CN1939378A - 活血止痛胶囊的制备工艺 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种活血止痛胶囊的制备工艺。该工艺将当归与乳香采用超临界萃取，萃取的挥发油采用β－环糊精制备成挥发油包合物，与冰片的β－环糊精包合物、当归与乳香超临界萃取的药渣的醇提物、土鳖虫和自然铜粉的水提物、三七超微粉混合制粒，灌装胶囊。采用该工艺制备的活血止痛胶囊疗效好，副作用少。

Description

活血止痛胶囊的制备工艺

技术领域

本发明属于中药制药领域，涉及一种活血止痛胶囊的制备工艺。

背景技术

活血止痛胶囊是经典中成药，该方源于清代道光年间“豫章彭竹楼民部家传秘方”，收载于《验方新编》卷十三，处方最早见报道于1975年出版的《赵炳南临床经验集》，现收载于新药转正标准(WS₃-084(Z-74)-95(Z))，该药组方合理，配伍精简，药专力洪，疗效确切，临床反应较好，为治疗跌打损伤、瘀血肿痛的首选药物。由于部颁标准受当时条件限制，该活血止痛胶囊的制法仅采用简单粉碎技术，故制剂质量较差，往往容易造成重金属超标、微生物含量超标、制剂稳定性差、生物利用度不高等缺点，故不少单位对其制备工艺进行了改进，或者将其剂型改为片剂、丸剂、软胶囊等，但主要工艺步骤多数仍局限于水(醇)提、醇沉、粉碎等手段的简单组合，没有很好地根据处方中各原料药材的特点进行有针对性地加工利用。

当归为伞形科植物Angelica sinensis(Oliv)Diels的干燥根，是处方中君药，具有抗凝血抗血栓、改善血液循环、抗炎、镇痛、解除平滑肌痉挛等作用。其所含挥发油以藁苯内酯为主，还有少量β-罗勒烯-χ、藁本内酯二聚物、香荆芥酚、黄樟醚、正丁烯基辅内酯等80余种成分，具有抗炎镇痛作用，可显著抑制醋酸所致的小鼠扭体反应，对炎症早期的水肿和渗出及炎症晚期的组织增生和肉芽组织增殖均有明显的抑制作用。另外，阿魏酸为当归中较早分离出的药效成分，既可溶于水又可溶于醇，具有抗炎、抗血小板聚集作用。文献报道，采用一定浓度的乙醇提取可以获得较高的提取率。

             藁苯内酯                                       阿魏酸

乳香为橄榄科植物小乔木或乔木卡氏乳香树Boswellia carterii Birdn.鲍达乳香树Boswellia bhdw-dagand Birdw及野乳香树Boswellia neglecta M Moore等干燥的树酯，含有蒎烯、柠檬烯、a-乳香脂酸等成分。关于乳香抗炎镇痛的药用部位，不同研究者有着不同的见解，一种认为乳香挥发油具有毒害作用和刺激性，易引起恶心、呕吐等反应，应予以除去。而另一种观点认为，乳香挥发油是镇痛作用的有效部位，应保留。对于乳香的抗炎作用，有的学者认为乳香挥发性成分为有效成分，醇提部位具有抗炎作用，超临界萃取物具有抗炎镇痛作用。

                  尿囊素

土鳖虫为鳖蠊科昆虫地鳖Eupolyphagasinensis Walker.或冀地鳖Steleophagaplancyi(Boeny).的雌虫干燥体。主要成分为蛋白质、挥发油(约20种)、脂肪酸、氨基酸(17种)、甾醇及多种微量元素等。现已从土鳖虫中分离出的单体有胆甾醇，棕榈酸和5，4二羟基-7-甲氧基黄酮，二十八烷醇，β-谷甾醇，十八烷基甘油醚(鲨肝醇)，尿嘧啶和尿囊素。其中尿囊素具有镇静、促进组织修复等作用。另外、大量文献报道，土鳖虫水提液具有抗凝血、抗血栓、镇痛作用。

自然铜主要成分为FeS₂，具有续筋接骨的作用，水煎液中铅的含量会大大降低，而铁离子含量仍保持较高水平。

三七为五加科植物三七Panax notoginseng(Burk)F.H.Chen的干燥根，主要成分为三帖皂苷、三七素等，为贵重药材，具有镇痛、抗炎、止血等作用，而且“生撵熟补”，生品重于散瘀止血，熟品重于补血和血，为发挥三七活血逐瘀的功效，一般将生药粉碎后直接入药。文献报道，采用超微粉碎可以大大提高三七总皂苷的溶出。有学者比较了三七超细粉与常规粉碎的三七药粉的家兔体内吸收情况，三七超细粉吸收人参皂苷Rb₁、Rg₁、Re更快，量更大，并且二者之间有显著性差异，说明三七经超微粉碎后增加了体内吸收，提高了生物利用度。

冰片(syntheticborneol)主要含龙脑(borneol)和异龙脑(isoborneol)，在活血止痛胶囊处方中作为佐使之剂，起开窍醒神、清热止痛的功效，中医理论认为其走窜力强，具有辅助药性的作用，“独行势弱，佐使有功”，可以“引药上行”。现代药理学研究表明，冰片不但具有抗炎、抗菌、止痛的作用，还可以促进药物透皮吸收，促进药物透过血脑屏障，促进提高药物体内浓度。由于冰片在生产和贮存过程中容易逸失，采用β-环糊精包合技术将其包合，以增加药物的稳定性。

龙脑

超临界流体萃取技术(Superitical Fluid Extraction，简称SFE)是20世纪兴起的一种提取、分离技术。上世纪50年代，美国的Todd和Elain首先在理论上提出了其可行性，直到70时年代才用于提取和分离。超临界流体兼有气、液两者的特点，密度接近于液体，粘度和扩散系数接近于气体，不仅具有与液体溶剂相当的溶解能力，而且具有优良的传质性能。如超临界CO₂的粘度是液态CO₂的百分之一，自扩散系数是液体的100倍。CO₂极性小，适于提取分子量小、亲脂性的挥发油、内酯、环氧化合物等物质，且CO₂安全无毒，容易获得。超临界流体萃取技术就是利用超临界流体的这种特殊性质，在高压条件下将超临界流体与待分离的固体或液体混合物接触，调节系统的操作压力和温度，萃取出所需要的物质，随后通过降压或升温的方法，降低超临界流体的密度，使萃取物得到分离，该技术具有低温提取、保持有效成分的活性、没有溶剂残留和可进行选择性分离等特点，是利用超临界状态下CO₂的较好的溶剂特性，对挥发性较强的成分、热敏性物质和脂溶性成分的提取分离具有较好的效果，正受到越来越多的重视，新的研究、应用成果不断问世。

超临界提取的影响因素有SFE的流体比、CO₂流量、压力、时间、温度、粉碎粉粒度等。压力是SFE中最重要的参数。一定温度下，随着压力的增大，流体密度显著增加，溶质的溶解度增大，萃取效率提高。但过高的压力使生产成本明显提高，其萃取率增加有限。在SFE过程中，温度增加，加强了其扩散能力，使得被萃取物在超临界CO₂中溶解度增加。有利于萃取。但随着温度的增加，杂质的溶解度也增加，使精制过程复杂化，从而降低产品的收率。同时温度增加，CO₂流体的密度降低，使得对溶质的溶解力下降，降低产品收率。萃取时间增加，有利于超临界流体与溶质中有效成分的溶解平衡，增加萃取的时间就增加萃取得率。由于萃取一定时间后，随着溶质中有效成分的减少，再增加萃取时间，萃取得率增加缓慢，能耗增加。而且有些无效成分也更多地被萃取出来，直接影响产品的质量。

包合物技术可使药物在体内的达峰时间缩短，促进药物在体内的吸收，达峰浓度升高，提高生物利用度，并使药物在体内的滞留时间缩短，消除半衰期缩短，消除迅速，使药物在达到治病疗效的同时不会在体内滞留很长时间，减少副作用。

ZL03112939.0公开了一种活血止痛胶囊的制备方法(以下称原工艺)，该专利将超临界萃取技术、包合技术及超微粉碎技术应用于活血止痛胶囊制备工艺，具体步骤是将三七、制乳香、煅自然铜制成超微粉，将当归超临界萃取物以及冰片制成包合物，将土鳖虫和当归药渣水提物制成细粉，混合均匀装入胶囊。该制备方法较部颁标准的简单粉碎技术有了较大提高，但仍存在一些不足，如未将乳香中的有效成分挥发油部位提取出来，进行包合可以减轻乳香挥发油对胃肠道的刺激作用，而且由于乳香为树脂类物质在微粉化产业化方面存在一定困难；自然铜(煅)中铅、砷等有害金属元素会因为微粉化而增加人体吸收；土鳖虫现多为人工饲养，体内含有大量的食物，采用粉碎工艺无法除去食物等。

发明内容

本发明的目的是提供一种活血止痛胶囊的制备工艺。

本发明的目的是通过下列技术措施实现的：

一种活血止痛胶囊的制备工艺，选用原料药的重量份为当归40份、三七8份、乳香(制)8份、冰片2份，土鳖虫20份、自然铜(煅)12份，该工艺包括以下步骤：

a、按重量份配比称取原料药当归、三七、乳香(制)、冰片、土鳖虫、自然铜(煅)，备用；

b、粉碎：将当归与乳香(制)按处方比例混合均匀，粉碎成颗粒，备用；三七粉碎成粒径10-30μm的三七超细粉备用；

c、CO₂超临界萃取：取当归与乳香(制)混合颗粒于萃取釜中，CO₂超临界萃取，其中压力为24-36Mpa，萃取釜温度为40-60℃，CO₂流速为10～30L/h，萃取时间为0.5-1.5小时，收集当归与乳香(制)超临界萃取的挥发油，备用；

d、挥发油包合：取当归与乳香(制)超临界萃取的挥发油重量4-8倍量的β-环糊精，加入β-环糊精重量2-3倍量的水研匀，倒入胶体磨中，缓慢连续滴加当归与乳香(制)超临界萃取的挥发油，碾磨包合20-40分钟，倾出，冷藏静置，滤过，真空干燥，即得挥发油包合物；

e、冰片包合：取冰片重量4-6倍量的β-环糊精，加入β-环糊精量1-3倍量的水研匀，倒入胶体磨中，缓慢连续滴加用适量乙醇溶解的冰片，碾磨包合30-50分钟，倾出，冷藏静置，滤过，真空干燥，即得冰片包合物；

f、醇提：当归与乳香(制)超临界萃取的药渣用药渣重量6-10倍量的浓度为50-70％的乙醇搅拌回流提取1-3次，每次1-2小时，回流液静置，吸取上清液，滤过，滤液减压浓缩至60℃相对密度为1.15-1.25的清膏，得清膏I，备用；

g、水提：自然铜(煅)粉用布袋包裹，加入土鳖虫，用自然铜(煅)粉与土鳖虫总重量4-8倍量的水提取1-3次，每次1-2小时，合并水提液，静置，取上清液，滤过，滤液减压浓缩至60℃时相对密度为1.15-1.25的清膏，得清膏II，备用；

h、混合、干燥、粉碎：将清膏I和清膏II混合均匀，加入三七超细粉，真空干燥至干膏，粉碎成80-120目的细粉备用；

I、制粒：将干膏细粉、挥发油包合物及适量糊精混合，以70-90％乙醇为黏合剂制成软材，16-20目筛制粒，40-80℃干燥，整粒，加入冰片包合物，混匀，装入胶囊即可。

本发明的有益效果：

本发明提供的活血止痛胶囊工艺中，运用了超临界萃取技术、β-环糊精包合技术、超微粉碎技术等先进技术，并采用统计学实验方法优化提取和制备工艺，采用本发明工艺制备的活血止痛胶囊比现有技术制备的活血止痛胶囊疗效好、重金属含量低、稳定性好、对人体副反应反应率降低。

本工艺中针对不同的原料采用不同的制备工艺，使各原料的有效部位能够得到充分应用，并减少了副作用，具体体现在以下几个方面：

(一)当归乳香CO₂超临界萃取挥发油工艺的研究

1、正交试验  影响CO₂超临界萃取挥发油得率的主要因素有萃取釜压力、萃取釜温度、CO₂流速和萃取时间，因此选用正交表L₉(3⁴)设计正交试验，取当归乳香药材混合粉400g(过3号筛，其中当归∶乳香为5∶1)，以萃取率(％)为评价指标，试验安排及结果见表1。

                          表1  因素水平表

水平	因素
					A萃取压力(MPa)	B萃取温度(℃)	CCO2流速(L/h)	D萃取时间(h)
	123	243036	405060	102030					0.511.5

以萃取率为指标考察，极差分析结果：B＞A＞D＞C，即影响萃取效果的因素顺序为：萃取温度＞萃取压力＞萃取时间＞C0₂流速。最佳工艺条件为A₃B₃C₂D₃，即萃取压力为36MPa，萃取温度为60℃，CO₂流速为20L/h，萃取时间为1.5h。进一步以C因素为误差项进行方差分析，三个因素对提取结果均无显著性差异。

2、验证试验  为了验证正交试验的可行性，取当归、乳香混合粉400g，按照上述最佳工艺条件进行3批验证试验，以萃取率(％)为考察指标，三批试验平均萃取率为7.6％，表明该工艺稳定可行。

(二)当归乳香CO₂超临界萃取药渣醇提工艺的研究

1、正交试验  影响醇提工艺的主要因素有乙醇浓度、溶剂倍量、回流时间和提取次数。上述4个因素各取3个水平进行L₉(3⁴)正交试验，取当归乳香CO₂超临界萃取的药渣20g，以干膏得率(％)、阿魏酸含量(％)为评价指标，筛选最佳提取工艺，试验安排及结果见表2。

                   表2  因素水平表

水平	因素
					A乙醇浓度(％)	B溶剂倍量(倍)	C提取时间(h)	D提取次数(次)
	123	506070	6810	11.52					123

以干膏得率为指标，极差分析结果：D＞B＞C＞A。即影响醇提效果的因素顺序为：提取次数＞溶剂倍量＞提取时间＞乙醇浓度。最佳工艺条件为A₃B₃C₃D₃，即70％乙醇，10倍量，每次2小时，提取3次。以A因素为误差项进一步方差分析。提取次数对醇提结果有显著影响。

以阿魏酸含量为指标，极差分析结果：D＞B＞C＞A。即影响醇提效果的因素顺序为：提取次数＞溶剂倍量＞提取时间＞乙醇浓度。最佳工艺条件为A₂B₂C₂D₃，即60％乙醇，8倍量，每次1.5小时，提取3次。以A因素为误差项进一步方差分析。提取次数对醇提结果有显著影响。

为了更合理的评价正交试验的结果，采用综合评分寻找最佳工艺，计算方法如下：在两个指标中，分别选取最高者作为100分，其余按公式计算：得分y_i′＝100-最高值+y_i，然后对两个指标赋与不同的权重。赋予干膏得率权重系数为0.4，阿魏酸含量权重系数为0.6，按此方法计算公式如下：

综合得分＝干膏得率得分×0.4+阿魏酸含量得分×0.6

采用综合评分，由极差分析结果：D＞B＞C＞A，即影响醇提效果的因素顺序为：提取次数＞溶剂倍量＞提取时间＞乙醇浓度。最佳工艺条件A₃B₃C₂D₃，即70％乙醇，10倍量，每次1.5小时，提取3次。以A因素为误差项进一步方差分析。提取次数对提取结果有显著差异。

2、追加验证试验

为了验证正交试验的结果，同时由于提取次数对试验结果有显著性影响，因此将提取次数再上浮一个档次进行追加验证试验，确定最佳工艺。取当归乳香超临界萃取药渣400g，以10倍量的70％乙醇提取，分别提取3次和4次，每次1.5小时。以干膏得率和阿魏酸含量为考察指标。结果表明，提取3次和4次所得干膏得率和阿魏酸含量无显著增加，考虑到大生产等成本因素，确定提取次数为3次。最佳醇提取工艺为：A₃B₃C₃D₃。即70％乙醇、10倍量、每次1.5小时、提取3次。

(三)土鳖虫、自然铜(煅)水提工艺的研究

1、正交试验  影响水提工艺的主要因素有加水倍量、提取时间和提取次数。上述3个因素各取3个水平进行L₉(3⁴)正交试验，取土鳖虫10g，自然铜(煅)6g(包煎)，以干膏得率(％)、铅含量(ppm)、尿囊素含量(％)、砷含量(ppm)和铁含量(％)为考察指标，筛选最佳提取工艺。试验安排及结果见表3。

                      表3  因素水平表

水平	因数
				A溶剂倍量(倍)	B提取时间(h)	C提取次数(次)
	123	468	11.52				123

此实验是多指标的优化实验，其中有些指标如尿囊素含量和铁含量欲求其最大值，而有些指标如得膏率、铅含量和砷含量则越小越好，因此在优化过程中需对各个指标进行综合考虑和权衡，根据试验结果及要求，首先将各指标确定最大值和最小值。

其次将各指标进行规格化。对于欲达到最大化的指标，如尿囊素含量和铁含量，其规格化方程为：d_i＝(Y_i-Y_min)/(Y_max-Y_min)。对于要进行最小化的指标，如得膏率、铅含量和砷含量，其规格化方程为：d_i＝(Y_max-Y_i)/(Y_max-Y_min)。

其根据规格化方程计算出各指标的规格化值后，由下式计算综合指标OD＝(d₁d₂d₃...d_k)^1/k，进行直观分析和方差分析，极差分析结果：C＞B＞A，即影响水提效果的因素顺序为：提取次数＞提取时间＞溶剂倍量。A₃B₂C₃为最佳因素水平组合，即8倍量水，每次1.5小时，提取3次。经方差分析可知，三因素对提取结果均无显著差异。

2、验证试验

取土鳖虫10g和自然铜(煅)6g，按照上述最佳工艺条件进行3批验证实验。以干膏得率、铅含量、尿囊素含量、砷含量和铁含量为考察指标，三批验证试验与正交试验结果相符，表明该工艺稳定可行。

(四)冰片及当归乳香挥发油β-环糊精包合工艺研究

β-环糊精包合的方法有饱和水溶液法，超声法和碾磨法，考虑到冰片和当归乳香挥发油的理化性质和产业化等因素，选用胶体磨法进行β-环糊精包合的研究。影响包合效果的主要因素有主客分子比，加水倍量和包合时间。对冰片和当归乳香挥发油的包合，分别选用不同的考察方法。

1、冰片β-环糊精包合工艺的研究

1.1、正交试验  取冰片10g，采用L₉(3⁴)正交设计，以龙脑含量(％)和龙脑利用率(％)为评价指标，筛选最佳包合工艺，试验安排和结果见表4。

                 表4  正交试验因素水平表

水平	因素
				A冰片∶β-CD(重量比)	B加水倍量(倍)	C包合时间(min)
	123	1∶41∶51∶6	123				304050

以龙脑含量为指标，极差分析结果：A＞B＞C，即影响包合效果的因素顺序：冰片∶β-CD＞加水倍量＞包合时间，最佳工艺条件为A₂B₃C₃，即冰片∶β-CD重量比为1∶5，加水量为3倍量，包合时间为50分钟。以D项为误差项，进一步方差分析，结果冰片∶β-CD重量比比有显著性差异。

以龙脑利用率为指标，极差分析结果：A＞C＞B，即影响包合效果的因素顺序：冰片∶β-CD重量比＞包合时间＞加水倍量，最佳工艺为A₃B₃C₂，即冰片∶β-CD重量比为1∶6，加水倍量为3倍量，包合时间为40min。以D项为误差项，进一步方差分析，结果冰片∶β-CD重量比有显著性差异。

为了更合理的评价正交试验的结果，寻找最佳工艺，计算方法如下：在两个指标中，分别选取最高者作为100分，其余按公式计算：得分y_i′＝100-最高值+y_i ^【21】，然后对两个指标赋与不同的权重。赋予包合物龙脑含量权重系数为0.4，龙脑利用率权重系数为0.6，进行综合评价分析，计算公式如下：

综合得分＝龙脑含量得分×0.4+龙脑利用率得分×0.6

综合评分分析，极差分析结果：A＞C＞B，即影响包合效果的因素顺序：冰片∶β-CD＞包合时间＞加水倍量，最佳工艺条件为A₂B₃C₂，即1∶5，3倍量水，包合40分钟。进一步方差分析，三因素均无显著性差异。

1.2、验证实验

为了验证最佳包合工艺与正交试验是否相符，取冰片10g，按优选的最佳工艺进行三批验证试验，以龙脑含量(％)和龙脑利用率(％)为考察指标，验证试验结果证实该工艺稳定可行。最后确定最佳工艺条件为A₂B₃C₂，即冰片∶β-CD重量比为1∶5，加水量为3倍量，包合时间为40分钟。

2、当归乳香挥发油β-环糊精包合工艺的研究

2.1、正交试验  取当归乳香挥发油10g，以包合物含油量为考察指标，评选最佳包合工艺。实验安排和结果见表5。

                 表5  因素水平表

水平	因素
				A油∶β-CD(g/g)	B加水倍量(倍)	C包合时间(min)
	123	1∶41∶61∶8	22.53				203040

以含油量为指标进行考察，极差分析结果为A＞B＞C，即油∶β-CD＞加水倍量＞包合时间，最佳工艺条件为A₁B₂C₃。即油∶β-环糊精(1∶4)、加水2.5倍、包合时间40min。以D项为误差项进行方差分析，三因素均无显著性影响。

2.2、验证试验  为了验证最佳包合工艺与正交试验结果是否相符，按优选的最佳工艺进行3批验证试验，取当归乳香挥发油10g，以含油量为考察指标，验证结果证实与正交结果基本相符，故确定最佳工艺条件为A₁B₂C₃。即油∶β-环糊精(1∶4)、加水2.5倍、包合时间40min。

(五)三七超微粉碎工艺的研究

1、三七预处理条件的选择

三七以药材细粉入药，在采收运输等过程中感染细菌，微生物限度超过《中国药典》所规定的限度。现分别称取30g药材粗粉，按照国家卫生部药发【1997】第38号文⁶⁰Co辐照药材灭菌法进行预处理，结果微生物限度检查均能符合要求。

2、三七超微粉碎

三七的超微粉碎，采用二次粉碎法。首先用万能粉碎机将三七粉碎成80目的粗粉，平均得粉率为97.3％。然后委托南京天目超微技术开发有限公司进行超微粉碎，得粉率为90.4％。

超细粉经扫描电镜检测，粒径2～8μm，正态分布测定为97.05％(10～30μm)。

超微粉碎设备：TC20药用超微粉碎机

超微粉碎工艺参数：空气压力0.5～0.8Mpa；空气压力露点0～5℃；空气量3M³/min；进料粒度80目；加料速度100g/min；分级机频率设定45Hz。

(六)、制法

将干膏细粉、挥发油包合物及适量糊精混合，以90％乙醇为黏合剂制成软材，20目不锈钢筛制粒，40～80℃干燥，整粒，加入冰片包合物，混匀，胶囊灌装，制成1000粒。

(七)质量标准研究

【性状】本品为胶囊剂，除去胶囊呈棕色至棕褐色颗粒；气香、味微苦。

【鉴别】(1)取本品(按实施例1制得，下同)约1g，加稀盐酸1ml，加热煮沸数分钟，滤过，滤液显铁盐的鉴别反应(《中国药典》2005年版一部附录IVB)。

(2)取本品1.5g，研细，加乙醚40ml，超声处理10分钟，滤过，滤液作为供试品溶液。另取当归对照药材0.5g，同法制成对照药材溶液。照薄层色谱法(《中国药典》2005年版一部附录VI B)试验，吸取上述两种溶液各10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以正己烷-醋酸乙酯(9∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。

(3)取本品胶囊内容物2.5g，研细，加乙醚30ml，超声处理10分钟，滤过，滤液作为供试品溶液。另取乳香对照药材0.5g，同法制成对照药材溶液。照薄层色谱法(《中国药典》2005年版一部附录VI B)试验，吸取供试品溶液10μl、对照品溶液5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以石油醚(30-60℃)-醋酸乙酯(19∶2)为展开剂，展开，展距为8cm，取出，晾干，喷以10％的硫酸乙醇溶液，105℃烘至显色。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。

(4)取本品2.5g，研细，加乙醚40ml，超声处理10分钟，滤过，药渣挥去乙醚，加甲醇30ml，超声处理15分钟，滤过，滤液蒸干，加水10ml溶解，用水饱和的正丁醇振摇提取2次，每次15ml，合并正丁醇液，用水洗涤2次，每次10ml，正丁醇液蒸干，残渣加甲醇2ml使溶解，作为供试品溶液。另取三七对照药材1g，加甲醇30ml，同法制成对照药材溶液。照薄层色谱法(《中国药典》2005年版一部附录VI B)试验，吸取上述两种溶液各5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以正丁醇-醋酸乙酯-水(4∶1∶5)上层溶液为展开剂，展开，取出，喷以10％硫酸乙醇溶液，105℃加热数分钟，分别置日光和紫外光灯(365nm)视检，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。

【检查】应符合胶囊剂项下有关的各项规定(《中国药典》2005年版一部附录IL)。

【含量测定】照高效液相色谱法(《中国药典》2005年版一部附录VID)测定

色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-甲醇-1％醋酸水(1∶1∶5)作为流动相；检测波长为316nm。理论板数按阿魏酸峰计算应不低于2000。

对照品溶液的制备取阿魏酸对照品适量，精密称定，置棕色量瓶中，加甲醇制成每1ml含4μg的溶液，即得。

供试品溶液的制备  取内容物适量，研细，取粉末适量(约0.5g)，精密称定，置具塞三角烧瓶中，精密加入25ml甲醇-甲酸(9∶1)溶液，称定重量，超声提取30分钟，放冷，补足减失的重量，摇匀，过0.45μm微孔滤膜即得(避光操作)。

测定法  分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

本品每粒含当归以阿魏酸(C₁₀H₁₀O₄)计，不得少于0.09mg。

本发明的药效学实验：

本实验研究活血止痛胶囊(新工艺)(按实施例1制得，下同)的镇痛、抗炎、抗凝血和抗血栓几方面的作用，证实其主要药效学功效。动物采用小鼠和大鼠，分别设置对照组、活血止痛胶囊(新工艺)组、活血止痛胶囊(原工艺)组，所设剂量小鼠试验高、中、低剂量分别为3.0、1.5、0.75g(生药量)/kg，大鼠试验高、中、低剂量分别为2.10、1.05、0.53g(生药量)/kg，活血止痛胶囊(原工艺)给药剂量相当于活血止痛胶囊(新工艺)中剂量。对照组采用0.5％CMC-Na。

1.活血止痛胶囊(新工艺)镇痛试验

1.1.小鼠醋酸扭体法镇痛试验

取健康昆明小鼠，按体重随机分组，小鼠给药体积0.5ml/20g，连续灌胃给药6天，禁食12小时，自由饮水，第7天再给药一次，给药后40min腹腔注射0.6％醋酸溶液0.20ml/只，观察并记录腹腔注射醋酸溶液后15min内动物的扭体反应次数。以次数来表示疼痛程度的指标，各实验组扭体反应次数均值与对照组进行比较并进行t检验。试验结果以15min内扭体反应次数表示，统计学检验采用组间t-student检验，结果见表7。

表7.活血止痛胶囊(新工艺)醋酸扭体法小鼠镇痛试验实验结果

组别	给药量(g/kg)	动物数	扭体反应次数X±SD
				对照组	---	12	34.92±6.9
活血止痛胶囊(新工艺)组	3.01.50.75	141414	6.1±2.4**13.5±2.9**21.1±4.3**
				活血止痛胶囊(原工艺)组	1.5	14	13.6±2.7**

注：^**：P＜0.01；与对照组比较(t检验)。

活血止痛胶囊(新工艺)小鼠扭体数的量效关系公式为：

Y＝-24.914X+92.697，r＝0.9999

[其中Y为扭体数，X为对数剂量，r为相关系数。量效关系曲线见图1]

试验结果表明活血止痛胶囊(新工艺)高、中、低剂量组的小鼠扭体反应数与对照组比较有极显著差异(P＜0.01)，说明活血止痛胶囊(新工艺)具有明显的镇痛作用。给药对数剂量与小鼠扭体数呈明显的线性关系，表明量-效关系明显。与活血止痛胶囊(原工艺)比较，同等给药量下降低小鼠扭体反应数效果一致。

1.2.小鼠热水缩尾法镇痛试验

取健康昆明小鼠，按体重随机分组，试验前动物首先禁食12小时过夜，自由饮水。将实验小鼠尾浸入50℃恒温水浴3cm，记录缩尾潜伏期(TFL)为痛阈指标。给药前测两次(间隔5min)，以其均值作为基础痛阈，剔除过敏或迟钝动物TFL(＜4s或＞30s)。然后分别灌胃给予相应药物，给药后40min将实验小鼠尾浸入50℃恒温水浴3cm，再记录缩尾时间，并与给药前比较，并计算痛阈提高百分率(％)。试验结果：实验结果以缩尾反应潜伏期(TFL)和痛阈提高百分率(％)表示，统计学采用组间t-student检验，结果见表8。

表8.活血止痛胶囊(新工艺)小鼠热水缩尾法镇痛试验结果

组别	给药量(g/kg)	动物数	缩尾反应潜伏期(S) X±SD		痛阈提高百分率(％)
						给药前	给药后40min
			对照组活血止痛胶囊(新工艺)组活血止痛胶囊(原工艺)组	---3.01.50.751.50				1212121212	6.04±1.536.24±1.226.06±0.826.10±1.286.41±1.52	6.58±1.5011.67±2.55**9.57±1.80**8.09±1.86*9.41±1.79**	9.53±6.0088.74±32.49**57.83±19.62**33.18±17.83**48.86±15.51**

注：(1)^*：P＜0.05，^**：P＜0.01；与对照组比较(t检验)。

(2)痛阈提高百分率(％)＝(给药后TFL-基础TFL)/基础TFL*100％

活血止痛胶囊(新工艺)小鼠缩尾反应潜伏期的量效关系公式为：

Y＝5.9463X-9.1092，r＝0.9905

[其中Y为潜伏期(S)，X为对数剂量，r为相关系数。量效关系曲线见图2]

活血止痛胶囊(新工艺)小鼠缩尾反应痛阈提高百分率的量效关系公式为：

Y＝92.283X-233.18，r＝0.9979

[其中Y为痛阈提高百分率，X为对数剂量，r为相关系数。量效关系曲线见图3]

试验结果表明活血止痛胶囊(新工艺)高、中、低剂量组小鼠热水缩尾潜伏期与对照组比较有极显著差异或显著差异(P＜0.01或P＜0.05)，高、中、低剂量组痛阈提高百分率与对照组比较有极显著差异(P＜0.01)，说明活血止痛胶囊(新工艺)具有明显的镇痛作用。给药对数剂量与小鼠热水缩尾潜伏期和痛阈提高百分率均呈良好的线性关系，随着活血止痛胶囊(新工艺)给药剂量的增加，小鼠热水缩尾潜伏期延长，痛阈提高百分率增加，表明量-效关系明显。与活血止痛胶囊(原工艺)比较，同等给药量下延长缩尾潜伏期接近，但痛阈提高百分率平均值更大。

2.活血止痛胶囊(新工艺)抗炎试验

2.1.二甲苯致小鼠耳肿胀的抑制作用试验

取昆明小鼠，按体重随机分组，连续灌胃给药6天，禁食12小时过夜，第7天再给药一次，末次给药1小时后，在小鼠右耳的前后两面均匀涂布二甲苯0.05mL，左耳不做任何处理。各组分别于致炎后60分钟脱颈椎处死小鼠，剪下双耳用7mm直径打孔器分别在双耳相同部位打下圆耳片，电子天平称质量。计算肿胀度及肿胀抑制率，比较给药组与对照组差异情况，统计学采用组间t-student检验，结果见表9、图4。计算公式为：

肿胀度(mg)＝右耳片质量(mg)-左耳片质量(mg)

肿胀抑制率＝(对照组肿胀度-给药组肿胀度)÷对照组肿胀度×100％。

表9.活血止痛胶囊(新工艺)对二甲苯致小鼠耳肿胀的抑制作用试验结果

组别	给药剂量(g/kg)	动物数	肿胀度(mg)x±SD	肿胀抑制率(％)
					对照组	---	12	6.35±1.99
活血止痛胶囊(新工艺)组	31.50.75	131312	1.83±0.76**1.92±0.62**#3.50±1.46**	71.1869.7644.88
					活血止痛胶囊(原工艺)组	1.5	13	2.51±0.64**	60.47

注：(1).^**：P＜0.01，与对照组比较(t检验)

(2).#：P＜0.05，与原工艺组比较

(2)肿胀度(mg)＝右耳片重-左耳片重

(3)肿胀抑制率(％)＝(对照组肿胀度-给药组肿胀度)/对照组肿胀度*100％

试验结果表明，活血止痛胶囊(新工艺)高、中、低剂量组的耳廓肿胀度与对照组比较有极显著差异(P＜0.01)，说明活血止痛胶囊(新工艺)对二甲苯致小鼠耳肿胀有极显著的抑制作用。且随着活血止痛胶囊(新工艺)给药剂量的增加，抑制作用增大，但给药剂量与抗炎作用疗效间的量-效关系不明显。与活血止痛胶囊(原工艺)比较，同等给药量下抗炎作用疗效更好(P＜0.05)。

2.2.角叉菜胶致大鼠足趾肿胀的抑制作用试验

取SD大鼠，按体重随机分组，连续灌胃给药6天，禁食12小时过夜，第7天再给药一次，前后共给药7次，给药容积：0.50ml/20g。第7天用足跖容积测定仪测定大鼠右后足跖的排水量作为致炎前0h的足趾排水量，然后各组均灌胃给药，立即于大鼠右后足跖皮内注入1％的角叉菜胶0.05ml以致炎，分别于致炎后1，2，3，4，5，6h用足跖容积测定仪测定大鼠右后足跖的排水量(ml)，以致炎前后的排水量之差代表足跖的肿胀程度。实验结果以肿胀度表示，结果见表10。统计学采用组间t-student检验。

表10：活血止痛胶囊(新工艺)对角叉菜胶致大鼠右后足趾肿胀的抑制作用实验结果

组别	给药量(g/kg)	动物数	肿胀度(ml  X±SD)
									致炎后记录时间
			1h	2h	3h	4h	5h	6h
									对照组	---	9	0.58±0.20	0.70±0.23	0.87±0.34	0.78±0.28	0.82±0.28	0.76±0.29
活血止痛胶囊(新工艺)组	2.101.050.52	888	0.16±0.21**0.26±0.17**0.36±0.22*	0.38±0.09**0.38±0.21**0.42±0.19*	0.53±0.19*0.69±0.260.70±0.30	0.45±0.13**0.68±0.250.60±0.24	0.41±0.21**0.48±0.23*#0.61±0.20	0.46±0.15*0.49±0.15*#0.52±0.22
									活血止痛胶囊(原工艺)组	1.05	8	0.24±0.14**	0.48±0.16*	0.69±0.29	0.79±0.14	0.76±0.18	0.68±0.15

注：(1)肿胀度(ml)＝致炎后右后足排水量-致炎前右后足排水量

(2)^*：P＜0.05，^**：P＜0.01；与对照组比较(t检验)

(3)#：P＜0.05；与活血止痛胶囊(原工艺)组比较

试验结果表明，在致炎后的前两个小时活血止痛胶囊(新工艺)高、中、低剂量组对角叉菜胶导致的炎症均有良好的抑制作用。尤其是活血止痛胶囊(新工艺)高(2.1g/kg)、中(1.05g/kg)剂量在前两小时与对照组相比，肿胀度均有极显著性差异(p＜0.01)。且活血止痛胶囊(新工艺)高剂量在6小时内均有抑制作用，活血止痛胶囊(新工艺)中剂量在第5、第6小时亦有抑制活性，优于活血止痛胶囊(原工艺)的作用。由此可见，活血止痛胶囊(新工艺)可抑制角叉菜胶导致的炎性反应，随着活血止痛胶囊(新工艺)剂量的增大，其抗炎作用也增强。综合考虑，相同给药量下，活血止痛胶囊(新工艺)疗效好于活血止痛胶囊(原工艺)。

2.3.小鼠腹腔毛细血管通透性试验

取昆明小鼠，按体重随机分组，续灌胃给药6天，禁食12小时，自由饮水，第7天再给药一次，术次给药后40min，静脉注射伊文思蓝后腹腔注射醋酸致炎，腹腔内渗出液中伊文思蓝浓度以洗脱液的吸光度表示，表示炎性渗出的多少。实验结果以吸光度(OD)表示，结果见表11、图5。统计学采用组间t-student检验。

表11.活血止痛胶囊(新工艺)对小鼠腹腔毛细血管通透性的影响试验结果

组别	给药量(g/kg)	动物数	洗脱液吸光度(OD， X±SD)
				对照组	---	12	0.248±0.035

活血止痛胶囊(新工艺)组	31.50.75	121110	0.061±0.021**0.118±0.025**0.191±0.031**
				活血止痛胶囊(原工艺)组	1.5	10	0.117±0.029**

注：^**：P＜0.01；与对照组比较(t检验)

活血止痛胶囊(新工艺)抑制小鼠腹腔毛细血管通透性的量效关系公式为：

Y＝-0.2159X+0.8092，r＝0.997

[其中Y为潜伏期(S)，X为对数剂量，r为相关系数，图6]

试验结果表明活血止痛胶囊(新工艺)高、中、低剂量组的吸光度与对照组比较有极显著差异(P＜0.01)。说明活血止痛胶囊(新工艺)能够显著抑制小鼠腹腔炎性渗出，增加腹腔内毛细血管的通透性。且随着活血止痛胶囊(新工艺)给药剂量的增加，抑制作用增大，给药对数剂量与吸光度呈明显的线性关系，表明量-效关系明显。与活血止痛胶囊(原工艺)比较，同等给药量下作用疗效一致。

3.活血止痛胶囊(新工艺)抗凝血及抗血栓作用试验

3.1.毛细管法测定小鼠凝血时间试验

取昆明小鼠，按体重随机分组，采用毛细玻管法试验，动物连续灌胃给药6天，末次给药前禁食12小时，第7天给药1h后，摘眼球取血至内径为1mm的玻璃毛细管，开始计时，至毛细管血柱达5cm，前1min每隔30s折断毛细管一段，超过1min每隔10s折断毛细管一段，检查有无出现凝血丝。计算毛细管采血到出现血凝丝时间，即为凝血时间，实验结果以凝血时间表示，结果见表12。各实验组凝血时间均值与对照组比较并进行组间t-student检验。

表12.活血止痛胶囊(新工艺)毛细管法测定小鼠凝血时间试验结果

组别	给药剂量(g/kg)	动物数	凝血时间(S)x±SD
				对照组	-	12	87.3±39.9
活血止痛胶囊(新工艺)组	31.50.75	121212	243.1±43.5**162.8±17.2**142.3±27.2**
				活血止痛胶囊(原工艺)组	1.5	12	157.3±27.5**

注：^**：P＜0.01；与对照组比较(t检验)

活血止痛胶囊(新工艺)延长小鼠凝血时间的量效关系公式为：

Y＝46.0X+102.1，r＝0.990

[其中Y为凝血时间(s)，X为给药量(相当于生药量g/kg)，r为相关系数，量效关系曲线见图7]

试验结果表明活血止痛胶囊(新工艺)高、中、低剂量组的凝血时间与对照组比较有极显著差异(P＜0.01)，说明活血止痛胶囊(新工艺)能明显延长小鼠凝血时间。且随着活血止痛胶囊(新工艺)给药剂量的增加，小鼠凝血时间延长，给药量与凝血时间呈较好的线性关系，说明量-效关系明显。与活血止痛胶囊(原工艺)比较，同等给药量下延长小鼠凝血时间疗效接近，但活血止痛胶囊(新工艺)凝血时间平均值更大。

3.2.大鼠动静脉旁路抗血栓试验

取SD大鼠，根据动物体重的不同，随机分组，连续给药7天，末次给药后40min，腹腔注射戊巴比妥钠麻醉，后分离右颈总动脉和左颈外静脉，以50μg/ml肝素生理盐水液充满聚乙稀管，管中预先放入一段约4cm长的一号手术丝线(每根丝线均于电子天平上称重)，管两端先后插入左颈静脉和右颈总动脉，开放动脉夹，立即开始计时，使血流通15min，后中断血流，取出丝线称血栓湿重。实验结果以血栓湿重和血栓抑制率表示，结果见表13。统计学采用组间t-student检验。

表13.活血止痛胶囊(新工艺)大鼠动静脉旁路血栓试验结果

组别	给药剂量(g/kg)	动物数	血栓湿重(mg)x±SD	血栓抑制率(％)
					对照组	---	10	36.92±3.02	0
活血止痛胶囊(新工艺)组	2.101.050.51	101010	18.52±0.87**21.17±1.55**#24.07±1.28**	44.2136.2427.51
					活血止痛胶囊(原工艺)组	1.05	10	22.40±2.17**	31.19

注：(1)血栓湿重＝(血栓+丝线重量)-丝线重量

(2)血栓抑制率＝(对照组血栓重-给药组血栓重)/对照组血栓重*100

(3)^**：P＜0.01，与对照组比较(t检验)

(4)#：P＜0.05，与原工艺组比较

活血止痛胶囊(新工艺)对数剂量与血栓湿重的量效关系公式为：Y＝-8.936X+48.246，r＝0.999。[其中Y为血栓湿重(mg)，X为对数剂量(mg/kg)，r为相关系数，对数给药量与血栓重量的量效关系曲线见图8]

活血止痛胶囊(新工艺)对数剂量与血栓抑制率量效关系公式为：

Y＝27.741X-47.817，r＝0.999。[其中Y为血栓抑制率(％)，X为对数剂量(mg/kg)，r为相关系数，量效关系见图9]

试验结果表明活血止痛胶囊(新工艺)高、中、低剂量组的血栓湿重、血栓抑制率与对照组比较有极显著差异(P＜0.01)，说明活血止痛胶囊(新工艺)各剂量组均能明显减轻血栓湿重。且随着活血止痛胶囊(新工艺)给药剂量的增加，血栓湿重减轻、血栓抑制率增大。给药对数剂量与血栓湿重、血栓抑制率间呈良好的线性关系，表明量-效关系明显。与活血止痛胶囊(原工艺)比较，同等给药量下抗血栓作用更明显(P＜0.05)，血栓抑止率更大。

4.试验总结

试验结果表明，活血止痛胶囊(新工艺)具有镇痛、抗炎、抗凝血和抑制血栓形成作用。小鼠醋酸扭体法镇痛试验和小鼠热水缩尾法镇痛试验证实具有镇痛作用，并呈明显的量-效关系；二甲苯致小鼠耳肿胀的抑制作用试验、小鼠腹腔毛细血管通透性试验和角叉菜胶致大鼠足趾肿胀的抑制作用试验证实具有抗炎作用，增加毛细血管通透性作用，并呈量-效相关性；毛细管法测定小鼠凝血时间试验证实具有抗凝血作用，并呈明显的量-效关系；大鼠动静脉旁路血栓形成试验证实具有抗血栓作用，并呈明显的量-效关系。

活血止痛胶囊(新工艺)与活血止痛胶囊(原工艺)比较，其抗炎、抗血栓作用疗效更好。表现为在二甲苯致炎作用试验、角叉菜胶致炎作用试验、动静脉旁路法抗血栓作用试验中，新工艺胶囊的疗效明显好于原工艺胶囊。另外，在热水缩尾法镇痛作用试验、对凝血时间的影响试验中，虽然新工艺胶囊与原工艺胶囊比较没有明显区别，但前者的平均疗效结果好于后者。

本发明的毒理试验：

用SD大鼠作为实验对象，共用大鼠120只，雌雄各半。设活血止痛胶囊(新工艺)高、中、低剂量组及对照组，每组动物数为30只(雌雄各半)。给药剂量为：5.0、2.5、1.25g/kg(相当于生药量为：5.9、2.95、1.48g/kg，相当于人用剂量的118倍，59倍，29.5倍)。采用灌胃给药(i.g.)方法，每天给药一次，每周给药6天，停药1天，连续给药92天(三个月)。试验期间记录动物体重、食耗及一般表现等。连续给药3个月后每组分别处死动物20只(雌雄各半)，停药4周后(恢复期)每组分别处死动物10只(雌雄各半)，记录及检查处死动物的血液学指标、血液生化指标(生化十项)、凝血时间、主要脏器重量、系统尸检、器官组织切片。另外，因该药具有活血化瘀作用，可明显延长凝血时间，故在给药后三个月用试剂盒进行了“凝血酶时间”测定，以检验纤维蛋白原转化为纤维蛋白的能力，验证对纤维蛋白原浓度、活性、是否引起异常的影响。试验结果表明：

活血止痛胶囊(新工艺)长期给药对大鼠一般活动、粪便、进食情况与对照组相比无差异，其体重增长与相应对照组相比也无明显差异(P＞0.05，t检验)。

活血止痛胶囊(新工艺)长期给药对红细胞数量、血红蛋白没有明显影响，红细胞计数、血红蛋白、红细胞压积、平均红细胞体积、平均血红蛋白含量、平均血红蛋白浓度这些指标，给药后三个月及恢复期三个剂量组与对照组比较均无明显差异(P＞0.05)。

活血止痛胶囊(新工艺)连续给药对大鼠血小板无明显影响，给药后三个月及恢复期三个剂量组均未见明显变化(P＞0.05，与对照组比较)。活血止痛胶囊(新工艺)三个月给药对凝血时间产生明显影响，三个剂量组凝血时间明显延长(P＜0.01，与对照组比较)，且凝血时间呈明显的剂量相关性。但恢复期三个剂量组凝血时间均未见明显延长(P＞0.05，与对照组比较)，表明给药引起的凝血时间延长停药后可自然恢复。给药后三个月“凝血酶时间”测定试验结果显示，三个剂量组试验结果均未与对照组有明显差异(P＞0.05)，表明对纤维蛋白原的浓度、活性及可能引起的异常等均无明显影响。

活血止痛胶囊(新工艺)长期给药对白细胞总数，嗜中性、嗜碱性、嗜酸性白细胞、淋巴细胞、单核细胞数据及比例均没有明显影响。给药后三个月及恢复期均未见以上指标有显著变化(P＞0.05，与对照组比较)。

活血止痛胶囊(新工艺)高、中剂量组给药后三个月可使ALT明显下降(P＜0.01，与对照组比较)，但这一指标的下降无临床意义；活血止痛胶囊(新工艺)对其它血液生化指标(包括血液钠、钾、氯浓度)没有明显影响(P＞0.05，与对照组比较)，给药期及恢复期均未见明显影响。

活血止痛胶囊(新工艺)三个剂量组给药后三个月及恢复期各脏器(心、肝、脾、肺、肾、肾上腺、脑、胸腺、睾丸及附睾、子宫及卵巢)的脏器指数均未发现异常现象。

系统尸解表明，在试验期及恢复期处死的大鼠经肉眼仔细观察检查，活血止痛胶囊(新工艺)三个剂量组(高、中、低剂量)与相应时期的对照组相比各种脏器均未发现异常现象。

对活血止痛胶囊(新工艺)高剂量组及对照组大鼠试验中期、试验末期及恢复期大鼠的心、肝、脾、肺、肾、胸腺、肾上腺、胃、肠、脑、子宫、睾丸、胰腺、骨、淋巴结、甲状腺等20种脏器的组织切片病理学检查，并以正常对照组大鼠内脏为基本标准与对照组比较，均未发现明显毒性所致的组织学病变。

试验结果表明：活血止痛胶囊(新工艺)长期给药对大鼠无明显或严重的毒副作用，但对凝血时间有明显影响，可计量相关性地延长凝血时间。这一凝血时间的延长不是改变血液纤维蛋白原浓度、活性及异常所致。

附图说明

图1：活血止痛胶囊(新工艺)小鼠扭体反应量效关系。

图2：活血止痛胶囊(新工艺)小鼠缩尾反应潜伏期量效关系。

图3：活血止痛胶囊(新工艺)小鼠缩尾反应痛阈提高率量效关系。

图4：活血止痛胶囊(新工艺)抑制二甲苯致炎作用试验结果。

图5：活血止痛胶囊(新工艺)对小鼠腹腔毛细血管通透性影响试验结果。

图6：活血止痛胶囊(新工艺)给药剂量与炎性渗出洗脱液OD值量效关系。

图7：活血止痛胶囊(新工艺)给药量与凝血时间量效关系。

图8：活血止痛胶囊(新工艺)给药对数剂量与血栓湿重量效关系。

图9：活血止痛胶囊(新工艺)给药对数剂量与血栓抑制率量效关系。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明作进一步的阐述。

实施例1

取当归40份、三七8份、乳香(制)8份、冰片2份，土鳖虫20份、自然铜(煅)12份，采用以下步骤制备：

(一)粉碎：将当归、乳香粉碎成60目的细粉，备用。三七经⁶⁰Co辐照药材灭菌后，粉碎成80目的细粉，然后将细粉超微粉碎成粒径10μm的超细粉备用。

(二)CO₂超临界萃取：取当归与乳香细粉于萃取釜中，加热萃取釜和解析釜，送入一定流速的CO₂气，调节各釜压力后开始循环萃取，其中萃取釜温度为60℃，压力为36Mpa，CO₂流速为20L/h，萃取时间为0.5小时，收集当归与乳香超临界萃取的挥发油。

(三)挥发油包合：取当归与乳香超临界萃取的挥发油重量6倍量的β-环糊精，加入β-环糊精重量2.5倍量的水研匀，倒入胶体磨中，缓慢连续滴加用油量的10％的无水乙醇溶解的当归、乳香超临界萃取的挥发油，碾磨40分钟，倾出，冷藏静置12小时，于40℃真空干燥，即得挥发油包合物。

(四)冰片包合：取冰片重量4倍量的β-环糊精，加入β-环糊精重量1倍量的水研匀，倒入胶体磨中，缓慢连续滴加用适量乙醇溶解的冰片，碾磨30分钟，倾出，冷藏静置12小时，于40℃真空干燥，即得冰片包合物。

(五)醇提：取当归与乳香超临界萃取的药渣，加药渣重量10倍量的70％乙醇搅拌回流提取3次，每次1小时，回流液静置12小时，吸取上清液，滤过，滤液减压浓缩至相对密度1.20左右(60℃)的清膏，即得清膏I。

(六)水提：取土鳖虫、煅自然铜粉，将自然铜粉用布袋包裹，加土鳖虫与自然铜粉重量4倍量的水提取1次，每次1.5小时，合并水提液，静置，吸取上清液，滤过，滤液减压浓缩至相对密度为1.15左右(60℃)的清膏，即得清膏II。

(七)清膏混合干燥粉碎：将清膏I和清膏II混合均匀，加入处方比例的三七超细粉，真空干燥(40℃)至干膏，粉碎成100目的细粉备用。

(八)混合干燥制粒：将干膏细粉、挥发油包合物及适量糊精混合，以90％乙醇为黏合剂制成软材，20目不锈钢筛制粒，60℃干燥，整粒，加入冰片包合物，混匀，即得。

(九)灌装：将所得颗粒，进行灌装。

(十)分装：将所得胶囊用铝塑铝封装，装盒，即得。

实施例2

取当归40份、三七8份、乳香(制)8份、冰片2份，土鳖虫20份、自然铜(煅)12份，采用以下步骤制备：

(一)粉碎：将当归、乳香粉碎成40目的细粉，备用。三七经⁶⁰Co辐照药材灭菌后，粉碎成60目的细粉，然后将细粉超微粉碎成粒径10μm的超细粉备用。

(二)CO₂超临界萃取：取当归、乳香细粉于萃取釜中，加热萃取釜和解析釜，达到预定温度，送入一定流速的CO₂气，调节各釜压力后开始循环萃取，其中萃取釜温度为40℃，压力为24Mpa，CO₂流速为10L/h，萃取时间为1.5小时，收集当归与乳香超临界萃取的挥发油。

(三)挥发油包合：取当归与乳香超临界萃取的挥发油重量5倍量的β-环糊精，加入β-环糊精重量2倍量的水研匀，倒入胶体磨中，缓慢连续滴加用油量的10％的无水乙醇溶解的当归、乳香超临界萃取的挥发油，碾磨20分钟，倾出，冷藏静置24小时，于40℃真空干燥，即得挥发油包合物。

(四)冰片包合：取冰片重量6倍量的β-环糊精，加入β-环糊精重量2倍量的水研匀，倒入胶体磨中，缓慢连续滴加用适量乙醇溶解的冰片，碾磨35分钟，倾出，冷藏静置48小时，于40℃真空干燥，即得冰片包合物。

(五)醇提：取当归与乳香超临界萃取的药渣，加药渣重量的6倍量50％乙醇搅拌回流提取1次，每次2小时，回流液静置24小时以上，吸取上清液，滤过，滤液减压浓缩至相对密度1.15左右(60℃)的清膏，即得清膏I。

(六)水提：取土鳖虫、煅自然铜粉，将自然铜粉用布袋包裹，加土鳖虫和自然铜粉重量5倍量的水提取2次，每次1小时，合并水提液，静置，吸取上清液，滤过，滤液减压浓缩至相对密度为1.25左右(60℃)的清膏，即得清膏II。

(七)清膏混合干燥粉碎：将清膏I和清膏II混合均匀，加入处方比例的三七超细粉，真空干燥(50℃)至干膏，粉碎成80目的细粉备用。

(八)混合干燥制粒：将干膏细粉、挥发油包合物及适量糊精混合，以70％乙醇为黏合剂制成软材，16目不锈钢筛制粒，60℃干燥，整粒，加入冰片包合物，混匀，即得。

(九)灌装：将所得颗粒，进行灌装。

(十)分装：将所得胶囊用铝塑铝封装，装盒，即得。

实施例3

取当归40份、三七8份、乳香(制)8份、冰片2份，土鳖虫20份、自然铜(煅)12份，采用以下步骤制备：

(一)粉碎：将当归、乳香粉碎成80目的细粉，备用。三七经⁶⁰Co辐照药材灭菌后，粉碎成65目的细粉，然后将细粉超微粉碎成粒径20μm的超细粉备用。

(二)CO₂超临界萃取：取当归、乳香细粉于萃取釜中，加热萃取釜和解析釜，达到预定温度，送入一定流速的CO₂气，调节各釜压力后开始循环萃取，其中萃取釜温度为50℃，压力为30Mpa，CO₂流速为30L/h，萃取时间为1小时，收集当归与乳香超临界萃取的挥发油。

(三)挥发油包合：取当归与乳香超临界萃取的挥发油重量4倍量的β-环糊精，加入β-环糊精重量2.5倍量的水研匀，倒入胶体磨中，缓慢连续滴加用油量的10％的无水乙醇溶解的当归、乳香超临界萃取的挥发油，碾磨40分钟，倾出，冷藏静置36小时，于40℃真空干燥，即得挥发油包合物。

(四)冰片包合：取冰片重量5倍量的β-环糊精，加入β-环糊精重量3倍量的水研匀，倒入胶体磨中，缓慢连续滴加用适量乙醇溶解的冰片，碾磨40分钟，倾出，冷藏静置24小时，于40℃真空干燥，即得冰片包合物。

(五)醇提：取当归与乳香超临界萃取的药渣，加药渣重量的10倍量70％乙醇搅拌回流提取3次，每次1小时，回流液静置36小时，吸取上清液，滤过，滤液减压浓缩至相对密度1.20左右(60℃)的清膏，即得清膏I。

(六)水提：取土鳖虫、煅自然铜粉，将自然铜粉用布袋包裹，加土鳖虫和自然铜粉重量8倍量的水提取3次，每次1.5小时，合并水提液，静置，吸取上清液，滤过，滤液减压浓缩至相对密度为1.20左右(60℃)的清膏，即得清膏II。

(七)清膏混合干燥粉碎：将清膏I和清膏II混合均匀，加入处方比例的三七超细粉，真空干燥(60℃)至干膏，粉碎成100目的细粉备用。

(八)混合干燥制粒：将干膏细粉、挥发油包合物及适量糊精混合，以90％乙醇为黏合剂制成软材，18目不锈钢筛制粒，40℃干燥，整粒，加入冰片包合物，混匀，即得。

(九)灌装：将所得颗粒，进行灌装。

(十)分装：将所得胶囊用铝塑铝封装，装盒，即得。

实施例4

取当归40份、三七8份、乳香(制)8份、冰片2份，土鳖虫20份、自然铜(煅)12份，采用以下步骤制备：

(一)粉碎：将当归、乳香粉碎成60目的细粉，备用。三七经⁶⁰Co辐照药材灭菌后，粉碎成60目的细粉，然后将细粉超微粉碎成粒径30μm的超细粉备用。

(二)CO₂超临界萃取：取当归、乳香细粉于萃取釜中，加热萃取釜和解析釜，达到预定温度，送入一定流速的CO₂气，调节各釜压力后开始循环萃取，其中萃取釜温度为60℃，压力为36Mpa，CO₂流速为20L/h，萃取时间为1小时，收集当归与乳香超临界萃取的挥发油。

(三)挥发油包合：取当归与乳香超临界萃取的挥发油重量8倍量的β-环糊精，加入β-环糊精重量3倍量的水研匀，倒入胶体磨中，缓慢连续滴加用油量的30％的无水乙醇溶解的当归、乳香超临界萃取的挥发油，碾磨30分钟，倾出，冷藏静置48小时，于40℃真空干燥，即得挥发油包合物。

(四)冰片包合：取冰片重量5.5倍量的β-环糊精，加入β-环糊精重量3倍量的水研匀，倒入胶体磨中，缓慢连续滴加用适量乙醇溶解的冰片，碾磨45分钟，倾出，冷藏静置36小时，于40℃真空干燥，即得冰片包合物。

(五)醇提：取当归与乳香超临界萃取的药渣，加药渣重量的8倍量60％乙醇搅拌回流提取2次，每次1.5小时，回流液静置48小时，吸取上清液，滤过，滤液减压浓缩至相对密度1.25左右(60℃)的清膏，即得清膏I。

(六)水提：取土鳖虫、煅自然铜粉，将自然铜粉用布袋包裹，加土鳖虫和自然铜粉重量6倍量的水提取2次，每次2小时，合并水提液，静置，吸取上清液，滤过，滤液减压浓缩至相对密度为1.25左右(60℃)的清膏，即得清膏II。

(七)清膏混合干燥粉碎：将清膏I和清膏II混合均匀，加入处方比例的三七超细粉，真空干燥(70℃)至干膏，粉碎成120目的细粉备用。

(八)混合干燥制粒：将干膏细粉、挥发油包合物及适量糊精混合，以80％乙醇为黏合剂制成软材，20目不锈钢筛制粒，80℃干燥，整粒，加入冰片包合物，混匀，即得。

(九)灌装：将所得颗粒，进行灌装。

(十)分装：将所得胶囊用铝塑铝封装，装盒，即得。

实施例5

取当归40份、三七8份、乳香(制)8份、冰片2份，土鳖虫20份、自然铜(煅)12份，采用以下步骤制备：

(一)粉碎：将当归、乳香粉碎成60目的细粉，备用。三七经⁶⁰Co辐照药材灭菌后，粉碎成80目的细粉，然后将细粉超微粉碎成粒径20μm的超细粉备用。

(二)CO₂超临界萃取：取当归、乳香细粉于萃取釜中，加热萃取釜和解析釜，达到预定温度，送入一定流速的CO₂气，调节各釜压力后开始循环萃取，其中萃取釜温度为40℃，压力为32Mpa，CO₂流速为30L/h，萃取时间为1.5小时，收集当归与乳香超临界萃取的挥发油。

(三)挥发油包合：取当归与乳香超临界萃取的挥发油重量7倍量的β-环糊精，加入β-环糊精重量2.5倍量的水研匀，倒入胶体磨中，缓慢连续滴加用油量的10％的无水乙醇溶解的当归、乳香超临界萃取的挥发油，碾磨40分钟，倾出，冷藏静置36小时，于40℃真空干燥，即得挥发油包合物。

(四)冰片包合：取冰片重量6倍量的β-环糊精，加入β-环糊精重量2倍量的水研匀，倒入胶体磨中，缓慢连续滴加用适量乙醇溶解的冰片，碾磨50分钟，倾出，冷藏静置12小时，于40℃真空干燥，即得冰片包合物。

(五)醇提：取当归、乳香超临界萃取的药渣，加10倍量70％乙醇搅拌回流提取3次，每次2小时，回流液静置24小时，吸取上清液，滤过，滤液减压浓缩至相对密度1.20左右(60℃)的清膏，即得清膏I。

(六)水提：取土鳖虫、煅自然铜粉，将自然铜粉用布袋包裹，加土鳖虫和自然铜粉重量8倍量的水提取3次，每次1.5小时，合并水提液，静置，吸取上清液，滤过，滤液减压浓缩至相对密度为1.20左右(60℃)的清膏，即得清膏II。

(七)清膏混合干燥粉碎：将清膏I和清膏II混合均匀，加入处方比例的三七超细粉，真空干燥(80℃)至干膏，粉碎成100目的细粉备用。

(八)混合干燥制粒：将干膏细粉、挥发油包合物及适量糊精混合，以90％乙醇为黏合剂制成软材，16目不锈钢筛制粒，80℃干燥，整粒，加入冰片包合物，混匀，即得。

(九)灌装：将所得颗粒，进行灌装。

(十)分装：将所得胶囊用铝塑铝封装，装盒，即得。

Claims (1)

1、一种活血止痛胶囊的制备工艺，选用原料药的重量份为当归40份、三七8份、乳香(制)8份、冰片2份，土鳖虫20份、自然铜(煅)12份，其特征在于该工艺包括以下步骤：

a、按重量份配比称取原料药当归、三七、乳香(制)、冰片、土鳖虫、自然铜(煅)，备用；

b、粉碎：将当归与乳香(制)按处方比例混合均匀，粉碎成颗粒，备用；三七粉碎成粒径10-30μm的三七超细粉备用；

c、CO₂超临界萃取：取当归与乳香(制)混合颗粒于萃取釜中，CO₂超临界萃取，其中压力为24-36Mpa，萃取釜温度为40-60℃，CO₂流速为10～30L/h，萃取时间为0.5-1.5小时，收集当归与乳香(制)超临界萃取的挥发油，备用；

d、挥发油包合：取当归与乳香(制)超临界萃取的挥发油重量4-8倍量的β-环糊精，加入β-环糊精重量2-3倍量的水研匀，倒入胶体磨中，缓慢连续滴加当归与乳香(制)超临界萃取的挥发油，碾磨包合20-40分钟，倾出，冷藏静置，滤过，真空干燥，即得挥发油包合物；

e、冰片包合：取冰片重量4-6倍量的β-环糊精，加入β-环糊精量1-3倍量的水研匀，倒入胶体磨中，缓慢连续滴加用适量乙醇溶解的冰片，碾磨包合30-50分钟，倾出，冷藏静置，滤过，真空干燥，即得冰片包合物；

f、醇提：当归与乳香(制)超临界萃取的药渣用药渣重量6-10倍量的浓度为50-70％的乙醇搅拌回流提取1-3次，每次1-2小时，回流液静置，吸取上清液，滤过，滤液减压浓缩至60℃相对密度为1.15-1.25的清膏，得清膏I，备用；

g、水提：自然铜(煅)粉用布袋包裹，加入土鳖虫，用自然铜(煅)粉与土鳖虫总重量4-8倍量的水提取1-3次，每次1-2小时，合并水提液，静置，取上清液，滤过，滤液减压浓缩至60℃时相对密度为1.15-1.25的清膏，得清膏II，备用；

h、混合、干燥、粉碎：将清膏I和清膏II混合均匀，加入三七超细粉，真空干燥至干膏，粉碎成80-120目的细粉备用；

I、制粒：将干膏细粉、挥发油包合物及适量糊精混合，以70-90％乙醇为黏合剂制成软材，16-20目筛制粒，40-80℃干燥，整粒，加入冰片包合物，混匀，装入胶囊即可。

Images