓缩液用醋酸乙脂振摇提5次，每次25ml，合并蒸干，残渣加甲醇使溶解，纯化得当归酚酸成分；

(7)将步骤(1)(4)中所得的药渣按5∶1投料，合并水煎煮，加水12倍量，煎煮2次，每次2小时，得粗多糖；

(8)将步骤(7)中所得的粗多糖加乙醇沉淀，取沉淀，加水溶解，去除不溶物，干燥，称重得多糖；

(9)将(3)中所得的黄芪皂苷，(6)中所得的当归酚酸类成分，(8)中所得的多糖混合并在70％乙醇溶液中以挤出滚圆的技术制得当归补血微丸。

10、根据权利要求1所述的一种当归补血微丸的制备方法，其特征在于步骤如下：

(1)黄芪醇回流：称取黄芪药材粗粉50g，精密称定；加8倍量70％乙醇回流提取，第二2次加6倍量共回流提取两次，每次1小时，减压浓缩药液并定容到50ml；药渣备用；

(2)将步骤(1)中所得的乙醇液进一步减压浓缩，减压回收乙醇，得醇提浓缩液；

(3)将步骤(2)中所得醇提浓缩液用AB-8型大孔吸附树吸附纯化；

(4)当归醇回流：称取当归药材粗粉50g，精密称定；加8倍量60％乙醇减压回流提取2次，每次1小时，减压浓缩药液并定容到700ml；药渣备用；

(5)将步骤(4)中所得醇浓缩液进一步减压浓缩并减压回收乙醇，得醇提浓缩液；

(6)将步骤(5)中所得醇提浓缩液用大孔吸附树脂吸附纯化得当归酚酸成分；

(7)将步骤(1)(4)中所得的药渣按5∶1投料，合并水煎煮，加水12倍量，煎煮2次，每次2小时，得粗多糖；

(8)将步骤(7)中所得的粗多糖加乙醇沉淀，取沉淀，加水溶解，去除不溶物，干燥，称重得多糖；

(9)将(3)中所得的黄芪皂苷，(6)中所得的当归酚酸类成分，(8)中所得的多糖混合并在70％乙醇溶液中以旋转式的技术制得当归补血微丸。

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