CN114076805B - 一种用于富集尿液中甲基化腺嘌呤核苷的方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于富集尿液中甲基化腺嘌呤核苷的方法及其应用。该方法采用磁性石墨烯材料对人体尿液样本中的多种甲基化腺嘌呤核苷进行富集，再使用液相色谱串联质谱进行分析。本发明的优点是实现了尿液等复杂生物样本中N6‑甲基‑2'‑脱氧腺苷(m6dA)、N6‑甲基腺苷(m6A)、2'‑O‑甲基腺苷(Am)、N6,2'‑O‑二甲基腺苷(m6Am)和N6,N6‑二甲基腺苷(m6 2A)同时富集，本发明方法可在分析化学、临床医学、预防医学以及代谢组学领域中应用，通过磁铁同时富集检测样品液中多种甲基化腺嘌呤核苷，再进行液相色谱质谱检测，从而提高检测准确率。具有很好的推广价值。
Description
技术领域
本发明属于分析化学、医学和纳米材料技术领域。涉及一种用于富集尿液中甲基化腺嘌呤核苷的方法，是通过磁性石墨烯材料对尿液中甲基化腺嘌呤核苷的富集，对尿液的样品前处理中，从而能实现尿液中多种甲基化腺嘌呤核苷的同时富集，以利于后续更好的液相色谱质谱检测。
背景技术
N6-甲基-2'-脱氧腺苷(m6dA)常见于原核生物的基因组中，在调节细菌的许多生物过程中起着至关重要的作用。近年来，m6dA被发现存在于人类基因组中，并在基因表达、染色质构型、肿瘤发生中起重要的调节作用。研究表明m6dA在人胶质母细胞瘤和食管鳞状细胞癌中升高。相反，也有研究报告称在原发性胃癌、肝癌和肺癌中，m6dA水平相对于正常组织下降。N6-甲基腺苷(m6A)、2'-O-甲基腺苷(Am)、N6,2'-O-二甲基腺苷(m6Am)和N6,N6-二甲基腺苷(m6 2A)，是重要的RNA甲基化修饰，这些修饰的核苷可以影响mRNA的稳定性和翻译效率，在细胞分化、胚胎发育以及肿瘤发生发展中起着至关重要的调控作用。研究表明m6A等甲基化腺嘌呤修饰核苷在不同肿瘤类型中呈现出不同的表达水平。因此，对m6dA,m6A,Am,m6Am和m6 2A进行定性定量分析在代谢组学、生物化学、生命科学以及临床医学等研究领域中有着非常重要的作用。
目前，甲基化修饰核苷的分析仍然在不断的拓展和完善中，我们应用靶向代谢组学的方法，以标准品作为对照，应用亲水相互作用色谱串联质谱技术对尿液样本中的甲基化腺嘌呤核苷进行绝对定量，用来鉴定其作为疾病的早期诊断的标志物。但是，在实际的尿液标本检测中，这些修饰核苷的含量极低，使得对这些化合物进行同时定量分析具有极大的困难与挑战。因此，选择性富集是提高检测灵敏度一种有效的策略。目前已报道的富集核苷的方法主要运用基于硼亲和吸附的材料，然而该方法只能实现具有邻位二羟基的核糖核苷富集，无法实现对脱氧核糖核苷以及2'-O修饰的核糖核苷的富集。
发明内容
针对现有技术存在的弊端，本发明的目的是提供一种用于富集尿液中甲基化腺嘌呤核苷的方法，是利用磁性石墨烯材料来作为富集材料，对尿液样品进行前处理，同时富集多种目标甲基化腺嘌呤核苷，获得最佳的目标物提取效率，从而实现其定性定量质谱分析。
为实现上述发明目的，本发明方法通过以下步骤实现：
(1)尿液样本在室温下解冻，在4℃下以13000rpm转速离心15分钟。取上清液于1.5mL离心管中，并加水稀释；取离心后尿液上清液的体积为100μL，加入水的体积为300μL；
(2)称取0.1-4mg特殊富集材料于1.5mL离心管中，并依次用甲醇、水清洗，随后将稀释后的尿液加入离心管中，超声0.5-30分钟后静置1-20分钟；
(3)将磁铁放置于1.5mL离心管外部，弃去上清液，加水进行清洗，弃去上清液；用作清洗的水的体积为1mL；
(4)加入含有乙酸的甲醇溶液洗脱，涡旋后用磁铁将特殊富集材料与洗脱液分离(将磁铁放置于离心管外侧)，收集洗脱液，重复解吸程序四次，合并洗脱液，随后真空离心干燥；洗脱溶剂为含有0.1％乙酸的甲醇溶液；
(5)用乙腈/水复溶后，使用亲水相互作用色谱串联质谱(HILIC-MS/MS)分析；复溶所使用的溶剂为100μL乙腈/水(9:1,v/v)，所使用的色谱柱为BEH HILIC柱(2.1×100mm,1.7μm)；
(6)配制不同浓度的混合标准溶液，运用HILIC-MS/MS进行分析，得到线性回归方程，对尿液样本进行测定，测得分析物与同位素内标的峰面积比值，代入线性方程，计算得到样本中分析物的含量。
所述步骤(6)中混合标准溶液包含有N6-甲基-2'-脱氧腺苷(m6dA)、N6-甲基腺苷(m6A)、2'-O-甲基腺苷(Am)、N6,2'-O-二甲基腺苷(m6Am)和N6,N6-二甲基腺苷(m6 2A)。使用的稳定同位素标记的内标化合物为[D3]m6dA,[D3]m6A,[13C5]Am,[D3]m6Am和[13C5]m6 2A。浓度范围分别为：m6dA(0.05-25nM)、m6A(1-1000nM)、Am(0.25-250nM)、m6Am(0.25-250nM)和m6 2A(0.05-25nM)。并加入同位素标记的内标化合物，添加量分别为：[D3]m6dA(250fmol)、[D3]m6A(25pmol)、[13C5]Am(2pmol)、[D3]m6Am(5pmol)和[13C5]m6 2A(250fmol)。
所述的特殊富集材料为磁性石墨烯材料。
作为进一步优选方案，步骤(2)所述的特殊富集材料的用量为2mg。
步骤(2)中，100μL尿液上清加10μL混合同位素标准液，用300μL水稀释。
步骤(4)中，用0.6mL含0.1％乙酸的甲醇洗脱目标分析物，涡旋5s后将磁铁放置于离心管外侧，收集洗脱液。重复解吸程序四次，洗脱液合并后真空离心干燥。
作为更进一步优选方案，在1-20min范围内考察了静置提取时间的影响，结果表明，磁性石墨烯在1分钟内就可以有效吸附这5种甲基化腺嘌呤核苷。
作为更进一步优选方案，对包括甲醇、乙腈、丙酮、乙酸乙酯和二氯甲烷在内的洗脱溶剂进行了评估。结果表明，甲醇对这5种甲基化腺嘌呤核苷具有最高的解吸能力。
作为更进一步优选方案，在甲醇中加入甲酸或乙酸可以提高这些目标物在磁性石墨烯表面的解吸，并对加酸比例进行了评估。结果表明含有0.1％乙酸的甲醇作为洗脱溶剂具有最高的解吸能力。
作为更进一步优选方案，用不同体积(0.6-3.0mL)的优化后的洗脱溶剂进行洗脱。结果表明，2.4mL为最佳洗脱体积。因此，选择2.4mL含0.1％乙酸的甲醇作为最终洗脱溶剂。
本发明的另一个目的是提供所述方法用于样品尿液中多种甲基化腺嘌呤核苷的检测，是先在尿液样本中添加特殊富集材料(磁性石墨烯)，通过磁铁同时富集检测样品尿液中多种甲基化腺嘌呤核苷，再进行液相色谱质谱检测，从而提高检测准确率。
所述尿液中的主要甲基化腺嘌呤核苷为m6dA,m6A,Am,m6Am和m6 2A。
本发明使用磁性石墨烯作为富集材料，实现了尿液样本中m6dA,m6A,Am,m6Am和m6 2A的同时富集，并实现其定性定量质谱分析，这对于定性定量分析甲基化腺嘌呤核苷是一大突破。与现有技术相比，本发明具有如下显著性效果：
(1)本发明提供的基于磁性石墨烯材料的分散萃取方法，能够方便快捷地从尿液中提取到m6dA,m6A,Am,m6Am和m6 2A，与现有的其他萃取方法如硼亲和富集相比，磁性石墨烯可以实现这5种甲基化腺嘌呤核苷的同时富集。
(2)本发明所使用的富集材料为磁性纳米材料，使用方便，只需要在尿液中加入适量的磁性石墨烯材料，就可以实现多种目标甲基化腺嘌呤核苷的同时富集。目前较常用的富集方法如固相萃取一般需要使用到商品化的萃取小柱，单价在30～50元/根，对于大数量样本而言，成本很高。而本发明所使用的的磁性石墨烯材料，每个样品只需要2mg材料，每个样本的前处理成本能控制在10元以下，极大地降低了分析成本。
(3)应用本发明对肠癌患者，胃癌患者以及健康志愿者的尿液进行前处理，取得了满意的富集效果，并实现了尿液中这5种甲基化腺嘌呤核苷的同时检测，说明本发明具有较强的实用性和很好的临床以及科研市场推广价值。
附图说明
图1：磁性石墨烯富集尿液中甲基化腺嘌呤核苷的萃取条件优化。
具体实施方式
下面结合附图和具体的实施例对本发明进行详细的说明。
实施例中所用的液相色谱为Waters公司的Acquity UPLC，质谱仪为AB SCIEX公司的4000 QTRAP质谱仪。
实施例中尿液的处理方法：将保存于-80℃的冰箱中尿液取出于室温下解冻，在4℃下以13000rpm转速离心15分钟，取100uL上清液并加入[D3]m6dA(250fmol)、[D3]m6A(25pmol)、[13C5]Am(2pmol)、[D3]m6Am(5pmol)和[13C5]m6 2A(250fmol)，再加入300μL水稀释。
实施例中磁性固相萃取的提取过程：将一定质量的磁性石墨烯材料加入上述稀释的尿液上清中，静置提取一段时间后，将磁铁放置于1.5mL离心管的管壁，弃掉上清液，加入1mL水清洗后再将磁铁放置于离心管管壁，弃掉清洗液。接着用一定体积的洗脱剂解吸目标分析物，洗脱液真空离心干燥。随后用100μL乙腈/水(9:1,v/v)复溶，并使用HILIC-MS/MS检测分析。
实施例中HILIC-MS/MS检测条件为：流动相：A相由10mM乙酸铵、0.2％乙酸及水组成；B相由0.05mM苹果酸、2mM乙酸铵、0.2％乙酸及乙腈组成；采用6％A、94％B的等度洗脱程序，流速为0.25mL/min；使用的色谱柱为Waters公司BEH HILIC柱(2.1×100mm,1.7μm)；进样为5μL。
实施例1
本实施例的目的是为了评估提取回收率，以验证该磁性固相萃取方法富集尿液中m6dA,m6A,Am,m6Am和m6 2A的可行性和有效性。
在尿液样品中加入三种不同浓度(低，中，高)的五种核苷标准品，并加入同位素标准品混合液，用本发明的提取方法对添加了标准品和同位素内标的尿液标本进行处理后进行HILIC-MS/MS分析。根据回收率＝(加标样品浓度-未加标样品浓度)/加标浓度×100％计算回收率。
(1)配制低、中、高三种浓度的五种核苷标准混合溶液，浓度如下：m6dA(0.5,2.5,20nM)，m6A(50,300,600nM)，Am(5,20,150nM)，m6Am(10,40,200nM)和m6 2A(0.5,2.5,20nM)。
(2)配制五种同位素标记核苷的储备液，[D3]m6dA、[D3]m6A、[13C5]Am、[D3]m6Am和[13C5]m6 2A的浓度为1mM，使用时稀释成所需要的浓度。
(3)准备四份100μL尿液上清，向其中三份分别添加低、中、高浓度的标准混合溶液。随后向四份尿液上清中添加同位素内标混合溶液，其中五种同位素标记核苷的添加量分别为：[D3]m6dA(250fmol)、[D3]m6A(25pmol)、[13C5]Am(2pmol)、[D3]m6Am(5pmol)和[13C5]m6 2A(250fmol)。
(4)实施例中液相色谱串联质谱的检测条件为：流动相A相由10mM乙酸铵，0.2％乙酸及水组成；B相由0.05mM苹果酸、2mM乙酸铵，0.2％乙酸及乙腈组成；采用6％A，94％B的等度洗脱程序，流动相的流速为0.25mL/min；使用色谱柱为BEH HILIC柱(2.1×100mm,1.7μm)；进样量为5μL。
(5)对上述四份尿液上清运用磁性石墨烯材料进行磁性固相萃取后，进行液相色谱串联质谱分析，每个样本测量两次。
(6)在三个加标浓度下，计算回收率。详细的回收率结果如表1所示。
表1磁性石墨烯萃取回收率
由表1结果可见：在三个加标浓度下，这五种甲基化腺嘌呤核苷的回收率介于92.69％到109.80％，RSD值小于4.77％。表明本发明所描述的磁性固相萃取方法可以用于尿液中m6dA，m6A，Am，m6Am和m6 2A的同时富集。
应用实施例1
(1)将保存在-80℃冰箱的31例结直肠癌患者的尿液样本于室温下解冻，在4℃下以13000rpm离心15分钟，取100μL上清液，加入同位素内标[D3]m6dA(250fmol)、[D3]m6A(25pmol)、[13C5]Am(2pmol)、[D3]m6Am(5pmol)和[13C5]m6 2A(250fmol)，用300μL水稀释。尿液样品使用实施例1所描述的磁性固相萃取方法处理。将洗脱液真空离心干燥，然后100μL乙腈/水(9:1,v/v)复溶。
(2)将复溶后的待测物在4℃下以13000rpm离心3分钟，取上层清液，按实施例1所述流动相及分析条件进行液相色谱串联质谱分析。
(3)根据构建的标准曲线计算结直肠癌患者尿液中m6dA，m6A，Am，m6Am和m6 2A浓度。
(4)分析结果为：运用本发明所示的基于磁性石墨烯的磁性固相萃取方法，我们从31名结直肠癌者收集的尿样中检测到了m6dA，m6A，Am，m6Am和m6 2A，并实现了这五种甲基化腺嘌呤核苷的准确定量分析。
应用实施例2
(1)将保存在-80℃冰箱的43例胃癌患者的尿液样本于室温下解冻，在4℃下以13000rpm离心15分钟，取100μL上清液，加入同位素内标[D3]m6dA(250fmol)、[D3]m6A(25pmol)、[13C5]Am(2pmol)、[D3]m6Am(5pmol)和[13C5]m6 2A(250fmol)，用300μL水稀释。尿液样品使用实施例1所描述的磁性固相萃取方法处理。将洗脱液真空离心干燥，然后100μL乙腈/水(9:1,v/v)复溶。
(2)将复溶后的待测物在4℃下以13000rpm离心3分钟，取上层清液，按实施例1所述流动相及分析条件进行液相色谱串联质谱分析。
(3)根据构建的标准曲线计算胃癌患者尿液中m6dA，m6A，Am，m6Am和m6 2A浓度。
(4)分析结果为：运用本发明所示的基于磁性石墨烯的磁性固相萃取方法，我们从43例胃癌患者收集的尿样中检测到了m6dA，m6A，Am，m6Am和m6 2A，并实现了这五种甲基化腺嘌呤核苷的准确定量分析。
应用实施例3
(1)将保存在-80℃冰箱的45例健康志愿者的尿液样本于室温下解冻，在4℃下以13000rpm离心15分钟，取100μL上清液，加入同位素内标[D3]m6dA(250fmol)、[D3]m6A(25pmol)、[13C5]Am(2pmol)、[D3]m6Am(5pmol)和[13C5]m6 2A(250fmol)，用300μL水稀释。尿液样品使用实施例1所描述的磁性固相萃取方法处理。将洗脱液真空离心干燥，然后100μL乙腈/水(9:1,v/v)复溶。
(2)将复溶后的待测物在4℃下以13000rpm离心3分钟，取上层清液，按实施例1所述流动相及分析条件进行液相色谱串联质谱分析。
(3)根据构建的标准曲线计算胃癌患者尿液中m6dA，m6A，Am，m6Am和m6 2A浓度。
(4)分析结果为：运用本发明所示的基于磁性石墨烯的磁性固相萃取方法，我们从45例健康志愿者收集的尿样中检测到了m6dA，m6A，Am，m6Am和m6 2A，并实现了这五种甲基化腺嘌呤核苷的准确定量分析。
对所测得的结直肠癌患者、胃癌患者及健康志愿者尿液中m6dA，m6A，Am，m6Am和m6 2A浓度进行统计学分析，我们发现相较于健康志愿者，结直肠癌患者和胃癌患者尿液中m6dA和Am的含量明显下降，m6Am和m6 2A的含量则无明显差异。对于m6A，与健康志愿者相比，结直肠癌患者尿液中m6A的含量明显增加，而胃癌患者尿液中m6A的含量明显下降。
本发明的实用性，由上述三个应用例结果可进一步说明本发明提供的基于磁性石墨烯的磁性固相萃取方法可用于复杂生物样本中的m6dA，m6A，Am，m6Am和m6 2A的同时富集，在代谢组学、分析化学、临床医学及预防医学领域具有很好的应用推广价值，因此该发明是有效的。
Claims (9)
1.一种用于富集尿液中甲基化腺嘌呤核苷的方法，其特征在于，通过以下步骤实现：
（1）尿液样本在室温下解冻，在4℃下以13000 rpm转速离心15分钟，取上清液于1.5 mL离心管中，并加水稀释；
（2）称取0.1-4 mg特殊富集材料于1.5 mL离心管中，并依次用甲醇、水清洗，随后将稀释后的尿液加入离心管中，超声0.5-30分钟后静置1-20分钟，所述特殊富集材料为磁性石墨烯；
（3）将磁铁放置于1.5 mL离心管外部，弃去上清液，加水进行清洗，弃去上清液；
（4）加入含有乙酸的甲醇溶液洗脱，涡旋后将磁铁放置于离心管外侧，用磁铁将特殊富集材料与洗脱液分离，收集洗脱液，重复解吸程序四次，合并洗脱液，随后真空离心干燥；
（5）用乙腈/水复溶后，使用亲水相互作用色谱串联质谱分析；
（6）配制不同浓度的混合标准溶液，并加入同位素标记的内标化合物，运用HILIC-MS/MS进行分析，得到线性回归方程，对尿液样本进行测定，测得分析物与同位素内标的峰面积比值，代入线性方程，计算得到样本中分析物的含量；
其中HILIC-MS/MS检测条件为：流动相：A相由10 mM乙酸铵、0.2%乙酸及水组成；B相由0.05 mM苹果酸、2 mM乙酸铵、0.2%乙酸及乙腈组成；采用6% A、94% B的等度洗脱程序，流速为0.25 mL/min；使用的色谱柱为Waters公司BEH HILIC柱，2.1 × 100 mm，1.7 μm；进样为5 μL；
所述的甲基化腺嘌呤核苷分别为：N 6-甲基-2'-脱氧腺苷、N 6-甲基腺苷、2'-O-甲基腺苷、N 6, 2'-O-二甲基腺苷和N 6, N 6-二甲基腺苷。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（1）中取离心后尿液上清液的体积为100 μL，加入水的体积为300 μL。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（2）中特殊富集材料的用量选为2mg，清洗用的甲醇和水的体积均为1 mL，超声时间选为5分钟，静置时间选为1分钟。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（3）中清洗用水的体积为1 mL。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（4）中洗脱溶液为含有0.1%乙酸的甲醇溶液，每次洗脱所用的体积为0.6 mL，洗脱总次数为4次，涡旋时间为5秒。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（5）中复溶所用的溶剂为100 μL乙腈/水，9:1, v/v，所使用的色谱柱为BEH HILIC柱 2.1 × 100 mm, 1.7 μm。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（6）中混合标准溶液为N 6-甲基-2'-脱氧腺苷、N 6-甲基腺苷、2'-O-甲基腺苷、N 6, 2'-O-二甲基腺苷和N 6, N 6-二甲基腺苷，使用的稳定同位素标记的内标化合物为[D3]m6dA、[D3]m6A、 [13C5]Am、[D3]m6Am和[13C5]m6 2A。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述混合标准溶液的浓度范围分别为：0.05-25 nM N 6-甲基-2'-脱氧腺苷、1-1000 nM N 6-甲基腺苷、0.25-250 nM 2'-O-甲基腺苷、0.25-250 nM N 6, 2'-O-二甲基腺苷和0.05-25 nM N 6, N 6-二甲基腺苷，同位素标记的内标化合物添加量分别为：250 fmol [D3]m6dA、25 pmol [D3]m6A、2 pmol [13C5]Am、5 pmol[D3]m6Am和250 fmol [13C5]m6 2A。
9.权利要求1所述方法在样品尿液中检测多种甲基化腺嘌呤核苷中的应用，其特征在于，所述多种甲基化腺嘌呤核苷分别为：N 6-甲基-2'-脱氧腺苷、N 6-甲基腺苷、2'-O-甲基腺苷、N 6, 2'-O-二甲基腺苷和N 6, N 6-二甲基腺苷。
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