CN102645493B - 五味甘露制剂的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种五味甘露制剂的检测方法，该方法通过包括以下步骤：显微鉴别所述五味甘露制剂中刺柏、水柏枝的显微特点；薄层色谱鉴别所述五味甘露制剂中的烈香杜鹃、刺柏和大籽蒿；高效液相色谱法测定所述制剂中麻黄所含盐酸麻黄碱和盐酸伪麻黄碱的含量、大籽蒿所含艾黄素的含量；本发明所述的检测方法具有重现性、稳定性好、操作方法简便、精密度高、专属性强、斑点显色清晰、分离度好、含量准确等优点，通过建立方法可靠，专属性强的质量检测方法，能够有效控制五味甘露制剂的质量，使五味甘露制剂的质量达到稳定、安全可控。

Description

五味甘露制剂的检测方法

技术领域

本发明涉及一种中药的检测方法，尤其涉及一种五味甘露制剂的检测方法，属于中药检测技术领域。

背景技术

五味甘露药浴汤散检测方法收载于中华人民共和国卫生部藏药部颁标准第一册第269页(WS3-BC-0266-95)。以麻黄、刺柏、水柏枝、大籽蒿、烈香杜鹃五味药材制成的五味甘露药浴汤散，具有发汗，消炎，止痛，干黄水，活血通络。用于痹病(风湿性关节炎，类风湿性关节炎)、痛风、偏瘫等。

【处方1刺柏100g、烈香杜鹃100g、大籽蒿100g、麻黄100g、水柏枝100g。

【制法】以上五味，捣碎煎汤，即得。

【性状】本品为褐棕色汤散剂；气香。

【鉴别】(1)取本品置显微镜下观察：纤维状下皮细胞易见，木质化或硅质化，多成束，长480～960μm，直径10～16μm；叶表皮细胞多角形或类长圆形，胞壁微弯或平直，直径15～20μm；不定式气孔类圆形或长圆形，直径17～20μm，长约20～29μm，副卫细胞3～5个；木纤维淡黄色，细胞长条形，微木化。

(2)称取本品约5g，捣碎，加乙醚20mL，与浓氨试液2mL，密塞、放置2小时，时时振摇，滤过，残渣用15mL乙醚分3次洗涤，滤过、合并滤液，加稀盐酸试液2滴，摇匀、蒸干、残渣加乙醇2mL使溶解，滤过，滤液作为供试品溶液。另取盐酸麻黄碱对照品，加甲醇制成每1mL含1mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(附录57页)试验，吸取上述两种溶液各5μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以氯仿-甲醇-浓氨试液(20∶5∶0.5)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以茚三酮试液，在105℃烘约10分钟。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同的颜色斑点。

【检查】应符合散剂项下有关的各项规定。

【功能与主治】发汗，消炎，止痛，平黄水，活血通络。用于痹病即风湿性关节炎、类风湿性关节炎、痛风、偏瘫、皮肤病、妇女产后疾病等。

【用法与用量】将上述粗粉煎汤倒入浴盆，并根据病情，配好加味药，与主药同时注入浴盆。水温40℃，浸泡全身或患病部位，每日2次，每次15～20分钟，浴后卧热炕发汗。浴疗3个疗程，每个疗程7日。

【注意】高血压、心脏病、高烧及妇女行经期禁浴。

【贮藏】密闭，置阴凉干燥处。

烈香杜鹃：收载于中华人民共和国卫生部藏药部颁标准第一册第78页(标准编号：WS3-BC-0078-95)。本品为杜鹃花科植物烈香杜鹃Rhododendron anthopogonoides Maxim.毛喉杜鹃Rhododendroncephalanthum Franch.及报春花状杜鹃Rhododendron primulaeflarum Bur.etFranch.的干燥花和叶。夏季采摘花叶，阴干。

大籽蒿：收载于中华人民共和国卫生部藏药部颁标准第一册第2页(标准编号：WS3-BC-0002-95)。本品为菊科植物大籽蒿Artemisia sieversianaWilld.或冷蒿Artemisia frigida Willd.的干燥地上部分。秋季采收，除去老茎枯叶，切段，晒干。

水柏枝：收载于中华人民共和国卫生部藏药部颁标准第一册第21页(标准编号WS3-BC-0021-95)。本品为柽柳科植物水柏枝Myricariagermanica(L.)Desv.及同属数种植物的干燥嫩枝。春夏季采集，晒干。

麻黄：收载于中华人民共和国药典2010年版一部-300页。本品为麻黄科植物草麻黄Ephedra sinica Stapf、中麻黄Ephedra intermedia Schrenket C.A.Mey.或木贼麻黄Ephedra equisetina Bge.的干燥草质茎。秋季采割绿色的草质茎，晒干。

刺柏：收载于中华人民共和国卫生部蒙药分册第23页。本品为柏科植物刺柏Juniperus formosana Hayata(J.taxifolia Parl)的干燥叶，常年采集，晒干。

五味甘露药浴汤散原检测方法中存在以下问题：①显微鉴别标准中没有指认出药材，难以显示显微鉴别对制剂的特点；②薄层色谱鉴别只有一个麻黄碱薄层色谱鉴别方法；③没有含量测定。原标准无法实现对五味甘露药浴汤散检测方法的可控性，因此本发明在原标准的基础上增加了烈香杜鹃、刺柏、大籽蒿的薄层鉴别；增加了麻黄药材中盐酸麻黄碱和盐酸伪麻黄碱、大籽蒿药材中艾黄素的含量测定；并在显微鉴别中指出哪些特征是哪种药材的，以便提供一种重现性好、专属性强，符合准确、简便、灵敏、快速的原则，可以有效的控制产品质量的检测方法。

而且目前既能有效控制痹病(风湿性关节炎，类风湿性关节炎)、痛风、偏瘫的藏药制剂产品质量，又能操作方便的检测方法，还没有报道。

发明内容

因此，本发明的目的是提供一种专属性强、重现性好、操作简便的五味甘露制剂的检测方法，能够有效地控制其质量，使五味甘露制剂质量稳定、安全可控。

除非特别说明，本文中的“五味甘露药浴汤散”、“五味甘露硬胶囊”、“五味甘露片”、“五味甘露颗粒”、“五味甘露丸”、“五味甘露软胶囊”和“五味甘露药浴颗粒”均指五味甘露制剂的一种剂型。

除非特别说明，本文中的“乙醇”指的是“95％乙醇”。

针对上述目的，本发明的技术方案如下：

本发明提供一种五味甘露制剂的检测方法，该方法为通过显微鉴别方法、薄层色谱法、含量测定方法鉴别所述五味甘露制剂中的刺柏、水柏枝的显微鉴别方法、烈香杜鹃、大籽蒿、刺柏的薄层鉴别方法、麻黄所含盐酸麻黄碱和盐酸伪麻黄碱含量测定方法、大籽蒿所含艾黄素含量测定方法，该方法包括以下步骤：

步骤1：显微鉴别所述五味甘露制剂中刺柏、水柏枝的显微特点；

步骤2：薄层色谱鉴别所述五味甘露制剂中的烈香杜鹃、刺柏和大籽蒿；

步骤3：高效液相色谱法测定所述制剂的麻黄所含盐酸麻黄碱和盐酸伪麻黄碱的含量、大籽蒿所含艾黄素的含量。

优选地，在步骤1中，通过包括以下步骤的方法进行：

步骤1.1：制备包括刺柏和水柏枝供试品溶液的第一样品溶液组；

步骤1.2：再将步骤1.1制得的第一样品溶液组分别置于显微镜下观察所述五味甘露制剂中刺柏、水柏枝的显微特点。

优选地，在步骤2中，通过包括以下步骤的方法进行：

步骤2.1：分别制备第二、第三和第四样品溶液组，所述第二样品溶液组包括烈香杜鹃供试品溶液、烈香杜鹃对照药材溶液和烈香杜鹃阴性样品溶液；所述第三样品溶液组包括刺柏供试品溶液、刺柏对照药材溶液和刺柏阴性样品溶液；所述第四样品溶液组包括大籽蒿供试品溶液、大籽蒿对照药材溶液和大籽蒿阴性样品溶液；

步骤2.2：再按照薄层色谱法(《中国药典》2010版一部附录VI B)试验，吸取第二、第三和第四样品溶液组中的各溶液分别点于同一硅胶薄层板上，优选地所述硅胶薄层板为硅胶GF₂₅₄或G薄层板；

步骤2.3：再将所述薄层板分别置展开缸中饱和，以展开剂展开，取出，晾干，紫外光灯下检视，检测所述五味甘露制剂中的烈香杜鹃、刺柏和大籽蒿。

优选地，在步骤3中，通过包括以下步骤的方法进行：

步骤3.1：分别制备第五、第六样品溶液组，所述第五样品溶液组包括麻黄供试品溶液、盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱混合对照品溶液和麻黄阴性样品溶液；所述第六样品溶液组包括大籽蒿供试品溶液、艾黄素对照品溶液和大籽蒿阴性样品溶液；

步骤3.2再分别以极性乙醚连接苯基键合硅胶或十八烷基硅胶键合相为填充剂；柱温25～40℃的条件的高效液相色谱法检测，测定所述制剂中麻黄所含盐酸麻黄碱和盐酸伪麻黄碱的含量、大籽蒿所含艾黄素的含量。

优选地，在步骤1中，所述显微鉴别刺柏、水柏枝的具体步骤为：制备第一样品溶液组后，置显微镜下观察：纤维状下皮细胞易见，木化，成束(为刺柏药材的主要特征结构)。叶表皮细胞多角形，胞壁微弯，木纤维黄色，细胞条形，木化(为水柏枝药材的主要特征结构)。

更为优选地，取上述第一样品溶液组，置显微镜下观察：纤维状下皮细胞易见，木质化或硅质化，多成束(为刺柏药材的主要特征结构)。叶表皮细胞多角形或类长圆形，胞壁微弯或平直，木纤维淡黄色，细胞长条形，微木化(为水柏枝药材的主要特征结构)。

优选地，所述第一样品溶液组通过包括以下步骤的方法制得：取所述五味甘露制剂0.0005～0.002g，研细，加水合氯醛0.05～0.2mL，透化1-5次，滴加适量稀甘油，制片，作为供试品溶液。

更为优选地，所述第一样品溶液组的通过包括以下步骤的方法制得：取所述五味甘露制剂0.001g，研细，加水合氯醛0.1mL，透化2次，滴加适量稀甘油，制片，作为供试品溶液。

优选地，在步骤2.3中，当检测第二样品溶液组或第四样品溶液组时，均以甲苯-乙酸乙酯-甲酸为展开剂展开；或

当检测第三样品溶液组时，以三氯甲烷-甲醇-浓氨试液为展开剂展开。

优选地，当检测第二样品溶液组或第四样品溶液组时，所述甲苯-乙酸乙酯-甲酸展开剂中含有以下体积份的各组分：甲苯2～15份、乙酸乙酯0.5～5份和甲酸0.1～2份，所述GF₂₅₄或G薄层板置展开缸中饱和0～40分钟，分别于254nm、365nm，紫外光灯下检视。

优选地，含有以下体积份的各组分：甲苯7份、乙酸乙酯2份、甲酸0.5份，所述GF₂₅₄或G薄层板置展开缸中饱和20分钟；或

当检测第三样品溶液组时，所述三氯甲烷-甲醇-浓氨试液展开剂中含有以下体积份的各组分：三氯甲烷5～20份、甲醇1～3份、浓氨试液0.05～0.5份，所述G薄层板置展开缸中饱和0～40分钟，于365nm，紫外光灯下检视。

优选地，含有以下体积份的各组分：三氯甲烷10份、甲醇2份、浓氨试液0.25份，所述G薄层板置展开缸中饱和20分钟。

优选地，吸取第二样品溶液组中的各溶液均为5～20μL；更为优选地，吸取第二样品溶液组中的各溶液均为10μL。

优选地，吸取第三样品溶液组中的各溶液均为2～8μL。更为优选地，

吸取第三样品溶液组中的各溶液均为4μL。

优选地，吸取第四样品溶液组中各溶液均为5～20μL。

更为优选地，吸取第四样品溶液组中各溶液均为10μL。

优选地，在步骤3.2中，当检测第五样品溶液组时，以乙腈-0.092％H₃PO₄(含0.04％三乙胺和0.02％二正丁胺)(100mL流动相中含乙腈1.5mL，含0.092％的磷酸98.5mL，而100mL 0.092％的磷酸中含三乙胺0.04mL、含二正丁胺0.02mL)为流动相，优选地，所述乙腈-0.092％H₃PO₄中乙腈和0.092％H₃PO₄的体积比为0.2～2.5∶97.5～99.8，更优选地，所述体积比为1.5∶98.5，检测波长为210±2nm，优选地，检测波长为210nm；柱温为25～40℃，优选地，柱温为30℃，理论塔板数按盐酸麻黄碱峰计算应不低于3000；或

当检测第六样品溶液组时，以乙腈-0.1％三氟乙酸为流动相进行梯度洗脱，优选地，所述乙腈-0.1％三氟乙酸为流动相进行的梯度洗脱的条件为：0分钟时，乙腈的浓度为25～65体积％，0.1％三氟乙酸的浓度为35～75％，再于35分钟内乙腈的浓度匀速变化至35～75体积％、0.1％三氟乙酸的浓度匀速变化至25～65％，更优选地，0分钟时，乙腈的浓度为45体积％，0.1％三氟乙酸的浓度为55体积％，再于35分钟内乙腈的浓度匀速变化至55体积％，0.1％三氟乙酸的浓度匀速变化至45％；检测波长为346±2nm，优选地，检测波长为346nm；柱温为25～40℃，优选地，柱温为30℃，理论塔板数按盐酸麻黄碱峰计算应不低于10000。

优选地，所述第二样品溶液组通过包括以下步骤的方法制得：取所述五味甘露制剂5～20g，加乙醇20～80mL，超声处理10～30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加20％～60％乙醇，分三次置水浴上加热溶解，每次5～20mL，趁热过滤，合并滤液，蒸去乙醇，水溶液加乙醚萃取1～3次，每次10～30mL，合并乙醚液，水浴蒸干，残渣加甲醇0.5～3mL溶解，作为烈香杜鹃供试品溶液；另取烈香杜鹃对照药材2～10g，按照与烈香杜鹃供试品溶液相同的制备方法制成烈香杜鹃对照药材溶液；按照与五味甘露制剂相同的处方比例及制备工艺，配制不含烈香杜鹃的阴性样品，按照所述烈香杜鹃供试品溶液的制备方法制成烈香杜鹃阴性样品溶液。

更为优选地，所述第二样品溶液组通过包括以下步骤的方法制得：取所述五味甘露制剂10g，加乙醇50mL，超声处理15分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加40％乙醇，分三次置水浴上加热溶解，每次10mL，趁热过滤，合并滤液，蒸去乙醇，水溶液加乙醚萃取2次，每次15mL，合并乙醚液，水浴蒸干，残渣加甲醇1mL溶解，作为烈香杜鹃供试品溶液；另取烈香杜鹃对照药材5g，按照与烈香杜鹃供试品溶液相同的制备方法制成烈香杜鹃对照药材溶液；按照与五味甘露制剂相同的处方比例及制备工艺，配制不含烈香杜鹃的阴性样品，按照所述烈香杜鹃供试品溶液的制备方法制成烈香杜鹃阴性样品溶液。

优选地，所述第三样品溶液组通过包括以下步骤的方法制得：取所述五味甘露制剂0.1～3g，加无水乙醇1～10mL，超声处理5～20分钟，滤过，滤液作为刺柏供试品溶液；另取刺柏对照药材0.2～5g，加无水乙醇1～15mL，超声处理10～45分钟，滤过，滤液浓缩至约0.5～3mL，作为刺柏对照药材溶液；按照与五味甘露制剂相同的处方比例及制备工艺，配制不含刺柏的阴性样品，按照所述刺柏供试品溶液的制备方法制成刺柏阴性样品溶液。

更为优选地，所述第三样品溶液组通过包括以下步骤的方法制得：取所述五味甘露制剂0.5g，加无水乙醇5mL，超声处理10分钟，滤过，滤液作为刺柏供试品溶液；另取刺柏对照药材1g，加无水乙醇5mL，超声处理20分钟，滤过，滤液浓缩至约1mL，作为刺柏对照药材溶液；按照与五味甘露制剂相同的处方比例及制备工艺，配制不含刺柏的阴性样品，按照所述刺柏供试品溶液的制备方法制成刺柏阴性样品溶液。

优选地，所述第四样品溶液组通过包括以下步骤的方法制得：取所述五味甘露制剂1～10g，加甲醇10～40mL，超声处理10～45分钟，滤过，滤液作为大籽蒿供试品溶液；另取大籽蒿对照药材0.5～3g，按照与大籽蒿供试品溶液相同的方法制成大籽蒿对照药材溶液；按照与五味甘露制剂相同的处方比例及制备工艺，配制不含大籽蒿的阴性样品，按照所述大籽蒿供试品溶液的制备方法制成大籽蒿阴性样品溶液。

更为优选地，所述制备第四样品溶液组通过包括以下步骤的方法制得：取所述五味甘露制剂5g，加甲醇20mL，超声处理30分钟，滤过，滤液作为大籽蒿供试品溶液；另取大籽蒿对照药材1g，按照与大籽蒿供试品溶液相同的方法制成大籽蒿对照药材溶液；按照与五味甘露制剂相同的处方比例及制备工艺，配制不含大籽蒿的阴性样品，按照所述大籽蒿供试品溶液的制备方法制成大籽蒿阴性样品溶液。

优选地，所述第五样品溶液组通过包括以下步骤的方法制得：取所述五味甘露制剂0.1～5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入1.44％磷酸溶液5～50mL，称定重量，超声处理10～45分钟，放冷，再称定重量，用1.44％磷酸溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，作为麻黄供试品溶液；另外精密称取盐酸麻黄碱对照品和盐酸伪麻黄碱对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1mL含盐酸麻黄碱0.00002～0.00006g、盐酸伪麻黄碱0.00008～0.00012g的混合溶液，作为盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱混合对照品溶液；按照与五味甘露制剂相同的处方比例及制备工艺，配置不含麻黄的阴性样品，按照所述麻黄供试品溶液的配制方法制成麻黄阴性样品溶液。

更为优选地，所述第五样品溶液组的通过包括以下步骤的方法制得：取所述五味甘露制剂0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入1.44％磷酸溶液10mL，称定重量，超声处理20分钟，放冷，再称定重量，用1.44％磷酸溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，作为麻黄供试品溶液；另外精密称取盐酸麻黄碱对照品和盐酸伪麻黄碱对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1mL含盐酸麻黄碱0.00004g、盐酸伪麻黄碱0.00010g的混合溶液，作为盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱混合对照品溶液；按照与五味甘露制剂相同的处方比例及制备工艺，配置不含麻黄的阴性样品，按照所述麻黄供试品溶液的配制方法制成麻黄阴性样品溶液。

优选地，所述测定法：分别精密吸取第五样品溶液组中的溶液各5～20μL，注入液相色谱仪，测定，即得。

更为优选地，所述测定法：分别精密吸取第五样品溶液组中的溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定，即得。

优选地，所述第六样品溶液组通过包括以下步骤的方法制得：取所述五味甘露制剂0.5～5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入乙醇10～50mL，称定重量，超声处理15～45分钟，放冷，再称定重量，用乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，作为大籽蒿供试品溶液；另外精密称取艾黄素对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1mL份含0.00001～0.00005g的溶液，作为艾黄素对照品溶液；按照与五味甘露制剂相同的处方比例及制备工艺，配置不含大籽蒿的阴性样品，按照所述大籽蒿供试品溶液的配制方法制成大籽蒿阴性样品溶液。

更为优选地，所述第六样品溶液组通过包括以下步骤的方法制得：取所述五味甘露制剂2.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入乙醇25mL，称定重量，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，作为大籽蒿供试品溶液；另外精密称取艾黄素对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1mL含0.00003g的溶液，作为艾黄素对照品溶液；按照与五味甘露制剂相同的处方比例及制备工艺，配置不含大籽蒿的阴性样品，按照所述大籽蒿供试品溶液的配制方法制成大籽蒿阴性样品溶液。

优选地，所述测定法：分别精密吸取第六样品溶液组中的溶液各5～20μL注入液相色谱仪，测定，即得。

更为优选地，所述测定法：分别精密吸取第六样品溶液组中的溶液各10μL注入液相色谱仪，测定，即得。

优选地，所述五味甘露制剂由以下重量份的原料药组成：麻黄100重量份、刺柏100重量份、大籽蒿100重量份、水柏枝100重量份、烈香杜鹃100重量份。

以上五味，捣碎煎汤，即得；或以上五味，粉成粗粉，混匀，发酵后，烘干、分装，即得；或以上五味，粉碎成细粉，过筛，混匀，按药剂学常规方法，加入常规辅料，制成临床上接受的口服制剂：颗粒剂、丸剂、胶囊剂、片剂或散剂。

优选地，所述五味甘露制剂的剂型还可制成片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂或散剂。

该藏药五味甘露制剂用于痹病即风湿性关节炎、类风湿性关节炎、痛风、偏瘫、皮肤病、妇女产后疾病等。

本发明的检测方法对方中烈香杜鹃、刺柏、大籽蒿进行了薄层色谱法检测研究；对方中麻黄所含盐酸麻黄碱和盐酸伪麻黄碱、大籽蒿所含艾黄素进行了高效液相色谱法含量测定研究，本发明所述的检测方法具有重现性、稳定性好、操作方法简便、精密度高、专属性强、斑点显色清晰、分离度好、含量准确等优点，通过建立方法可靠，专属性强的质量检测方法，能够有效控制五味甘露制剂的质量，使五味甘露制剂的质量达到稳定、安全可控。

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：

图1为本发明所述的显微鉴别实验结果图，图中1为叶表皮细胞，2为纤维状下皮细胞，3为木纤维；

图2为本发明所述的烈香杜鹃薄层色谱图，图中1-3为烈香杜鹃供试品、4、5为烈香杜鹃对照药材、6为烈香杜鹃阴性样品；

图3为本发明所述的刺柏薄层色谱图，图中1-3为刺柏供试品、4、5为刺柏对照药材、6为刺柏阴性样品；

图4为本发明所述的大籽蒿薄层色谱图，图中1-3为大籽蒿供试品、4、5为大籽蒿对照药材、6为大籽蒿阴性样品；

图5为本发明所述的麻黄所含盐酸麻黄碱和盐酸麻黄伪碱色谱图，其中，图5a为盐酸麻黄碱和盐酸麻黄伪碱混合对照品的色谱图，图5b为麻黄供试品的色谱图，图5c为麻黄阴性样品的色谱图；

图6为盐酸麻黄碱的峰面积与对照品浓度的线性关系图；

图7为盐酸麻黄伪碱的峰面积与对照品浓度的线性关系图；

图8为本发明所述的大籽蒿所含艾黄素色谱图，其中图8a为艾黄素对照品的色谱图；图8b为大籽蒿供试品的色谱图；图8c为大籽蒿阴性样品的色谱图；

图9为艾黄素的峰面积与对照品浓度的线性关系图。

具体实施方式

下述实验例和实施例只是用于说明本发明而不是限制本发明。实施例中所用的试剂和仪器如未进行特别说明，均为可从一般商业渠道获得的常规试剂和仪器，所用试剂均为常规的分析级别试剂(如乙醇、乙醚等)。

实验例1：刺柏和水柏枝的显微鉴别

(1)仪器

显微镜、照相机、载玻片、盖玻片、电子天平、移液管、滤纸、超声仪。

(2)试剂

水合氯醛、甘油、蒸馏水、醋酸。

(3)检验方法：

透化溶剂的选择：分别采用水合氯醛试液、醋酸甘油试液、稀甘油等溶液为透化溶剂；

透化方法的选择：分别采用传统加热透化方法和烘箱加热方法；

分别选择以上透化溶剂、透化方法进行试验，结果如下表1所示：

表1

在以上条件下反复试验，最终确定了刺柏和水柏枝的专属性显微鉴别方法如下：

取所述五味甘露制剂0.001g，加水合氯醛0.1mL，透化2次，滴加适量稀甘油，制片，置显微镜下观察：纤维状下皮细胞易见，木质化或硅质化，多成束(为刺柏药材的主要特征结构)。叶表皮细胞多角形或类长圆形，胞壁微弯或平直，木纤维淡黄色，细胞长条形，微木化(为水柏枝药材的主要特征结构)。如图1所示。

实验例2：烈香杜鹃的薄层鉴别

(1)仪器

乳钵、电子秤、量筒、平底烧瓶、冷凝管、橡胶管、水浴锅、超声波提取仪、漏斗、滤纸、蒸发皿、分液漏斗、脱脂棉、点样器、硅胶GF254板、层析缸、紫外点样分析仪。

(2)对照药材

烈香杜鹃对照药材(批号：121394-200401)，购自中国药品生物制品鉴定所。

(3)试剂

乙醇、乙醚、甲醇、甲苯、乙酸乙酯、甲酸、蒸馏水、丙酮。

(4)检验方法：

提取溶剂的选择：分别采用甲醇、乙醇、丙酮为提取溶剂；

提取方法的选择：分别采用超声和加热回流；

展开剂的选择：分别采用甲苯-乙酸乙酯(体积比为7∶3)、甲苯-乙酸乙酯-甲酸(体积比为7∶2∶0.5)；

分别选择以上提取溶剂、提取方法和展开剂进行试验，结果如下表2所示：

表2

在以上条件下反复试验，最终确定了烈香杜鹃的专属性薄层鉴别方法如下：

取所述五味甘露制剂10g，加乙醇50mL，超声处理15分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加40％乙醇，分三次置水浴上加热溶解，每次10mL，趁热过滤，合并滤液，蒸去乙醇，水溶液加乙醚萃取2次，每次15mL，合并乙醚液，水浴蒸干，残渣加甲醇1mL使溶解，作为烈香杜鹃供试品溶液；另取烈香杜鹃对照药材5g，按照同样的方法制成烈香杜鹃对照药材溶液；按处方比例及制备工艺，配置不含烈香杜鹃的阴性样品，并按上述烈香杜鹃供试品溶液的配制方法制成烈香杜鹃阴性样品溶液；照薄层色谱法(《中国药典》2010版一部附录VI B)试验，吸取上述两种溶液各10μL，分别点于同一硅胶GF₂₅₄薄层板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸(体积比为7∶2∶0.5)为展开剂，薄层板置展开缸中饱和20分钟，展开，取出，晾干，置紫外光灯(254nm)下检视。如图2所示，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。

实验例3：刺柏的薄层鉴别

(1)仪器

乳钵、电子秤、量筒、锥形瓶、平底烧瓶、冷凝管、橡胶管、水浴锅、超声波提取仪、漏斗、滤纸、点样器、硅胶G板、层析缸、紫外点样分析仪。

(2)对照药材

刺柏对照药材(批号：121485-200503)，购自中国药品生物制品鉴定所。

(3)试剂

无水乙醇、甲醇、乙醇、三氯甲烷、氨水、蒸馏水。

(4)检验方法：

提取溶剂的选择：分别采用无水乙醇、甲醇、乙醇为提取溶剂；

提取方法的选择：分别采用超声和加热回流；

展开剂的选择：分别采用三氯甲烷-甲醇-浓氨试液(体积比为10∶3)、三氯甲烷∶甲醇-浓氨试液(体积比为10∶2∶0.25)；

分别选择以上提取溶剂、提取方法和展开剂进行试验，结果如下表3所示：

表3

在以上条件下反复试验，最终确定了刺柏的专属性薄层鉴别方法如下：

取所述五味甘露制剂0.5g，加无水乙醇5mL，超声处理10分钟，滤过，滤液作为刺柏供试品溶液。另取刺柏对照药材1g，加无水乙醇5mL，超声处理20分钟，滤过，滤液浓缩至约1mL，作为刺柏对照药材溶液；按处方比例及制备工艺，配置不含刺柏的阴性样品，并按上述刺柏供试品溶液的配制方法制成刺柏阴性样品溶液；照薄层色谱法(《中国药典》2010年版一部附录VIB)试验，吸取上述两种溶液各4μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷∶甲醇∶浓氨试液(体积比为10∶2∶0.25)为展开剂，薄层板置展开缸中饱和20分钟，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365nm)下检视。如图3所示，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。

实验例4：大籽蒿的薄层鉴别

(1)仪器

乳钵、电子秤、量筒、锥形瓶、平底烧瓶、冷凝管、橡胶管、水浴锅、超声波提取仪、漏斗、滤纸、点样器、硅胶G板、层析缸、紫外点样分析仪。

(2)对照药材

大籽蒿对照药材(批号：1312282-200317)，购自中国药品生物制品鉴定所。

(3)试剂

丙酮、甲醇、乙醇、甲苯、乙酸乙酯、甲酸。

(4)检验方法：

提取溶剂的选择：分别采用丙酮、甲醇、乙醇为提取溶剂；

提取方法的选择：分别采用超声和加热回流；

展开剂的选择：分别采用甲苯-乙酸乙酯(体积比为7∶3)、甲苯-乙酸乙酯-甲酸(体积比为7∶2∶0.5)；

分别选择以上提取溶剂、提取方法和展开剂进行试验，结果如下表4所示：

表4

在以上条件下反复试验，最终确定了大籽蒿的专属性薄层鉴别方法如下：

取所述五味甘露制剂5g，加甲醇20mL，超声处理30分钟，滤过，滤液作为大籽蒿供试品溶液；另取大籽蒿对照药材1g，同法制成大籽蒿对照药材溶液；按处方比例及制备工艺，配置不含大籽蒿的阴性样品，并按上述大籽蒿供试品溶液的配制方法制成大籽蒿阴性样品溶液；照薄层色谱法(《中国药典》2010年版一部附录VI B)试验，吸取上述两种溶液各10μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸(体积比为7∶2∶0.5)为展开剂，薄层板置展开缸中饱和20分钟，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365nm)下检视。如图4所示，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同的淡蓝色荧光斑点。

实验例5：麻黄所含盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱的含量测定

(1)仪器

电子天平、锥形瓶、容量瓶、10mL移液管、50mL移液管、注射器、烧杯、漏斗、滤纸、滤头、高效液相色谱仪。

(2)对照品

盐酸麻黄碱(批号：714-9202)、盐酸伪麻黄碱(批号：0714-9903)，均购自中国药品生物制品鉴定所。

(3)试剂

甲醇、乙腈、三乙胺、二正丁胺、磷酸、蒸馏水。

(4)检验方法：

提取溶剂的选择：分别采用甲醇、磷酸、1.44％磷酸溶液为提取溶剂；

提取时间的选择：分别采用超声10分钟、20分钟、30分钟进行试验；

流动相的选择：分别采用乙腈-0.092％H₃PO₄(含0.04％三乙胺和0.02％二正丁胺)(体积比为5∶95)、乙腈-0.092％H₃PO₄(含0.04％三乙胺和0.02％二正丁胺)(体积比为1.5∶98.5)；

分别选择以上提取溶剂、提取时间和流动相进行试验，结果如下表5所示：

表5

在以上条件下反复试验，最终确定了麻黄所含盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱含量测定的方法如下：

色谱条件与系统适用性试验：

高效液相色谱仪(美国Agilent公司)：包括G1314A紫外可见检测器，G1314A二元泵，Agilent1100色谱工作站；用极性乙醚连接苯基键合硅胶为填充剂；以乙腈-0.092％H₃PO₄(含0.04％三乙胺和0.02％二正丁胺)(1.5∶98.5)为流动相；检测波长为210nm；柱温：30℃。理论板数按盐酸麻黄碱峰计算应不低于3000。

取所述五味甘露制剂，研细，取约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入1.44％磷酸溶液10mL，称定重量，超声处理(功率500W，频率53kHz)20分钟，放冷，再称定重量，用1.44％磷酸溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液作为麻黄供试品溶液；取盐酸麻黄碱对照品和盐酸伪麻黄碱对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1mL含盐酸麻黄碱40μg、盐酸伪麻黄碱100μg的混合溶液，作为盐酸麻黄碱和盐酸伪麻黄碱混合对照品溶液；按处方比例及制备工艺，配置不含麻黄的阴性样品，并按上述供试品溶液的配制方法制成麻黄阴性样品溶液；照高效液相色谱法(《中国药典》2010版一部附录VID)试验，分别精密吸取混合对照品溶液和供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定，如图5所示，制剂每1g含麻黄以盐酸麻黄碱(C₁₀H₁₅NO·HCl)和盐酸伪麻黄碱(C₁₀H₁₅NO·HCl)计的总量为3.82mg。

实验例6：麻黄所含盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱的含量测定-方法学 考察

(1)仪器与试药

高效液相色谱仪(美国Agilent公司)：包括G1314A紫外可见检测器，G1314A二元泵，Agilent1100色谱工作站；SK8200HP超声波清洗器(功率250W，频率40kHz)(上海科导超声仪器有限公司)；

乙腈为色谱纯，三乙胺、磷酸、二正丁胺均为分析纯；

盐酸麻黄碱(批号：714-9202)、盐酸伪麻黄碱(批号：0714-9903)，均购自中国药品生物制品鉴定所。

五味甘露制剂：由西藏奇正藏药股份有限公司提供；

缺麻黄的阴性样品：按处方比例及其制备工艺，配制不含麻黄药材的阴性样品。

(2)色谱条件

极性乙醚连接苯基键合硅胶为填充剂；色谱柱：菲罗门Synergi 4uPolar-RP 80A 557919-35(4.6×250mm，5.0μm，广州菲罗门科学仪器有限公司)；

流动相：乙腈-0.092％磷酸溶液(含0.04％三乙胺和0.02％二正丁胺)(1.5∶98.5)；

流速：1.0mL/min；

检测波长：210nm；

柱温：30℃。

(3)色谱系统适用性试验

在上述色谱条件下，盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱与其余杂质峰分离效果较好，理论塔板数按盐酸麻黄碱峰计算应不低于3000。

(4)对照品溶液、供试品溶液、阴性样品溶液的配制

对照品溶液的制备：取盐酸麻黄碱对照品和盐酸伪麻黄碱对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1mL含盐酸麻黄碱40μg、盐酸伪麻黄碱100μg的混合溶液，即得。

供试品溶液的制备：取所述五味甘露制剂约0.25g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入1.44％磷酸溶液10mL，称定重量，超声处理(功率500W，频率53kHz)20分钟，放冷，再称定重量，用1.44％磷酸补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。

阴性样品溶液的制备：按处方比例及其制备工艺，配制不含麻黄药材的阴性样品，同法制成阴性样品溶液。

(5)阴性干扰试验

精密吸取对照品溶液、供试品溶液和阴性样品溶液各10μL，注入液相色谱仪中，由色谱图可知，在与对照品色谱峰保留时间相应的位置上，供试品溶液具有相同保留时间的色谱峰出现，阴性样品溶液在此无色谱峰。结果见图5中图5a、5b、5c所示的色谱图。

(6)线性关系的考察

取盐酸麻黄碱对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1mL含421μg的溶液，作为储备液。分别精密吸取上述储备液0.25mL、0.6mL、1mL、1.2mL、1.5mL、2.1mL，置于10mL容量瓶中，加甲醇稀释制刻度，摇匀，即得。精密量取上述各稀释液10μL分别注入液相色谱仪，测定峰面积。结果表明盐酸麻黄碱在10.53～88.41μg/mL范围内峰面积与对照品的浓度呈良好的线性关系，其回归方程为y＝40.95x--51.02，r＝0.9995，结果见表6和图6。盐酸伪麻黄碱对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1mL含320μg的溶液，作为储备液。分别精密吸取上述储备液0.4mL、1.3mL、2.5mL、3mL、4.5mL、6mL，置于10mL容量瓶中，加甲醇稀释制刻度，摇匀，即得。精密量取上述各稀释液10μL分别注入液相色谱仪，测定峰面积。结果表明盐酸伪麻黄碱在12.80～192.00μg/mL范围内峰面积与对照品的浓度呈良好的线性关系，其回归方程为y＝30.11x-12.47，r＝0.9995，结果见表7和图7。

表6盐酸麻黄碱对照品浓度与峰面积结果

表7盐酸伪麻黄碱对照品浓度与峰面积结果

(7)精密度试验

精密吸取同一供试品溶液10μL，连续进样5次，测定峰面积，结果见表8。

表8精密度试验结果

试验表明，精密度良好，盐酸麻黄碱和盐酸伪麻黄碱的RSD分别为2.81％和1.19％。

(8)稳定性试验

精密吸取同一供试品溶液10μL，分别于0、2、4、6、12h进样，测定峰面积，结果见表9。

表9稳定性试验结果

试验表明，样品在12小时内测定，结果稳定，盐酸麻黄碱和盐酸伪麻黄碱的RSD分别为1.66％和0.60％。

(9)重现性试验

取本品6份，按照样品制备方法进行样品处理，分别进样，测定峰面积，计算RSD，结果见表10。

表10重现性试验结果

试验表明，取同一批样品6份测定，结果重现性较好，盐酸麻黄碱和盐酸伪麻黄碱的RSD分别为2.43％和2.59％。

(10)准确度(回收率)试验

取已知含量的五味甘露制剂(批号090001，盐酸麻黄碱含量为1.07mg/g，盐酸伪麻黄碱含量为3.96mg/g)9份，每份约0.25g，精密称定，分别加入盐酸麻黄碱对照品、盐酸伪麻黄碱对照品适量，依法处理样品，测定峰面积，求得盐酸麻黄碱和盐酸伪麻黄碱含量，计算回收率，测定结果见表11、表12。结果表明本法回收率好，盐酸麻黄碱和盐酸伪麻黄碱的RSD分别为2.21％和2.19％。

表11盐酸麻黄碱回收率试验结果

表12盐酸伪麻黄碱回收率试验结果

(11)样品中盐酸麻黄碱和盐酸伪麻黄碱总量的含量测定

精密吸取供试品溶液10μL进样，依法测定12批样品的色谱峰峰面积，每批样品处理2份平行样，测定，计算平均值，求得样品中盐酸麻黄碱和盐酸伪麻黄碱的含量，结果见表13。

表13样品中盐酸麻黄碱的含量测定结果

根据以上多批样品的含量测定结果，五味甘露制剂每1g含麻黄以盐酸麻黄碱和盐酸伪麻黄碱总量计在1.63mg～5.07mg的范围内，按最低含量的70％作为含量下限，即1.63mg/g×70％＝1.14mg/g≈1.10mg/g，转化率为：1.10/1.6×100％＝68.75％，暂定本品含麻黄以盐酸麻黄碱(C₁₀H₁₅NO·HCl)和盐酸伪麻黄碱(C₁₀H₁₅NO·HCl)的总量计，每1g不得少于1.10mg。

实验例7：大籽蒿所含艾黄素的含量测定

(1)仪器

电子天平、锥形瓶、容量瓶、10mL移液管、25mL移液管、注射器、烧杯、漏斗、滤纸、滤头、高效液相色谱仪。

(2)对照品

艾黄素对照品(批号为：00011014-645)，购自中国药品生物制品检定所。

(3)试剂

甲醇、乙醇、乙腈、无水乙醇、三氟乙酸和蒸馏水。

(4)检验方法：

提取溶剂的选择：分别采用甲醇、乙醇、无水乙醇为提取溶剂；

提取时间的选择：分别采用超声20分钟、30分钟、40分钟进行试验；

流动相的选择：分别采用如下两种方案为流动性，①以甲醇-0.1％三氟乙酸为流动相，按下表14中的规定进行梯度洗脱；

表14

②以乙腈-0.1％三氟乙酸为流动相，按下表15中的规定进行梯度洗脱；

表15

分别选择以上提取溶剂、提取时间和流动相进行试验，结果如下表16所示：

表16

在以上条件下反复试验，最终确定了大籽蒿所含艾黄素含量测定的方法如下：

色谱条件与系统适用性试验：ACQUITY H-Class(美国沃特世Waters公司)：PDA eλDetector，Sample Manager-FTN，Quaternary Solvent Manager；以十八烷基硅胶键合相为填充剂；流动相：以乙腈-0.1％三氟乙酸为流动相，按下表17中的规定进行梯度洗脱：

表17

检测波长为346nm；柱温：30℃，理论板数按艾黄素峰计算应不低于10000。

取所述五味甘露制剂，研细，取约2.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入乙醇25mL，精密称定重量，超声处理(功率250W，频率40kHz)30分钟，放冷，再称定重量，用乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液；取艾黄素对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1mL含0.03mg的溶液，作为对照品溶液；按处方比例及制备工艺，配置不含大籽蒿的阴性样品，并按上述供试品溶液的配制方法制成大籽蒿阴性样品溶液；照高效液相色谱法(《中国药典》2010版一部附录VID)试验，分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各5μL，注入液相色谱仪，测定，如图8所示，制剂每1g含大籽蒿以艾黄素(C₂₀H₂₀O₈)计为238μg。

实验例7：大籽蒿所含艾黄素的含量测定-方法学考察

1.仪器与试药

ACQUITY H-Class(美国沃特世Waters公司)：PDA eλDetector，SampleManager-FTN，Quaternary Solvent Manager；

SK8200HP超声波清洗器(上海科导超声仪器有限公司)；

乙腈为色谱纯、甲醇、乙醇、三氟乙酸均为分析纯；

艾黄素购自中国药品生物制品检定所(批号为：00011014-645)；

五味甘露制剂：由西藏奇正藏药股份有限公司提供；

缺大籽蒿的阴性样品：按处方比例及其制备工艺，配制不含大籽蒿药材的阴性样品。

2.色谱条件

色谱柱：安捷伦XDB-C₁₈柱(4.6×250mm，安捷伦科技有限公司)；十八烷基硅胶键合相为填充剂；

流动相：以乙腈为流动相A，以0.1％三氟乙酸为流动相B，按下表18中的规定进行梯度洗脱；

表18

流速：1.0mL/min；

检测波长：346nm；

柱温：30℃。

3.色谱系统适用性试验

在上述色谱条件下，艾黄素与其余杂质峰分离效果较好，理论塔板数以艾黄素峰计算应不低于10000。

4.对照品溶液、供试品溶液、阴性样品溶液的配制

对照品溶液的制备：取艾黄素对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1mL含0.03mg的溶液，备用。

供试品溶液的制备：取所述五味甘露制剂约2.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入乙醇25mL，精密称定重量，超声处理(功率250W，频率40kHz)30分钟，放冷，再称定重量，用乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液，备用。

阴性样品溶液的制备：按处方比例及其制备工艺，配制不含大籽蒿药材的阴性样品，同法制成阴性样品溶液。

5.阴性干扰试验

精密吸取对照品溶液、供试品溶液和阴性样品溶液各5μL，注入液相色谱仪中，由色谱图可知，在与对照品色谱峰保留时间相应的位置上，供试品溶液具有相同保留时间的色谱峰出现，且阴性样品溶液在此无色谱峰。结果见图8中图8a、图8b、图8c所示的色谱图。

6.不同提取时间、方法比较试验

按供试品溶液制备方法，乙醇分别超声20、30、40分钟，甲醇超声30分钟，各处理五份，精密量取5μL分别注入液相色谱仪，测定峰面积，结果见表19。

表19五味甘露制剂中艾黄素不同提取溶媒和不同提取时间比较

注：1表示乙醇超声20分钟；2表示乙醇超声30分钟；3表示乙醇超声40分钟；4表示甲醇超声30分钟。

上述实验结果表明：乙醇超声20、30、40分钟和甲醇超声30分钟后，对样品的含量测定结果无明显影响，虽然甲醇和乙醇超声30分钟的含量测定结果接近，但是从安全性和对人体毒性方面考虑，遵从药品质量标准简便、灵敏、快速的原则，采用乙醇超声提取30分钟的方法。

7.耐用性试验

7.1检测波长的考察

色谱条件：十八烷基硅胶键合相为填充剂；色谱柱：安捷伦XDB-C₁₈柱(4.6×250mm，安捷伦科技有限公司)；流动相：以乙腈为流动相A，以0.1％三氟乙酸为流动相B，按下表20中的规定进行梯度洗脱；

表20

流速：1.0mL/min；柱温：30℃。精密吸取供试品溶液和对照品溶液各5μL，分别进样，不同波长条件下测定，计算，结果见表21。

表21不同检测波长耐用性试验结果

试验结果表明，本品在检测波长346±10nm的范围内变化时，样品含量无明显差异，RSD＝0.81％，说明在仪器检测波长发生微小变化的情况下，耐用性良好，不会影响产品结果的检测。

7.2柱温考察

色谱条件：十八烷基硅胶键合相为填充剂；色谱柱：安捷伦XDB-C₁₈柱(4.6×250mm，安捷伦科技有限公司)；流动相：以乙腈为流动相A，以0.1％三氟乙酸为流动相B，按下表22中的规定进行梯度洗脱；

表22

流速：1.0mL/min；波长：346nm。精密吸取供试品溶液和对照品溶液各5μL，分别进样，不同柱温条件下测定，计算，结果见表23。

表23不同检测柱温耐用性试验结果

试验结果表明，本品在柱温25～40℃的范围内发生变化时，只是保留时间发生了前后变化，而样品含量无明显差异，RSD＝1.86％，说明在色谱柱柱温发生微小变化的情况下，耐用性良好，不会影响产品结果的检测。

7.3不同流速考察

色谱条件：十八烷基硅胶键合相为填充剂；色谱柱：安捷伦XDB-C₁₈柱(4.6×250mm，安捷伦科技有限公司)；流动相：以乙腈为流动相A，以0.1％三氟乙酸为流动相B，按下表24中的规定进行梯度洗脱；

表24

柱温：30℃；波长：346nm。精密吸取供试品液和对照品溶液各5μL，分别进样，不同流速条件下测定，计算，结果见表25。

表25不同流速耐用性试验结果

试验结果表明，本品流速在0.8～1.1mL/min的范围内发生变化时，只是样品保留时间前后发生了变化、柱压也高低变化，但对样品含量无明显差异，RSD＝1.18％，说明在仪器流速发生微小变化的情况下，耐用性良好，不会影响产品结果的检测。

7.4流动相组成比例考察

色谱条件：十八烷基硅胶键合相为填充剂；色谱柱：安捷伦XDB-C₁₈柱(4.6×250mm，安捷伦科技有限公司)；流速：1mL/min；柱温：30℃；波长：346nm。精密吸取供试品溶液和对照品溶液各5μL，分别进样，不同流动相组成比例条件下测定，计算，结果见表26。

表26不同流动相组成比例耐用性试验结果

注：以乙腈为流动相A，以0.1％三氟乙酸为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱。

1.

2.

3.

4.

试验结果表明，本品流动相组成比例发生微小变化的情况下，耐用性良好，RSD＝1.81％，不会影响含量结果的检测。

7.5不同色谱柱条件考察

色谱条件：十八烷基硅胶键合相为填充剂；流动相：以乙腈为流动相A，以0.1％三氟乙酸为流动相B，按下表27中的规定进行梯度洗脱；

表27

流速：1mL/min；柱温：30℃；波长：346nm。精密吸取供试品溶液和对照品溶液各5μL，分别进样，不同色谱柱条件下测定，计算，结果见表28。

表28不同色谱柱耐用性实验考察

试验结果表明，采用不同厂家和不同批次的色谱柱检测本品含量，耐用性良好，RSD＝1.23％，说明该方法对不同色谱柱的耐用性良好。

8.线性关系的考察

精密称取艾黄素对照品4.70mg，加入甲醇，定容至50mL，作为贮备液，精密吸取贮备液1.0mL、1.5mL、2mL、3mL、4mL、5mL、6mL、10mL至10mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，精密量取5μL分别注入液相色谱仪，测定峰面积。艾黄素在0.047μg～0.47μg范围内峰面积与对照品的浓度呈良好的线性关系，其回归方程为y＝12988x-18671(r＝0.999)，结果见表29和图9。

表29艾黄素对照品浓度与峰面积结果

9.精密度试验

精密吸取同一供试品溶液(批号20110501)5μL，连续进样5次，测定峰面积，结果见表30。

表30精密度试验结果

试验结果表明，精密度良好，RSD＝0.54％。

10.稳定性试验

精密吸取同一供试品(批号20110501)溶液5μL，分别于0、2、4、6、12、24h进样，测定峰面积，结果见表31。

表31稳定性试验结果

试验结果表明，样品在24小时内测定，结果稳定，RSD＝1.40％。

11.重现性试验

取本品(批号：20110501)6份，按照样品制备方法进行样品处理，分别进样，测定峰面积，计算RSD，结果见表32。

表31重现性试验结果

试验结果表明，同一批样品在取样6份测定，结果重现性较好，RSD＝2.81％。

12.准确度(回收率)试验

取已知含量的五味甘露制剂(批号：20110501含量为0.2855mg/g)9份，研细，每份约1.25g，精密称定，分别加入艾黄素对照品溶液(30.4μg/mL)6.8mL、10.7mL、15.6mL，依法处理样品，测定峰面积，求得艾黄素含量，计算回收率，测定结果见表33。

表33回收率试验结果

试验结果表明，样品检测回收率较好，RSD＝1.37％。

13.样品中艾黄素的含量测定

精密吸取供试品溶液5μL进样，依法测定10批样品的色谱峰峰面积，每批样品处理2份，测定，计算平均值，求得样品中艾黄素的含量，结果见表34。

表34样品中艾黄素的含量测定结果(n＝2)

根据以上多批样品的含量测定结果，五味甘露制剂每1g含大籽蒿以艾黄素计在0.118mg～0.408mg的范围内，按最低含量的70％作为含量下限，即0.118mg/g×70％＝0.0826mg/g，因此，暂定本品每1g含大籽蒿以艾黄素(C₂₀H₂₀O₈)计应不得少于82μg。

下述实施例均能实现上述实验例的效果。

试验实施例1：五味甘露药浴汤散的检测

刺柏100g、烈香杜鹃100g、大籽蒿100g、麻黄100g、水柏枝100g；以上五味，粉成粗粉，混匀，发酵后，烘干、分装，即得。

A.刺柏和水柏枝的显微鉴别

取上述五味甘露药浴汤散0.001，研细，加水合氯醛0.1mL，透化2次，滴加适量稀甘油，制片，以消除基质对显微观察的干扰，置显微镜下观察，鉴别各味药材的形态特征：

刺柏的主要形态特征：纤维状下皮细胞易见，木质化或硅质化，多成束；

水柏枝的主要形态特征：叶表皮细胞多角形或类长圆形，胞壁微弯或平直，为水柏枝里的主要特征结构；木纤维淡黄色，细胞长条形，微木化。

B.烈香杜鹃的薄层鉴别

取上述五味甘露药浴汤散10g，加乙醇50mL，超声处理15分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加40％乙醇，分三次置水浴上加热溶解，每次10mL，趁热过滤，合并滤液，蒸去乙醇，水溶液加乙醚萃取2次，每次15mL，合并乙醚液，水浴蒸干，残渣加甲醇1mL溶解，作为烈香杜鹃供试品溶液；另取烈香杜鹃对照药材5g，按照与烈香杜鹃供试品溶液相同的方法制成烈香杜鹃对照药材溶液；按处方比例及制备工艺，配制不含烈香杜鹃的阴性样品，并照上述供试品溶液的制备方法制成阴性样品溶液。照薄层色谱法(《中国药典》2010年版一部附录VIB)试验，吸取上述溶液各5μL，分别点于同一硅胶GF₂₅₄薄层板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸(体积比为7∶2∶0.5)的上层液为展开剂，薄层板置展开缸中饱和20分钟，展开，取出，晾干，置紫外光灯(254nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。

C.刺柏的薄层鉴别

取上述五味甘露药浴汤散0.5g，加无水乙醇5mL，超声处理10分钟，滤过，滤液作为刺柏供试品溶液；另取刺柏对照药材1g，加无水乙醇5mL，超声处理20分钟，滤过，滤液浓缩至约1mL，作为刺柏对照药材溶液；按处方比例及制备工艺，配制不含刺柏的阴性样品，并照上述供试品溶液的制备方法制成阴性样品溶液。照薄层色谱法(《中国药典》2010年版一部附录VIB)试验，吸取上述溶液各4μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷∶甲醇∶浓氨试液(体积比为10∶2∶0.25)为展开剂，薄层板置展开缸中饱和20分钟，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。

D.大籽蒿的薄层鉴别

取上述五味甘露药浴汤散5g，加甲醇20mL，超声处理30分钟，滤过，滤液作为大籽蒿供试品溶液；另取大籽蒿对照药材1g，按照与大籽蒿供试品溶液相同的方法制成大籽蒿对照药材溶液；按处方比例及制备工艺，配制不含大籽蒿的阴性样品，并照上述供试品溶液的制备方法制成阴性样品溶液。照薄层色谱法(《中国药典》2010年版一部附录VI B)试验，吸取上述溶液各10μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸(体积比为7∶2∶0.5)为展开剂，薄层板置展开缸中饱和20分钟，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同的淡蓝色荧光斑点。

E.麻黄所含盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱的含量测定

照高效液相色谱法(《中国药典》2010版一部附录VID)

色谱条件与系统适用性试验：极性乙醚连接苯基键合硅胶为填充剂；流动相：乙腈-0.092％H₃PO₄(含0.04％三乙胺和0.02％二正丁胺)(1.5∶98.5体积百分比)；流速：1.0mL/min；检测波长：210nm；柱温：30℃；理论塔板数按盐酸麻黄碱峰计算应不低于3000。

对照品溶液的制备：取盐酸麻黄碱对照品、盐酸伪麻黄碱对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1mL含盐酸麻黄碱40μg、盐酸伪麻黄碱100μg的混合溶液，即得。

供试品溶液制备：取上述五味甘露药浴汤散约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入1.44％磷酸溶液10mL，称定重量，超声处理(功率500W，频率53kHz)20分钟，放冷，再称定重量，用1.44％磷酸补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。

测定法：分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定，即得。

五味甘露药浴汤散每1g含麻黄以盐酸麻黄碱(C₁₀H₁₅NO·HCl)和盐酸伪麻黄碱(C₁₀H₁₅NO·HCl)的总量计为3.82mg。

F.大籽蒿所含艾黄素的含量测定

照高效液相色谱法(《中国药典》2010版一部附录VID)

色谱条件与系统适用性试验：十八烷基硅胶键合相为填充剂；流动相：以乙腈-0.1％三氟乙酸为流动相，按下表35中的规定进行梯度洗脱：

表35

流速：1.0mL/min；检测波长：346nm；柱温：30℃；理论塔板数以艾黄素峰计算应不低于10000。

对照品溶液的制备：取艾黄素对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1mL含0.03mg的溶液，备用。

供试品溶液的制备：取上述五味甘露药浴汤散约2.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入乙醇25mL，精密称定重量，超声处理(功率250W，频率40kHz)30分钟，放冷，再称定重量，用乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液，备用。

测定法：分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各5μL，注入液相色谱仪，测定，即得。

五味甘露药浴汤散每1g含大籽蒿以艾黄素(C₂₀H₂₀O₈)计为232μg。

试验实施例2：五味甘露硬胶囊的检测

刺柏100g、烈香杜鹃100g、大籽蒿100g、麻黄100g、水柏枝100g；

以上五味，粉碎成细粉，过筛，混匀，按药剂学常规方法，加入常规辅料，制成临床上接受五味甘露硬胶囊。

A.刺柏和水柏枝的显微鉴别

取上述五味甘露硬胶囊0.0008，研细，加水合氯醛0.08mL，透化1次，滴加适量稀甘油，制片，以消除基质对显微观察的干扰，置显微镜下观察，鉴别各味药材的形态特征：

刺柏的主要形态特征：纤维状下皮细胞易见，木质化或硅质化，多成束；

水柏枝的主要形态特征：叶表皮细胞多角形或类长圆形，胞壁微弯或平直，为水柏枝里的主要特征结构；木纤维淡黄色，细胞长条形，微木化。

B.烈香杜鹃的薄层鉴别

取上述五味甘露硬胶囊5g，加乙醇25mL，超声处理10分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加20％乙醇，分三次置水浴上加热溶解，每次5mL，趁热过滤，合并滤液，蒸去乙醇，水溶液加30mL乙醚萃取1次，收集乙醚液，水浴蒸干，残渣加甲醇0.5mL溶解，作为烈香杜鹃供试品溶液；另取烈香杜鹃对照药材2.5g，按照与烈香杜鹃供试品溶液相同的方法制成烈香杜鹃对照药材溶液；按处方比例及制备工艺，配制不含烈香杜鹃的阴性样品，并照上述供试品溶液的制备方法制成阴性样品溶液。照薄层色谱法(《中国药典》2010年版一部附录VIB)试验，吸取上述溶液各5μL，分别点于同一硅胶GF₂₅₄薄层板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸(体积比为3∶1.2∶0.2)的上层液为展开剂，薄层板置展开缸中饱和30分钟，展开，取出，晾干，置紫外光灯(254nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。

C.刺柏的薄层鉴别

取上述五味甘露硬胶囊0.3g，加无水乙醇2mL，超声处理5分钟，滤过，滤液作为刺柏供试品溶液；另取刺柏对照药材0.5g，加无水乙醇2mL，超声处理10分钟，滤过，滤液浓缩至约0.5mL，作为刺柏对照药材溶液；按处方比例及制备工艺，配制不含刺柏的阴性样品，并照上述供试品溶液的制备方法制成阴性样品溶液。照薄层色谱法(《中国药典》2010年版一部附录VIB)试验，吸取上述溶液各2μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷∶甲醇∶浓氨试液(体积比为7∶1.2∶0.18)为展开剂，薄层板置展开缸中饱和40分钟，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。

D.大籽蒿的薄层鉴别

取上述五味甘露硬胶囊5g，加甲醇20mL，超声处理30分钟，滤过，滤液作为大籽蒿供试品溶液；另取大籽蒿对照药材1g，按照与大籽蒿供试品溶液相同的方法制成大籽蒿对照药材溶液；按处方比例及制备工艺，配制不含大籽蒿的阴性样品，并照上述供试品溶液的制备方法制成阴性样品溶液。照薄层色谱法(《中国药典》2010年版一部附录VI B)试验，吸取上述溶液各10μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸(体积比为7∶2∶0.5)为展开剂，薄层板置展开缸中饱和20分钟，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同的淡蓝色荧光斑点。

E.麻黄所含盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱的含量测定

照高效液相色谱法(《中国药典》2010版一部附录VID)

色谱条件与系统适用性试验：极性乙醚连接苯基键合硅胶为填充剂；流动相：乙腈-0.092％H₃PO₄(含0.04％三乙胺和0.02％二正丁胺)(1.4∶98.6体积百分比)；流速：1.0mL/min；检测波长：210nm；柱温：25℃；理论塔板数按盐酸麻黄碱峰计算应不低于3000。

对照品溶液的制备：取盐酸麻黄碱对照品、盐酸伪麻黄碱对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1mL含盐酸麻黄碱20μg、盐酸伪麻黄碱80μg的混合溶液，即得。

供试品溶液制备：取上述五味甘露硬胶囊约0.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入1.44％磷酸溶液5mL，称定重量，超声处理(功率500W，频率53kHz)15分钟，放冷，再称定重量，用1.44％磷酸补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。

测定法：分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各20μL，注入液相色谱仪，测定，即得。

五味甘露硬胶囊每1g含麻黄以盐酸麻黄碱(C₁₀H₁₅NO·HCl)和盐酸伪麻黄碱(C₁₀H₁₅NO·HCl)的总量计为189mg。

F.大籽蒿所含艾黄素的含量测定

照高效液相色谱法(《中国药典》2010版一部附录VID)

色谱条件与系统适用性试验：十八烷基硅胶键合相为填充剂；流动相：以乙腈-0.1％三氟乙酸为流动相，按下表36中的规定进行梯度洗脱：

表36

流速：1.0mL/min；检测波长：346nm；柱温：25℃；理论塔板数以艾黄素峰计算应不低于10000。

对照品溶液的制备：取艾黄素对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1mL含0.02mg的溶液，备用。

供试品溶液的制备：取上述五味甘露硬胶囊约1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入乙醇10mL，精密称定重量，超声处理(功率250W，频率40kHz)20分钟，放冷，再称定重量，用乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液，备用。

测定法：分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各20μL，注入液相色谱仪，测定，即得。

五味甘露药浴硬胶囊每1g含大籽蒿以艾黄素(C₂₀H₂₀O₈)计为143μg。

试验实施例3：五味甘露片的检测

刺柏100g、烈香杜鹃100g、大籽蒿100g、麻黄100g、水柏枝100g；

以上五味，粉碎成细粉，过筛，混匀，按药剂学常规方法，加入常规辅料，制成临床上接受五味甘露片。

A.刺柏和水柏枝的显微鉴别

取上述五味甘露片0.0012，研细，加水合氯醛0.12mL，透化3次，滴加适量稀甘油，制片，以消除基质对显微观察的干扰，置显微镜下观察，鉴别各味药材的形态特征：

刺柏的主要形态特征：纤维状下皮细胞易见，木质化或硅质化，多成束；

水柏枝的主要形态特征：叶表皮细胞多角形或类长圆形，胞壁微弯或平直，为水柏枝里的主要特征结构；木纤维淡黄色，细胞长条形，微木化。

B.烈香杜鹃的薄层鉴别

取上述五味甘露片10g，加乙醇50mL，超声处理15分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加40％乙醇，分三次置水浴上加热溶解，每次10mL，趁热过滤，合并滤液，蒸去乙醇，水溶液加乙醚萃取2次，每次15mL，合并乙醚液，水浴蒸干，残渣加甲醇1mL溶解，作为烈香杜鹃供试品溶液；另取烈香杜鹃对照药材5g，按照与烈香杜鹃供试品溶液相同的方法制成烈香杜鹃对照药材溶液；按处方比例及制备工艺，配制不含烈香杜鹃的阴性样品，并照上述供试品溶液的制备方法制成阴性样品溶液。照薄层色谱法(《中国药典》2010年版一部附录VIB)试验，吸取上述溶液各5μL，分别点于同一硅胶GF₂₅₄薄层板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸(体积比为7∶2∶0.5)的上层液为展开剂，薄层板置展开缸中饱和20分钟，展开，取出，晾干，置紫外光灯(254nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。

C.刺柏的薄层鉴别

取上述五味甘露片1g，加无水乙醇3mL，超声处理10分钟，滤过，滤液作为刺柏供试品溶液；另取刺柏对照药材1.5g，加无水乙醇10mL，超声处理15分钟，滤过，滤液浓缩至约1.5mL，作为刺柏对照药材溶液；按处方比例及制备工艺，配制不含刺柏的阴性样品，并照上述供试品溶液的制备方法制成阴性样品溶液。照薄层色谱法(《中国药典》2010年版一部附录VIB)试验，吸取上述溶液各5μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷∶甲醇∶浓氨试液(体积比为13∶2.3∶0.4)为展开剂，薄层板置展开缸中饱和30分钟，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。

D.大籽蒿的薄层鉴别

取上述五味甘露片1.5g，加甲醇10mL，超声处理10分钟，滤过，滤液作为大籽蒿供试品溶液；另取大籽蒿对照药材0.5g，按照与大籽蒿供试品溶液相同的方法制成大籽蒿对照药材溶液；按处方比例及制备工艺，配制不含大籽蒿的阴性样品，并照上述供试品溶液的制备方法制成阴性样品溶液。照薄层色谱法(《中国药典》2010年版一部附录VI B)试验，吸取上述溶液各20μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸(体积比为3∶1∶0.2)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同的淡蓝色荧光斑点。

E.麻黄所含盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱的含量测定

照高效液相色谱法(《中国药典》2010版一部附录VID)

色谱条件与系统适用性试验：极性乙醚连接苯基键合硅胶为填充剂；流动相：乙腈-0.092％H₃PO₄(含0.04％三乙胺和0.02％二正丁胺)(1.6∶98.4体积百分比)；流速：1.0mL/min；检测波长：210nm；柱温：30℃；理论塔板数按盐酸麻黄碱峰计算应不低于3000。

对照品溶液的制备：取盐酸麻黄碱对照品、盐酸伪麻黄碱对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1mL含盐酸麻黄碱30μg、盐酸伪麻黄碱90μg的混合溶液，即得。

供试品溶液制备：取上述五味甘露片约1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入1.44％磷酸溶液15mL，称定重量，超声处理(功率500W，频率53kHz)25分钟，放冷，再称定重量，用1.44％磷酸补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。

测定法：分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各15μL，注入液相色谱仪，测定，即得。

五味甘露片每1g含麻黄以盐酸麻黄碱(C₁₀H₁₅NO·HCl)和盐酸伪麻黄碱(C₁₀H₁₅NO·HCl)的总量计为254mg。

F.大籽蒿所含艾黄素的含量测定

照高效液相色谱法(《中国药典》2010版一部附录VID)

色谱条件与系统适用性试验：十八烷基硅胶键合相为填充剂；流动相：以乙腈-0.1％三氟乙酸为流动相，按下表37中的规定进行梯度洗脱：

表37

流速：1.0mL/min；检测波长：346nm；柱温：30℃；理论塔板数以艾黄素峰计算应不低于10000。

对照品溶液的制备：取艾黄素对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1mL含0.01mg的溶液，备用。

供试品溶液的制备：取上述五味甘露片约1.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入乙醇15ml，精密称定重量，超声处理(功率250W，频率40kHz)25分钟，放冷，再称定重量，用乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液，备用。

测定法：分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各15μL，注入液相色谱仪，测定，即得。

五味甘露片每1g含大籽蒿以艾黄素(C₂₀H₂₀O₈)计为227μg。

试验实施例4：五味甘露颗粒的检测

刺柏100g、烈香杜鹃100g、大籽蒿100g、麻黄100g、水柏枝100g；

以上五味，粉碎成细粉，过筛，混匀，按药剂学常规方法，加入常规辅料，制成临床上接受五味甘露颗粒。

A.刺柏和水柏枝的显微鉴别

取上述五味甘露颗粒0.0015g，研细，加水合氯醛0.15mL，透化4次，滴加适量稀甘油，制片，以消除基质对显微观察的干扰，置显微镜下观察，鉴别各味药材的形态特征：

刺柏的主要形态特征：纤维状下皮细胞易见，木质化或硅质化，多成束；

水柏枝的主要形态特征：叶表皮细胞多角形或类长圆形，胞壁微弯或平直，为水柏枝里的主要特征结构；木纤维淡黄色，细胞长条形，微木化。

B.烈香杜鹃的薄层鉴别

取上述五味甘露颗粒8g，加乙醇30mL，超声处理20分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加30％乙醇，分三次置水浴上加热溶解，每次8mL，趁热过滤，合并滤液，蒸去乙醇，水溶液加乙醚萃取3次，每次10mL，合并乙醚液，水浴蒸干，残渣加甲醇1.5mL溶解，作为烈香杜鹃供试品溶液；另取烈香杜鹃对照药材3.5g，按照与烈香杜鹃供试品溶液相同的方法制成烈香杜鹃对照药材溶液；按处方比例及制备工艺，配制不含烈香杜鹃的阴性样品，并照上述供试品溶液的制备方法制成阴性样品溶液。照薄层色谱法(《中国药典》2010年版一部附录VIB)试验，吸取上述溶液各10μL，分别点于同一硅胶GF₂₅₄薄层板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸(体积比为5∶2.8∶0.3)的上层液为展开剂，薄层板置展开缸中饱和40分钟，展开，取出，晾干，置紫外光灯(254nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。

C.刺柏的薄层鉴别

取上述五味甘露颗粒0.5g，加无水乙醇5mL，超声处理10分钟，滤过，滤液作为刺柏供试品溶液；另取刺柏对照药材1g，加无水乙醇5mL，超声处理20分钟，滤过，滤液浓缩至约1mL，作为刺柏对照药材溶液；按处方比例及制备工艺，配制不含刺柏的阴性样品，并照上述供试品溶液的制备方法制成阴性样品溶液。照薄层色谱法(《中国药典》2010年版一部附录VIB)试验，吸取上述溶液各4μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷∶甲醇∶浓氨试液(体积比为10∶2∶0.25)为展开剂，薄层板置展开缸中饱和20分钟，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。

D.大籽蒿的薄层鉴别

取上述五味甘露颗粒35g，加甲醇15mL，超声处理20分钟，滤过，滤液作为大籽蒿供试品溶液；另取大籽蒿对照药材1.5g，按照与大籽蒿供试品溶液相同的方法制成大籽蒿对照药材溶液；按处方比例及制备工艺，配制不含大籽蒿的阴性样品，并照上述供试品溶液的制备方法制成阴性样品溶液。照薄层色谱法(《中国药典》2010年版一部附录VI B)试验，吸取上述溶液各15μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸(体积比为5∶1.7∶0.8)为展开剂，薄层板置展开缸中饱和30分钟，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同的淡蓝色荧光斑点。

E.麻黄所含盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱的含量测定

照高效液相色谱法(《中国药典》2010版一部附录VID)

色谱条件与系统适用性试验：极性乙醚连接苯基键合硅胶为填充剂；流动相：乙腈-0.092％H₃PO₄(含0.04％三乙胺和0.02％二正丁胺)(体积比为1.3∶98.7体积百分比)；流速：1.0mL/min；检测波长：210nm；柱温：35℃；理论塔板数按盐酸麻黄碱峰计算应不低于3000。

对照品溶液的制备：取盐酸麻黄碱对照品、盐酸伪麻黄碱对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含盐酸麻黄碱50μg、盐酸伪麻黄碱110μg的混合溶液，即得。

供试品溶液制备：取上述五味甘露颗粒约2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入1.44％磷酸溶液20mL，称定重量，超声处理(功率500W，频率53kHz)30分钟，放冷，再称定重量，用1.44％磷酸补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。

测定法：分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定，即得。

五味甘露颗粒每1g含麻黄以盐酸麻黄碱(C₁₀H₁₅NO·HCl)和盐酸伪麻黄碱(C₁₀H₁₅NO·HCl)的总量计为304mg。

F.大籽蒿所含艾黄素的含量测定

照高效液相色谱法(《中国药典》2010版一部附录VI D)

色谱条件与系统适用性试验：十八烷基硅胶键合相为填充剂；流动相：以乙腈-0.1％三氟乙酸为流动相，按下表38中的规定进行梯度洗脱：

表38

流速：1.0mL/min；检测波长：346nm；柱温：30℃；理论塔板数以艾黄素峰计算应不低于10000。

对照品溶液的制备：取艾黄素对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1mL含0.03mg的溶液，备用。

供试品溶液的制备：取上述五味甘露颗粒约2.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入乙醇25mL，精密称定重量，超声处理(功率250W，频率40kHz)30分钟，放冷，再称定重量，用乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液，备用。

测定法：分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各5μL，注入液相色谱仪，测定，即得。

五味甘露颗粒每1g含大籽蒿以艾黄素(C₂₀H₂₀O₈)计为178μg。

试验实施例5：五味甘露丸的检测

刺柏100g、烈香杜鹃100g、大籽蒿100g、麻黄100g、水柏枝100g；

以上五味，粉碎成细粉，过筛，混匀，按药剂学常规方法，加入常规辅料，制成临床上接受五味甘露丸。

A.刺柏和水柏枝的显微鉴别

取上述五味甘露丸0.0018，研细，加水合氯醛0.18mL，透化2次，滴加适量稀甘油，制片，以消除基质对显微观察的干扰，置显微镜下观察，鉴别各味药材的形态特征：

刺柏的主要形态特征：纤维状下皮细胞易见，木质化或硅质化，多成束；

水柏枝的主要形态特征：叶表皮细胞多角形或类长圆形，胞壁微弯或平直，为水柏枝里的主要特征结构；木纤维淡黄色，细胞长条形，微木化。

B.烈香杜鹃的薄层鉴别

取上述五味甘露丸12g，加乙醇40mL，超声处理25分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加50％乙醇，分三次置水浴上加热溶解，每次12mL，趁热过滤，合并滤液，蒸去乙醇，水溶液加乙醚萃取2次，每次15mL，合并乙醚液，水浴蒸干，残渣加甲醇2mL溶解，作为烈香杜鹃供试品溶液；另取烈香杜鹃对照药材7.5g，按照与烈香杜鹃供试品溶液相同的方法制成烈香杜鹃对照药材溶液；按处方比例及制备工艺，配制不含烈香杜鹃的阴性样品，并照上述供试品溶液的制备方法制成阴性样品溶液。照薄层色谱法(《中国药典》2010年版一部附录VI B)试验，吸取上述溶液各15μL，分别点于同一硅胶GF₂₅₄薄层板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸(体积比为10∶3.5∶1.2)的上层液为展开剂，薄层板置展开缸中饱和20分钟，展开，取出，晾干，置紫外光灯(254nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。

C.刺柏的薄层鉴别

取上述五味甘露丸1.5g，加无水乙醇7mL，超声处理15分钟，滤过，滤液作为刺柏供试品溶液；另取刺柏对照药材2g，加无水乙醇12mL，超声处理30分钟，滤过，滤液浓缩至约2mL，作为刺柏对照药材溶液；按处方比例及制备工艺，配制不含刺柏的阴性样品，并照上述供试品溶液的制备方法制成阴性样品溶液。照薄层色谱法(《中国药典》2010年版一部附录VI B)试验，吸取上述溶液各6μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷∶甲醇∶浓氨试液(体积比为15∶3∶0.36)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。

D.大籽蒿的薄层鉴别

取上述五味甘露丸7.5g，加甲醇30mL，超声处理30分钟，滤过，滤液作为大籽蒿供试品溶液；另取大籽蒿对照药材2g，按照与大籽蒿供试品溶液相同的方法制成大籽蒿对照药材溶液；按处方比例及制备工艺，配制不含大籽蒿的阴性样品，并照上述供试品溶液的制备方法制成阴性样品溶液。照薄层色谱法(《中国药典》2010年版一部附录VI B)试验，吸取上述溶液各10μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸(体积比为11∶3.8∶1.2)为展开剂，薄层板置展开缸中饱和40分钟，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同的淡蓝色荧光斑点。

E.麻黄所含盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱的含量测定

照高效液相色谱法(《中国药典》2010版一部附录VI D)

色谱条件与系统适用性试验：极性乙醚连接苯基键合硅胶为填充剂；流动相：乙腈-0.092％H₃PO₄(含0.04％三乙胺和0.02％二正丁胺)(1.5∶98.5体积百分比)；流速：1.0mL/min；检测波长：210nm；柱温：30℃；理论塔板数按盐酸麻黄碱峰计算应不低于3000。

对照品溶液的制备：取盐酸麻黄碱对照品、盐酸伪麻黄碱对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1mL含盐酸麻黄碱40μg、盐酸伪麻黄碱100μg的混合溶液，即得。

供试品溶液制备：取上述五味甘露丸约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入1.44％磷酸溶液10mL，称定重量，超声处理(功率500W，频率53kHz)20分钟，放冷，再称定重量，用1.44％磷酸补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。

测定法：分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定，即得。

五味甘露丸每1g含麻黄以盐酸麻黄碱(C₁₀H₁₅NO·HCl)和盐酸伪麻黄碱(C₁₀H₁₅NO·HCl)的总量计为436mg。

F.大籽蒿所含艾黄素的含量测定

照高效液相色谱法(《中国药典》2010版一部附录VID)

色谱条件与系统适用性试验：十八烷基硅胶键合相为填充剂；流动相：以乙腈-0.1％三氟乙酸为流动相，按下表39中的规定进行梯度洗脱：

表39

流速：1.0mL/min；检测波长：346nm；柱温：35℃；理论塔板数以艾黄素峰计算应不低于10000。

对照品溶液的制备：取艾黄素对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1mL含0.04mg的溶液，备用。

供试品溶液的制备：取上述五味甘露丸约3g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入乙醇30mL，精密称定重量，超声处理(功率250W，频率40kHz)30分钟，放冷，再称定重量，用乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液，备用。

测定法：分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定，即得。

五味甘露丸每1g含大籽蒿以艾黄素(C₂₀H₂₀O₈)为385μg。

试验实施例6：五味甘露软胶囊的检测

刺柏100g、烈香杜鹃100g、大籽蒿100g、麻黄100g、水柏枝100g；

以上五味，粉碎成细粉，过筛，混匀，按药剂学常规方法，加入常规辅料，制成临床上接受五味甘露软胶囊。

A.刺柏和水柏枝的显微鉴别

取上述五味甘露软胶囊0.001g，研细，加水合氯醛0.1mL，透化2次，滴加适量稀甘油，制片，以消除基质对显微观察的干扰，置显微镜下观察，鉴别各味药材的形态特征：

刺柏的主要形态特征：纤维状下皮细胞易见，木质化或硅质化，多成束；

水柏枝的主要形态特征：叶表皮细胞多角形或类长圆形，胞壁微弯或平直，为水柏枝里的主要特征结构；木纤维淡黄色，细胞长条形，微木化。

B.烈香杜鹃的薄层鉴别

取上述五味甘露软胶囊18g，加乙醇75mL，超声处理30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加60％乙醇，分三次置水浴上加热溶解，每次18mL，趁热过滤，合并滤液，蒸去乙醇，水溶液加乙醚萃取3次，每次10mL，合并乙醚液，水浴蒸干，残渣加甲醇2.5mL溶解，作为烈香杜鹃供试品溶液；另取烈香杜鹃对照药材9.5g，按照与烈香杜鹃供试品溶液相同的方法制成烈香杜鹃对照药材溶液；按处方比例及制备工艺，配制不含烈香杜鹃的阴性样品，并照上述供试品溶液的制备方法制成阴性样品溶液。照薄层色谱法(《中国药典》2010年版一部附录VI B)试验，吸取上述溶液各20μL，分别点于同一硅胶GF₂₅₄薄层板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸(体积比为14∶4.4∶1.5)的上层液为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(254nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。

C.刺柏的薄层鉴别

取上述五味甘露软胶囊2.5g，加无水乙醇8mL，超声处理20分钟，滤过，滤液作为刺柏供试品溶液；另取刺柏对照药材4.5g，加无水乙醇15mL，超声处理45分钟，滤过，滤液浓缩至约2.5mL，作为刺柏对照药材溶液；按处方比例及制备工艺，配制不含刺柏的阴性样品，并照上述供试品溶液的制备方法制成阴性样品溶液。照薄层色谱法(《中国药典》2010年版一部附录VI B)试验，吸取上述溶液各8μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷∶甲醇∶浓氨试液(体积比为17∶1.8∶0.45)为展开剂，薄层板置展开缸中饱和20分钟，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。

D.大籽蒿的薄层鉴别

取上述五味甘露软胶囊9g，加甲醇40mL，超声处理45分钟，滤过，滤液作为大籽蒿供试品溶液；另取大籽蒿对照药材2.5g，按照与大籽蒿供试品溶液相同的方法制成大籽蒿对照药材溶液；按处方比例及制备工艺，配制不含大籽蒿的阴性样品，并照上述供试品溶液的制备方法制成阴性样品溶液。照薄层色谱法(《中国药典》2010年版一部附录VI B)试验，吸取上述溶液各5μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸(体积比为14∶4.5∶1.6)为展开剂，薄层板置展开缸中饱和20分钟，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同的淡蓝色荧光斑点。

E.麻黄所含盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱的含量测定

照高效液相色谱法(《中国药典》2010版一部附录VI D)

色谱条件与系统适用性试验：极性乙醚连接苯基键合硅胶为填充剂；流动相：乙腈-0.092％H₃PO₄(含0.04％三乙胺和0.02％二正丁胺)(1.7∶98.3体积百分比)；流速：1.0mL/min；检测波长：210nm；柱温：30℃；理论塔板数按盐酸麻黄碱峰计算应不低于3000。

对照品溶液的制备：取盐酸麻黄碱对照品、盐酸伪麻黄碱对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1mL含盐酸麻黄碱60μg、盐酸伪麻黄碱120μg的混合溶液，即得。

供试品溶液制备：取上述五味甘露软胶囊约4.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入1.44％磷酸溶液45mL，称定重量，超声处理(功率500W，频率53kHz)40分钟，放冷，再称定重量，用1.44％磷酸补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。

测定法：分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各5μL，注入液相色谱仪，测定，即得。

五味甘露软胶囊每1g含麻黄以盐酸麻黄碱(C₁₀H₁₅NO·HCl)和盐酸伪麻黄碱(C₁₀H₁₅NO·HCl)的总量计为207mg。

F.大籽蒿所含艾黄素的含量测定

照高效液相色谱法(《中国药典》2010版一部附录VI D)

色谱条件与系统适用性试验：十八烷基硅胶键合相为填充剂；流动相：以乙腈-0.1％三氟乙酸为流动相，按下表40中的规定进行梯度洗脱：

表40

流速：1.0mL/min；检测波长：346nm；柱温：30℃；理论塔板数以艾黄素峰计算应不低于10000。

对照品溶液的制备：取艾黄素对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1mL含0.05mg的溶液，备用。

供试品溶液的制备：取上述五味甘露软胶囊约4.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入乙醇45mL，精密称定重量，超声处理(功率250W，频率40kHz)45分钟，放冷，再称定重量，用乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液，备用。

测定法：分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各5μL，注入液相色谱仪，测定，即得。

五味甘露软胶囊每1g含大籽蒿以艾黄素(C₂₀H₂₀O₈)计为186μg。

试验实施例7：五味甘露药浴颗粒的检测

刺柏100g、烈香杜鹃100g、大籽蒿100g、麻黄100g、水柏枝100g；

以上五味，加水煎煮三次，每次1小时，同时收集挥发油，煎液合并，滤过，滤液减压浓缩至适量，喷雾干燥，加入上述挥发油，混匀，制颗粒，制成1000～1200g，即得。

A.刺柏和水柏枝的显微鉴别

取上述五味甘露药浴颗粒0.001g，研细，加水合氯醛0.1mL，透化2次，滴加适量稀甘油，制片，以消除基质对显微观察的干扰，置显微镜下观察，鉴别各味药材的形态特征：

刺柏的主要形态特征：纤维状下皮细胞易见，木质化或硅质化，多成束；

水柏枝的主要形态特征：叶表皮细胞多角形或类长圆形，胞壁微弯或平直，为水柏枝里的主要特征结构；木纤维淡黄色，细胞长条形，微木化。

B.烈香杜鹃的薄层鉴别

取上述五味甘露药浴颗粒10g，加乙醇50mL，超声处理15分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加40％乙醇，分三次置水浴上加热溶解，每次10mL，趁热过滤，合并滤液，蒸去乙醇，水溶液加乙醚萃取2次，每次15mL，合并乙醚液，水浴蒸干，残渣加甲醇1mL溶解，作为烈香杜鹃供试品溶液；另取烈香杜鹃对照药材5g，按照与烈香杜鹃供试品溶液相同的方法制成烈香杜鹃对照药材溶液；按处方比例及制备工艺，配制不含烈香杜鹃的阴性样品，并照上述供试品溶液的制备方法制成阴性样品溶液。照薄层色谱法(《中国药典》2010年版一部附录VI B)试验，吸取上述溶液各5μL，分别点于同一硅胶GF₂₅₄薄层板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸(体积比为7∶2∶0.5)的上层液为展开剂，薄层板置展开缸中饱和20分钟，展开，取出，晾干，置紫外光灯(254nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。

C.刺柏的薄层鉴别

取上述五味甘露药浴颗粒0.5g，加无水乙醇5mL，超声处理10分钟，滤过，滤液作为刺柏供试品溶液；另取刺柏对照药材1g，加无水乙醇5mL，超声处理20分钟，滤过，滤液浓缩至约1mL，作为刺柏对照药材溶液；按处方比例及制备工艺，配制不含刺柏的阴性样品，并照上述供试品溶液的制备方法制成阴性样品溶液。照薄层色谱法(《中国药典》2010年版一部附录VI B)试验，吸取上述溶液各4μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷∶甲醇∶浓氨试液(体积比为10∶2∶0.25)为展开剂，薄层板置展开缸中饱和20分钟，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。

D.大籽蒿的薄层鉴别

取上述五味甘露药浴颗粒5g，加甲醇20mL，超声处理30分钟，滤过，滤液作为大籽蒿供试品溶液；另取大籽蒿对照药材1g，按照与大籽蒿供试品溶液相同的方法制成大籽蒿对照药材溶液；按处方比例及制备工艺，配制不含大籽蒿的阴性样品，并照上述供试品溶液的制备方法制成阴性样品溶液。照薄层色谱法(《中国药典》2010年版一部附录VI B)试验，吸取上述溶液各10μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸(体积比为7∶2∶0.5)为展开剂，薄层板置展开缸中饱和20分钟，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同的淡蓝色荧光斑点。

E.麻黄所含盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱的含量测定

照高效液相色谱法(《中国药典》2010版一部附录VI D)

色谱条件与系统适用性试验：极性乙醚连接苯基键合硅胶为填充剂；流动相：乙腈-0.092％H₃PO₄(含0.04％三乙胺和0.02％二正丁胺)(1.5∶98.5体积百分比)；流速：1.0mL/min；检测波长：210nm；柱温：30℃；理论塔板数按盐酸麻黄碱峰计算应不低于3000。

对照品溶液的制备：取盐酸麻黄碱对照品、盐酸伪麻黄碱对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1mL含盐酸麻黄碱40μg、盐酸伪麻黄碱100μg的混合溶液，即得。

供试品溶液制备：取上述五味甘露药浴颗粒约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入1.44％磷酸溶液10mL，称定重量，超声处理(功率500W，频率53kHz)20分钟，放冷，再称定重量，用1.44％磷酸补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。

测定法：分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定，即得。

五味甘露药浴颗粒每1g含麻黄以盐酸麻黄碱(C₁₀H₁₅NO·HCl)和盐酸伪麻黄碱(C₁₀H₁₅NO·HCl)的总量计339mg。

F.大籽蒿所含艾黄素的含量测定

照高效液相色谱法(《中国药典》2010版一部附录VI D)

色谱条件与系统适用性试验：十八烷基硅胶键合相为填充剂；流动相：以乙腈-0.1％三氟乙酸为流动相，按下表41中的规定进行梯度洗脱：

表41

流速：1.0mL/min；检测波长：346nm；柱温：30℃；理论塔板数以艾黄素峰计算应不低于10000。

对照品溶液的制备：取艾黄素对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1mL含0.03mg的溶液，备用。

供试品溶液的制备：取上述五味甘露药浴颗粒约2.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入乙醇25mL，精密称定重量，超声处理(功率250W，频率40kHz)30分钟，放冷，再称定重量，用乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液，备用。

测定法：分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各5μL，注入液相色谱仪，测定，即得。

五味甘露药浴颗粒每1g含大籽蒿以艾黄素(C₂₀H₂₀O₈)计为197μg。

Claims (32)

1.一种五味甘露制剂的检测方法，该方法通过包括以下步骤：

步骤1：显微鉴别所述五味甘露制剂中刺柏、水柏枝的显微特点；

步骤2：薄层色谱鉴别所述五味甘露制剂中的烈香杜鹃、刺柏和大籽蒿；在步骤2中，通过包括以下步骤的方法进行：

步骤2.1：分别制备第二、第三和第四样品溶液组，所述第二样品溶液组包括烈香杜鹃供试品溶液、烈香杜鹃对照药材溶液和烈香杜鹃阴性样品溶液；所述第三样品溶液组包括刺柏供试品溶液、刺柏对照药材溶液和刺柏阴性样品溶液；所述第四样品溶液组包括大籽蒿供试品溶液、大籽蒿对照药材溶液和大籽蒿阴性样品溶液；

步骤2.2：再按照薄层色谱法，吸取第二、第三和第四样品溶液组中的各溶液分别点于同一硅胶薄层板上；

步骤2.3：再将所述薄层板分别置展开缸中饱和，以展开剂展开，取出，晾干，紫外光灯下检视，检测所述五味甘露制剂中的烈香杜鹃、刺柏和大籽蒿；当检测第二样品溶液组或第四样品溶液组时，均以甲苯-乙酸乙酯-甲酸展开剂展开；或

当检测第三样品溶液组时，以三氯甲烷-甲醇-浓氨试液展开剂展开；

步骤3：高效液相色谱法测定所述制剂中麻黄所含盐酸麻黄碱和盐酸伪麻黄碱的含量、大籽蒿所含艾黄素的含量；在步骤3中，通过包括以下步骤的方法进行：

步骤3.1：分别制备第五、第六样品溶液组，所述第五样品溶液组包括麻黄供试品溶液、盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱混合对照品溶液和麻黄阴性样品溶液；所述第六样品溶液组包括大籽蒿供试品溶液、艾黄素对照品溶液和大籽蒿阴性样品溶液；

步骤3.2再分别以极性乙醚连接苯基键合硅胶或十八烷基硅胶键合相为填充剂；柱温25～40℃的条件的高效液相色谱法检测，测定所述制剂中麻黄所含盐酸麻黄碱和盐酸伪麻黄碱的含量、大籽蒿所含艾黄素的含量；当检测第五样品溶液组时，以乙腈-0.092%H₃PO₄为流动相，检测波长为210±2nm，柱温为25～40℃；或

当检测第六样品溶液组时，以乙腈-0.1%三氟乙酸为流动相进行梯度洗脱，检测波长为346±2nm，柱温为25～40℃。

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，在步骤1中，通过包括以下步骤的方法进行：

步骤1.1：制备包括刺柏和水柏枝供试品溶液的第一样品溶液组；

步骤1.2：再将步骤1.1制得的第一样品溶液组分别置于显微镜下观察所述五味甘露制剂中刺柏、水柏枝的显微特点。

3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，在步骤2.2中，所述硅胶薄层板为硅胶GF₂₅₄或G薄层板。

4.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，在步骤2.3中，当检测第二样品溶液组或第四样品溶液组时，所述甲苯-乙酸乙酯-甲酸展开剂中含有以下体积份的各组分：甲苯2～15份、乙酸乙酯0.5～5份和甲酸0.1～2份，所述GF₂₅₄或G薄层板置展开缸中饱和0～40分钟，分别于254nm、365nm，紫外光灯下检视；或

当检测第三样品溶液组时，所述三氯甲烷-甲醇-浓氨试液展开剂中含有以下体积份的各组分：三氯甲烷5～20份、甲醇1～3份、浓氨试液0.05～0.5，所述G薄层板置展开缸中饱和0～40分钟，于365nm，紫外光灯下检视。

5.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，在步骤2.3中，当检测第二样品溶液组或第四样品溶液组时，所述甲苯-乙酸乙酯-甲酸展开剂中含有以下体积份的各组分：所述甲苯7份、乙酸乙酯2份、甲酸0.5份，所述GF₂₅₄或G薄层板置展开缸中饱和20分钟。

6.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，在步骤2.3中，当检测第三样品溶液组时，所述三氯甲烷-甲醇-浓氨试液展开剂中含有以下体积份的各组分：三氯甲烷10份、甲醇2份、浓氨试液0.25份，所述G薄层板置展开缸中饱和20分钟。

7.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，在步骤2中，吸取第二样品溶液组中的各溶液均为5～20μL。

8.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，在步骤2中，吸取第二样品溶液组中的各溶液均为10μL.

9.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，在步骤2中，吸取第三样品溶液组中的各溶液均为2～8μL。

10.根据权利要求9所述的检测方法，其特征在于，在步骤2中，吸取第三样品溶液组中的各溶液均为4μL。

11.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，在步骤2中，吸取第四样品溶液组中各溶液均为5～20μL。

12.根据权利要求11所述的检测方法，其特征在于，在步骤2中，吸取第四样品溶液组中各溶液均为10μL。

13.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，在步骤3.2中，所述乙腈-0.092%H₃PO₄中乙腈和0.092%H₃PO₄的体积比为0.2～2.5：97.5～99.8。

14.根据权利要求13所述的检测方法，其特征在于，所述乙腈-0.092%H₃PO₄中乙腈和0.092%H₃PO₄的体积比为1.5：98.5。

15.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，在步骤3.2中，当检测第五样品溶液组时，检测波长为210nm。

16.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，在步骤3.2中，当检测第五样品溶液组时，柱温为30℃。

17.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，在步骤3.2中，所述乙腈-0.1%三氟乙酸为流动相进行的梯度洗脱的条件为：0分钟时，乙腈的浓度为25～65体积%，0.1%三氟乙酸的浓度为35～75%，再于35分钟内乙腈的浓度匀速变化至35～75体积%、0.1%三氟乙酸的浓度匀速变化至25～65%。

18.根据权利要求17所述的检测方法，其特征在于，在步骤3.2中，所述乙腈-0.1%三氟乙酸为流动相进行的梯度洗脱的条件为：0分钟时，乙腈的浓度为45体积%，0.1%三氟乙酸的浓度为55体积%，再于35分钟内乙腈的浓度匀速变化至55体积%，0.1%三氟乙酸的浓度匀速变化至45%。

19.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，在步骤3.2中，当检测第六样品溶液组时，检测波长为346nm。

20.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，在步骤3.2中，当检测第六样品溶液组时，柱温为30℃。

21.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，在步骤1.1中，所述第一样品溶液组通过包括以下步骤的方法制得：取所述五味甘露制剂0.0005～0.002g，研细，加水合氯醛0.05～0.2mL，透化1～5次，滴加适量稀甘油，制片，作为刺柏供试品溶液；再按照与刺柏供试品相同的方法制得水柏枝供试品溶液。

22.根据权利要求21所述的检测方法，其特征在于，在步骤1.1中，所述第一样品溶液组通过包括以下步骤的方法制得：取所述五味甘露制剂0.001g，加水合氯醛0.1mL，透化2次，滴加适量稀甘油，制片，作为刺柏供试品溶液；再按照与刺柏供试品相同的方法制得水柏枝供试品溶液。

23.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，在步骤2.3中，所述第二样品溶液组通过包括以下步骤的方法制得：取所述五味甘露制剂5～20g，加乙醇20～80mL，超声处理10～30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加20%～60%乙醇，分三次置水浴上加热溶解，每次5～20mL，趁热过滤，合并滤液，蒸去乙醇，水溶液加乙醚萃取1～3次，每次10～30mL，合并乙醚液，水浴蒸干，残渣加甲醇0.5～3mL溶解，作为烈香杜鹃供试品溶液；另取烈香杜鹃对照药材2～10g，按照与烈香杜鹃供试品溶液相同的制备方法制成烈香杜鹃对照药材溶液；按照与烈香杜鹃供试品溶液相同的处方比例及制备工艺，配制不含烈香杜鹃的阴性样品，按照所述烈香杜鹃供试品溶液的制备方法制成烈香杜鹃阴性样品溶液；或

所述第三样品溶液组通过包括以下步骤的方法制得：取所述五味甘露制剂0.1～3g，加无水乙醇1～10mL，超声处理5～20分钟，滤过，滤液作为刺柏供试品溶液；另取刺柏对照药材0.2～5g，加无水乙醇1～15mL，超声处理10～45分钟，滤过，滤液浓缩至约0.5～3mL，作为刺柏对照药材溶液；按照与五味甘露制剂相同的处方比例及制备工艺，配制不含刺柏的阴性样品，按照所述刺柏供试品溶液的制备方法制成刺柏阴性样品溶液；或

所述第四样品溶液组通过包括以下步骤的方法制得：取所述五味甘露制剂1～10g，加甲醇10～40mL，超声处理10～45分钟，滤过，滤液作为大籽蒿供试品溶液；另取大籽蒿对照药材0.5～3g，按照与大籽蒿供试品溶液相同的方法制成大籽蒿对照药材溶液；按照与五味甘露制剂相同的处方比例及制备工艺，配制不含大籽蒿的阴性样品，按照所述大籽蒿供试品溶液的制备方法制成大籽蒿阴性样品溶液。

24.根据权利要求23所述的检测方法，其特征在于，在步骤2.3中，所述第二样品溶液组通过包括以下步骤的方法制得：取所述五味甘露制剂10g，加乙醇50mL，超声处理15分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加40%乙醇，分三次置水浴上加热溶解，每次10mL，趁热过滤，合并滤液，蒸去乙醇，水溶液加乙醚萃取2次，每次15mL，合并乙醚液，水浴蒸干，残渣加甲醇1mL溶解，作为烈香杜鹃供试品溶液；另取烈香杜鹃对照药材5g，按照与烈香杜鹃供试品溶液相同的制备方法制成烈香杜鹃对照药材溶液；按照与五味甘露制剂相同的处方比例及制备工艺，配制不含烈香杜鹃的阴性样品，按照所述烈香杜鹃供试品溶液的制备方法制成烈香杜鹃阴性样品溶液；或

所述第三样品溶液组通过包括以下步骤的方法制得：取所述五味甘露制剂0.5g，加无水乙醇5mL，超声处理10分钟，滤过，滤液作为刺柏供试品溶液；另取刺柏对照药材1g，加无水乙醇5mL，超声处理20分钟，滤过，滤液浓缩至约1mL，作为刺柏对照药材溶液；按照与五味甘露制剂相同的处方比例及制备工艺，配制不含刺柏的阴性样品，按照所述刺柏供试品溶液的制备方法制成刺柏阴性样品溶液；或

所述第四样品溶液组通过包括以下步骤的方法制得：取所述五味甘露制剂5g，加甲醇20mL，超声处理30分钟，滤过，滤液作为大籽蒿供试品溶液；另取大籽蒿对照药材1g，按照与大籽蒿供试品溶液相同的方法制成大籽蒿对照药材溶液；按照与五味甘露制剂相同的处方比例及制备工艺，配制不含大籽蒿的阴性样品，按照所述大籽蒿供试品溶液的制备方法制成大籽蒿阴性样品溶液。

25.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，在步骤3.2中，所述第五样品溶液组通过包括以下步骤的方法制得：所述第五样品溶液组通过包括以下步骤的方法制备：取所述五味甘露制剂0.1～5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入1.44%磷酸溶液5～50mL，称定重量，超声处理10～45分钟，放冷，再称定重量，用1.44%磷酸溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，作为麻黄供试品溶液；另外精密称取盐酸麻黄碱对照品和盐酸伪麻黄碱对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1mL含盐酸麻黄碱0.00002～0.00006g、盐酸伪麻黄碱0.00008～0.00012g的混合溶液，作为盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱混合对照品溶液；按照与五味甘露制剂相同的处方比例及制备工艺，配置不含麻黄的阴性样品，按照所述麻黄供试品溶液的配制方法制成麻黄阴性样品溶液；或

所述第六样品溶液组通过包括以下步骤的方法制得：取所述五味甘露制剂0.5～5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入乙醇10～50mL，称定重量，超声处理15～45分钟，放冷，再称定重量，用乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，作为大籽蒿供试品溶液；另外精密称取艾黄素对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1mL含0.00001～0.00005g的溶液，作为艾黄素对照品溶液；按照与五味甘露制剂相同的处方比例及制备工艺，配置不含大籽蒿的阴性样品，按照所述大籽蒿供试品溶液的配制方法制成大籽蒿阴性样品溶液。

26.根据权利要求25所述的检测方法，其特征在于，在步骤3.2中，所述第五样品溶液组的测定法为：分别精密吸取第五样品溶液组中的溶液各5～20μL，注入液相色谱仪，测定，即得。

27.根据权利要求25所述的检测方法，其特征在于，在步骤3.2中，所述第六样品溶液组的测定法为：分别精密吸取第六样品溶液组中的溶液各5～20μL注入液相色谱仪，测定，即得。

28.根据权利要求25所述的检测方法，其特征在于，在步骤3.2中，所述第五样品溶液组通过包括以下步骤的方法制得：取所述五味甘露制剂0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入1.44%磷酸溶液10mL，称定重量，超声处理20分钟，放冷，再称定重量，用1.44%磷酸溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，作为麻黄供试品溶液；另外精密称取盐酸麻黄碱对照品和盐酸伪麻黄碱对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1mL含盐酸麻黄碱0.00004g、盐酸伪麻黄碱0.00010g的混合溶液，作为盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱混合对照品溶液；按照与五味甘露制剂相同的处方比例及制备工艺，配置不含麻黄的阴性样品；按照与所述麻黄供试品溶液相同的方法制成麻黄阴性样品溶液；或

所述第六样品溶液组通过包括以下步骤的方法制得：取所述五味甘露制剂2.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入乙醇25mL，称定重量，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，作为大籽蒿供试品溶液；另外精密称取艾黄素对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1mL含0.00003g的溶液，作为艾黄素对照品溶液；按照与五味甘露制剂相同的处方比例及制备工艺，配置不含大籽蒿的阴性样品，按照所述大籽蒿供试品溶液的配制方法制成大籽蒿阴性样品溶液。

29.根据权利要求28所述的检测方法，其特征在于，在步骤3.2中，所述第五样品溶液组的测定法为：分别精密吸取第五样品溶液组中的溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定，即得。

30.根据权利要求28所述的检测方法，其特征在于，在步骤3.2中，所述第六样品溶液组的测定法为：分别精密吸取第六样品溶液组中的溶液各10μL注入液相色谱仪，测定，即得。

31.根据权利要求1至30中任一项所述的检测方法，其特征在于，所述五味甘露制剂的原料药组成为：刺柏100重量份、烈香杜鹃100重量份、大籽蒿100重量份、麻黄100重量份和水柏枝100重量份；

所述五味甘露制剂通过包括以下步骤的方法制得：

取以上配比的五味原料，捣碎煎汤，即得；或取以上配比的五味原料，粉成粗粉，混匀，发酵后，烘干、分装，即得；或取以上配比的五味原料，粉碎成细粉，过筛，混匀，按药剂学常规方法，加入常规辅料，制成临床上接受的口服制剂。

32.根据权利要求1至30中任一项所述的检测方法，其特征在于，所述五味甘露制剂的剂型为片剂、胶囊剂、颗粒剂、丸剂或散剂。

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