CN105954454B - 一种分离测定唾液中有机酸和脂肪酸物质的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种分离测定唾液中有机酸和脂肪酸物质的方法，属于分析化学技术领域，具体涉及一种专用于分离测定唾液中有机酸和脂肪酸物质的方法。本发明采用脱脂棉收集唾液样品，采集完后脱脂棉置于注射器针筒中，利用注射器推杆推移挤压得到唾液样品，经高速离心后取上清液，然后依次经盐析萃取、甲酯化反应和溶剂萃取分离后，浓缩至近干，再复溶，过微孔滤膜，滤液采用气相色谱‑质谱联用法测定唾液中有机酸和脂肪酸物质，制作标准曲线，外标法定量。本发明方法可以有效的用于测定唾液中有机酸和脂肪酸物质，方法可行，检出限低，精密度好，准确可靠，具有推广应用价值。

Description

一种分离测定唾液中有机酸和脂肪酸物质的方法

技术领域

本发明属于分析化学技术领域，具体涉及一种专用于分离测定唾液中有机酸和脂肪酸物质的方法。

背景技术

食品中有机酸和脂肪酸是食品香吃味的主要来源，它们的含量及相互比例对色、香、味乃至质量和风格均有着直接影响。对食品中有机酸和脂肪酸的研究，通常是直接测定食品中这些组分的含量。然而，食品饮食过程中，被口腔唾液选择性溶解吸收的成分才是刺激人体产生感官感受的物质，决定了食品的风格和风味。研究测定饮食者唾液中吸收溶解的有机酸和脂肪酸成分，则能更直接、客观的得到决定食品风味的化学成分数据，不仅可为食品、烟草等的香吃味评定提供数据支持，还可为改善食品风味提供理论依据。

目前，测定不同基质、样品中有机酸或脂肪酸已有大量报道，然而唾液样品中有机酸和脂肪酸物质的测定还未见报道。唾液样品基体复杂，主要成分是水（占99%），但含有多种有机物如黏蛋白、黏多糖、唾液淀粉酶、溶菌酶、免疫球蛋白、血型物质、尿素、尿酸和游离氨基酸等，以及无机物和一些气体分子，被分析成分在唾液中含量极低，还会受到唾液中多种有机成分和无机成分的干扰。因此，开发简单快速、高选择性、高灵敏度、定量准确的唾液中有机酸和脂肪酸物质的提取和分离测定方法非常迫切。

发明内容

本发明的目的在于针对目前唾液中有机酸和脂肪酸物质分离测定的方法未见文献报道的现状，以及现有技术的不足，提供一种分离测定唾液中有机酸和脂肪酸物质的方法，该方法可行，精密度好，检出限低，准确可靠，具有推广应用价值。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

一种分离测定唾液中有机酸和脂肪酸物质的方法，包括以下步骤：

步骤（1），样品采集：将脱脂棉置于口腔内，放置0.2-5 min后，取出吸收了唾液的脱脂棉，置于注射器针筒中，利用注射器推杆推移挤压，挤出液收集于离心管中，经高速离心后，收集上清液得到唾液样品；

步骤（2），盐析萃取：移取唾液样品于离心管中，加入甲醇、氯化钠、萃取用盐和pH调节剂，经涡旋振荡至混合均匀后离心，取甲醇所在的萃取液层，得到第一萃取液；

甲醇加入量与唾液样品的体积比为0.5-2：1；氯化钠的加入质量为唾液样品质量的5-20%；

所述的萃取用盐为无水硫酸镁和无水硫酸钠中的一种或两种的组合物；萃取用盐的加入质量为唾液样品质量的40-70%；当为组合物时，无水硫酸镁和无水硫酸钠的之间的比例没有具体限制；

pH调节剂为液体酸或缓冲盐，液体酸为盐酸、硫酸、甲酸和乙酸中的一种或几种的组合（当为组合物时，各组分的之间的比例没有具体限制），缓冲盐为柠檬酸钠和柠檬酸氢二钠中的一种或两种的组合（当为组合物时，各组分的之间的比例没有具体限制）；液体酸的加入体积是唾液样品体积的0.01-1%，缓冲盐的加入质量是唾液样品质量的10-25%；

步骤（3），甲酯化：将步骤（2）得到的第一萃取液中加入促甲酯化反应试剂后在50-80℃下的密闭条件进行甲酯化反应，反应完成后，加入饱和食盐水和萃取溶剂进行萃取，取萃取液层并用水洗至中性，加入干燥剂进行干燥，得到第二萃取液；

所述的促甲酯化反应试剂为硫酸、盐酸、氢氧化钾或三氟化硼，加入体积为步骤（2）得到的第一萃取液体积的5-40%；所述的饱和食盐水的体积是步骤（2）得到的第一萃取液体积的50-200%；

所述的萃取溶剂为二氯甲烷、三氯甲烷、正己烷或环己烷；每次萃取萃取溶剂的体积是步骤（2）得到的第一萃取液体积的25-100%；

所述的干燥剂为无水硫酸镁或无水硫酸钠；干燥剂的质量是步骤（2）中萃取溶剂质量的5-25%；

步骤（4），测定：将步骤（3）得到的第二萃取液，在30-45℃下浓缩至近干后，用正己烷复溶，正己烷的用量为步骤（2）移取唾液样品体积的10-200%，过0.22 μm微孔滤膜，滤液采用气相色谱-质谱联用法分析，外标法定量，根据标准曲线计算目标物含量。

进一步，优选的是步骤（1）中的脱脂棉的质量为0.2-2.0 g。

进一步，优选的是步骤（1）中唾液离心转速不低于10000 rpm，离心时间不少于10min。

进一步，优选的是步骤（2）中唾液移取量为0.5-10 mL，涡旋振荡转速为100-20000rpm，涡旋振荡时间为0.5-10 min，离心转速不低于10000 rpm，离心时间不少于5 min。

进一步，优选的是所述的甲酯化反应是将加入促甲酯化反应试剂的第一萃取液中移入微波萃取罐中并密闭，放入微波萃取系统中在50-80℃条件下进行甲酯化反应，反应时间为1-10 min；

或者所述的甲酯化反应是将加入促甲酯化反应试剂的第一萃取液中移入密闭的锥形瓶中，在加热50-80℃条件下进行甲酯化反应，反应时间为2-30 min。

进一步，优选的是步骤（3）中萃取次数为1-2次。

进一步，优选的是步骤（4）中收集到的萃取液在35℃水浴中减压蒸发浓缩至近干，用正己烷复溶，定容至1.0-5.0 mL，过0.22 μm滤膜后进样分析。

进一步，优选的是步骤（4）中所用分析方法为气相色谱-质谱联用法，气相色谱条件如下：

色谱柱为长度×内径×膜厚为60 m×0.32 mm × 0.25 μm，DB-5MS石英毛细管柱或相当者；载气氦气，纯度≥99. 999 %，恒流模式，流量2.5 mL/min；进样口温度：230℃；不分流进样；进样量：1 μL；程序升温：初始温度120℃，保持 2 min，然后以10℃/min升温到160℃，再以20 ℃/min 升温到200℃，保持20 min；

电离方式为电子轰击源（EI），色谱质谱接口温度为250℃，离子源温度为220℃，电离能量为70 eV，溶剂延迟：3.0 min，选择离子监测模式，离子选择参数见表1。

表1 有机酸和脂肪酸的定量和辅助定性离子

进一步，优选的是步骤（4）中标准曲线绘制方法如下：配制有机酸和脂肪酸对应甲酯化产物的系列标准溶液，浓度为：0.1 mg/L、0.5 mg/L、1 mg/L、2 mg/L、5 mg/L、10 mg/L，对系列标准溶液进行气相色谱-质谱联用仪分析，得到标准溶液的总离子流色谱图（如图1所示），根据各物质定量离子峰面积为纵坐标，以各物质浓度为横坐标，作各测定物质的标准曲线。

进一步，优选的是所述的有机酸为乳酸、草酸、丙二酸、乙酰丙酸、苹果酸和柠檬酸；所述的脂肪酸为棕榈酸、亚油酸、油酸、亚麻酸和硬脂酸。

本发明与现有技术相比，其有益效果为：本发明方法可以有效的用于测定唾液中有机酸和脂肪酸物质，方法可行，前处理简单，萃取效率高于98.5%，甲酯化效率高于98%，萃取效率和甲酯化效率高，检测限低，精密度好，准确可靠，具有推广应用价值。

以上说明为本发明技术方案的概述，为了更清楚的了解本发明的技术手段，而可依照说明书的内容予以实施，并且为了让本发明的上述和其它目的、特征和优点能够更明显易懂，现特举较佳实施例，并配合附图，详细说明如下。

附图说明

图1是本发明有机酸和脂肪酸对应甲酯化产物混合标准溶液（2.0 mg/L）的总离子流色谱图；

图2为唾液加标样品的总离子流色谱图。

图中各峰的含义如下：1，6.47 min，乳酸；2，8.32 min，草酸；3，9.60 min，丙二酸；4，9.75 min，乙酰丙酸；5，10.18 min，苹果酸；6，10.63 min，柠檬酸；7，10.99 min，棕榈酸；8，11.53 min，亚油酸；9，11.74 min，油酸+亚麻酸；10，13.20 min，硬脂酸。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的详细描述，但其并不限制本发明。

本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过购买获得的常规产品。

本发明所述的萃取液层为萃取后萃取溶剂所在层。

本发明如无特殊说明，百分号代表质量百分数。

实施例1

一种分离测定烟草吸食者唾液中有机酸和脂肪酸物质的方法，包括以下步骤：

步骤（1），样品采集：将0.2 g脱脂棉置于烟草吸食者口腔内，放置0.3 min后取出，置于注射器针筒中，利用注射器推杆推移挤压，挤出液收集于离心管中，于10000 rpm转速下离心时间10 min得到唾液样品。

步骤（2），盐析萃取：移取2.0 mL唾液样品于离心管中，加入2.0 mL甲醇、1 g无水硫酸镁、0.2 g氯化钠、0.2 g柠檬酸钠、0.1 g柠檬酸氢二钠，于500 rpm转速涡旋振荡2.0min，再于10000 rpm转速下离心时间5 min，取萃取液层；

步骤（3），甲酯化：萃取液中加入萃取液体积10%的硫酸，移入微波萃取罐中并密闭，放入微波萃取系统中于60℃下进行甲酯化反应2 min。反应完成后，加入2.0 mL饱和食盐水、0.5 mL正己烷进行萃取，取正己烷层，再加入0.5 mL正己烷重复萃取1次，合并正己烷层，并用1.0 mL水洗至中性，加入0.25 g无水硫酸钠进行干燥。

步骤（4），测定：将步骤（3）收集到的洗脱液在30℃水浴中，用减压蒸发浓缩至近干，用1.0 mL正己烷复溶，过0.22 μm滤膜后进样分析，滤液采用气相色谱-质谱联用法分析，得到的样品的总离子流色谱图如图2所示，根据标准曲线计算有机酸和脂肪酸物质的含量。

步骤（3）中采用的微波萃取系统为EXCEL全功能型微波化学工作平台（上海屹尧仪器科技发展有限公司）。

表2是本方法分析烟草吸食者唾液中有机酸和脂肪酸物质的试验数据。表2给出了本分析方法的线性相关系数、精密度（RSD）、检出限、定量限和回收率相关参数，表明该方法结果可靠，精密度好。萃取时加入盐与不加入盐相比显著提高了目标分析物的萃取率；加入pH调节剂，不但可以保证目标物的稳定性，还可进一步提高萃取效率；采用微波辅助甲酯化，甲酯化效率高，甲酯化完全，因此目标物回收率高。该方法适合于烟草吸食者唾液中有机酸和脂肪酸物质的分析检测。

表2线性相关系数、精密度（RSD）、检出限、定量限和回收率

n表示实验重复次数。

实施例2

一种分离测定白酒饮用者唾液中有机酸和脂肪酸物质的方法，包括以下步骤：

步骤（1），样品采集：将1.5 g脱脂棉置于烟草吸食者口腔内，放置4.0 min后取出，置于注射器针筒中，利用注射器推杆推移挤压，挤出液收集于离心管中，于15000 rpm转速下离心时间12 min得到唾液样品。

步骤（2），盐析萃取：移取8.0 mL唾液样品于离心管中，加入8.0 mL甲醇、5 g无水硫酸钠、0.8 g氯化钠、10 μL甲酸，于15000 rpm转速涡旋振荡10.0 min，再于10000 rpm转速下离心时间5 min，取萃取液层；

步骤（3），甲酯化：萃取液中加入萃取液体积30%的三氟化硼，在水浴中于75℃下进行甲酯化反应5 min。反应完成后，加入10.0 mL饱和食盐水、5.0 mL二氯甲烷进行萃取，取二氯甲烷层，再加入3.0 mL二氯甲烷重复萃取1次，合并二氯甲烷层，并用5.0 mL水洗至中性，加入2.5 g无水硫酸镁进行干燥。

步骤（4），测定：将步骤（3）收集到的洗脱液在40℃水浴中，用减压蒸发浓缩至近干，用2.0 mL正己烷复溶，过0.22 μm滤膜后进样分析，滤液采用气相色谱-质谱联用法分析，根据标准曲线计算有机酸和脂肪酸物质的含量。

表3是本方法分析白酒饮用者唾液中有机酸和脂肪酸物质的试验数据。表3给出了本分析方法的线性相关系数、精密度（RSD）、检出限、定量限和回收率相关参数，表明该方法结果可靠，精密度好。该方法适合于白酒饮用者唾液中有机酸和脂肪酸物质的分析检测。

表3线性相关系数、精密度（RSD）、检出限、定量限和回收率

n表示实验重复次数。

实施例3

一种分离测定唾液中有机酸和脂肪酸物质的方法，包括以下步骤：

步骤（1），样品采集：将0.2 g脱脂棉置于口腔内，放置0.2 min后，取出吸收了唾液的脱脂棉，置于注射器针筒中，利用注射器推杆推移挤压，挤出液收集于离心管中，经高速离心后，收集上清液得到唾液样品；唾液离心转速不低于10000 rpm，离心时间不少于10min；

步骤（2），盐析萃取：移取0.5 mL唾液样品于离心管中，加入甲醇、氯化钠、萃取用盐和pH调节剂，经涡旋振荡至混合均匀后离心，取甲醇所在的萃取液层，得到第一萃取液；其中，涡旋振荡转速为100 rpm，涡旋振荡时间为0.5min，离心转速不低于10000 rpm，离心时间不少于5 min；

甲醇加入量与唾液样品的体积比为0.5：1；氯化钠的加入质量为唾液样品质量的5%；

所述的萃取用盐为无水硫酸镁；萃取用盐的加入质量为唾液样品质量的40%；

pH调节剂为液体酸，液体酸为盐酸和硫酸（体积比为1：1）；液体酸的加入体积是唾液样品体积的0.01%；

步骤（3），甲酯化：将步骤（2）得到的第一萃取液中加入促甲酯化反应试剂后在50℃下的微波萃取罐进行甲酯化反应，反应时间为1min，反应完成后，加入饱和食盐水和萃取溶剂进行萃取，萃取次数为1次，取萃取液层并用水洗至中性，加入干燥剂进行干燥，得到第二萃取液；

所述的促甲酯化反应试剂为盐酸，加入体积为步骤（2）得到的第一萃取液体积的5%；所述的饱和食盐水的体积是步骤（2）得到的第一萃取液体积的50%；

所述的萃取溶剂为二氯甲烷；每次萃取萃取溶剂的体积是步骤（2）得到的第一萃取液体积的25%；

所述的干燥剂为无水硫酸镁；干燥剂的质量是步骤（2）中萃取溶剂质量的5%；

步骤（4），测定：将步骤（3）得到的第二萃取液，在30℃下浓缩至近干后，用正己烷复溶，正己烷的用量为1mL，过0.22 μm微孔滤膜，滤液采用气相色谱-质谱联用法分析，外标法定量，根据标准曲线计算目标物含量。

步骤（4）中所用分析方法为气相色谱-质谱联用法，气相色谱条件如下：

色谱柱为长度×内径×膜厚为60 m×0.32 mm × 0.25 μm，DB-5MS石英毛细管柱或相当者；载气氦气，纯度≥99.999 %，恒流模式，流量2.5 mL/min；进样口温度：230℃；不分流进样；进样量：1 μL；程序升温：初始温度120℃，保持 2 min，然后以10℃/min升温到160℃，再以20 ℃/min 升温到200℃，保持20 min；

质谱条件如下：电离方式为电子轰击源，色谱质谱接口温度为250℃，离子源温度为220℃，电离能量为70 eV，溶剂延迟：3.0 min，选择离子监测模式。

步骤（4）中标准曲线绘制方法如下：配制有机酸和脂肪酸对应甲酯化产物的系列标准溶液，浓度为：0.1 mg/L、0.5 mg/L、1 mg/L、2 mg/L、5 mg/L、10 mg/L，对系列标准溶液进行气相色谱-质谱联用仪分析，根据各物质定量离子峰面积为纵坐标，以各物质浓度为横坐标，作各测定物质的标准曲线。

所述的有机酸为乳酸、草酸、丙二酸、乙酰丙酸、苹果酸和柠檬酸；所述的脂肪酸为棕榈酸、亚油酸、油酸、亚麻酸和硬脂酸。

实施例4

实施例4与实施例3的区别在于：

pH调节剂为液体酸，液体酸为盐酸、硫酸、甲酸和乙酸（体积比为1：1：1：1），液体酸的加入体积是唾液样品体积的1%；

甲酯化反应时间为10 min。

实施例5

实施例5与实施例3的区别在于：

pH调节剂为液体酸，液体酸为乙酸，液体酸的加入体积是唾液样品体积的0.5%；

甲酯化反应时间为5 min。

实施例6

实施例6与实施例3的区别在于：

pH调节剂为缓冲盐，缓冲盐为柠檬酸钠，缓冲盐的加入质量是唾液样品质量的10%；

实施例7

实施例7与实施例3的区别在于：

pH调节剂为缓冲盐，缓冲盐为柠檬酸氢二钠，缓冲盐的加入质量是唾液样品质量的25%；

实施例8

实施例6与实施例3的区别在于：

pH调节剂为缓冲盐，缓冲盐为柠檬酸钠和柠檬酸氢二钠（质量比为1：1）；缓冲盐的加入质量是唾液样品质量的15%；

实施例9

一种分离测定唾液中有机酸和脂肪酸物质的方法，包括以下步骤：

步骤（1），样品采集：将2.0 g脱脂棉置于口腔内，放置5 min后，取出吸收了唾液的脱脂棉，置于注射器针筒中，利用注射器推杆推移挤压，挤出液收集于离心管中，经高速离心后，收集上清液得到唾液样品；唾液离心转速不低于10000 rpm，离心时间不少于10 min；

步骤（2），盐析萃取：移取10 mL唾液样品于离心管中，加入甲醇、氯化钠、萃取用盐和pH调节剂，经涡旋振荡至混合均匀后离心，取甲醇所在的萃取液层，得到第一萃取液；其中，涡旋振荡转速为120000 rpm，涡旋振荡时间为10 min，离心转速不低于10000 rpm，离心时间不少于5 min；

甲醇加入量与唾液样品的体积比为2：1；氯化钠的加入质量为唾液样品质量的20%；

所述的萃取用盐为无水硫酸钠；萃取用盐的加入质量为唾液样品质量的70%；

pH调节剂为液体酸液体酸为盐酸；液体酸的加入体积是唾液样品体积的1%；

步骤（3），甲酯化：将步骤（2）得到的第一萃取液中加入促甲酯化反应试剂后在80℃下的密闭的锥形瓶中进行甲酯化反应，反应2min，反应完成后，加入饱和食盐水和萃取溶剂进行萃取，萃取次数为2次，合并萃取液层并用水洗至中性，加入干燥剂进行干燥，得到第二萃取液；

所述的促甲酯化反应试剂为氢氧化钾，加入体积为步骤（2）得到的第一萃取液体积的40%；所述的饱和食盐水的体积是步骤（2）得到的第一萃取液体积的200%；

所述的萃取溶剂为三氯甲烷；每次萃取萃取溶剂的体积是步骤（2）得到的第一萃取液体积的100%；

所述的干燥剂为无水硫酸钠；干燥剂的质量是步骤（2）中萃取溶剂质量的25%；

步骤（4），测定：将步骤（3）得到的第二萃取液，在45℃下浓缩至近干后，用正己烷复溶，正己烷的用量为1 mL，过0.22 μm微孔滤膜，滤液采用气相色谱-质谱联用法分析，外标法定量，根据标准曲线计算目标物含量。

步骤（4）中所用分析方法为气相色谱-质谱联用法，气相色谱条件如下：

色谱柱为长度×内径×膜厚为60 m×0.32 mm × 0.25 μm，DB-5MS石英毛细管柱或相当者；载气氦气，纯度≥99.999 %，恒流模式，流量2.5 mL/min；进样口温度：230℃；不分流进样；进样量：1 μL；程序升温：初始温度120℃，保持 2 min，然后以10℃/min升温到160℃，再以20 ℃/min 升温到200℃，保持20 min；

质谱条件如下：电离方式为电子轰击源，色谱质谱接口温度为250℃，离子源温度为220℃，电离能量为70 eV，溶剂延迟：3.0 min，选择离子监测模式。

步骤（4）中标准曲线绘制方法如下：配制有机酸和脂肪酸对应甲酯化产物的系列标准溶液，浓度为：0.1 mg/L、0.5 mg/L、1 mg/L、2 mg/L、5 mg/L、10 mg/L，对系列标准溶液进行气相色谱-质谱联用仪分析，根据各物质定量离子峰面积为纵坐标，以各物质浓度为横坐标，作各测定物质的标准曲线。

所述的有机酸为乳酸、草酸、丙二酸、乙酰丙酸、苹果酸和柠檬酸；所述的脂肪酸为棕榈酸、亚油酸、油酸、亚麻酸和硬脂酸。

实施例10

一种分离测定唾液中有机酸和脂肪酸物质的方法，包括以下步骤：

步骤（1），样品采集：将1 g脱脂棉置于口腔内，放置3 min后，取出吸收了唾液的脱脂棉，置于注射器针筒中，利用注射器推杆推移挤压，挤出液收集于离心管中，经高速离心后，收集上清液得到唾液样品；唾液离心转速不低于10000 rpm，离心时间不少于10 min；

步骤（2），盐析萃取：移取6 mL唾液样品于离心管中，加入甲醇、氯化钠、萃取用盐和pH调节剂，经涡旋振荡至混合均匀后离心，取甲醇所在的萃取液层，得到第一萃取液；其中，涡旋振荡转速为10000 rpm，涡旋振荡时间为4 min，离心转速不低于10000 rpm，离心时间不少于5 min；

甲醇加入量与唾液样品的体积比为1：1；氯化钠的加入质量为唾液样品质量的12%；

所述的萃取用盐为无水硫酸镁和无水硫酸钠（质量比为1：1）；萃取用盐的加入质量为唾液样品质量的60%；

pH调节剂为缓冲盐，缓冲盐为柠檬酸钠和柠檬酸氢二钠的组合（质量比为1：4）；缓冲盐的加入质量是唾液样品质量的20%；

步骤（3），甲酯化：将步骤（2）得到的第一萃取液中加入促甲酯化反应试剂后在70℃下的锥形瓶中进行甲酯化反应，反应30min，反应完成后，加入饱和食盐水和萃取溶剂进行萃取，萃取次数为2次，合并萃取液层并用水洗至中性，加入干燥剂进行干燥，得到第二萃取液；

所述的促甲酯化反应试剂为三氟化硼，加入体积为步骤（2）得到的第一萃取液体积的40%；所述的饱和食盐水的体积是步骤（2）得到的第一萃取液体积的200%；

所述的萃取溶剂为环己烷；每次萃取萃取溶剂的体积是步骤（2）得到的第一萃取液体积的60%；

所述的干燥剂为无水硫酸钠；干燥剂的质量是步骤（2）中萃取溶剂质量的18%；

步骤（4），测定：将步骤（3）得到的第二萃取液，在35℃下浓缩至近干后，用正己烷复溶，正己烷的用量为3mL，过0.22 μm微孔滤膜，滤液采用气相色谱-质谱联用法分析，外标法定量，根据标准曲线计算目标物含量。

步骤（4）中所用分析方法为气相色谱-质谱联用法，气相色谱条件如下：

色谱柱为长度×内径×膜厚为60 m×0.32 mm × 0.25 μm，DB-5MS石英毛细管柱或相当者；载气氦气，纯度≥99.999 %，恒流模式，流量2.5 mL/min；进样口温度：230℃；不分流进样；进样量：1 μL；程序升温：初始温度120℃，保持 2 min，然后以10℃/min升温到160℃，再以20 ℃/min 升温到200℃，保持20 min；

质谱条件如下：电离方式为电子轰击源，色谱质谱接口温度为250℃，离子源温度为220℃，电离能量为70 eV，溶剂延迟：3.0 min，选择离子监测模式。

步骤（4）中标准曲线绘制方法如下：配制有机酸和脂肪酸对应甲酯化产物的系列标准溶液，浓度为：0.1 mg/L、0.5 mg/L、1 mg/L、2 mg/L、5 mg/L、10 mg/L，对系列标准溶液进行气相色谱-质谱联用仪分析，根据各物质定量离子峰面积为纵坐标，以各物质浓度为横坐标，作各测定物质的标准曲线。

所述的有机酸为乳酸、草酸、丙二酸、乙酰丙酸、苹果酸和柠檬酸；所述的脂肪酸为棕榈酸、亚油酸、油酸、亚麻酸和硬脂酸。

实施例11

实施例11与实施例10的区别在于：

甲酯化反应的反应时间为18 min.

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

Claims (9)

1.一种分离测定唾液中有机酸物质的方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤（1），样品采集：将脱脂棉置于口腔内，放置0.2-5 min后，取出吸收了唾液的脱脂棉，置于注射器针筒中，利用注射器推杆推移挤压，挤出液收集于离心管中，经高速离心后，收集上清液得到唾液样品；

步骤（2），盐析萃取：移取唾液样品于离心管中，加入甲醇、氯化钠、萃取用盐和pH调节剂，经涡旋振荡至混合均匀后离心，取甲醇所在的萃取液层，得到第一萃取液；

甲醇加入量与唾液样品的体积比为0.5-2：1；氯化钠的加入质量为唾液样品质量的5-20%；

所述的萃取用盐为无水硫酸镁和无水硫酸钠中的一种或两种的组合物；萃取用盐的加入质量为唾液样品质量的40-70%；

pH调节剂为液体酸或缓冲盐，液体酸为盐酸、硫酸、甲酸和乙酸中的一种或多种的组合，缓冲盐为柠檬酸钠和柠檬酸氢二钠中的一种或两种的组合；液体酸的加入体积是唾液样品体积的0.01-1%，缓冲盐的加入质量是唾液样品质量的10-25%；

步骤（3），甲酯化：将步骤（2）得到的第一萃取液中加入促甲酯化反应试剂后在50-80℃下的密闭条件进行甲酯化反应，反应完成后，加入饱和食盐水和萃取溶剂进行萃取，取萃取液层并用水洗至中性，加入干燥剂进行干燥，得到第二萃取液；

所述的促甲酯化反应试剂为硫酸、盐酸、氢氧化钾或三氟化硼，加入体积为步骤（2）得到的第一萃取液体积的5-40%；所述的饱和食盐水的体积是步骤（2）得到的第一萃取液体积的50-200%；

所述的萃取溶剂为二氯甲烷、三氯甲烷、正己烷或环己烷；每次萃取萃取溶剂的体积是步骤（2）得到的第一萃取液体积的25-100%；

所述的干燥剂为无水硫酸镁或无水硫酸钠；干燥剂的质量是步骤（2）中萃取溶剂质量的5-25%；

步骤（4），测定：将步骤（3）得到的第二萃取液，在30-45℃下浓缩至近干后，用正己烷复溶，正己烷的用量为步骤（2）移取唾液样品体积的10-200%；根据标准曲线计算有机酸物质的含量；

所用分析方法为气相色谱-质谱联用法，气相色谱条件如下：

色谱柱为长度×内径×膜厚为60 m×0.32 mm × 0.25 μm，DB-5MS石英毛细管柱；载气氦气，纯度≥99.999 %，恒流模式，流量2.5 mL/min；进样口温度：230℃；不分流进样；进样量：1 μL；程序升温：初始温度120℃，保持 2 min，然后以10℃/min升温到160℃，再以20℃/min 升温到200℃，保持20 min；

质谱条件如下：电离方式为电子轰击源，色谱质谱接口温度为250℃，离子源温度为220℃，电离能量为70 eV，溶剂延迟：3.0 min，选择离子监测模式。

2.根据权利要求1所述的分离测定唾液中有机酸物质的方法，其特征在于：步骤（1）中的脱脂棉的质量为0.2-2.0 g。

3.根据权利要求1所述的分离测定唾液中有机酸物质的方法，其特征在于：步骤（1）中唾液离心转速不低于10000 rpm，离心时间不少于10 min。

4.根据权利要求1所述的分离测定唾液中有机酸物质的方法，其特征在于：步骤（2）中唾液移取量为0.5-10 mL，涡旋振荡转速为100-20000 rpm，涡旋振荡时间为0.5-10 min，离心转速不低于10000 rpm，离心时间不少于5 min。

5.根据权利要求1所述的分离测定唾液中有机酸物质的方法，其特征在于：所述的甲酯化反应是将加入促甲酯化反应试剂的第一萃取液中移入微波萃取罐中并密闭，放入微波萃取系统中在50-80℃条件下进行甲酯化反应，反应时间为1-10 min；

或者所述的甲酯化反应是将加入促甲酯化反应试剂的第一萃取液中移入密闭的锥形瓶中，在加热50-80℃条件下进行甲酯化反应，反应时间为2-30 min。

6.根据权利要求4所述的分离测定唾液中有机酸物质的方法，其特征在于：步骤（3）中萃取次数为1-2次。

7.根据权利要求6所述的分离测定唾液中有机酸物质的方法，其特征在于：步骤（4）中收集到的萃取液在35℃水浴中减压蒸发浓缩至近干，用正己烷1.0-5.0 mL复溶，过0.22 μm滤膜后进样分析。

8.根据权利要求1所述的分离测定唾液中有机酸物质的方法，其特征在于：步骤（4）中标准曲线绘制方法如下：配制有机酸对应甲酯化产物的系列标准溶液，浓度为：0.1 mg/L、0.5 mg/L、1 mg/L、2 mg/L、5 mg/L、10 mg/L，对系列标准溶液进行气相色谱-质谱联用仪分析，根据各物质定量离子峰面积为纵坐标，以各物质浓度为横坐标，作各测定物质的标准曲线。

9.根据权利要求1或8所述的分离测定唾液中有机酸物质的方法，其特征在于：所述的有机酸为乳酸、草酸、丙二酸、乙酰丙酸、苹果酸和柠檬酸、棕榈酸、亚油酸、油酸、亚麻酸和硬脂酸。