CN104549593B - 一种具备超滤和固相萃取双重净化作用的功能化移液枪头及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种样品前处理的实验装置，尤其涉及一种具备超滤和固相萃取双重净化作用的功能化移液枪头，及其在药物分析过程中用于生物样品的前处理及定量分析。该枪头包括移液枪头、固相萃取材料和中空纤维膜，所述的移液枪头的尖端设置所述的中空纤维膜，并通过设置胶水均匀涂抹于移液枪头尖端与中空纤维膜交接处，所述的中空纤维膜具有上、下两端口，所述的上端口密封，下端口保持开口状态，所述的固相萃取材料设置在所述的移液枪头内部。本发明制作过程简便可控,萃取条件灵活调整,方法科学合理,取材方便应用前景良好。

Description

一种具备超滤和固相萃取双重净化作用的功能化移液枪头及 其应用

技术领域

本发明涉及一种样品前处理的实验装置，尤其涉及一种具备超滤和固相萃取双重净化作用的功能化移液枪头，及其在药物分析过程中用于生物样品的前处理及定量分析。

背景技术

固相萃取是一种样品前处理技术，随着现代仪器的快速发展，对样品的前处理要求也相应提高，固相萃取以其特有的优势，区别于传统的液液萃取法，在样品分离提纯方面发挥了越来越重要的作用。该技术由液-固萃取和柱-液色谱技术相结合发展而来，能够净化样品，将目标物质从样品基体中转移出来，并富集浓缩微量目标物质，从而提高样品分析的灵敏度、准确度。最常用的固相萃取形式是固相萃取柱，是一种填充好固定相的短色谱柱，已经广泛应用于环境、化工、食品等各个领域。但是固相萃取柱的柱体积较大，样品用量较多，难以用于血液、细胞培养液、组织液等珍贵及微量生物样品的分析，限制了该技术的应用。因此，微型化已成为固相萃取领域的研究热点。

移液枪是一种半自动化的液体定量转移装置，在各类实验室中广泛应用。将移液枪头作为载体，通过内置固相萃取吸附剂，可以同时实现采样、定量、净化和目标物质富集，能够将固相萃取和定量取样相结合，能够弥补传统生物样本预处理方法操作程序复杂、有机溶剂用量大、目标物质损失大等技术缺陷，是一个很有发展潜力的方向。移液枪头内置吸附剂的形式主要有以下几种：①整体柱内置型：将一小段整体柱放入移液枪头中作为固相萃取吸附剂。但是整体柱的制备重现性较低，造成结果差异性较大，另外由于整体柱的孔隙较小，不易吸取液体，无法实现定量吸取样品；②内部粘贴型；将一层吸附材料粉末粘贴在移液枪头内部。但是该方法难以将吸附材料定量，而且粘贴的材料质量有限，难以实现较高的吸附容量；③尖头信封型；将吸附材料用微孔滤膜包裹后，粘贴在枪头顶端。但是该方法制作难度较大，且无法很好地控制包裹的形状和体积等会影响吸附效果的因素，因此结果重现性较低。因此，亟需发展一种制作简单、吸附材料质量可控的固相萃取装置。

发明内容

本发明的第一目的为了设计一种具备超滤及固相萃取双重净化作用，用于生物样品净化、富集的实验装置，本发明提供了一种具备超滤和固相萃取双重净化作用的功能化移液枪头。

为了实现上述的目的，本发明采用了以下的技术方案：

一种具备超滤和固相萃取双重净化作用的功能化移液枪头，该枪头包括移液枪头、固相萃取材料和中空纤维膜，所述的移液枪头为锥形结构，所述的中空纤维膜设置在移液枪头的尖端内部，并通过设置胶水均匀涂抹于移液枪头尖端与中空纤维膜交接处，所述的中空纤维膜具有上、下两端口，所述的上端口密封，下端口凸出尖端设置并保持开口状态，所述的固相萃取材料设置在所述的移液枪头内部并完全覆盖中空纤维膜。

作为进一步改进,所述的中空纤维膜下端口凸出尖端的长度为0.2-0.6 cm。

作为进一步改进,所述的中空纤维膜形状为圆柱体，长度0.5 -2 cm，内径200 -1000 μm，外径500- 2000 μm，膜壁孔径0.1-0.5 μm。

作为进一步改进,所述的中空纤维膜材料选自聚丙烯、混合纤维酯、硝酸纤维素、聚偏氟乙烯、醋酸纤维素、再生纤维素、聚酰胺、聚四氟乙烯和聚氯乙烯中一种或多种混合。

作为进一步改进,所述的胶水为环氧胶水。

作为进一步改进,所述的固相萃取材料为具有吸附能力的固体粉末，微粒直径2-50 μm；所述的固相萃取材料质量范围为5-200 mg。

作为进一步改进,所述的固相萃取材料材料选自反相材料、正相材料或离子交换材料。

本发明的第二目的提供了一种具备超滤和固相萃取双重净化作用的功能化移液枪头的制备方法。

为了实现上述的目的，本发明采用了以下的技术方案：

一种具备超滤和固相萃取双重净化作用的功能化移液枪头的制备方法，其特征包括以下步骤：

1）根据待测目标物质分子量与结构式，选择适宜的中空纤维膜并确定最佳尺寸；用加热的镊子按压中空纤维膜上部端口，将其密封，下部端口保持开口状态；

2）取1只移液枪头，根据中空纤维膜的外径，从移液枪头的相应位置剪去部分枪头尖端，使中空纤维膜外径与枪头尖端内径基本吻合；将步骤1）的中空纤维膜，以开口朝下的方式内置于移液枪头中，中空纤维膜下部端口突出枪头一定的距离，用适量环氧胶水均匀涂覆于中空纤维膜和移液枪头的交接处，在室温下固化24 h，得到内置中空纤维膜的枪头；

3）根据待测目标物质的理化性质，选择适宜的固相萃取材料，称取粉末状材料，放入步骤2）的移液枪头内部，即得到带有超滤和固相萃取双重净化能力的功能化移液枪头。

本发明的第三目的提供了一种进行生物样本中中药活性成分的样品预处理及定量分析。

为了实现上述的目的，本发明采用了以下的技术方案：

一种进行生物样本中中药活性成分的样品预处理及定量分析，该样品预处理及定量分析包括以下步骤：

1）中空纤维膜与固相萃取材料的选择，并制备功能化枪头；

2）活化功能化移液枪头

将步骤1）的功能化移液枪头连接在移液枪上，通过移液枪，吸取色谱纯甲醇，通过多次吸取排出甲醇冲洗移液枪头；再吸取去离子水，同样重复吸取排出去离子水冲洗移液枪头，即活化完成，得到活化的功能化移液枪头；

3）取样

用步骤2）的活化枪头，通过移液枪，吸取0.1-1 mL待测样品溶液，通过反复吸取、排出同一待测样品的步骤，使目标物质被充分吸附于固相萃取材料上，最后一次将萃取完成的样品废液排出后，得到吸附目标物质的枪头；

4）净化

用步骤3）的枪头，通过移液枪，吸取去离子水，通过反复吸取、排出步骤，最后一次将移液枪头内的液体充分排空，去除杂质，得到初步净化的功能化枪头；

5）洗脱并富集

取步骤4）的枪头，通过移液枪，吸取一定体积的洗脱液，洗脱液可以是色谱纯甲醇、色谱乙醇、不同比例的缓冲盐有机溶液等，吸取后将移液枪头静置5-30 min，静置过程确保洗脱液无渗漏，然后将移液枪头内的液体排除，收集洗脱液，装入样品瓶即得到供试品溶液，供含量测定；如果洗脱液体积等于待测样品取样体积，则功能化枪头发挥纯化待测目标物质的作用；如果洗脱液体积小于待测样品取样体积，则具有富集作用，可以通过公式计算待测目标物质富集系数；

6）目标物质定量分析

取步骤5）的供试品溶液，直接注入高效液相色谱仪、气相色谱仪、液质联用等分析仪器中，选择优化的分离条件，进行含量分析，同时配制待测物质标准品溶液，记录标准品及供试品溶液的色谱或质谱峰面积；

7）目标物质含量测定结果。

根据步骤6）标准品及供试品溶液的色谱或质谱峰面积，计算生物样品中待测物质的含量，当功能化枪头富集样品时，样品的浓度应根据富集系数折算实际浓度。

作为进一步改进，样品溶液为细胞培养液、血清、血浆或组织液；所述的洗脱液为色谱纯甲醇、色谱乙醇或不同比例的缓冲盐有机溶液；分析仪器为高效液相色谱仪、气相色谱仪或液质联用分析仪。

本发明由于采用了上述的实验装置及应用步骤，具有以下的特点：

1、制作过程简便可控

由于目前数量有限的可用于固相萃取的移液枪头制作工艺复杂，对影响萃取的关键因素如接触面积、固相萃取材料用量都难以精准控制，结果重现性较差。本发明的固相萃取装置结构简单，能严格控制制作过程中的各个因素，萃取材料用量能够精准控制，且可以和样品溶液充分接触，结果重现性好，能够为生物样本的色谱分析提供可靠的样品前处理装置。

2、萃取条件灵活调整

目前可用于固相萃取的移液枪头吸附容量有限，材料用量和类型难以调节。本发明的实验装置，可针对不同的目标物质和样品，方便选择多种萃取材料，通过调整不同的材料类型、用量和洗脱条件，提供多样化的实验数据，满足不同生物样品的分析要求。

3、方法科学合理

目前的固相萃取装置所需样品量较大，一般大于3 mL，无法满足微量生物样品的分析需要。本发明的装置所需样品量最低仅用0.1 mL，可用于绝大多数生物样品的前处理；且本发明的萃取过程均通过移液枪的移取完成，可实现液体定量移取，操作简便快捷，方法科学合理。

4、取材方便应用前景良好

本发明所采用的制作材料如移液枪头、移液枪和固相萃取材料是各类实验室常用的实验耗材，中空纤维膜材料、环氧胶水也应用广泛，取材方便。通过本发明的制作方法，可以方便地制作出具有超滤和固相萃取双重性能的功能化移液枪头，并且可以多次重复使用，能够为减少样品前处理时间，降低实验费用，发挥积极的作用。

附图说明

图1功能化移液枪头的结构示意图。

图2固相萃取操作过程示意图。

图3功能化枪头应用于生物样本分析的流程示意图。

图4萃取前后样品的色谱分析图（A：对照品溶液，B：未萃取样品溶液，C：萃取后废液，D：洗脱液）。

具体实施方式

下面结合附图对本发明的具体实施方式做一个详细的说明。

如图1所示一种具备超滤和固相萃取双重净化作用的功能化移液枪头，该枪头包括移液枪头1、固相萃取材料2和中空纤维膜3，所述的中空纤维膜3为1段长度2 cm，内径600μm，外径1000 μm，膜壁孔径0.2 μm，为聚丙烯材料；用加热的镊子按压中空纤维膜3上部端口，将其密封，下部端口保持开口状态；取1只200 μL的移液枪头1，将其尖端剪去0.3 cm；将上述中空纤维膜3内置于移液枪头1中，中空纤维膜3下部端口突出枪头0.5 cm，用10 mg环氧胶水均匀涂覆于中空纤维膜3和移液枪头1的交接处，在室温下固化24 h，称取10 mg 白色粉末状C₁₈硅胶固相萃取材料2放置移液枪头1内部。

一种具备超滤和固相萃取双重净化作用的功能化移液枪头的制备方法，该制备方法包括以下步骤：

1）根据待测目标物质分子量与结构式，选择适宜的中空纤维膜3并确定最佳尺寸；用加热的镊子按压中空纤维膜3上部端口，将其密封，下部端口保持开口状态；

2）取1只移液枪头1，根据中空纤维膜3的外径，从移液枪头1的相应位置剪去部分枪头尖端，使中空纤维膜3外径与枪头尖端内径基本吻合；将步骤1）的中空纤维膜3，以开口朝下的方式内置于移液枪头1中，中空纤维膜3下部端口突出枪头一定的距离，用适量环氧胶水均匀涂覆于中空纤维膜3和移液枪头1的交接处，在室温下固化24 h，得到内置中空纤维膜的枪头；

3）根据待测目标物质的理化性质，选择适宜的固相萃取材料2，称取粉末状材料，放入步骤2）的移液枪头1内部，即得到带有超滤和固相萃取双重净化能力的功能化移液枪头。

一种进行生物样本中中药活性成分的样品预处理及定量分析，该样品预处理及定量分析包括以下步骤：

1）中空纤维膜3与固相萃取材料2的选择，并制备功能化枪头；

2）活化功能化移液枪头

将步骤1）的功能化移液枪头连接在1支最大移取体积为200 μL的移液枪上。通过移液枪，吸取色谱纯甲醇，每次吸取200 μL ，吸取10次，共用2 mL甲醇冲洗移液枪头；再吸取去离子水，每次吸取200 μL，吸取10次，共用2 mL去离子水冲洗移液枪头，即活化完成，得到活化的功能化移液枪头。

3）取样

用步骤2）的活化枪头，通过移液枪，吸取200 μL待测样品溶液（样品溶液为DEME细胞培养基，含有0.512 mg/L淫羊藿苷、0.456 mg/L朝藿定A、0.516 mg/L朝藿定B和0.660mg/L朝藿定C），同一份待测样品重复吸取及排出步骤，循环10次，然后再次吸取200 μL待测样品溶液，同样重复吸取及排出步骤，循环10次，2次共吸取400 μL待测样品溶液，并通过重复吸取排出步骤，使待测目标物质被充分吸附在固相萃取材料上。最后一次将移液枪头内已完成萃取的样品废液充分排空。目标物质被吸附于固相萃取材料上，得到吸附目标物质的枪头。

4）净化

用步骤3）的枪头，通过移液枪，吸取去离子水，每次吸取200 μL ，吸取2次，共用400 μL去离子水净化吸附目标物质的枪头，最后一次将移液枪头内的液体充分排空，得到初步净化的枪头。

5）洗脱并富集

用步骤4）的枪头，通过移液枪，吸取100 μL甲醇，吸取后将移液枪头静置10 min，然后将移液枪头内的液体排除，收集洗脱液装入样品瓶，作为供试品溶液，供含量测定，计算待测物质富集系数为4。

6）目标物质定量分析

采用岛津LC-20AT色谱仪，取步骤5）的供试品溶液20 μL，直接注入高效液相色谱仪，优化色谱条件为：CapcellPac C₁₈色谱柱，流动相为乙腈-水（26:74，v/v），流速为1 mL/min，柱温为25℃，紫外检测波长为270 nm，进行色谱分析。同时配制待测物质标准品溶液，记录标准品及供试品溶液的色谱峰面积。

7）目标物质含量测定结果。

采用外标法，计算样品中各目标成分的含量，并与乙酸乙酯溶剂萃取法进行比较，结果见表1。

表1. 细胞培养液中4种淫羊藿苷的含量测定

Claims (9)

1.一种进行生物样本中中药活性成分的样品预处理及定量分析方法，其特征该方法包括以下步骤：

1）中空纤维膜（3）与固相萃取材料（2）的选择，并制备功能化枪头；该枪头包括移液枪头（1）、固相萃取材料（2）和中空纤维膜（3），所述的移液枪头（1）为锥形结构，所述的中空纤维膜（3）设置在移液枪头（1）的尖端内部，并通过设置胶水（4）均匀涂抹于移液枪头（1）尖端与中空纤维膜（3）交接处，所述的中空纤维膜（3）具有上、下两端口，所述的上端口密封，下端口凸出尖端设置并保持开口状态，所述的固相萃取材料（2）设置在所述的移液枪头（1）内部并完全覆盖中空纤维膜（3）；

2）活化功能化移液枪头 将步骤1）的功能化移液枪头连接在移液枪上；通过移液枪，吸取色谱纯甲醇，通过多次吸取排出甲醇冲洗移液枪头；再吸取去离子水，同样重复吸取排出去离子水冲洗移液枪头，即活化完成，得到活化的功能化移液枪头；

3）取样 用步骤2）的活化枪头，通过移液枪，吸取0.1-1 mL待测样品溶液，通过反复吸取、排出同一待测样品的步骤，使目标物质被充分吸附于固相萃取材料上，最后一次将萃取完成的样品废液排出后，得到吸附目标物质的枪头；

4）净化 用步骤3）的枪头，通过移液枪，吸取去离子水，通过反复吸取、排出步骤，最后一次将移液枪头内的液体充分排空，去除杂质，得到初步净化的功能化枪头；

5）洗脱并富集 取步骤4）的枪头，通过移液枪，吸取一定体积的洗脱液，吸取后将移液枪头静置5-30 min，静置过程确保洗脱液无渗漏，然后将移液枪头内的液体排除，收集洗脱液，装入样品瓶即得到供试品溶液，供含量测定；如果洗脱液体积等于待测样品取样体积，则功能化枪头发挥纯化待测目标物质的作用；如果洗脱液体积小于待测样品取样体积，则具有富集作用，可以通过公式计算待测目标物质富集系数；

6）目标物质定量分析 取步骤5）的供试品溶液，直接注入分析仪器中，选择优化的分离条件，进行含量分析，同时配制待测物质标准品溶液，记录标准品及供试品溶液的色谱或质谱峰面积；

7）目标物质含量测定结果 根据步骤6）标准品及供试品溶液的色谱或质谱峰面积，计算生物样品中待测物质的含量，当功能化枪头富集样品时，样品的浓度应根据富集系数折算实际浓度。

2.根据权利要求1所述的一种进行生物样本中中药活性成分的样品预处理及定量分析方法,其特征在于：所述的中空纤维膜（3）下端口凸出尖端的长度为0.2-0.6 cm。

3.根据权利要求1所述的一种进行生物样本中中药活性成分的样品预处理及定量分析方法,其特征在于：所述的中空纤维膜（3）形状为圆柱体，长度0.5 -2 cm，内径200 -1000 μm，外径500- 2000 μm，膜壁孔径0.1-0.5 μm。

4.根据权利要求1所述的一种进行生物样本中中药活性成分的样品预处理及定量分析方法,其特征在于：所述的中空纤维膜（3）材料选自聚丙烯、混合纤维酯、硝酸纤维素、聚偏氟乙烯、醋酸纤维素、再生纤维素、聚酰胺、聚四氟乙烯和聚氯乙烯中一种或多种混合。

5.根据权利要求1所述的一种进行生物样本中中药活性成分的样品预处理及定量分析方法，其特征在于：所述的胶水（4）为环氧胶水。

6.根据权利要求1所述的一种进行生物样本中中药活性成分的样品预处理及定量分析方法,其特征在于：所述的固相萃取材料（2）为具有吸附能力的固体粉末，微粒直径2-50μm；所述的固相萃取材料（2）质量范围为5-200 mg。

7.根据权利要求6所述的一种进行生物样本中中药活性成分的样品预处理及定量分析方法,其特征在于：所述的固相萃取材料（2）材料选自反相材料、正相材料或离子交换材料。

8.根据权利要求1-7任一项所述的一种进行生物样本中中药活性成分的样品预处理及定量分析方法，其特征在于：所述功能化移液枪头的制作方法包括以下步骤：

1）根据待测目标物质分子量与结构式，选择适宜的中空纤维膜（3）并确定最佳尺寸；用加热的镊子按压中空纤维膜（3）上部端口，将其密封，下部端口保持开口状态；

2）取1只移液枪头（1），根据中空纤维膜（3）的外径，从移液枪头（1）的相应位置剪去部分枪头尖端，使中空纤维膜（3）外径与枪头尖端内径基本吻合；将步骤1）的中空纤维膜（3），以开口朝下的方式内置于移液枪头（1）中，中空纤维膜（3）下部端口突出枪头一定的距离，用适量环氧胶水均匀涂覆于中空纤维膜和移液枪头的交接处，在室温下固化24 h，得到内置中空纤维膜的枪头；

3）根据待测目标物质的理化性质，选择适宜的固相萃取材料，称取粉末状材料，放入步骤2）的移液枪头内部，即得到带有超滤和固相萃取双重净化能力的功能化移液枪头。

9.根据权利要求1所述的一种进行生物样本中中药活性成分的样品预处理及定量分析方法，其特征在于：样品溶液为细胞培养液、血清、血浆或组织液；所述的洗脱液为色谱纯甲醇、色谱乙醇或不同比例的缓冲盐有机溶液；分析仪器为高效液相色谱仪、气相色谱仪或液质联用分析仪。